專利名稱：液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置與方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及衛(wèi)生安全檢疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)等相關(guān)領(lǐng)域的樣本前處理技術(shù)，特別是涉及一種液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置與方法。
背景技術(shù)：
對(duì)特定的指示細(xì)菌尤其是致病細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)是衛(wèi)生安全檢疫、環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域的一項(xiàng)重要工作。在食品衛(wèi)生安全、環(huán)境水質(zhì)監(jiān)控等實(shí)際應(yīng)用場(chǎng)合，配制或采集的原始液體樣本(主要是水溶液樣本)中指示細(xì)菌的含量通常較低，但背景雜質(zhì)卻很復(fù)雜，現(xiàn)有的檢測(cè)方法難以直接檢出，必須要預(yù)先對(duì)其進(jìn)行富集和純化。因此，液樣中細(xì)菌的富集純化成為決定檢測(cè)成敗的關(guān)鍵因素，快速高效的富集和純化無疑將有助于提高檢測(cè)的靈敏度和可靠性。
當(dāng)前常用的液樣中細(xì)菌的富集純化方法有選擇性過濾、密度梯度離心、化學(xué)沉淀等，市場(chǎng)上已有一些基于相關(guān)原理的商用產(chǎn)品，例如美國(guó)Millipore公司的切向流系統(tǒng) Labscale和Pellicon ；離心系統(tǒng)Centricon Plus-70等。這些方法和產(chǎn)品在實(shí)際應(yīng)用時(shí)存在諸如容易堵塞、耗時(shí)較長(zhǎng)、富集效率偏低、純化效果不佳等種種問題，局限性較大，通常還需要真空泵、離心機(jī)等設(shè)備配合，操作和使用都不夠方便。隨著超順磁性微珠技術(shù)的逐漸成熟，基于磁珠吸附與分離的磁性富集純化方法開始得到應(yīng)用。這一類方法屬于生物親和技術(shù)，其中利用抗原抗體特異結(jié)合的免疫磁珠法能夠特異性的富集目標(biāo)細(xì)菌，濃縮比較大、分離純度高、操控性好、易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化處理。市場(chǎng)上基于免疫磁珠法的自動(dòng)化設(shè)備比較多， 例如美國(guó)Dynal公司的BeadRetriever等。然而，在突發(fā)公共衛(wèi)生事件、環(huán)境污染等致病細(xì)菌不明的情況下，需要對(duì)樣本中所含的所有細(xì)菌進(jìn)行富集，以便后續(xù)篩查檢測(cè)。但免疫磁珠包被抗體的種類有限，一種免疫磁珠通常只能特異吸附一種細(xì)菌，要同時(shí)富集多種細(xì)菌就要使用多種磁珠，成本較高且容易造成細(xì)菌損失，從而最終導(dǎo)致漏檢。因此對(duì)于這些場(chǎng)合， 細(xì)菌的非特異富集比特異性富集更能滿足需求。
相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，全裸或表面修飾特定基團(tuán)(例如羧基、氨基)的納米級(jí)磁珠能夠非特異性的吸附液樣中的細(xì)菌。吸附的原理目前尚無定論，可能由于磁珠與細(xì)菌表面蛋白的非特異性結(jié)合，或由于納米I^e3O4顆粒帶有正電，細(xì)菌表面因含有磷壁酸而帶負(fù)電，兩者通過靜電吸引作用而結(jié)合。報(bào)道的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在一定的條件下，對(duì)于常見的數(shù)十種食源性致病細(xì)菌和衛(wèi)生指示細(xì)菌，無論液樣中細(xì)菌濃度的高低，納米磁珠都能實(shí)現(xiàn)對(duì)其的高效吸附，平均吸附率不低于80%，很多種細(xì)菌甚至可達(dá)到95%以上。發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明旨在克服現(xiàn)有的細(xì)菌特異性富集純化方法在應(yīng)用到目標(biāo)細(xì)菌不明確，需要廣泛篩查場(chǎng)合時(shí)存在的種種不足，提供一種液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置與方法，該裝置和方法能夠高效富集樣本中所含的各種細(xì)菌，以降低漏檢的風(fēng)險(xiǎn)，提高后續(xù)檢測(cè)的靈敏度和可靠性。
本發(fā)明的技術(shù)方案之一是提供一種液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，包括控制系統(tǒng)和流路系統(tǒng)；所述控制系統(tǒng)包括蠕動(dòng)微泵、三通閥A、三通閥B、三通閥C、加熱塊、溫度傳感器、電磁鐵和主控模塊；所述流路系統(tǒng)包括吸附柱、緩沖液瓶、磁性分離柱、出樣管、廢液瓶和和連通各組件的管路；所述吸附柱、三通閥A、蠕動(dòng)微泵、磁性分離柱、三通閥B、三通閥C由所述管路依次首尾相連，構(gòu)成一個(gè)閉合的液流循環(huán)通道，通道中的液體在蠕動(dòng)微泵的推動(dòng)下，可依次沿吸附柱、三通閥A、蠕動(dòng)微泵、磁性分離柱、三通閥B、三通閥C、 吸附柱的方向循環(huán)流動(dòng)；所述三通閥A的第三個(gè)接口端與緩沖液瓶相連，所述三通閥B的第三個(gè)接口端與出樣管相連，所述三通閥C的第三個(gè)接口端與廢液瓶相連，所述加熱塊緊密貼合環(huán)抱吸附柱的底部，所述溫度傳感器貼于吸附柱內(nèi)腔室底部的壁面上，所述磁性分離柱處于電磁鐵磁極的緊密貼合環(huán)抱中，所述主控模塊用于控制蠕動(dòng)微泵、三通閥A、三通閥 B、三通閥C、加熱塊和電磁鐵，使它們按照設(shè)定的流程和時(shí)序，以及溫度傳感器反饋的溫度信號(hào)分別進(jìn)行相應(yīng)的動(dòng)作。
所述蠕動(dòng)微泵為工業(yè)級(jí)微型蠕動(dòng)泵，所述微型蠕動(dòng)泵泵頭上卡裝硅膠軟管，所述硅膠軟管兩端分別與循環(huán)流路中的管路相連，所述蠕動(dòng)微泵的工作流量與吸附柱內(nèi)腔室的容積相關(guān)，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述蠕動(dòng)微泵每分鐘的最大流量應(yīng)不小于所述吸附柱內(nèi)腔室的容積。
所述三通閥A、三通閥B、三通閥C均為電磁隔膜閥，其三個(gè)端口在某一時(shí)刻保證只有兩個(gè)端口相互連通，而與第三個(gè)端口隔斷。
所述加熱塊用于對(duì)所述吸附柱內(nèi)腔室中的液體進(jìn)行快速加熱，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述加熱塊為功率不低于20W的陶瓷加熱塊。
所述溫度傳感器用于感知所述吸附柱內(nèi)腔室中液體的溫度，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述溫度傳感器為薄片式熱敏電阻，所述熱敏電阻表面覆有防水絕緣涂層，所述熱敏電阻有效測(cè)溫范圍為0°C 100°C，在此溫度范圍內(nèi)測(cè)量誤差不超過0.2°C。
所述電磁鐵為微型繞組式電磁鐵，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述電磁鐵的軟磁材料磁極呈水平雙臂式環(huán)繞豎直放置的磁性分離柱，所述磁極的端面與所述磁性分離柱的外壁緊密貼合，所述磁極端面的厚度可覆蓋所述磁性分離柱的整個(gè)內(nèi)腔室。
所述主控模塊為所述液樣中細(xì)菌非特異性快速富集純化裝置的控制單元，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述主控模塊為單片機(jī)控制器，可按照設(shè)定的時(shí)序和指令集合對(duì)所述蠕動(dòng)微泵、三通閥A、三通閥B、三通閥C和電磁鐵進(jìn)行控制，并根據(jù)所述溫度傳感器反饋的溫度信號(hào)和已優(yōu)化的溫度控制程序?qū)訜釅K進(jìn)行閉環(huán)控制，從而使所述吸附柱內(nèi)腔室中的液體溫度快速達(dá)到并穩(wěn)定在預(yù)設(shè)的最佳吸附溫度，控溫誤差不超過0. 2°C。
所述吸附柱、磁性分離柱和出樣管分別為樣本與納米磁珠(裸珠或表面修飾羧基基團(tuán))懸液初步混合吸附、磁性分離和盛裝細(xì)菌非特異性富集純化溶液的容器，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述吸附柱、磁性分離柱和出樣管的材質(zhì)均為化學(xué)特性穩(wěn)定且易于加工的惰性材料(例如聚四氟乙烯(PTFE))，所述吸附柱、磁性分離柱和出樣管的內(nèi)腔室壁面均經(jīng)過硅烷化疏水處理，以避免液體的掛壁，所述吸附柱和出樣管的內(nèi)腔室頂部均開有與外界大氣相通，用以保持腔室內(nèi)外氣壓平衡的通氣孔，所述通氣孔的氣道上裝有可更換的高效空氣微粒濾芯(HEPA)過濾裝置，HEPA對(duì)直徑0. 3 μ m以上的微粒過濾效率可達(dá)99. 99 %，能夠有效阻擋所述吸附柱和出樣管內(nèi)腔室內(nèi)外的氣溶膠顆粒物隨氣流發(fā)生交換。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述吸附柱的內(nèi)腔室呈漏斗形，漏斗最底端為出液口，這種設(shè)計(jì)可有效防止液體流動(dòng)時(shí)向管路中引入氣泡以及液體中不溶物在腔室底部的淤積，所述吸附柱內(nèi)腔室的容積不小于10ml，高寬比約為2 1，所述吸附柱內(nèi)腔室的頂部開有用于插接與自動(dòng)進(jìn)樣裝置相連管路的密封加樣口，如果采用手工加樣，加樣后需用孔塞將所述加樣口堵住。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，用于非特異性吸附樣本中細(xì)菌的納米磁珠懸液也通過所述加樣口加入到所述吸附柱內(nèi)，所述納米磁珠為表面全裸或修飾羧基基團(tuán)，直徑通常為50 200nm的單分散超順磁性顆粒。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述磁性分離柱外形為圓柱形，豎直放置在所述電磁鐵的兩個(gè)磁極之間，所述磁性分離柱的內(nèi)腔室為圓柱兩端各接一個(gè)圓錐的紡錘形，為保證內(nèi)腔室中軸處的磁場(chǎng)強(qiáng)度，所述紡錘形內(nèi)腔室圓柱部分的直徑不宜超過3cm，壁厚不宜超過 3mm ο
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，為了提高所述納米磁珠吸附細(xì)菌和磁性分離的效率與速度，所述磁性分離柱的內(nèi)腔室可填充直徑為200 1000 μ m的導(dǎo)磁珠，所述導(dǎo)磁珠為軟磁材料，可被所述電磁鐵產(chǎn)生的外加磁場(chǎng)磁化，從而具備吸引所述納米磁珠的能力，當(dāng)所述外加磁場(chǎng)撤銷后，又能迅速退磁而不留剩磁，因而具有空間位阻和細(xì)化磁場(chǎng)的雙重作用。在非特異性吸附階段，所述電磁鐵未產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，所述導(dǎo)磁珠主要發(fā)揮空間位阻的作用，迫使所述樣本和納米磁珠的混合液從所述導(dǎo)磁珠之間的微小縫隙中曲折流過，增加所述納米磁珠與細(xì)菌相遇的概率，從而提高吸附速度和效率；在磁性分離階段，所述電磁鐵產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，所述導(dǎo)磁珠被磁化，將發(fā)揮空間位阻和細(xì)化磁場(chǎng)的雙重作用，混合液在縫隙間流過時(shí)， 液流中已吸附細(xì)菌和未吸附細(xì)菌的納米磁珠將被就近吸引到所述導(dǎo)磁珠表面或所述磁性分離柱內(nèi)腔室的側(cè)壁上，撤銷外加磁場(chǎng)，所述導(dǎo)磁珠退磁，所述納米磁珠又可從所述吸引面上輕松解離，所述導(dǎo)磁珠的加入大幅度縮短了所述納米磁珠在磁場(chǎng)中的平均運(yùn)動(dòng)距離，因此可加快磁性分離的速度，又可減少因來不及吸引而隨液流排出所造成的分離損失，兩個(gè)階段都可通過液流的多次循環(huán)來充分提高吸附率和分離率，填充了所述導(dǎo)磁珠的所述磁性分離柱內(nèi)腔室的實(shí)際容積應(yīng)不小于10ml。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述出樣管內(nèi)腔室的容積不小于anl，所述出樣管內(nèi)腔室底部可根據(jù)需要開通用于吸取液體的出液口。
所述緩沖液瓶為盛裝緩沖液的容器，所述緩沖液主要用于磁性分離時(shí)雜質(zhì)的清洗、磁性分離后細(xì)菌與納米磁珠的洗脫和重懸，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述緩沖液瓶的容積不小于40ml，頂部開有1個(gè)用于插接與三通閥A相連管路的密封插孔和1個(gè)用于平衡所述緩沖液瓶?jī)?nèi)外氣壓的通氣孔，所述通氣孔的氣道上裝有可更換的HEPA過濾裝置，以阻擋外界環(huán)境的氣溶膠顆粒物進(jìn)入所述緩沖液瓶?jī)?nèi)部，所述緩沖液的主要成分為生理鹽水(0. 9% 的NaCl水溶液)。
所述廢液瓶為盛裝廢液的容器，在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述廢液瓶的容積不小于 80ml，頂部開有1個(gè)用于插接與三通閥C相連管路的密封插孔和1個(gè)用于平衡所述廢液瓶?jī)?nèi)外氣壓的通氣孔，所述通氣孔的氣道上裝有可更換的HEPA過濾裝置，以阻擋所述廢液瓶?jī)?nèi)的氣溶膠顆粒物向外界擴(kuò)散。
在優(yōu)選的技術(shù)方案中，所述連通各組件的管路為內(nèi)徑2 4mm的惰性材質(zhì)管路，所述管路內(nèi)壁經(jīng)過硅烷化疏水處理。
本發(fā)明的技術(shù)方案之二是提供一種利用上述裝置對(duì)液樣中細(xì)菌進(jìn)行非特異性快速富集純化的方法，該方法以吸附柱和磁性分離柱為核心，借助蠕動(dòng)微泵的動(dòng)力令樣本與納米磁珠的混合液在連接各組件的閉合流路中循環(huán)流動(dòng)，再配合三通閥與電磁鐵的開閉， 自動(dòng)完成非特異性富集純化的全部流程，具體步驟如下
1)加樣經(jīng)由手工或自動(dòng)進(jìn)樣裝置，將適量待富集細(xì)菌的樣本溶液和納米磁珠懸液通過加樣口依次加入到吸附柱中，如果原始樣本溶液所含雜質(zhì)較多，應(yīng)先對(duì)其進(jìn)行預(yù)過濾，濾除粒徑超過20 μ m的雜質(zhì)顆粒之后再加入到吸附柱中；
2)非特異性吸附在加熱塊和溫度傳感器的閉環(huán)控制下，吸附柱內(nèi)腔室中溶液的溫度快速達(dá)到預(yù)設(shè)的最佳吸附溫度，并在整個(gè)富集純化過程中始終維持這一溫度，在控溫過程中，吸附柱內(nèi)腔室中的溶液受熱產(chǎn)生對(duì)流，使得樣本與納米磁珠預(yù)混合，納米磁珠開始非特異性吸附溶液中的細(xì)菌，控制各三通閥選通適當(dāng)端口，開啟蠕動(dòng)微泵，令樣本和納米磁珠的混合液在吸附柱、蠕動(dòng)微泵、磁性分離柱組成的閉合流路中循環(huán)流動(dòng)，當(dāng)液流經(jīng)過磁性分離柱時(shí)，液體只能從導(dǎo)磁珠之間的縫隙中流過，增加納米磁珠與細(xì)菌相遇的概率，促使納米磁珠能夠充分的非特異性吸附各種細(xì)菌。經(jīng)過數(shù)次循環(huán)，混合液中的絕大多數(shù)細(xì)菌已被納米磁珠吸附，形成納米磁珠-細(xì)菌復(fù)合物；
3)磁性分離開啟電磁鐵產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，填充在磁性分離柱內(nèi)的導(dǎo)磁珠被外加磁場(chǎng)迅速磁化，降低蠕動(dòng)微泵的速度，使混合液緩慢通過磁性分離柱，液流中的納米磁珠-細(xì)菌復(fù)合物和未吸附到細(xì)菌的游離納米磁珠將被就近吸引到導(dǎo)磁珠表面或磁性分離柱內(nèi)腔室的側(cè)壁上，從而與其它雜質(zhì)分離，達(dá)到富集純化的目的。液流可在流路中循環(huán)多次，以確保磁珠-細(xì)菌復(fù)合物被完全吸引。三通閥C選通廢液瓶，流路中剩余的液體排入廢液瓶；
4)清洗三通閥A選通緩沖液瓶，吸取適量緩沖液對(duì)吸引在磁性分離柱內(nèi)的磁珠-細(xì)菌復(fù)合物進(jìn)行清洗，進(jìn)一步去除殘留雜質(zhì)，從磁性分離柱流出的液體排入廢液瓶；為保證清洗效果，此步可重復(fù)多次；
5)洗脫出樣撤銷電磁鐵的外加磁場(chǎng)，導(dǎo)磁珠退磁，失去對(duì)磁珠-細(xì)菌復(fù)合物的吸引力，三通閥C關(guān)閉廢液瓶，三通閥B選通出樣管，從緩沖液瓶中吸取少量緩沖液進(jìn)入磁性分離柱，導(dǎo)磁珠表面和磁性分離柱內(nèi)腔室側(cè)壁上的磁珠-細(xì)菌復(fù)合物被洗脫下來，隨液流進(jìn)入出樣管。出樣管中收集的少量液體即為細(xì)菌的富集純化液，液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化流程至此完成。
本發(fā)明具有的優(yōu)點(diǎn)和積極效果是
(一)使用更靈活，適用范圍更廣。利用全裸或表面修飾羧基基團(tuán)的納米磁珠可實(shí)現(xiàn)液樣中細(xì)菌無遺漏的非特異性富集，能夠滿足目標(biāo)細(xì)菌不明確，需要廣泛篩查場(chǎng)合的需要；利用表面包被特定抗體的免疫納米磁珠又可實(shí)現(xiàn)對(duì)液樣中某種細(xì)菌的特異性富集，能夠滿足針對(duì)某種細(xì)菌進(jìn)行高靈敏度檢測(cè)場(chǎng)合的需要。
(二)富集純化效率更高。采用循環(huán)流動(dòng)的形式反復(fù)進(jìn)行吸附與磁性分離，有效地降低了細(xì)菌損失，提高了非特異性吸附和磁性分離的效率。
(三)富集純化速度更快。通過在磁性分離柱中填充導(dǎo)磁珠，加快了非特異性吸附和磁性分離的速度，使得細(xì)菌的富集純化可在30分鐘甚至更短的時(shí)間內(nèi)完成。
(四)操作簡(jiǎn)單，自動(dòng)化程度高。提出了液樣中細(xì)菌非特異性快速富集純化的自動(dòng)化實(shí)現(xiàn)方案，加樣后一鍵啟動(dòng)即可自動(dòng)完成全部富集純化流程，毋需離心的步驟，可作為自動(dòng)檢測(cè)設(shè)備整機(jī)中的一個(gè)內(nèi)嵌功能單元，直接與檢測(cè)單元級(jí)聯(lián)。
(五)擴(kuò)展性強(qiáng)，易于實(shí)現(xiàn)高通量富集。富集純化裝置結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單緊湊，易于實(shí)現(xiàn)微型化和模塊化，多個(gè)相同模塊的并行集成即可實(shí)現(xiàn)樣本的高通量富集純化。


圖1為本發(fā)明液樣中細(xì)菌非特異性快速富集純化裝置實(shí)施例的整體結(jié)構(gòu)示意圖2(a)為本發(fā)明裝置實(shí)施例中磁性分離柱和電磁鐵的組合布局俯視圖2 (b)為圖2 (a)中的A-A’剖面圖。
圖中1、加樣口，2、通氣孔，3、吸附柱，4、控制線，5、三通閥A，6、蠕動(dòng)微泵，7、主控模塊，8、電磁鐵，9、磁性分離柱，10、三通閥B, 11、出樣管，12、廢液瓶，13、三通閥C，14、緩沖液瓶，15、溫度傳感器，16、加熱塊，17、管路，18、電磁鐵線圈，19、電磁鐵磁極，20、分離柱入口，21、管路接頭，22、分離柱內(nèi)腔室，23、導(dǎo)磁珠，24、導(dǎo)磁珠隔網(wǎng)，25、分離柱出口。
具體實(shí)施方式
為能進(jìn)一步了解本發(fā)明的發(fā)明內(nèi)容、特點(diǎn)及功效，茲例舉以下實(shí)施例，并配合附圖詳細(xì)說明如下
請(qǐng)參見圖1，一種液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，該裝置包括控制系統(tǒng)和流路系統(tǒng)，其中控制系統(tǒng)主要由蠕動(dòng)微泵6、三通閥A5、三通閥B10、三通閥C13、加熱塊 16、溫度傳感器15、電磁鐵8和主控模塊7組成；流路系統(tǒng)主要由吸附柱3、緩沖液瓶14、磁性分離柱9、出樣管11、廢液瓶12和連通各組件的管路17組成。該實(shí)施例設(shè)計(jì)單次最大樣本處理容量為20ml。在本實(shí)施例中，吸附柱3、三通閥A5、蠕動(dòng)微泵6、磁性分離柱9、三通閥B10、三通閥C13由管路17依次首尾相連，構(gòu)成一個(gè)閉合的液流循環(huán)通道，液流循環(huán)通道中的液體在蠕動(dòng)微泵6的推動(dòng)下，將依次沿吸附柱3、三通閥A5、蠕動(dòng)微泵6、磁性分離柱9、 三通閥B10、三通閥C13、吸附柱3的方向循環(huán)流動(dòng)。三通閥A5的第三個(gè)接口端與緩沖液瓶 14相連，三通閥BlO的第三個(gè)接口端與出樣管11相連，三通閥C13的第三個(gè)接口端與廢液瓶12相連。蠕動(dòng)微泵6的最大流量為每分鐘30ml。
在本實(shí)施例中，主控模塊為采用STM32芯片組的單片機(jī)系統(tǒng)，通過控制線4控制蠕動(dòng)微泵6、三通閥A5、三通閥BlO、三通閥C13、加熱塊16和電磁鐵8，使它們按照設(shè)定的流程和時(shí)序進(jìn)行相應(yīng)的動(dòng)作，并根據(jù)溫度傳感器15反饋的溫度信號(hào)和已優(yōu)化的溫度控制程序?qū)訜釅K16進(jìn)行閉環(huán)控制，從而使吸附柱3內(nèi)腔室中的液體溫度快速達(dá)到并穩(wěn)定在最佳吸附溫度37 °C，控溫誤差不超過0. 2°C。
在本實(shí)施例中，吸附柱3、磁性分離柱9和出樣管11的材質(zhì)為聚四氟乙烯(PTFE)， 其內(nèi)腔室壁面均已經(jīng)過硅烷化疏水處理。吸附柱3和出樣管11的內(nèi)腔室頂部均開有通氣孔2，通氣孔2的氣道上裝有可更換的HEPA過濾裝置。
在本實(shí)施例中，吸附柱3的內(nèi)腔室呈漏斗形，出液口位于漏斗的最底端。吸附柱內(nèi)腔室的容積為30ml，高寬比為2 1，其頂部與加樣口 1相連，加樣口 1在不用時(shí)需用孔塞堵住。原始樣本溶液需要預(yù)先經(jīng)過20 μ m過濾，然后再通過加樣口 1注入吸附柱3，而用于吸附細(xì)菌的納米磁珠也要通過加樣口 1加入到吸附柱3中。納米磁珠則選用表面全裸或修飾羧基，直徑約為IOOnm的單分散超順磁性納米磁珠。
在本實(shí)施例中，加熱塊16選用功率為30W的陶瓷加熱塊，該陶瓷加熱塊緊密貼合環(huán)抱吸附柱3的底部。溫度傳感器15選用表面覆有防水絕緣涂層的薄片式熱敏電阻，貼于吸附柱3內(nèi)腔室底部的壁面上。該熱敏電阻的有效測(cè)溫范圍為0°C 100°C，在此范圍內(nèi)最大測(cè)量誤差不超過0.2°C。
在本實(shí)施例中，磁性分離柱9的外形為圓柱形。電磁鐵8為繞組式，由漆包線圈18 和軟磁材料磁極19組成。磁性分離柱9和電磁鐵8的組合布局結(jié)構(gòu)如圖2示，其中圖2(a) 為俯視圖，圖2(b)為磁性分離柱9軸心處的剖面圖。磁性分離柱9豎直放置在電磁鐵的兩個(gè)水平環(huán)繞式磁極19之間，電磁鐵磁極19的端面與磁性分離柱9的外壁緊密貼合，端面的厚度覆蓋整個(gè)分離柱內(nèi)腔室22。分離柱內(nèi)腔室22為圓柱兩端各接一個(gè)圓錐的紡錘形，紡錘形頂部開有入口 20，底部開有出口 25，分離柱入口 20和出口 25通過管路接頭21和連接管路17分別與蠕動(dòng)微泵6和三通閥BlO相連。紡錘形中部圓柱處的直徑為2cm，壁厚為2mm。 分離柱內(nèi)腔室22中填充直徑為1000 μ m的導(dǎo)磁珠23，在導(dǎo)磁珠23的底部，分離柱出口 25 的上方放置孔徑200 μ m的導(dǎo)磁珠隔網(wǎng)24，以防止導(dǎo)磁珠隨液體流出磁性分離柱9。填充導(dǎo)磁珠23之后的分離柱內(nèi)腔室22實(shí)際有效容積約為10ml。
在本實(shí)施例中，出樣管11的內(nèi)腔室容積為5ml。
在本實(shí)施例中，緩沖液瓶14的容積為100ml，內(nèi)部盛裝主要成分為生理鹽水 (0. 9%的NaCl水溶液)的緩沖液。緩沖液瓶14的頂部開有1個(gè)用于插接與三通閥A5相連管路的密封插孔和1個(gè)通氣孔2，通氣孔2的氣道上裝有可更換的HEPA過濾裝置。廢液瓶12的容積為200ml，頂部開有1個(gè)用于插接與三通閥C13相連管路的密封插孔和1個(gè)通氣孔2，通氣孔2的氣道上裝有可更換的HEPA過濾裝置。
在本實(shí)施例中，連通各組件的管路17為內(nèi)徑3. 2mm的聚四氟乙烯(PTFE)管，其內(nèi)壁已經(jīng)過硅烷化疏水處理。
利用液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置實(shí)施例將20ml樣本中的細(xì)菌富集純化至2ml液樣的一個(gè)具體流程實(shí)例如下
(一 )初始狀態(tài)
裝置初始狀態(tài)吸附柱3、磁性分離柱9、出樣管11和廢液瓶12為空，各條連接管路17均為空，電磁鐵8斷電。緩沖液瓶14已預(yù)先加注滿緩沖液。三通閥A5選通吸附柱3 與蠕動(dòng)微泵6，三通閥BlO選通磁性分離柱9與三通閥C13，三通閥C13選通三通閥BlO與吸附柱3。
(二)加樣
1)預(yù)過濾手工或利用過濾裝置對(duì)原始樣本溶液進(jìn)行20 μ m過濾，去除較大顆粒懸濁雜質(zhì)。
2)加樣由手工或自動(dòng)進(jìn)樣裝置依次通過加樣口 1向吸附柱3內(nèi)加入20ml已過濾的樣本溶液和細(xì)1表面全裸或修飾羧基的納米磁珠懸液，懸液中納米磁珠的含量應(yīng)盡量保證其對(duì)于樣本細(xì)菌而言是過量的。加樣完成后用孔塞將加樣口1堵住。
(三)非特異性吸附
1)加熱/保溫溫度傳感器15感知吸附柱3中溶液的當(dāng)前溫度，如果低于37°C，啟動(dòng)加熱塊16對(duì)吸附柱3進(jìn)行加熱，令吸附柱3中的溶液溫度快速達(dá)到最佳吸附溫度37°C， 并在整個(gè)富集純化過程中維持這一溫度，控溫誤差不超過0.2°C。加熱過程中，吸附柱3中的溶液受熱產(chǎn)生對(duì)流，使得樣本與納米磁珠預(yù)混合，納米磁珠開始非特異性吸附溶液中的細(xì)菌。
2)非特異性吸附待吸附柱3中的溶液溫度達(dá)到最佳吸附溫度37°C后，開啟蠕動(dòng)微泵漸至最大流量，令樣本和納米磁珠的混合液在吸附柱3、蠕動(dòng)微泵6、磁性分離柱9組成的閉合流路中循環(huán)流動(dòng)10 15分鐘，促使納米磁珠充分的非特異性吸附溶液中的各種細(xì)菌。此步完成后，混合液中的絕大多數(shù)細(xì)菌已被納米磁珠吸附，形成納米磁珠-細(xì)菌復(fù)合物。
(四)磁性分離
電磁鐵8通電產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，降低蠕動(dòng)微泵6的流量至最大流量的50%，使混合液緩慢通過磁性分離柱9，液流中的納米磁珠-細(xì)菌復(fù)合物和未吸附到細(xì)菌的游離納米磁珠被就近吸引到導(dǎo)磁珠23表面或磁性分離柱內(nèi)腔室22的側(cè)壁上。維持液流循環(huán)3 5分鐘，確保磁珠-細(xì)菌復(fù)合物被完全吸引。三通閥C13選通廢液瓶12，流路中剩余的液體被蠕動(dòng)微泵6推入廢液瓶12。
(五)清洗
待循環(huán)流路中的液體全部排空后，三通閥A5選通緩沖液瓶14，蠕動(dòng)微泵6吸取緩沖液對(duì)吸引在磁性分離柱9內(nèi)的磁珠-細(xì)菌復(fù)合物進(jìn)行清洗，從磁性分離柱9流出的液體排入廢液瓶12 ；清洗過程維持2分鐘后，三通閥A5與緩沖液瓶14斷開。
(六)洗脫出樣
待循環(huán)流路中的液體全部排空后，電磁鐵8斷電，外加磁場(chǎng)撤銷。三通閥C13與廢液瓶12斷開，三通閥BlO選通出樣管11，三通閥A5選通緩沖液瓶14，蠕動(dòng)微泵6從緩沖液瓶14中吸取2ml緩沖液進(jìn)入磁性分離柱9，導(dǎo)磁珠23表面和磁性分離柱內(nèi)腔室22側(cè)壁上的磁珠-細(xì)菌復(fù)合物被洗脫下來，隨液流進(jìn)入出樣管11。出樣管11中收集的洗脫液體即為細(xì)菌的富集純化液。
(七)流路洗滌
1)流路洗滌如果有多批樣本需要富集純化，每批樣本處理完之后要對(duì)流路進(jìn)行洗滌，以防止樣本間的交叉污染。三通閥A5選通緩沖液瓶14，蠕動(dòng)微泵6吸取20ml緩沖液進(jìn)入循環(huán)流路，三通閥A5與緩沖液瓶14斷開，選通吸附柱3，蠕動(dòng)微泵6開至最大流量，緩沖液在循環(huán)流路中循環(huán)流動(dòng)2分鐘，三通閥C13選通廢液瓶12，緩沖液排入廢液瓶12。此步可根據(jù)需要重復(fù)多次。
2)強(qiáng)力洗滌當(dāng)富集純化全部完成之后，在裝置關(guān)機(jī)前還需進(jìn)行一次徹底的洗滌。將緩沖液瓶14中的緩沖液換成含有去污劑、抑菌劑和蛋白酶等成分的洗滌液，參照流路洗滌的程序?qū)ρb置流路進(jìn)行洗滌。
盡管上面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行了描述，但是本發(fā)明并不局限于上述的具體實(shí)施方式
，上述的具體實(shí)施方式
僅僅是示意性的，并不是限制性的，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員在本發(fā)明的啟示下，在不脫離本發(fā)明宗旨和權(quán)利要求所保護(hù)的范圍情況下，還可以作出很多形式，這些均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，該裝置包括控制系統(tǒng)和流路系統(tǒng)；所述控制系統(tǒng)包括蠕動(dòng)微泵、三通閥A、三通閥B、三通閥C、加熱塊、溫度傳感器、電磁鐵和主控模塊；所述流路系統(tǒng)包括吸附柱、緩沖液瓶、磁性分離柱、出樣管、廢液瓶和連通各組件的管路；所述吸附柱、三通閥A、蠕動(dòng)微泵、磁性分離柱、三通閥B、三通閥C由所述管路依次首尾相連，構(gòu)成一個(gè)閉合的通道，液流循環(huán)通道中的液體在蠕動(dòng)微泵的推動(dòng)下，依次沿吸附柱、三通閥A、蠕動(dòng)微泵、磁性分離柱、三通閥B、三通閥C、吸附柱的方向循環(huán)流動(dòng)；所述三通閥A的第三個(gè)接口端與緩沖液瓶相連，所述三通閥B的第三個(gè)接口端與出樣管相連，所述三通閥C的第三個(gè)接口端與廢液瓶相連，所述加熱塊緊密貼合環(huán)抱在吸附柱的底部，所述溫度傳感器貼于吸附柱內(nèi)腔室底部的壁面上，所述磁性分離柱處于電磁鐵磁極的緊密貼合環(huán)抱中，所述主控模塊按照設(shè)定的時(shí)序和指令集合對(duì)所述蠕動(dòng)微泵、三通閥 A、三通閥B、三通閥C和電磁鐵進(jìn)行控制，并根據(jù)所述溫度傳感器反饋的溫度信號(hào)和溫度控制程序?qū)訜釅K進(jìn)行閉環(huán)控制，使所述吸附柱內(nèi)腔室中的液體溫度達(dá)到并穩(wěn)定在預(yù)設(shè)吸附溫度。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，所述蠕動(dòng)微泵每分鐘的最大流量應(yīng)不小于所述吸附柱內(nèi)腔室的容積。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，所述電磁鐵的磁極端面厚度覆蓋所述磁性分離柱的整個(gè)內(nèi)腔室。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，所述吸附柱、磁性分離柱和出樣管均是由惰性材料制成的，所述吸附柱、磁性分離柱和出樣管的內(nèi)腔室壁面均經(jīng)過硅烷化疏水處理。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，所述吸附柱的內(nèi)腔室呈漏斗形，漏斗最底端為出液口。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，所述納米磁珠為表面全裸或修飾羧基基團(tuán)，直徑為50 200nm的單分散超順磁性顆粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，其特征在于，所述磁性分離柱內(nèi)填充有直徑為200 1000 μ m的導(dǎo)磁珠，所述導(dǎo)磁珠是由軟磁材料制成的。
8.一種利用如權(quán)利要求1 7任意一項(xiàng)所述裝置對(duì)液樣中細(xì)菌進(jìn)行非特異性快速富集純化的方法，其特征在于，包括以下步驟1)加樣將待富集細(xì)菌的樣本溶液和納米磁珠懸液加入到吸附柱中；2)非特異性吸附加熱吸附柱，使其中溶液的溫度達(dá)到預(yù)設(shè)吸附溫度，并在整個(gè)富集純化過程中始終維持這一溫度，在控溫過程中，開啟蠕動(dòng)微泵，樣本和納米磁珠的混合液在液流循環(huán)通道中循環(huán)流動(dòng)，經(jīng)過數(shù)次循環(huán)，混合液中的細(xì)菌被納米磁珠吸附，形成納米磁珠-細(xì)菌復(fù)合物；3)磁性分離電磁鐵加電產(chǎn)生外加磁場(chǎng)，降低蠕動(dòng)微泵的速度，使混合液多次緩慢通過磁性分離柱，液流中的納米磁珠-細(xì)菌復(fù)合物和未吸附到細(xì)菌的游離納米磁珠被吸引到導(dǎo)磁珠表面或磁性分離柱內(nèi)腔室的側(cè)壁上，排出剩余液體；4)清洗吸取適量緩沖液對(duì)吸引在磁性分離柱內(nèi)的磁珠-細(xì)菌復(fù)合物進(jìn)行清洗，并將清洗液排出；5)洗脫出樣撤銷電磁鐵的外加磁場(chǎng)，將緩沖液注入磁性分離柱，導(dǎo)磁珠表面和磁性分離柱內(nèi)腔室側(cè)壁上的磁珠-細(xì)菌復(fù)合物被洗脫下來，收集洗脫液，該洗脫液即為細(xì)菌的富集純化液。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化方法，其特征在于，在樣本溶液加入吸附柱前，進(jìn)行過濾處理，濾除粒徑超過20 μ m的雜質(zhì)顆粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化裝置，該裝置包括控制系統(tǒng)和流路系統(tǒng)；流路系統(tǒng)包括吸附柱、緩沖液瓶、磁性分離柱、出樣管、廢液瓶和連通各組件的管路；吸附柱、三通閥A、蠕動(dòng)微泵、磁性分離柱、三通閥B、三通閥C構(gòu)成一個(gè)閉合的液流循環(huán)通道；三通閥A與緩沖液瓶相連，三通閥B與出樣管相連，三通閥C與廢液瓶相連，加熱塊設(shè)置在吸附柱的底部，溫度傳感器貼于吸附柱內(nèi)腔底部的壁面上，磁性分離柱處于電磁鐵磁極的環(huán)抱中，主控模塊控制蠕動(dòng)微泵、三通閥A、三通閥B、三通閥C、加熱塊和電磁鐵。本發(fā)明還公開了利用上述裝置對(duì)液樣中細(xì)菌進(jìn)行非特異性快速富集純化的方法。本發(fā)明實(shí)現(xiàn)了液樣中細(xì)菌的非特異性快速富集純化。
文檔編號(hào)C12M1/00GK102504991SQ20111030666
公開日2012年6月20日 申請(qǐng)日期2011年10月11日 優(yōu)先權(quán)日2011年10月11日
發(fā)明者吳太虎, 杜耀華, 程智, 陳鋒, 顧彪 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生裝備研究所