擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因ugt76d1在減少植物表面蠟質(zhì)中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種糖基轉(zhuǎn)移酶基因的應(yīng)用，尤其涉及一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1在減少植物表面蠟質(zhì)中的應(yīng)用，屬于基因工程領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002] 蠟質(zhì)是植物表面一層疏水性保護(hù)層，常常包被在植物的葉片、莖桿表面。植物表面 蠟質(zhì)由位于植物表皮的角質(zhì)層外蠟和角質(zhì)層內(nèi)蠟構(gòu)成。蠟質(zhì)在不同的植物組成成分不同， 主要由特長鏈脂肪酸及其衍生物包括烷烴、初級和次級醇、醛、酮以及萜類和微量的次生代 謝產(chǎn)物如類黃酮等化合物組成（Pollard et al.，2008 ;Samuels et al.，2008 ;Li_Beisson et al. , 2013) 〇
[0003] 蠟質(zhì)作為植物表面的疏水屏障，雖然在一定程度上能夠減少水分散失、抵御病蟲 害和防止紫外輻射，但同時(shí)也給農(nóng)業(yè)生產(chǎn)帶來了很多弊端。例如，植物表面蠟質(zhì)影響了葉面 微肥的吸收效率，蠟質(zhì)的存在影響了光的吸收、降低了光合效率，蔬菜莖葉表面的蠟質(zhì)還能 影響口感、降低消化效率，另外，對于觀賞植物而言，表面蠟質(zhì)遮掩了植物本身的翠綠顏色， 影響了觀感，等等。因此，如何減少植物表面蠟質(zhì)，更好地滿足農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的不同需求，也是目 前亟需解決的問題之一。然而，檢索發(fā)現(xiàn)目前的轉(zhuǎn)基因技術(shù)還沒有找到一個(gè)很好的解決方 案。
[0004] 糖基轉(zhuǎn)移酶是專門負(fù)責(zé)催化糖基化修飾反應(yīng)的酶類，擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶家族1中 共有119個(gè)可能的糖基轉(zhuǎn)移酶。雖然這些糖基轉(zhuǎn)移酶基因的序列已公開于核酸序列數(shù)據(jù) 庫中，但是這些糖基轉(zhuǎn)移酶基因的特殊功能還遠(yuǎn)遠(yuǎn)沒有被揭示，如擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶家族1 中的UGT76D1基因能夠創(chuàng)造出表面蠟質(zhì)減少的轉(zhuǎn)基因植物的功能和應(yīng)用目前未見報(bào)道。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供了 一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1在減少植物表面蠟質(zhì)中的應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明所述擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1在減少植物表面蠟質(zhì)中的應(yīng)用。
[0007] 其中：所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1的核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示。所述植 物優(yōu)選是十字花科植物，所述十字花科植物優(yōu)選是擬南芥、油菜、白菜、甘藍(lán)或芥菜。
[0008] 本發(fā)明利用SEQ ID No. 3和SEQ ID No. 4所示的引物序列，通過RT-PCR技術(shù)從擬 南芥中克隆糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1，然后利用該基因構(gòu)建植物過表達(dá)載體，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基 因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測表明該轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)明顯減少（見圖1、圖2、圖3、圖 4)〇
[0009] 本發(fā)明實(shí)施后可能帶來的有益效果：
[0010] 實(shí)驗(yàn)證實(shí)，應(yīng)用本發(fā)明所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作，可以 減少轉(zhuǎn)基因植物的表面蠟質(zhì)。這一新技術(shù)對于增強(qiáng)植物葉面微肥的吸收效率、增強(qiáng)光能吸 收和植物光合效率、增加產(chǎn)量、改善蔬菜在食用過程中的口感、增加觀賞植物的翠綠顏色和 提高觀感，都將帶來有益效果，對于植物新品種開發(fā)生產(chǎn)具有重要意義。
【附圖說明】
[0011] 圖I. UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的實(shí)物照片（證據(jù)之一）。
[0012] 其中WT為對照植物，OE-I和OE-2為兩個(gè)UGT76D1轉(zhuǎn)基因的過表達(dá)株系。對照植 物和過表達(dá)株系正常培養(yǎng)6周后，發(fā)現(xiàn)過表達(dá)株系均表現(xiàn)莖葉表面翠綠色，蠟質(zhì)減少。
[0013] 圖2. UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的實(shí)物照片（證據(jù)之二）。
[0014] 葉片經(jīng)過苯胺藍(lán)染色以后，兩個(gè)過表達(dá)株系更容易著色，進(jìn)一步證明表面蠟質(zhì)減 少，增加了染色劑的滲入。
[0015] 圖3. UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的實(shí)物照片------莖桿表面掃描電子顯 微鏡結(jié)果（證據(jù)之三）。
[0016] 其中WT為對照植物，OE-I和OE-2為兩個(gè)過表達(dá)株系。實(shí)驗(yàn)材料是正常生長2周 的擬南芥對照植物和兩個(gè)過表達(dá)株系。結(jié)果顯示兩株過表達(dá)系莖桿表面蠟質(zhì)顯著減少（表 面白色顆粒狀結(jié)構(gòu)）。
[0017] 圖4.葉綠素提取率結(jié)果圖（UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的證據(jù)之四）。
[0018] 葉綠素提取實(shí)驗(yàn)，其中WT為對照植物，OE-I和0E-2為兩個(gè)過表達(dá)株系。由葉綠 素提取率結(jié)果表明，由于表面蠟質(zhì)的減少，兩個(gè)過表達(dá)株系的葉綠素提取率明顯高于對照。 闡明UGT76D1基因在減少蠟質(zhì)方面具有新應(yīng)用。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 實(shí)施例1克隆擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1
[0020] 1.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1的克隆
[0021] 通過公開網(wǎng)站http://www. cazy. org獲得UGT76D1基因的cDNA序列。根據(jù)cDNA序 列設(shè)計(jì)引物，正向引物為 76D1-F:5' -CGGGATCCATGGCAGAGATTCGCCAG-3'，反向引物為7601- R:5'-CGAGCTCTCATTGTTCGTCAATTTGCATC-3'。利用 TRIzol 試劑盒提取擬南芥RNA，RT-PCR方 法擴(kuò)增UGT76D1基因的全長cDNA序列。將cDNA克隆的過程是先經(jīng)過BamHI和Sac I酶切， 之后連入相應(yīng)酶切的pBluescript II SK(+)載體中，構(gòu)建成測序中間載體，稱為pK76Dl，然 后用載體進(jìn)行基因全長PCR擴(kuò)增和BamHI和Sac I酶切驗(yàn)證，最后進(jìn)行序列測定，驗(yàn)證克隆 序列的正確性。
[0022] 2.擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1的序列信息與特性分析
[0023] UGT76D1基因的編碼區(qū)cDNA為1359bp(核苷酸序列如SEQ ID No. 1所示），編碼 452個(gè)氨基酸（氨基酸序列如SEQ ID No. 2所示）的57. 6kDa蛋白，C端具有44個(gè)氨基酸 的PSPG盒，為植物次生代謝物糖基轉(zhuǎn)移酶所共同具有的保守序列。
[0024] 實(shí)施例2擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因 UGT76D1的轉(zhuǎn)基因應(yīng)用
[0025] 1.含有UGT76D1編碼區(qū)cDNA表達(dá)載體的構(gòu)建
[0026] pK76Dl中間測序載體經(jīng)過BamHI和Sac I雙酶切后，獲得帶有酶切粘性末端的全 長cDNA序列。將此基因片段與用相應(yīng)酶酶切后的pBI121載體部分相連，得到以CaMV 35S 啟動子驅(qū)動糖基轉(zhuǎn)移酶基因過表達(dá)的植物表達(dá)載體，稱為PBI76D1。
[0027] 2.農(nóng)桿菌介導(dǎo)植物轉(zhuǎn)化
[0028] 農(nóng)桿菌GV3101具有侵染植物和轉(zhuǎn)移基因的能力，故將構(gòu)建的UGT76D1植物表達(dá)載 體（PBI76D1)轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌，然后進(jìn)行PCR驗(yàn)證和酶切驗(yàn)證。利用浸花法（一種公開的常規(guī) 方法），使含有植物表達(dá)載體的農(nóng)桿菌GV3101浸染擬南芥花蕾。待其長出的角果成熟之后， 收集Tl代種子并在篩選培養(yǎng)基（MS培養(yǎng)基附加30mg/L卡那霉素）上進(jìn)行篩選，將能夠正 常生長的綠色轉(zhuǎn)化苗移栽至營養(yǎng)土中培養(yǎng)，分別收獲其T2代種子再進(jìn)行下一輪的卡那霉 素篩選，挑選出綠苗：白苗為3 :1的培養(yǎng)皿。將此培養(yǎng)皿上的綠苗移栽，單株收獲種子（T3 代）。對每一單株的種子部分用于卡那霉素平皿篩選，直到選出在篩選培養(yǎng)基上為全綠的株 系，即為純合轉(zhuǎn)基因株系。
[0029] 3.轉(zhuǎn)基因植株分子鑒定
[0030] 對上述轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行基因表達(dá)水平的檢測。分別提取轉(zhuǎn)基因植株和野生型 植株的RNA，反轉(zhuǎn)錄后進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，分析過表達(dá)植株和野生型植株的基因表達(dá)差異。 UGT76D1在過表達(dá)植株中的表達(dá)量都明顯高于野生型植株。利用兩個(gè)UGT76D1表達(dá)量高的 株系，即OE-I、OE-2,來進(jìn)行后續(xù)的工作。
[0031] 4. UGT76D1基因減少植物表面蠟質(zhì)功能驗(yàn)證
[0032] (1)UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的證據(jù)之一。
[0033] 對照植物和過表達(dá)株系正常培養(yǎng)6周后，肉眼即可觀察到過表達(dá)株系均表現(xiàn)莖葉 表面翠綠色，蠟質(zhì)減少。見圖1，其中WT為對照植物，OE-I和OE-2為兩個(gè)UGT76D1轉(zhuǎn)基因 的過表達(dá)株系。
[0034] (2)UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的證據(jù)之二。
[0035] 葉片經(jīng)過苯胺藍(lán)染色以后，兩個(gè)過表達(dá)株系更容易著色，進(jìn)一步證明表面蠟質(zhì)減 少，增加了染色劑的滲入。見圖2。
[0036] (3)UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的證據(jù)之三。
[0037] 莖桿表面進(jìn)行掃描電子顯微鏡觀察，實(shí)驗(yàn)材料是正常生長2周的擬南芥對照植物 和兩個(gè)過表達(dá)株系。選取生長狀態(tài)一致同高度莖段，掃描電子顯微鏡檢測莖桿表面蠟質(zhì)，結(jié) 果發(fā)現(xiàn)兩株過表達(dá)系莖桿表面蠟質(zhì)顯著減少，見圖3,蠟質(zhì)為表面白色顆粒狀結(jié)構(gòu)，WT為對 照植物，OE-I和OE-2為兩個(gè)過表達(dá)株系。
[0038] (4)UGT76D1轉(zhuǎn)基因植物表面蠟質(zhì)減少的證據(jù)之四。
[0039] 葉綠素提取實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)材料是正常生長2周的擬南芥對照植物和兩個(gè)過表達(dá)株 系。選取生長狀態(tài)一致的植株，剪取地上葉子，浸沒于80 %的乙醇，每隔20min在647nm和 664nm處測定溶液的吸光度，計(jì)算葉綠素提取率。結(jié)果見圖4,由于表面蠟質(zhì)的減少，兩個(gè)過 表達(dá)株系的葉綠素提取率明顯高于對照。WT為對照植物，OE-I和0E-2為兩個(gè)過表達(dá)株系。 再次證明UGT76D1基因在減少蠟質(zhì)方面的新功用。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI76D1在減少植物表面蠟質(zhì)中的應(yīng)用。2. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGI76D1的核苷酸序 列如SEQ ID No. 1所示。3. 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于：所述植物是十字花科植物。4. 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述十字花科植物是擬南芥、油菜、白菜、甘 藍(lán)或芥菜。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT76D1在減少植物蠟質(zhì)中的應(yīng)用，其中所述糖基轉(zhuǎn)移酶基因UGT76D1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。本發(fā)明利用基因UGT76D1構(gòu)建植物過表達(dá)載體，進(jìn)行植物轉(zhuǎn)基因操作，獲得轉(zhuǎn)基因植物。檢測表明該轉(zhuǎn)基因植物蠟質(zhì)顯著減少，預(yù)示本發(fā)明實(shí)施后將對增強(qiáng)植物葉面微肥的吸收效率、增強(qiáng)光能吸收和植物光合效率、增加產(chǎn)量、改善蔬菜在食用過程中的口感、增加觀賞植物的翠綠顏色和提高觀感，都將帶來有益效果，對于植物新品種開發(fā)生產(chǎn)具有重要意義。
【IPC分類】C12N15/54, C12N15/84, A01H5/00
【公開號】CN104975033
【申請?zhí)枴緾N201510319744
【發(fā)明人】侯丙凱, 黃戌戌, 李燕潔
【申請人】山東大學(xué)
【公開日】2015年10月14日
【申請日】2015年6月11日