一種優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其在制備異槲皮素中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其在制備異槲皮素中的應(yīng)用。
[0002]
【背景技術(shù)】
[0003]黃酮類化合物廣泛存在于銀杏、槐米、沙棘、桉樹、黃芩等多種植物中，具有廣泛的藥理活性，包括抗氧化、抗炎、抗過(guò)敏、抗菌、免疫調(diào)節(jié)和保護(hù)心血管等功效。研宄表明，與蘆丁、槲皮素相比，異槲皮素(槲皮素-3-0-葡萄糖苷)在多個(gè)方面具有更強(qiáng)的生物活性。如異槲皮素在抑制惡性腫瘤增殖活性、抑制HIV-1和HSV-1/2的活性等方面均優(yōu)于蘆丁和槲皮素，在抑制乙酰膽堿酯酶活性方面優(yōu)于槲皮素。因而，異槲皮素在抗癌、抗阿爾茲海默癥、抗HIV等方面具有巨大的應(yīng)用潛力。其次，異槲皮素具有更好的生物利用度。異槲皮素有著適宜的分子極性，相比槲皮素具有更好的水溶性，相比蘆丁具有更高的腸上皮吸收率。Duenas和Makino等比較了槲皮素及其糖苷經(jīng)口服給藥在大鼠體內(nèi)的生物利用度，結(jié)果顯示異槲皮素的生物利用度顯著高于槲皮素及蘆丁。至目前為止，異槲皮素是唯一被FDA批準(zhǔn)作為安全可供食用的食品添加劑。顯然，異槲皮素在食品、保健品領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景，也成為新藥研宄的熱點(diǎn)。
[0004]目前制備異槲皮素主要通過(guò)提取分離和蘆丁降解。發(fā)明專利(公開號(hào):CN1355797A)公開了一種從生物類黃酮中回收異槲皮素的方法，但異槲皮素天然平均含量很低，通過(guò)提取分離手段制備難度大、產(chǎn)率低、成本高。發(fā)明專利(授權(quán)公告:CN 1261585C)公開了一種酶法水解蘆丁制備異槲皮素和槲皮素的方法，但獲得的是異槲皮素和槲皮素的混合物。利用轉(zhuǎn)糖基酶以槲皮素為底物，通過(guò)轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)生成異槲皮素是有效的方法(圖1)，但轉(zhuǎn)糖基酶可以在槲皮素的3位，5位，7位，3’位和4’位任何一個(gè)或多個(gè)位置轉(zhuǎn)糖基，生產(chǎn)多種糖基化槲皮素。如何選擇合適的轉(zhuǎn)糖基酶，專一性的在3位添加葡萄糖基是研宄的關(guān)鍵問(wèn)題。
[0005]本發(fā)明是利用來(lái)源于擬南芥的轉(zhuǎn)糖基酶，并對(duì)該酶基因按照大腸桿菌的優(yōu)勢(shì)密碼子進(jìn)行優(yōu)化，克隆表達(dá)，構(gòu)建重組基因工程菌，利用該工程菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素，并通過(guò)乙酸乙酯抽提，獲得純度達(dá)到99.9% (HPLC)的異槲皮素。
[0006]

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]解決的技術(shù)問(wèn)題:本發(fā)明提供了一種優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其在制備異槲皮素中的應(yīng)用，利用重組大腸桿菌所攜帶的重組質(zhì)粒能高效表達(dá)轉(zhuǎn)糖基酶AP73B3，該轉(zhuǎn)糖基酶能特異性的轉(zhuǎn)化槲皮素生產(chǎn)異槲皮素。
[0008]技術(shù)方案:優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因，核苷酸序列如SEQ NO: 3所示。
[0009]包含上述優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組質(zhì)粒。
[0010]一種重組大腸桿菌，由上述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 DE3而得。
[0011]上述優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因在制備異槲皮素中應(yīng)用。
[0012]上述重組大腸桿菌在異槲皮素制備中的應(yīng)用。
[0013]上述重組大腸桿菌制備異槲皮素的具體方法為:將重組大腸桿菌以體積比1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)0D_至0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG至0.2 mM，葡萄糖至2wt.%，槲皮素至0.5 g/L，20°C，160 rpm全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h ;將上述轉(zhuǎn)化液離心，取上清，加入I倍體積的乙酸乙酯抽提2次，得異槲皮素。
[0014]有益效果:1.本發(fā)明所用的糖基轉(zhuǎn)移酶專一性高，可以特異性轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素。2.本發(fā)明所述的異槲皮素生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，所得的異槲皮素純度高。
【附圖說(shuō)明】
[0015]圖1槲皮素和異槲皮素結(jié)構(gòu)示意圖；
圖2轉(zhuǎn)化條件對(duì)重組菌生成異槲皮素的影響a:誘導(dǎo)劑IPTG用量對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素的影響；b:轉(zhuǎn)化溫度對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素的影響；c:葡萄糖濃度對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素的影響；
圖3為實(shí)施例3的槲皮素和異槲皮素的高效液相圖譜A:槲皮素的標(biāo)樣:異槲皮素的標(biāo)樣；C:重組菌產(chǎn)異槲皮素的高效液相圖譜。
[0016]
【具體實(shí)施方式】
[0017]下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例僅為本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例。基于本發(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒(méi)有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0018]為了進(jìn)一步理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)闡述，其中，如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)施例中涉及的各種反應(yīng)試劑均可以通過(guò)商業(yè)渠道購(gòu)買得到；如無(wú)特殊說(shuō)明，實(shí)施例中涉及的具體操作參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南第三版》。
[0019]實(shí)施例1:
1.重組質(zhì)粒PGEX-2T-0PAP73B3的構(gòu)建
1.1擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因似的優(yōu)化
參考NCBI已經(jīng)發(fā)布的擬南芥UrahWoASi1S糖基轉(zhuǎn)移酶73B3 (AP 73B3)
的cDNA序列，得到糖基轉(zhuǎn)移酶AP 73B3的核苷酸序列信息，如SEQ NO:1所示，氨基酸序列如SEQ NO:2所示。按照大腸桿菌K12優(yōu)勢(shì)密碼子表(http://www.kazusa.0r.jp/codon/)對(duì)糖基轉(zhuǎn)移酶AP 73B3的基因序列進(jìn)行優(yōu)化，選擇氨基酸同義密碼子使用頻率高的密碼子作為優(yōu)勢(shì)密碼子，最終獲得優(yōu)化后的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因(opap73B3、序列信息，如SEQNO:3所示，獲得序列信息后，由上海捷瑞生物工程有限公司合成，獲得優(yōu)化后的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因似，氨基酸序列如SEQ NO:4所示。
[0020]1.2 重組質(zhì)粒 PGEX-2T-0PAP73B3 的構(gòu)建按照優(yōu)化后的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因OA3/77JA5序列設(shè)計(jì)引物。引物序列如SEQ NO:5和SEQ N0:6所示；以合成的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因似為模板，用合成的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增的條件是95°C，5 min ;暫停計(jì)時(shí)，加Pyrobest聚合酶，加40 μ L石錯(cuò)油密封；35 次循環(huán)(94°C，50 s;51°C，90 s;72°C，1.0 min );72°C，10 min ;反應(yīng)停止，4°C保溫。通過(guò)凝膠回收試劑盒對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，得到優(yōu)化后的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因opap73B3o
[0021]得到優(yōu)化后的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因opeip73B:m pGEX_2T分別用BamH I和EcoRI雙酶切，并分別割膠回收，16°C過(guò)夜連接；將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌ToplOF’感受態(tài)細(xì)胞，篩選陽(yáng)性克隆，進(jìn)行序列分析；挑選序列正確的克隆提取質(zhì)粒，獲得擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因核苷酸序列的重組質(zhì)粒PGEX-2T-0PAP73B3。
[0022]2.重組菌生成異槲皮素的轉(zhuǎn)化條件研宄
2.1槲皮素及異槲皮素的測(cè)定
槲皮素及異槲皮素的測(cè)定采用HPLC方法測(cè)定，HPLC測(cè)定的條件為:Agilent 1260Infinity ;DAD檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)為368 nm，柱溫為40°C，流動(dòng)相流速為0.8 mL/min (A:甲醇，B: 1% 甲酸水；0 min, A:B 為 50:50 ；12 min, A:B 為 62:38 ；25 min, A:B 為 50:50.)
2.2誘導(dǎo)劑IPTG用量對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素的影響將重組質(zhì)粒PGEX-2T-0PAP73B3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑單菌落到LB試管過(guò)夜培養(yǎng)，將該菌以體積比1%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)0D_至0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG分別為0，0.05，0.1，0.2，0.4和 0.8 mM，槲皮素至0.5 g/L，30°C，160 rpm全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h，分別測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)0.2 mM IPTG轉(zhuǎn)化率最高。
[0023]2.3葡萄糖濃度對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素的影響
將重組質(zhì)粒PGEX-2T-0PAP73B3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑單菌落到LB試管過(guò)夜培養(yǎng)，將該菌以1%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)OD6c?至0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG為0.2禮，槲皮素至0.5 g/L，葡萄糖濃度分別為0，2，2.5和4%，30°C，160 rpm全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h，分別測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加2%的葡萄糖轉(zhuǎn)化率最高。
[0024]2.4轉(zhuǎn)化溫度對(duì)重組菌轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素的影響
將重組質(zhì)粒PGEX-2T-0PAP73B3轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)，挑單菌落到LB試管過(guò)夜培養(yǎng)，將該菌以1%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)OD6c?至0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG為0.2mM,槲皮素至0.5 g/L,葡萄糖濃度為2%，轉(zhuǎn)化溫度分別為16，20，30和37°C，160 rpm全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h，分別測(cè)定轉(zhuǎn)化率，結(jié)果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化溫度為20°C葡萄糖轉(zhuǎn)化率最高。
[0025]3.異槲皮素的制備及抽提
將該重組菌以體積比1%接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)OD6c?至0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG至0.2禮，葡萄糖至2 wt.%，槲皮素至0.5 g/L, 20°C, 160 rpm全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h。將上述轉(zhuǎn)化液離心，取上清，加入I倍體積的乙酸乙酯抽提2次，合并抽提液，并風(fēng)干，加入甲醇，測(cè)定異槲皮素的純度，結(jié)果表明異槲皮素的純度到達(dá)99.9%，得率為90%。
[0026]經(jīng)本發(fā)明優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因表達(dá)的酶只能在3位添加葡萄糖，圖3所示HPLC結(jié)果證明該酶是在3位添加葡萄糖基。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因，其特征在于核苷酸序列如SEQN0:3所示。2.包含權(quán)利要求1所述優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因的重組質(zhì)粒。3.—種重組大腸桿菌，其特征在于由權(quán)利要求2所述的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21DE3而得。4.權(quán)利要求1所述優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因在制備異槲皮素中應(yīng)用。5.權(quán)利要求3所述重組大腸桿菌在異槲皮素制備中的應(yīng)用。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于將重組大腸桿菌以體積比1%的接種量接種于LB培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)OD6tltl至0.8，添加誘導(dǎo)劑IPTG至0.2禮，葡萄糖至2 wt.%，槲皮素至0.5 g/L，20°C，160 rpm全細(xì)胞轉(zhuǎn)化36 h ;將上述轉(zhuǎn)化液離心，取上清，加入I倍體積的乙酸乙酯抽提2次，得異槲皮素。
【專利摘要】一種優(yōu)化的擬南芥糖基轉(zhuǎn)移酶基因及其在制備異槲皮素中的應(yīng)用，核苷酸序列如SEQ NO:3所示。本發(fā)明所用的糖基轉(zhuǎn)移酶專一性高，可以特異性轉(zhuǎn)化槲皮素生成異槲皮素，所提供的異槲皮素生產(chǎn)方法簡(jiǎn)單，所得的異槲皮素純度高。
【IPC分類】C12N15/54, C12N15/70, C12N1/21, C12P19/60
【公開號(hào)】CN104988164
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510439518
【發(fā)明人】裴建軍, 趙林果, 董萍, 吳濤
【申請(qǐng)人】南京林業(yè)大學(xué)
【公開日】2015年10月21日
【申請(qǐng)日】2015年7月23日