專利名稱：擬南芥細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因的植物表達(dá)載體及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物基因工程領(lǐng)域，具體涉及一種提高植物耐鋁毒能力的植物表達(dá) 載體pH2-35S-PrbcS-觀權(quán)其構(gòu)建方法與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
鋁是地殼中含量最豐富的金屬元素，其平均含量約占地殼的8%。有試驗(yàn)表明， 適量的鋁能，茶樹和野牡丹的生長發(fā)育，如鋁在一定范圍(《400pmo1 /L。)增加 茶樹側(cè)根數(shù)量和長度,低于50詣o1 /L的鋁對(duì)水稻幼苗生長有促進(jìn)作用，但大多數(shù) 作物容易受到鋁的毒害，通常毫微摩爾濃度水平的鋁在短時(shí)間內(nèi)即可影響許多作物 根系的生長(MA J F， PETER R R， DELHAIZE. 2001. Aluminum tolerance in plants and the complexing role of organic acids[J]. Trends in Plant Science, 6(6): 273-278)。同時(shí)鋁也是酸性土壤中限制作物生長的主要因氣并Bl的溶解度對(duì)pH 值十分敏感，在酸性割牛下，PH的微量變化就會(huì)大幅度影響Al3+的濃度，比如稀釋營 養(yǎng)液pH從4. 5提高至4. 6即可使Ar濃度降低26% (BlameyF P C， Edwards D G， Asher C J". 1983. Effects of aluminium, 0H:A1 and P: Al molar ratio, and iomic strength on soybean root elongation in solution culture. Soil Science, 136:197-207) PH每減少O. 11個(gè)單位，土壤中Al的溶解度將增力口2umol(0.054mg/L)(孔繁翔，桑 偉蓮,蔣新,等.2000，鋁對(duì)植物毒害及植物抗鋁作用機(jī)理.生態(tài)學(xué)報(bào)，20(5): 856 —858)。在酸性土壤中，鋁主要是以Al (H20) 63+形態(tài)存在的，即通常所說的Ar, 這種形態(tài)是目前公認(rèn)的對(duì)植物毒害很強(qiáng)的一種形態(tài)。
植物受鋁毒害最明顯、最突出的特征是根的伸長生長受到抑制(TamAs L， Huttov J，Mistrik L 2003，Inhibition ofA12induced root elongation and enhancement of A12induced peroxidase activity in A12sensitive and A12resistance barley cultivars are positively correlated, /^/a/7t《6b_z7， 250: 193 200)，根尖 的結(jié)構(gòu)受到破壞。在鋁脅迫下植物主根的伸長受到抑制，地上分蘗少，側(cè)根少、短粗而脆，并且為棕褐色，根尖巻曲,呈魚鉤狀，根毛減少，根冠脫落。鋁對(duì)根的毒害作 用部位是根尖，包括根冠與根分生區(qū)，故而植物發(fā)生鋁毒害的最主要癥狀是其根生
長的快速受阻;對(duì)鋁毒機(jī)理研究結(jié)果表明鋁可能通過一種未知的信號(hào)傳導(dǎo)途徑泡 括根冠，根分生區(qū)，激素以及其他信號(hào))間接抑制根的生長。此外，鋁離子交換量占 土壤中陽離子交換總量的20% 80% ，容易導(dǎo)致土壤陽離子流失，如造成磷、鉀、鈣、 鎂、硼、鉬等營養(yǎng)元素的缺乏。
目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中治理酸性土壤的方法主要是施用石灰，增加土壤有機(jī)質(zhì)等。雖 然施用有機(jī)肥料，可以明顯降低土壤A^+含量，增加土壤養(yǎng)分，保持作物的穩(wěn)產(chǎn)和 高產(chǎn)；也可以施用土壤改良劑來達(dá)到目的，如合成腐植酸、丙烯酰胺、丙烯酸共聚 物作為土壤結(jié)構(gòu)改良劑，共聚物可抑制土壤中鋁的活性，改良后的土壤活性鋁的存 在形態(tài)有所改變，活性鋁的含量減少，土壤的pH提高。但由于全球酸性土面積較大， 這樣成本高，操作起來也存在困難。尤其是施石灰不僅成本高，而且只改善土壤表 面的狀況，長期下去會(huì)破壞土壤結(jié)構(gòu)和特性，破壞生態(tài)系統(tǒng)。從長遠(yuǎn)考慮，還需要 提出更多更有效的方法措施。目前關(guān)于酸性土壤的鋁毒問題研究很多，開發(fā)和利用 耐鋁植物資源來解決酸鋁脅迫的難題是目前研究的熱點(diǎn)之一。
對(duì)于植物耐鋁的機(jī)制，目前提出了多種耐A1作用的生理生化機(jī)制。但普遍認(rèn)為 A1脅迫下植物耐A1基因型或品種通過根系大量分泌有機(jī)酸來解除或減輕A1的毒害， 是植物的重要耐A1機(jī)理之一。有機(jī)酸，尤其是低分子有機(jī)酸可影響根尖的土壤環(huán)境， 對(duì)植物根際營養(yǎng)具有重要作用.當(dāng)根系處于高水平鋁環(huán)境中時(shí)， 一些植物根際的pH 值上升，從而刺激根系分泌檸檬酸、蘋果酸等,特別是耐鋁品種(系)根系能大量分泌 蘋果酸或擰檬酸到質(zhì)外體或根際溶液。研究表明，有機(jī)酸如檸檬酸鹽，草酸鹽，酒 石酸蘋果酸鹽，丙二酸，琥珀酸鹽和醋酸鹽可以合土壤中的鋁離子，降低鋁對(duì)植 物體的毒害作用。
蘋果酸脫氫酶(malate dehydrogenase, MDH)是生物中廣泛存在的一類蛋白， 它以NADH鄉(xiāng)ADPH為還原劑，催化k一蘋果酸與OM的可逆反應(yīng)。它在檸檬酸循環(huán)中 催化蘋果酸形成草酰乙酸，也可催化草酰乙酸形成蘋果酸.而草酰乙酸是生物體內(nèi)生化反應(yīng)的一個(gè)非常重要的中間產(chǎn)物，連接多條重要的代謝途徑，是氨基酸形成所
必需的碳骨架的主要來源之一。在植物中，MDH參與了眾多的發(fā)育進(jìn)程為C4代謝 提供蘋果酸，pH平衡的維持，氣孔的運(yùn)動(dòng)，呼吸作用，脂肪酸的P-氧化以及豆科 木艮瘤的形成等(Imsande， J. ，Berkemeyer， M. ， Scheibe， R. ， et al. (2001)A soybean plastid—targeted NADH-malate dehydrogenase: cloning and expression analyses. American J. Botany. 88:2136-2142.)。除此以外，蘋果酸脫氫酶還在 細(xì)胞的多種生理活動(dòng)中扮演著重要的角色，涉及線粒體的能量代謝、蘋果酸一天冬 氨酸穿梭系統(tǒng)、植物的抗病性(其酶活力的異常變動(dòng)可作為植物對(duì)疾病易感性和抗 病性早期鑒別的手段)以及植物抗病過程中的活性氧代謝等。
Tesfaye等(2001)利用35S啟動(dòng)子在苜蓿中過量表達(dá)根瘤特異型的MDH，得到 的轉(zhuǎn)基因苜蓿根尖MDH的活性提高1. 6倍，根部有機(jī)酸的含量提高了 4. 2倍，增加 了有機(jī)酸分泌量，當(dāng)植物生長在含有鋁的酸性培養(yǎng)液中時(shí)，轉(zhuǎn)MDH的植株積累的生 物量比未轉(zhuǎn)基因的苜蓿高，在含有鋁的水培液或土壤中栽培時(shí)，非轉(zhuǎn)基因植物的生 長困難，轉(zhuǎn)基因植物生長情況良好，提高了轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鋁的耐受性，取得明顯效 果(Tesfay.e， M. ， Temple, S. J. ， Allan, D. L ， et al. 2001， Overexpression of Malate Dehydrogenase in Transgenic Alfalfa Enhances Organic Acid Synthesis and Confers Tolerance to Aluminum Plant Physiol. 127: 1836-1844)。羅小英等 在苜蓿根瘤中分離出的根瘤型蘋果酸脫氫酶(neMDH)，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染 苜蓿胚性愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，篩選的轉(zhuǎn)化株在20tool/L的AL"溶液中處理24h 后根部的伸長量比對(duì)照植株高3. 6%-22. 5%，由此表明在相同的鋁毒條件下過量表達(dá) 蘋果酸脫氫酶的轉(zhuǎn)基因苜蓿能夠更好地生長(羅小英，崔衍波，鄧偉，等.2004.超量 表達(dá)蘋果酸脫氫酶基因提高苜蓿對(duì)鋁毒的抗受性.分子植物育種，2004， 2 (5): 621-626)。綜上所述，通，傳操作在植物中過量表達(dá)MDH可以提高植物中MDH 的活性，增加其有機(jī)酸分泌量，從而提高植物對(duì)鋁毒的耐受能力，使植物在有鋁脅 迫的情況下更好的生長，是提高植物對(duì)鋁耐受性的有效方法。
已有的研究結(jié)果表明高等植物中至少有5種異構(gòu)型的MDH (Ding and Ma, 2004)，其中細(xì)胞質(zhì)性型的MDH催化的反應(yīng)向生成蘋果酸的方向進(jìn)行。未有含有擬南芥基因 組中存在的細(xì)胞質(zhì)型的MDH基因的植物表達(dá)載體附艮道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種提高植物對(duì)鋁毒耐受能力的蘋果酸脫氫酶基因的植
物表達(dá)載體，該載體是含有擬南芥細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因(即^fce^基因)的
植物表達(dá)載體；同時(shí)提供該載體的構(gòu)建方法，以及該載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因
植物中的應(yīng)用。
本發(fā)明所提供的用于提高植物耐鋁毒能力的載體，是具有光誘導(dǎo)啟動(dòng)子和蘋果
酸脫氫 因cDNA的植物表達(dá)載體。
上述載體中，所述的蘋果酸脫氫酶基因遊W的cDNA來源于擬南芥Ui^j'ob/^is AaA'朋a)。所述的來源于擬南芥的蘋果酸脫氫酶基因觀F的cDNA GenBank登錄 號(hào)為AY091220。
上述蘋果酸脫氫 因cDNA的上游為Rubisco小亞基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。 上述載體中，用于構(gòu)建所屬植物表達(dá)載體的起始載體為pH2GW7 (購自Flanders Interuniversity Institute for Biotechnology, VIB)。
本發(fā)明的上述植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-廁W由下述方法構(gòu)建而成
(1) 從GenBank中查找擬南芥細(xì)胞質(zhì)型^f^F的全長基因cDNA序列，并設(shè)計(jì)序 列如下的一對(duì)弓嫩
細(xì)H5: 5， -CACCATGGCGMGGMCCAGTTCGTG-3 ，
細(xì)H3: 5， ~CTCGAGTTMGAGAGGCATGAGTMGCG-3 ， 5，端引物AMDH5， 5，端加CACC特征序列，并由此形成Afco I酶切位點(diǎn)；3， 端弓|物AMDH3，末端加I酶切位點(diǎn)；以擬南芥第一鏈cDNA為模版擴(kuò)增，得到^MF 基因的全長cDNA。
(2) 回收并純化^^F全長基因cDNA片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采 用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pUCm-m^;
(3) 構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-^M%用歷o I禾卩化o I切割pENTR*-PrbcS-*T~GFP (pENTR*-PrbcS-*T~GFP的構(gòu)建方 去見本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專利 申請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枮?00710066422. 9)和pUCm-避F，回收載體pENTR*-PrbcS片段和 ^M^基因cDNA片段，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)f雄行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)，獲得 重組質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-^J^%
(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-避F，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把 PrbcS-觀W亞克隆到植物表達(dá)載體pH2GW7 (Gateway的目的載體，比利時(shí)VIB/Gent 公司)中，獲得m^基因的植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-^f^F。
本發(fā)明利用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS構(gòu)建觀W基因的植物表達(dá)載體，以便在轉(zhuǎn) 基因植物葉片的細(xì)胞質(zhì)中過量表達(dá)MDH基因，直接利用光合作用產(chǎn)物產(chǎn)生的碳骨架 合成蘋果酸，使之分泌到細(xì)胞外，最后通過根系進(jìn)入到土壤中，熬合土壤中的鋁離 子，解除酸性土壤中高濃度的鋁對(duì)植物的毒害，提高轉(zhuǎn)基因植物耐鋁毒的能力。


圖1中間載體pUCm-，W的構(gòu)建策略
圖2中間載體pUCm-^J^^的檢測(cè)
(A):重組質(zhì)粒pUCm-^i7的PCR檢觀!J。 1: DNAMarker D2000; 2-4:以pUCm_v4MF 為模板，用引物AMDH5和AMDH3引物擴(kuò)增到的PCR產(chǎn)物。(B): TVco I I雙酶切 檢驗(yàn)pUCm-^4MF。 1: DNA Marker 500bp; 2-3: tVco I和J力o I雙酶切pUCm-^4M 〃重 組質(zhì)粒；4: pUCm-AJ^^重組質(zhì)粒。
圖3 AMDH基因的Gateway入門克隆載體pENTR*-PrbcS-觀W的構(gòu)建策略
圖4入門克隆載體pENTR—PrbcS-避W的檢測(cè)
(A):重纟！M粒pENTR承-PrbcS-v4MF的PCR檢測(cè)。1: DNAMarkerlll; 2 ， 4: 以pENTR*-PrbcS-v4M^質(zhì)粒為模板，利用PrbcS5和AMDH3弓l物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn) 物；3， 5:以pENTR*-PrbcS-^4MF質(zhì)粒為模板，利用AMDH5和AMDH3引物擴(kuò)增得到 的PCR產(chǎn)物。(B)用tVco1和J/ oL酶切檢驗(yàn)pENT砂-PrbcS-避私1: pENTR*-PrbcS-質(zhì)粒；2-3: I和J力o I雙酶切pENT妙-PrbcS-避肝重組質(zhì)粒；4: DNAMarkerlll 圖5用Gateway的LR反應(yīng)構(gòu)建^M^基因的植物表達(dá)載體圖6 AMDH植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-廁W的檢測(cè)和農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化 (A)重組質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-^f^〃的PCR檢測(cè)。1: DNAMarkerIII; 24:以 pH2-35S-PrbcS-v4MF質(zhì)粒為模板，利用attBl和AMDH3弓l物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物； 5:以pH2GW7質(zhì)粒為模板，利用attBl和AMDH3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物。(B)用 P^I酶切檢驗(yàn)pH2-35S-PrbcS-觀私1: DNAMarkerIII; 2:用尸wl酶切 pENTR*-PrbcS-m^質(zhì)粒；3—5:用尸W I酶切pH2-35S-PrbcS-m^質(zhì)粒；6:用 尸對(duì)I酶切pH2GW7質(zhì)粒。(C)轉(zhuǎn)化pH2-35S-PrbcS-^M 〃質(zhì)粒的農(nóng)桿菌PCR檢測(cè)。1: 以pH2-35S-PrbcS-m^質(zhì)粒為模板，利用aUBl和AMDH3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn) 物；2-4:以農(nóng)桿菌菌落為模版，利用attBl和AMDH3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物；5: 以pH2GW7質(zhì)粒為模板，利用attBl和AMDH3弓l物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物。
圖7 AMDH在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況以及轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè) (A)煙草植物基因組的PCR檢測(cè)。1: DNAMarkerIII; 2:負(fù)對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因的 野生型煙草基因組為模版)。3-7:以轉(zhuǎn)基因煙草基因組為模板，利用AMDH5和AMDH3 引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物。8:以pH2-35S-PrbcS-^^F質(zhì)粒為模板，利用AMDH5和 AMDH3引物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物。(B) 1: DNAMarkerIII; 2:負(fù)對(duì)照；3-5:轉(zhuǎn)基 因煙草的RT-PCR產(chǎn)物；6:正對(duì)照(以質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-觀W為模板，利用AMDH5 和AMDH3弓l物擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物)。
圖8 AMDH在轉(zhuǎn)基因煙草中的酶活性測(cè)定
圖9 AMDH轉(zhuǎn)基因煙草蘋果酸分泌量的測(cè)定
(A) AMDH轉(zhuǎn)基因煙草在無鋁脅迫的CaCl2溶液中蘋果酸分泌量。(B) AMDH轉(zhuǎn) 基因煙草在A1CL濃度為30 u mol/L的CaCl2溶液中蘋果酸分泌量。 圖10 AMDH轉(zhuǎn)基因煙草在鋁毒脅迫下根尖的染色情況 圖ll AMDH轉(zhuǎn)基因煙草在鋁毒脅迫下根相對(duì)生長率的測(cè)定 圖12 AMDH轉(zhuǎn)基因煙草在有鋁毒脅迫的基質(zhì)中的生長瞎況 具體實(shí)旨式 試劑與儀器試劑主要分為分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑、植物遺傳轉(zhuǎn)化所需的培養(yǎng)基以及轉(zhuǎn)基因植
物鑒定和檢測(cè)所需的各種試劑。各種限制性內(nèi)切酶、Taq DNA聚合酶、反轉(zhuǎn)錄酶、 RNA酶抑制劑、dNTP等為寶生物工程有限公司(大連)產(chǎn)品，質(zhì)粒提取試劑盒購自博 大泰克生物技術(shù)有限公司，TRIzoL Reagent RNA提取試劑盒、pENTR Directional T0PCf Cloning Kits以及Gateway clonase Enzyme Mix kit購自invitrogen公司。 其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
儀器均為分子生物學(xué)以及基因工程實(shí)驗(yàn)室常用儀器。
所有引物序列均在大連寶生物公司合成。本發(fā)明實(shí)施例中所用方法如無特別說 明均為常規(guī)方法。 實(shí)施例1:
AMDH基因cDNA擴(kuò)增及TA克隆
首先從GenBank中查找^MF的全長基因序列，并設(shè)計(jì)一對(duì)引物，序列如下 細(xì)H5: 5， -CACCATGGCGMGGMCCAGTTCGTG-3 ， 細(xì)H3: 5， -CTCGAGTTMGAGAGGCATGAGTMGCG-3 ，
5'端引物AMDH5末端加CACC特征序列，并由此形成tVcoI酶切位點(diǎn)；3'端引 物EMDH3末端加Wol酶切位點(diǎn)。
用TRIzoL Reagent (Invitrogen)從擬南芥(JraM 戸is 幼苗中提取總 RNA，取植物嫩葉約O. lg，加入lml的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min 后移入離心管，再加入0.2ml氯仿，振蕩混勻，離心15min (12000rpm)，轉(zhuǎn)移上清 液至新管，加入0.5ml異丙醇，混勻室溫放置10min， 4。C離心10min (12000卬m)， 棄上清，沉淀用75X乙醇lml清洗，4。C離心5min (7500rpm)，棄乙醇真空干燥沉 淀或自然晾干，用20 u 1焦碳酸二乙酯(DEPC)處理水溶解RNA。使用M-MuLV Reverse Transcriptase Kit (TaKaRa)進(jìn)行cDNA的合成，取植物總RNA約0. lpg-5)ng， oligo(dT) 50ng， lOmM dNTP mix l|til，用DEPC處理水補(bǔ)足至lO(il，混勻后，短暫 離心將之收集于管底，置于65'C加熱5min，冰浴10min，加入反應(yīng)混合物9^1 (5 X reaction buffer 4jil， 25mM MgCl2 4)iil， 0. 1M DTT 2|ul, RNA酶抑制劑l|nl)，將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25。C保溫2min，加入1^1 M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25°。保 溫20min，然后42-C保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用^M^基因上下游 特異性弓l物AMDH5和AMDH3作PCR，擴(kuò)增得到^MF的全長cDNA 1. Okb (圖1)。 回收并純化^MF全長基因片段，并將其連接到pUCm-T (大連寶生物公司)載體上， 轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5a (天根生化科技)，采用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，經(jīng)l %瓊脂糖凝膠電泳，選取大小和理論值相符的重組質(zhì)粒做進(jìn)一步的PCR檢測(cè)和雙酶 切檢測(cè)。以重組質(zhì)粒為模板，用引物AMDH5和AMDH3弓嫩擴(kuò)增到的1.0kb的PCR產(chǎn) 物(圖2A)。根據(jù)陽性重組質(zhì)粒pUCm-1^載體兩端的多克隆位點(diǎn)，用Atol和^01 雙酶切重組質(zhì)粒，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切產(chǎn)物，連接成功的重組質(zhì)粒 pUCm-^^含有l(wèi).Okb左右的DNA插入片段(圖2B)。 實(shí)施例2:
AMDH基因的Gateway入門克隆載體pENTR—PrbcS-避肝的構(gòu)建 用Afcol和J力ol切開純化的質(zhì)粒載體pENTR*-PrbcS_*T-GFP和pUCm-(圖 3)，通過瓊脂糖凝膠電泳分離已切開的載體和插入片段，從凝膠中回收 pENTR*-PrbcS-氺T^GFP被切割后產(chǎn)生的載體片斷pENTR氺-PrbcS(4. 0kb)及pUCm-^4MF 被切割產(chǎn)生的^MF基因的DNA片斷(l.Okb)，然后用寶生物(TaKaRa)的連接酶試 劑盒連接pENTR*-PrbcS和避W基因的DNA片斷產(chǎn)生入門載體pENTR*-PrbcS-^MF (圖3)。用連接反應(yīng)混合物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞加5d，購 自天根生化科技公司)，把轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有卡那霉素(Km， 50pg/ml)的平 板上，于37。C過夜培養(yǎng)，篩選Km抗性重組子菌落，從Km抗性重組子菌落中提取 質(zhì)粒，選出連接成功的質(zhì)粒載體pENT妙-PrbcS-避私用兩組引物作PCR檢測(cè)。第 一組用AMDH上下游的特異性引物AMDH5和AMDH3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選的質(zhì)粒都能 擴(kuò)增出一條1.0kb的^MF條帶(圖4A),第二組用位于PrbcS區(qū)域中的特異性引 物PrbcS5和AMDH的下游特異性引物AMDH 3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選的質(zhì)粒能擴(kuò)增出 一條l. lkb的條帶(圖4A)。用AfcoI (Fermentas)和(Fermentas)雙酶切檢測(cè)，連接成功的質(zhì)粒在瓊脂糖凝膠電泳圖上只產(chǎn)生兩條帶， 一條為4. 0kb的載體帶，
另一條為l.O kb的^lfiF基因片段(圖4B)。確認(rèn)是連接成功的質(zhì)粒后，重新轉(zhuǎn)化 大腸桿菌DH5 a ，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-^M^ 實(shí)施例3:
^!MF基因植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-觀W的構(gòu)建 通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把PrbcS-^^亞克隆到植物表達(dá)載體pH2GW7 (Gateway的目的載體比利時(shí)VIB/Gent公司)中(圖5)。具體的做法是用質(zhì) 粒抽提i式劑盒純化Gateway的目的載體pH2GW7 ，在Gateway的LR反應(yīng)體系中加 pENTR*-PrbcS-^MF和pH2GW7各150ng， l|ul LR Clonase II Enzyme Mix (Invitrogen)，混均于25 °C反應(yīng)過夜，通過整合酶的作用把PrbcS-^MW整合到 pH2GW7中獲得避肝的植物表達(dá)載體質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-v4MW(圖5)。用反應(yīng)混合 物轉(zhuǎn)化高效率(108)的大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(DH5a，購自天根生化禾斗技公司)，把 轉(zhuǎn)化好的大腸桿菌涂于加有壯觀霉素(Spe， 50ng/ml)的平板上，于37。C過夜培養(yǎng)， 篩選Spe抗性重組子菌落，從Spe抗性重組子菌落中提取質(zhì)粒，選出大小和理論預(yù) 測(cè)值相符的整合質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-^^F進(jìn)行PCR檢測(cè)，用位于載體pH2GW7的特 異性弓l物attBl和細(xì)H的下游特異性弓胸細(xì)H 3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選的質(zhì)粒能擴(kuò) 增出一條2. 5kb的條帶(圖6A)。然后進(jìn)一步用酶切驗(yàn)證重組質(zhì)粒的正確性，用細(xì)H 基因內(nèi)部的酶切位點(diǎn)i^ I酶切質(zhì)粒pENT砂-PrbcS-v4MF和pH2-35S-PrbcS-駕好以 及pH2GW7，含有AMDH片段的可以得到0.7kb左右的片段，整合質(zhì)粒 pH2-35S-PrbcS-m^可以得到0. 7kb的片段(圖6B)。確認(rèn)是整合成功的質(zhì)粒后， 重新轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci，挑單個(gè)菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)，用試劑盒純化質(zhì)粒。pH2GW7 攜帶的篩選標(biāo)記基因?yàn)槌泵顾乜剐曰?Hgr)，這樣可用加有潮霉素的平板篩選轉(zhuǎn) 基因植物。
實(shí)施例4:
用細(xì)H基因的植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌
制備農(nóng)桿菌的感受態(tài)細(xì)胞，用電脈沖法將上述構(gòu)建好的植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-觀W轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌(C58C1 (pPMP90))中，布加有壯觀霉素的平板上 篩選轉(zhuǎn)化子。取少量質(zhì)粒加入農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻；將混合物加入到預(yù) 冷的電轉(zhuǎn)化杯中，輕輕敲擊杯身使混和液落至杯底；將電轉(zhuǎn)化杯置于電轉(zhuǎn)化儀 (BIO-RAD)滑槽中，用lmm的電擊杯和200歐姆，2. 5kV/0. 2cm的參數(shù)進(jìn)行電擊，電 擊后立即取出電轉(zhuǎn)化杯，fflil加入0. 5mlS0C培養(yǎng)基，混勻，轉(zhuǎn)移到1. 5ml的離心管 中；28°C， 200rpm搖床培養(yǎng)3—5h;室溫下，7500rpm離心lmin，棄大部分上清， 保留100pl將細(xì)胞懸??；把農(nóng)桿菌涂布^^有壯觀霉素(Spe， 50pg/ml)的LB固體培 養(yǎng)基上，28。C培養(yǎng)2天獲得單菌落；首先用牙簽挑取農(nóng)桿菌菌落放入20iil ddH20 中，98'C處理5分鐘后取出10^il農(nóng)桿菌裂解液作為PCR反應(yīng)的模板。用位于載體 pH2GW7的特異性弓|物attBl和AMDH的下游特異性弓嫩AMDH 3進(jìn)行PCR擴(kuò)增，所選 的質(zhì)粒能擴(kuò)增出一條2. 5kb的條帶(圖6C)，經(jīng)菌落PCR確認(rèn)的轉(zhuǎn)化子菌落用于轉(zhuǎn) 化植物。
實(shí)施例5:
用含有^4MW基因植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草
挑取攜帶有質(zhì)粒pH2-35S-PrbcS-^i7的農(nóng)桿菌單菌落接種于50ml的LB培養(yǎng) 基中(含Spe， 100^ig/ml)， 180ipm， 28。C培養(yǎng)24h，待菌液OD,至1. 0左右，離心 10min (3000rpm)，沉淀菌體。再用10ml左右的MS液體培養(yǎng)基懸浮，離心10min
(3000rpm)，沉淀菌體。重復(fù)以上操作2 3次。最后加入一定體積的MS液體培養(yǎng) 基重懸浮，使菌體的0D,值為0.5。制備煙草(Ai'c"j'a/7a taAgc湖cv. Xanth)的無 菌苗，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)，用葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，然后通過組織培養(yǎng)獲得小苗，進(jìn)一步 篩選獲得所需的轉(zhuǎn)基因植物。把無菌煙草的葉片切成小片葉盤，把天竺葵的葉柄切 成小段，在制備好的農(nóng)桿菌菌液中浸染15—20min，用無菌吸水紙吸干后，平鋪于 愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS1 (MS+NAA02. l|Lig/ml+BAP0.02^ig/ml)上黑暗共培養(yǎng)2天， 將外植體轉(zhuǎn)移至含潮霉素(25)Lig/ml)的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS4
(MS+NM0.53)Lig/ml+BAP0.5|Lig/ml)上進(jìn)行芽的誘導(dǎo)，約15天繼代一次。待有芽生 成后，轉(zhuǎn)入含潮霉素(25ug/ml)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行+艮的誘導(dǎo)。實(shí)施例6:
^MF基因在轉(zhuǎn)基因煙草中的插入情況及轉(zhuǎn)錄水平檢測(cè)
為了確認(rèn)通過潮霉素篩選的轉(zhuǎn)基因煙草株系確實(shí)含有導(dǎo)入的目的基因的DNA片 段，用PCR方法對(duì)篩選到的轉(zhuǎn)基因煙草作進(jìn)一步的鑒定。首先采用CTAB法提取植 物基因組稱取植物葉片100mg左右置于1.5ml離心管中，加液氮用特制研棒研磨 至粉末狀;加入900|iil預(yù)熱到65°C的2 X CTAB緩沖液(Tris-HC1 pH 7. 5 100 mM， EDTA 20mM，NaCl 1. 4 M， CTAB 2%)， 65'C度水浴加熱20分鐘后取出冷卻；加入500iul氯 仿—異戊醇混合液(24: 1)搖勻，4。C離心10min (7500rpm)后轉(zhuǎn)移上清至1. 5ml EP管；再次加入500|nl氯仿一異戊醇混合液(24:1 )搖勻，4。C離心10min(7500卬m); 取出上清置于新的EP管中，加入1/10體積3M PH5. 2醋酸鈉和等體積異丙醇，搖 勻后4。C離心20min (12000rpm);棄上清，用75%乙醇清洗兩次后，干燥，用含 RNase的TE緩沖液溶解并降解RNA，獲得的基因組DNA樣品。以植物基因組DNA為 模板，用^MF基因的上下游引物AMDH5和AMDH3作PCR檢測(cè)，PCR產(chǎn)物的理論長度 l.Okb，成功轉(zhuǎn)入目的基因的植株均能擴(kuò)增出1.0kb的條帶(圖7A)，經(jīng)PCR確認(rèn)的 轉(zhuǎn)基因植株用于RT-PCR分析。
為了考察目的基因在轉(zhuǎn)基因煙草株系中的轉(zhuǎn)錄情況，從轉(zhuǎn)基因植物中抽取總 RNA，反轉(zhuǎn)綠成cDNA后用于RT-PCR分析，檢測(cè)AMDH基因在轉(zhuǎn)基因植物中的轉(zhuǎn)錄水 平。采用TRIzoL Reagent (Invitrogen)提取RNA,取植物嫩葉約O. lg，加入lml 的TRIzoL提取液在研缽中研磨，室溫靜置5min后移入離心管，再加入0. 2ml氯仿， 振蕩混勻，離心15min (12000卬m)，轉(zhuǎn)移上清液至新管，加入0.5ml異丙醇，混勻 室溫放置10min， 4。C離心10min (12000rpm)，棄上清，沉淀用75%乙醇lml清洗， 4。C離心5min (7500卬m)，棄乙醇真空干燥沉淀或自然晾干，用20ul焦碳酸二乙 酯(DEPC)處理水溶解RNA。所獲得的RNA樣品用凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量和濃度。使用 Reverse Transcriptase進(jìn)行cDNA的合成，取植物總RNA約0. l|ug-5|Lig， oligo(dT) 50ng，10mM dNTP mix l|il，用DEPC處理水補(bǔ)足至10|ul，混勻后，短暫離心將之收 集于管底，置于65。C加熱5min,冰浴10min，加入反應(yīng)混合物9pl (5 X reactionbuffer 4^1， 25mM MgCl2 4|al， 0. 1M DTT 2|li1， RNA酶抑制劑1^1)，將上述混合物 混勻，短暫離心將之收集于管底，25。C保溫2min，加入l|ul M-MuLV Reverse Transcriptase,將上述混合物混勻，短暫離心將之收集于管底，25。C保溫20min， 然后42。C保溫70min，合成cDNA。以cDNA為模板，用^4MF基因的上下游弓|物AMDH5 和AMDH3作RT-PCR分析，考察轉(zhuǎn)基因煙草中是否有目的基因的轉(zhuǎn)錄物。結(jié)果證明 大部分轉(zhuǎn)基因煙草植株均有目的基因的轉(zhuǎn)錄物，而野生型的煙草則沒有(圖7B)。 實(shí)施例7:
轉(zhuǎn)基因煙草蘋果酸脫氫酶(MDH)的活性分析
選取經(jīng)RT-PCR分析表明有目的基因的轉(zhuǎn)錄物的轉(zhuǎn)基因煙草植株測(cè)定檸檬酸合 成酶的活性。從煙草葉片中抽提可溶性蛋白，取0.2g煙草葉片，加lml蛋白抽提 液[IOO mM Tris-HC1 (pH 7.5); 10% (V/V)甘油；10 mM巰基乙醇；1 mM PMSF; 5% (W/V) PVP]研磨，轉(zhuǎn)移至EP管中，13000 r/min離心25 min (4 。C)。將上清 移到新的EP管中，用Bradford方法測(cè)定植物上清中的蛋白質(zhì)濃度。
蘋果酸脫氫酶活性測(cè)定按 Tesfaye 等 (Tesfaye， M. ， Temple, S. J. ， Allan, D丄，et al. 2001， Overexpression of Malate Dehydrogenase in Transgenic Alfalfa Enhances Organic Acid Synthesis and Confers Tolerance to Aluminum Plant Physiol. 127: 1836-1844)的方法進(jìn)行， 其原理為草酰乙酸與NADH在蘋果酸脫氫酶的作用下能夠生成L-蘋果酸和NAD。 在該反應(yīng)中，通過測(cè)定波長為340 nm下NADH的減少量從而獲得MDH的相對(duì)酶活性。
測(cè)定MDH酶活性的反應(yīng)體系為0.05 M Tris-HCl (pH 8.0)， 4 mM草酰乙酸， 0.1 mM NADH。加入蛋白樣品之前，用紫外分光光度儀測(cè)定反應(yīng)溶液在波長340 nm 處的吸收值(0D值)，然后在反應(yīng)體系中加入100煙草蛋白樣品，再次檢測(cè)340 nm 處的0D值。計(jì)算兩次讀數(shù)的差值得到MDH酶活性數(shù)據(jù)。
共挑選了三個(gè)轉(zhuǎn)基因株系測(cè)定其MDH酶活性，結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因煙草MDH酶活性 為野生型煙草的1. 4倍左右(圖8)，可見^MF在轉(zhuǎn)基因煙草植株中的表達(dá)大大提高 了匪活性。實(shí)施例8:
轉(zhuǎn)基因煙草植株根分泌的蘋果酸含量測(cè)定
蘋果酸含量采用酶動(dòng)力學(xué)-紫外分光光度法測(cè)定(文獻(xiàn))。首先，將0.35 mL樣 品與0. 45 mL緩沖液Tris-HC1 (pH 9. 0)以及30 u L氧化型輔酶I (NAD)溶液(30 mg/mL)混合，并讀取波長為340 nm處的OD值(A 1)。接著加入2 " L蘋果酸脫氫 酶懸浮液(16.5U/uL)于上述反應(yīng)溶液中并混合均勻。15分鐘后，讀取340 nm處的 0D值A(chǔ)2。同時(shí)測(cè)定蘋果酸標(biāo)準(zhǔn)樣品的0D值A(chǔ)1'、 A2'。根據(jù)供試樣品和蘋果酸標(biāo)準(zhǔn) 溶液吸光度的增加值(A2-A1)以及(A2'- Al')，計(jì)算供試樣品中蘋果酸的含量。
將大小均勻一致的轉(zhuǎn)基因幼苗以及野生型煙草幼苗，分別置于AlClr濃度為0 和30 umol/L的CaCl2溶液中，16小時(shí)后收集CaCl2溶液并濃縮根分泌的蘋果酸。 分析結(jié)果表明，在有無鋁脅迫的情況下，AMDH轉(zhuǎn)基因煙草都具有較高的蘋果酸分泌 量(圖9)。
實(shí)施例9:
轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)鋁毒的抗性檢測(cè)
植物對(duì)鋁毒的耐受性一般采用根尖染色情況來衡量。根尖染色的染料有蘇木精 (hematoxylin)和鉻天青(eriochrome cyanine S)，兩者均適于鑒定植物對(duì)鋁的敏 感性或忍耐性。其原理是染料能通過死亡的細(xì)胞膜進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，并與殘留于死亡 細(xì)胞核中的鋁結(jié)合產(chǎn)生藍(lán)色(蘇木精)或紅色(鉻天青S)物質(zhì)，這一反頗鋁具有高 度的專 一性(Cancado GMA， Loguercio IX， Martins PR. 1999. Hematoxylin staining as a phenotypic indes for aluminum tolerance selection in tropical maize (Zea鵬j^s L.). 彷eor 6"e"et 99:747-754; Ma JF， Zhen SJ， Li XF. 1997. A rapid hydroponic screening for,aluminum tolerance in barley, 尸7s/7t 191:133-137)，而且根尖染色程度與鋁對(duì)植物的毒害皿呈正相關(guān)。
將大小均勻一致且生根良好的轉(zhuǎn)基因煙草以及野生型煙草幼苗，置于AlCl3濃 度分別為25 |imol/L的CaCl2溶液(pH值4. 3)中處理16 h，再經(jīng)過0.1%的鉻天青 S染色液染色15 min。用蒸餾水沖洗后，在顯微鏡下觀察并記錄根尖染色情況。結(jié)果表明野生型煙草的根尖均被染成紫色，出現(xiàn)鋁離子中毒現(xiàn)象，而避F轉(zhuǎn)基因株
系A(chǔ)MDH8、 AMDHll、 AMDH13的根尖不著色或只有很淺的著色(圖10)。這些結(jié)果初步 證明在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表達(dá)^MF能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物對(duì)鋁毒的耐受性。 實(shí)施例10:
轉(zhuǎn)基因煙草植株在鋁毒脅迫下樹申長速率的測(cè)定-
根相對(duì)伸長率為Ar處理與對(duì)照^r處理的根系伸長量百分比。根的相對(duì)伸長
率是衡量植物耐AI性強(qiáng)弱的重要指標(biāo)，因此我們還測(cè)定在鋁毒脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草植
株根相對(duì)生長率。將大小均勻一致的轉(zhuǎn)基因煙草和野生型煙草幼苗，分別置于AlCl3 濃度為25iiunol/L的CaCl2溶液中。處理16小時(shí)之后，測(cè)量{共試植株根的生長量，重復(fù) 三次，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖ll所示。從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出，野生型煙草在25)Lmiol/L的鋁脅 迫下根相對(duì)生長率只有50%，然而^J^維基因煙草的根相對(duì)生長率卻基本不受影響， 仍然保持在100%左右。進(jìn)一步證明在轉(zhuǎn)基因煙草中過量表;&4M 力能增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植物 對(duì)鋁毒的耐受性。 實(shí)施例11:
轉(zhuǎn)基因煙草植株在鋁毒脅迫下的生長情況分析
將大小均勻一致且生根良好的轉(zhuǎn)基因煙草幼苗以及野生型煙草幼苗移載到新
的珍g基質(zhì)中，在溫室內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗(yàn)，每星期澆灌含有0. 5mM A1CL的Blaydes 培養(yǎng)基營養(yǎng)液兩次，六周后觀察其生長狀況。避W轉(zhuǎn)基因植株生長良好，并且已經(jīng) 出現(xiàn)花蕾。然而野生型煙草植株生長明顯受阻，不僅植株矮小，而且發(fā)育遲緩，沒 有現(xiàn)蕾(圖12)。對(duì)煙草株高的測(cè)量結(jié)果說明在鋁毒脅迫的基質(zhì)中^Jfi^轉(zhuǎn)基因煙草 的株高是野生型煙草的1. 2 1. 5倍?？梢奮MF轉(zhuǎn)基因煙草植株可以有效地增強(qiáng)植 物對(duì)鋁的耐受性?！鯤5: 5， -CACCATGGCGMGGMCCAGTTCGTG-3 ， ■H3: 5， 一CTCGAGTTMGAGAGGCATGAGTAAGCG-3，
權(quán)利要求
1、一種重組植物表達(dá)載體，含有擬南芥細(xì)胞質(zhì)型蘋果酸脫氫酶基因即AMDH基因。
2、 權(quán)利要求1的重組載體，用于構(gòu)建所述植物表達(dá)載體的起始載體為pH2GW7。
3、 權(quán)利要求1的重組載體，其中^MW基因cDNA的上游添加有Rubisco小亞 基的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子PrbcS。
4、 權(quán)利要求l的重組載體，為pH2-35S-PrbcS-避權(quán)在起始載體pH2GW7上連 有啟動(dòng)子PrbcS，其后緊接避W基因。
5、 權(quán)利要求1的重組載體，由下述方法構(gòu)建而成-(1) 從GenBank中査找擬南芥細(xì)胞質(zhì)型^MF的全長基因cDNA序列，并設(shè)計(jì)序 列如下的一對(duì)引物細(xì)H5: 5， -CACCATGGCGMGGMCCAGTTCGTG-3 ，細(xì)H3: 5， -CTCGAGTTMGAGAGGCATGAGTMGCG-3 ， 5，端引物AMDH5， 5，端加CACC特征序列，并由此形成vVco I酶切位點(diǎn)；3， 端引物AMDH3，末端加I酶切位點(diǎn)；以擬南芥第一鏈cDNA為模版擴(kuò)增，得到 基因的全長cDNA;(2) 回收并純化^MW全長基因cDNA片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采 用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pUCm-^M^;(3 )構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-避W，用厥o I和化o I切割 pENTR*-PrbcS-*T"GFP (pENTR*_PrbcS-*T_GFP的構(gòu)建見本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專利申 請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枮?00710066422. 9)和pUCm-避私回收載體pENTR*-PrbcS片段和^MW 基因cDNA片段，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)，獲得重組 質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-/IM^(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-yMF，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把 PrbcS-避好亞克隆到植物表達(dá)載體pH2GW7中，獲得^^7基因的植物表達(dá)載體 pH2-35S-PrbcS-m^。
6、權(quán)利要求1蘋果酸脫氫酶基因皿W的cDNA 5^源于擬南芥，來源于擬南芥的蘋果酸脫氫酶基因觀W的cDNA GenBank登錄號(hào)為AY091220。
7、 權(quán)利要求1的重組植物表達(dá)載體的構(gòu)建方法，其特征在于-(1)從GenBank中査找擬南芥細(xì)胞質(zhì)型，W的全長基因cDNA序列，并設(shè)計(jì)序 列如下的一對(duì)引物細(xì)H5: 5， -CACCATGGCGMGGMCCAGTTCGTG-3 ， 細(xì)H3: 5， -CTCGAGTTMGAGAGGCATGAGTMGCG-3 ， 5，端引物AMDH5， 5，端加CACC特征序列，并由此形成餘ol酶切位 點(diǎn)；3'端引物AMDH3，末端加lol酶切位點(diǎn)；以擬南芥第一鏈cDNA為模版擴(kuò)增， 得到^M^基因的全長cDNA;(2)回收并純化^MF全長基因cDNA片段，并將其連接到pUCm-T載體上，采 用堿裂解法提取質(zhì)粒DNA，通過PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)獲得重組質(zhì)粒pUCm-^MF; > (3 )構(gòu)建入門載體pENTR*-PrbcS-^MF，用I禾卩^ o I切割 pENTR*-PrbcS-*T~GFP (pENTR*_PrbcS-*T~GFP的構(gòu)建見本申請(qǐng)人的另一項(xiàng)專利申 請(qǐng)，申請(qǐng)?zhí)枮?00710066422. 9)和pUCm-避私回收載體pENTR*-PrbcS片段和^4MF 基因cDNA片段，然后連接、轉(zhuǎn)化、抽提質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)和酶切檢測(cè)，獲得重組 質(zhì)粒pENTR*-PrbcS-詹〃；(4)構(gòu)建植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-v4MF，通過Gateway技術(shù)的LR反應(yīng)把 PrbcS-觀肝亞克隆到植物表達(dá)載體pH2GW7中，獲得^MW基因的植物表達(dá)載體 pH2-35S-PrbcS-^4MW。
8、 權(quán)利要求1-5之一的重組植物載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因植株中的應(yīng)用。
9、 權(quán)利要求1-5之一的重組植物載體在制備耐受鋁毒的轉(zhuǎn)基因煙草中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明具體涉及一種提高植物耐鋁毒能力的植物表達(dá)載體pH2-35S-PrbcS-AMDH，其構(gòu)建方法與應(yīng)用，屬于植物基因工程領(lǐng)域。它提高植物耐鋁毒能力的專用載體pH2-35S-PrbcS-AMDH，為含有1，5二磷酸核酮糖羧化酶(Rubisco)小亞基基因的光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子(PrbcS)和擬南芥細(xì)胞質(zhì)蘋果酸脫氫酶(Arabidopsis thaliana cytosolic malate dehydrogenase)基因AMDH的植物表達(dá)載體。從擬南芥中克隆出AMDH基因，用光誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制它在煙草中過量表達(dá)，合成蘋果酸并分泌到細(xì)胞外，從而增強(qiáng)了植物在酸性土壤中對(duì)鋁毒的耐受性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)AMDH基因煙草葉片的蘋果酸脫氫酶活性是野生型煙草的1.4倍。在30μM的鋁毒脅迫下，轉(zhuǎn)AMDH基因煙草能分泌較多的有機(jī)酸，根系生長較好，鋁毒脅迫下的生長情況顯示出轉(zhuǎn)AMDH基因煙草的株高和綠葉片數(shù)目高于野生型。
文檔編號(hào)C12N15/53GK101586116SQ200810233439
公開日2009年11月25日 申請(qǐng)日期2008年10月14日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月14日
發(fā)明者瓊 易, 李昆志, 玉永雄, 王奇峰, 陳麗梅 申請(qǐng)人:昆明理工大學(xué)