專利名稱：一種純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本實(shí)用新型涉及一種純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。 技術(shù)背景
磁小體主要由微生物合成的Fe304晶體，質(zhì)膜和蛋白質(zhì)構(gòu)成，顆粒大小在 40-50rnn之間，分散性好，磁性強(qiáng)，生物相容性好，所以它是一種很理想的 生物納米材料。目前納米磁性顆粒在生物醫(yī)學(xué)診斷和納米科學(xué)方面的應(yīng)用引 起了極大的關(guān)注。例如，納米磁性顆粒被用于體外蛋白和核酸的檢測(cè)，體內(nèi) 細(xì)胞表面和細(xì)胞質(zhì)蛋白的檢測(cè)，分子檢測(cè)信號(hào)的加強(qiáng)，核磁共振成像，高靈 敏度的磁性檢測(cè)試劑，制備磁性細(xì)胞并分離純化目的細(xì)胞，用于金屬處理和 污水回收。到目前為止，人工合成的納米磁顆粒被廣泛地應(yīng)用于上述領(lǐng)域， 然而其分散性，顆粒的均一度，磁性，生物相容性并不能完全符合上述領(lǐng)域 嚴(yán)格要求。磁小體與人工納米磁性顆粒相比，顆粒均勻，磁性強(qiáng)，分散性和 生物相容性好，使得磁小體在生物及醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用前景更為廣闊。由于磁 小體的脂膜中還含有大量的蛋白，這些蛋白可以為抗體的連接提供了很好的 位點(diǎn)。磁小體在免疫檢測(cè)方面的應(yīng)用與傳統(tǒng)方法相比有著很高的靈敏度。但 是，磁小體的膜蛋白有可能在體內(nèi)引起非正常的免疫反應(yīng)，這使得磁小體作 為抗癌藥物載體和基因治療載體受到了限制。目前大部分研究者所使用的純 化磁小體的方法只適用于少量磁小體的提取。
綜上所述，細(xì)菌磁小體的應(yīng)用前景廣泛，成本低廉。但是，它的應(yīng)用還 受到一些條件的限制，其一是磁細(xì)菌培養(yǎng)困難，無(wú)法獲得大量的材料(本試 驗(yàn)室的前期工作已將此問(wèn)題解決)，其二是磁小體的大量快速純化。目前磁小體純化提取存在的問(wèn)題是，1)離心收集菌體，不適用于工業(yè)化生
產(chǎn)。2)使用高壓均質(zhì)機(jī)或細(xì)胞超聲破碎儀破碎細(xì)胞，細(xì)胞超聲破碎儀的功率 太高可能會(huì)使磁小體質(zhì)膜受到損傷。3)將破碎好的細(xì)胞放置在容器內(nèi)，容器 外底部放置磁鐵，利用磁鐵的磁性將磁小體和細(xì)胞碎片分離開，此過(guò)程所用 時(shí)間的可能會(huì)相當(dāng)長(zhǎng)并且效率低。4)當(dāng)磁小體被分離后，棄去上清，將磁小 體重懸于緩沖溶液中，使用低功率的超聲波輕擊打，再用磁鐵吸附，棄上清。 此步驟重復(fù)20次以上。此過(guò)程完全人工處理，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。5)此方法只適用于 實(shí)驗(yàn)室小規(guī)模提取純化磁小體，幾乎不能實(shí)現(xiàn)磁小體的商業(yè)化應(yīng)用。
發(fā)明內(nèi)容
本實(shí)用新型針對(duì)上述問(wèn)題，采用磁性層析裝置分離純化磁小體，提供了 一種全新的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)。避免了傳統(tǒng)純化方法的各種缺點(diǎn)，破碎 細(xì)胞和磁小體的分離同時(shí)進(jìn)行，即破碎好的細(xì)胞直接流入磁性層析裝置。當(dāng) 細(xì)胞破碎完，磁小體的分離也基本完成，這一步所用的時(shí)間只用了相當(dāng)于傳 統(tǒng)方法破碎細(xì)胞的時(shí)間，節(jié)省了離心和菌液重懸時(shí)間。在整個(gè)純化過(guò)程中只 有在磁小體需要過(guò)磁性層析裝置時(shí)才需要使用細(xì)胞超聲破碎儀打散分散。而 磁小體達(dá)到純化要求，最多需要過(guò)5次磁性層析裝置。與傳統(tǒng)方法相比，減 少細(xì)胞超聲破碎儀的作用時(shí)間和次數(shù)，使磁小體的質(zhì)膜受到損傷的可能性降 到了最低。而且磁小體純化效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)磁小體純化的半自動(dòng)化，操作
安全方便，性能穩(wěn)定可靠。本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的
一種純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，主要包括發(fā)酵罐l，高壓均質(zhì)機(jī)3、細(xì)胞超 聲破碎儀16,其特征在于，高壓均質(zhì)機(jī)3通過(guò)管道連接一個(gè)三相通路接頭的 一端，此通路接頭的其余兩端分別通過(guò)管道與蠕動(dòng)泵6和儲(chǔ)液槽4相連接， 其中與儲(chǔ)液槽4相連接的管道上裝有可開關(guān)閥門5，蠕動(dòng)泵6的另一端與磁 性層析裝置18的下端接口 24相通，磁性層析裝置18的下端還有一個(gè)接口25與蠕動(dòng)泵7連接，蠕動(dòng)泵7通過(guò)裝有可開關(guān)閥門8的管道與儲(chǔ)液槽4連接， 并且通過(guò)一個(gè)三相通路接頭與閥門9連接，閥門9的另一端與細(xì)胞超聲破碎 儀16相連，細(xì)胞超聲破碎儀16另一端與蠕動(dòng)泵15連接，蠕動(dòng)泵15的另一 端與電洗脫儀11連接，電洗脫儀11的另一端與蠕動(dòng)泵14連接，蠕動(dòng)泵14 的另一端通往磁力攪拌器12的底部，磁性層析裝置18的上端有兩個(gè)端口分 別與兩個(gè)閥門17和19連接。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的分離純化磁小體的磁性層析裝 置18包括，用于洗脫吸附層析柱上磁小體的超聲水槽26，使層析系統(tǒng)帶有 磁性的永磁鐵22和可吸附磁小體的層析柱20;該永磁鐵22設(shè)置在超聲水槽 26的一側(cè)槽壁上，層析柱20豎直固定于永磁鐵22上，永磁鐵22在層析柱 20和超聲水槽26之間，形成夾心結(jié)構(gòu)。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的層析柱20是由一個(gè)內(nèi)置鐵珠 21的塑料圓柱體，該圓柱體一端有兩個(gè)接口 24和25并且內(nèi)部裝置一個(gè)塑料 網(wǎng)23，另一端有一個(gè)接口 27。塑料網(wǎng)23可防止鐵珠堵塞接口 24和25。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的電洗脫儀11包括電洗脫槽31， 其兩端有接口 30用于連接降低槽內(nèi)溫度的水循環(huán)系統(tǒng)28，其中電洗脫槽31 的底部中間部位有可裝卸永磁鐵32的插槽33。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的磁力攪拌器12帶有可控速旋鈕 和開關(guān)，其上置容器的底端與蠕動(dòng)泵14連接，容器的口部分別由管道與蠕動(dòng) 泵10和13連接。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的發(fā)酵罐1通過(guò)閥門2連接高壓 均質(zhì)機(jī)3。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的儲(chǔ)液槽4由塑料或有機(jī)玻璃材 料制成，其內(nèi)部被分成幾個(gè)可儲(chǔ)存不同液體的單元格，用于儲(chǔ)存各種緩沖溶 液和磁小體懸液；儲(chǔ)液槽4帶有控溫儀。儲(chǔ)液槽4不應(yīng)使用鋼鐵等易銹蝕具有磁性的金屬材料，以防止金屬磁性材料剝落影響磁小體的純化質(zhì)量和磁性 層析裝置的吸附效率。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的管道為硅膠管。
上述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)中，所述的鐵珠21的直徑為4mm-6mm 。 本實(shí)用新型與經(jīng)典的磁小體純化提取方法(Li xiang， Jiang Wei， Sun
Jianbo et al， 2007, Lett, in Appl. Micro. 45 (1): 75-81)相比具有如
下優(yōu)點(diǎn)
1. 本系統(tǒng)中磁性層析裝置的設(shè)置，可快速、高效地純化磁小體，使磁小體與 細(xì)菌細(xì)胞的其它物質(zhì)成分快速分離。帶有鐵珠的層析柱在磁小體純化過(guò)程 中起到重要的作用，使得快速純化磁小體成為可能，減少了細(xì)胞超聲破碎 儀的作用時(shí)間和次數(shù)，使磁小體的質(zhì)膜受到損傷的可能性降到了最低。
2. 電洗脫儀可以快速洗脫磁小體膜上所吸附的和膜結(jié)合不緊密的蛋白，電洗 脫儀使用簡(jiǎn)單的電泳儀即可，洗脫方式簡(jiǎn)單，每次洗脫只需使用15-30分 鐘。在經(jīng)過(guò)電洗脫后磁小體的膜還保持完整。
3. 本系統(tǒng)操作安全方便、性能穩(wěn)定可靠，能夠?qū)崿F(xiàn)磁小體純化的半自動(dòng)化， 目前在國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有此類設(shè)備，造價(jià)低廉。


圖1為本實(shí)用新型一種純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖2為本實(shí)用新型的磁性層析裝置18的結(jié)構(gòu)示意圖； 圖3為本實(shí)用新型的電洗脫儀11的結(jié)構(gòu)示意圖。
具體實(shí)施方式
以下通過(guò)附圖和實(shí)施例對(duì)本實(shí)用新型做進(jìn)一步的說(shuō)明
圖中1為發(fā)酵罐，3為均質(zhì)機(jī)，4為儲(chǔ)液槽，18為磁性層析裝置，16為細(xì)胞超聲破碎儀，ll為電洗脫儀，12為磁性攪拌裝置，6、 7、 10、 13、 14、 15為蠕動(dòng)泵，2、 5、 8、 9、 17、 19為閥門，20為層析柱，21為鐵珠，22為 永磁鐵，23為塑料網(wǎng)，24、 25、 27為接口， 26為超聲水槽，28為水循環(huán)系 統(tǒng)，29為電極接口， 30為接口， 31為電洗脫槽，33為插槽，32為可裝卸永 磁鐵。
如圖l、 2和圖3所示，本連續(xù)、規(guī)?；兓?xì)菌磁小體的系統(tǒng)主要包括 發(fā)酵罐1，高壓均質(zhì)機(jī)3、細(xì)胞超聲破碎儀16，發(fā)酵罐1通過(guò)閥門2連接高 壓均質(zhì)機(jī)3，高壓均質(zhì)機(jī)3通過(guò)管道連接一個(gè)三相通路接頭的一端，此通路 接頭的其余兩端分別通過(guò)管道與蠕動(dòng)泵6和儲(chǔ)液槽4相連接，其中與儲(chǔ)液槽 4相連接的管道上裝有可開關(guān)閥門5，蠕動(dòng)泵6的另一端與磁性層析裝置18 的下端接口 24相通，磁性層析裝置18的下端還有一個(gè)接口 25與蠕動(dòng)泵7連 接，蠕動(dòng)泵7通過(guò)裝有可開關(guān)閥門8的管道與儲(chǔ)液槽4連接，并且通過(guò)一個(gè) 三相通路接頭與閥門9連接，閥門9的另一端與細(xì)胞超聲破碎儀16相連，細(xì) 胞超聲破碎儀16另一端與蠕動(dòng)泵15連接，蠕動(dòng)泵15的另一端與電洗脫儀 11連接，電洗脫儀11的另一端與蠕動(dòng)泵14連接，蠕動(dòng)泵14的另一端通往 磁力攪拌器12的底部，磁性層析裝置18的上端有兩個(gè)端口分別與兩個(gè)閥門 17和19連接。
本系統(tǒng)的核心部分是分離純化磁小體的磁性層析裝置18，它包括，用于 洗脫吸附層析柱上磁小體的超聲水槽26，使層析系統(tǒng)帶有磁性的永磁鐵22 和可吸附磁小體的層析柱20;該永磁鐵22設(shè)置在超聲水槽26的一側(cè)槽壁上， 層析柱20豎直固定于永磁鐵22上，永磁鐵22在層析柱20和超聲水槽26之 間，形成夾心結(jié)構(gòu)。
層析柱20為磁性層析裝置18的關(guān)鍵部分，它是一個(gè)內(nèi)置鐵珠21的塑料 圓柱體，該圓柱體一端有兩個(gè)接口24和25并且內(nèi)部裝置一個(gè)塑料網(wǎng)23，另 一端有一個(gè)接口 27。塑料網(wǎng)23可防止鐵珠堵塞接口 24和25。本系統(tǒng)的電洗脫儀11包括電洗脫槽31，其兩端有接口 30用于連接降低 槽內(nèi)溫度的水循環(huán)系統(tǒng)28，其中電洗脫槽31的底部中間部位有可裝卸永磁 鐵32的插槽33。
本系統(tǒng)的磁力攪拌器12帶有可控速旋鈕和開關(guān)，其上置容器的底端與蠕 動(dòng)泵14連接，容器的口部分別由管道與蠕動(dòng)泵10和13連接。
本系統(tǒng)的儲(chǔ)液槽4由塑料或有機(jī)玻璃材料制成，其內(nèi)部被分成幾個(gè)可儲(chǔ) 存不同液體的單元格，用于儲(chǔ)存各種緩沖溶液和磁小體懸液；儲(chǔ)液槽4帶有 控溫儀。儲(chǔ)液槽4不應(yīng)使用鋼鐵等易銹蝕具有磁性的金屬材料，以防止金屬 磁性材料剝落影響磁小體的純化質(zhì)量和磁性層析裝置的吸附效率。
本系統(tǒng)中的管道都為硅膠管。
本系統(tǒng)中鐵珠21的直徑為4mm-6mm。
本實(shí)用新型的工作程序是(1)當(dāng)趨磁細(xì)菌發(fā)酵結(jié)束時(shí)，往發(fā)酵罐l加入 PBS緩沖溶液(O.IM， pH6.54)。然后將混合溶液輸入高壓均質(zhì)機(jī)3，破碎細(xì)胞。
(2)啟動(dòng)蠕動(dòng)泵6，打開闊門17用于排出廢液，破碎好的細(xì)胞懸液進(jìn)入 磁性層析裝置18，以分離清洗磁小體。當(dāng)所有的菌體破碎懸液都進(jìn)入到磁性 層析分離系統(tǒng)18并且磁小體被吸附到層析柱上后，廢棄的懸液經(jīng)閥門17被 排出系統(tǒng)。打開閥門5向磁性層析裝置18中泵入6倍體積(這里指柱體積的 6倍，下同)的磷酸鹽緩沖溶液(lOniM， pH 7.2-7.4)，接著泵入6倍體積的 含2M尿素的磷酸鹽溶液，關(guān)閉蠕動(dòng)泵6，閥門5和閥門17。在本實(shí)施例中， 儲(chǔ)液槽4被分隔成四個(gè)槽可用于盛儲(chǔ)不同的溶液。
接通超聲水槽26電源，打開蠕動(dòng)泵7和閥門19使磁小體被泵7泵出的緩 沖溶液帶動(dòng)流出磁性層析系統(tǒng)18，只有在超聲水槽通電工作的時(shí)候，磁小體 與磁性層析系統(tǒng)結(jié)合不緊密，磁小體才能被緩沖溶液從磁性層析系統(tǒng)18沖洗 出來(lái)。打開閥門9，磁小體被蠕動(dòng)泵7泵到超聲細(xì)胞破碎儀16中，超聲分散的參數(shù)設(shè)置為超聲50次，功率20-200W，每次超聲4秒，每?jī)纱纬曋g 間歇6秒；在磁小體被超聲分散之后，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵7將磁小體懸液泵入磁性 層析裝置18中，并打開閥門5和17，關(guān)閉閥門19，啟動(dòng)蠕動(dòng)泵6，用磷酸 鹽緩沖溶液洗脫；接著再將磁小體洗脫至超聲細(xì)胞破碎儀16中進(jìn)行超聲分 散。重復(fù)上述操作4一5次。
(3) 最后打開閥門8和19關(guān)閉閥門17， 9和5，把蛋白酶K加入到儲(chǔ) 液槽4中，用蛋白酶k消化磁小體膜上的蛋白，消化溫度5(TC，保溫卜3小 時(shí)；打開蠕動(dòng)泵15，打開閥門9，關(guān)閉閥門5， 17， 19。將磁小體泵入電洗 脫儀ll進(jìn)行電洗脫，并打開水循環(huán)系統(tǒng)28，洗脫電壓控制在100-400mA之 間。
(4) 打開蠕動(dòng)泵14將磁小體泵入磁性攪拌裝置12，關(guān)閉蠕動(dòng)泵14。打開 蠕動(dòng)泵10將純水泵入磁性攪拌系統(tǒng)12中，靜置20分鐘使磁小體吸附在磁性層 析系統(tǒng)底部，打開泵13將上層的溶液泵出。重復(fù)本步驟3次。
最后所應(yīng)說(shuō)明的是，以上實(shí)施例僅用以說(shuō)明本發(fā)明技術(shù)方案而非限制， 盡管參照較佳實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)說(shuō)明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng) 理解，可以對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技 術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。
權(quán)利要求1. 一種純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，主要包括發(fā)酵罐(1)，高壓均質(zhì)機(jī)(3)、細(xì)胞超聲破碎儀(16)，其特征在于，高壓均質(zhì)機(jī)(3)通過(guò)管道連接一個(gè)三相通路接頭的一端，此通路接頭的其余兩端分別通過(guò)管道與蠕動(dòng)泵(6)和儲(chǔ)液槽(4)相連接，其中與儲(chǔ)液槽(4)相連接的管道上裝有可開關(guān)閥門(5)，蠕動(dòng)泵(6)的另一端與磁性層析裝置(18)的下端接口相通，磁性層析裝置(18)的下端還有一個(gè)接口與蠕動(dòng)泵(7)連接，蠕動(dòng)泵(7)通過(guò)裝有可開關(guān)閥門(8)的管道與儲(chǔ)液槽(4)連接，并且通過(guò)一個(gè)三相通路接頭與閥門(9)連接，閥門(9)的另一端與細(xì)胞超聲破碎儀(16)相連。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，細(xì)胞超聲破 碎儀(16)另一端與蠕動(dòng)泵(15)連接，蠕動(dòng)泵(15)的另一端與一電洗 脫儀(11)連接，該電洗脫儀(11)的另一端與蠕動(dòng)泵(14)連接，蠕動(dòng) 泵(14)的另一端通往磁力攪拌器(12)的底部，磁性層析裝置(18)的 上端有兩個(gè)端口分別與兩個(gè)闊門(17， 19)連接。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的 磁性層析裝置(18)包括，用于洗脫吸附層析柱上磁小體的超聲水槽(26)， 使層析系統(tǒng)帶有磁性的永磁鐵(22)和可吸附磁小體的層析柱(20);該 永磁鐵(22)設(shè)置在超聲水槽(26)的一側(cè)槽壁上，層析柱(20)豎直固 定于永磁鐵(22)上，永磁鐵(22)在層析柱(20)和超聲水槽(26)之 間，形成夾心結(jié)構(gòu)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的層析 柱(20)是一個(gè)內(nèi)置鐵珠(21)的塑料圓柱體，該圓柱體一端有兩個(gè)接口(24， 25)并且內(nèi)部裝置一個(gè)塑料網(wǎng)(23)，該圓柱體的另一端有一個(gè)接 口 (27)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的電洗 脫儀(11)包括電洗脫槽(31)，其兩端有接口 (30)用于連接降低槽內(nèi) 溫度的水循環(huán)系統(tǒng)(28)，其中電洗脫槽(31)的底部中間部位有可裝卸 永磁鐵(32)的插槽(33)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2或5所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的 磁力攪拌器(12)帶有可控速旋鈕和開關(guān)，其上置容器的底端與蠕動(dòng)泵(14) 連接，容器的口部分別由管道與蠕動(dòng)泵(10， 13)連接。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的發(fā)酵 罐(1)通過(guò)閥門(2)連接高壓均質(zhì)機(jī)(3)。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的 儲(chǔ)液槽(4)由塑料或有機(jī)玻璃材料制成，其內(nèi)部被分成幾個(gè)可儲(chǔ)存不同 液體的單元格，儲(chǔ)液槽(4)帶有控溫儀。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的 管道為硅膠管。
10. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的純化細(xì)菌磁小體的系統(tǒng)，其特征在于，所述的鐵珠(21)的直徑為4mm-6mm 。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種連續(xù)、規(guī)?；兓?xì)菌磁小體的系統(tǒng)，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。技術(shù)方案包括發(fā)酵罐(1)，高壓均質(zhì)機(jī)(3)、細(xì)胞超聲破碎儀(16)，高壓均質(zhì)機(jī)(3)與蠕動(dòng)泵(6)和儲(chǔ)液槽(4)相連接，其中與儲(chǔ)液槽(4)相連接的管道上裝有閥門(5)，蠕動(dòng)泵(6)的另一端與磁性層析裝置(18)的下端接口相通，磁性層析裝置(18)的下端還有一個(gè)接口與蠕動(dòng)泵(7)連接，蠕動(dòng)泵(7)通過(guò)裝有閥門(8)的管道與儲(chǔ)液槽(4)連接，并且通過(guò)三通接頭與閥門(9)連接，閥門(9)接細(xì)胞超聲破碎儀(16)。本實(shí)用新型采用磁性層析裝置，純化磁小體用時(shí)短，效率高，能夠?qū)崿F(xiàn)磁小體純化的半自動(dòng)化，操作安全方便，性能穩(wěn)定可靠。
文檔編號(hào)C12M1/00GK201280551SQ200820123160
公開日2009年7月29日 申請(qǐng)日期2008年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2008年10月20日
發(fā)明者關(guān)國(guó)華, 陽(yáng) 劉, 偉 姜, 穎 李, 李季倫, 田杰生, 郭芳芳 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)