專利名稱：：用于活的減毒病毒的方法和組合物的制作方法用于活的減毒病毒的方法和組合物優(yōu)先權(quán)防止病毒感染的疫苗已經(jīng)被有效地用于減少人類疾病的發(fā)病率。用于病毒疫苗的最成功的技術(shù)之一是用減弱的或者減毒的病毒("活的減毒病毒")株免疫動物或者人類。由于免疫之后有限的復制，減毒株不會引起疾病。然而，該有限的病毒復制足以表達病毒抗原全部的所有組成成分并且對該病毒產(chǎn)生有效和持久的免疫反應(yīng)。因此，當后來暴露于致病的病毒株時，該免疫個體被保護免于疾病。這些活的減毒病毒疫苗是用于公眾健康的最成功的疫苗之一。為了使活的減毒病毒疫苗是有效的，它們必須在免疫之后能夠復制。因此，任何使病毒失活的因素可以削弱疫苗。例如，第二次世界大戰(zhàn)之前天花疫苗的廣泛分發(fā)和應(yīng)用被限制，因為該病毒在環(huán)境溫度下僅僅幾天后就失活。在20世紀20年代，法國科學家證明冷凍干燥的疫苗提供長期穩(wěn)定性，并且在20世紀40年代發(fā)展了用于大規(guī)模生產(chǎn)冷凍干燥疫苗的技術(shù)(參見，例如Collier1955)。除了冷凍干燥外，各種能夠幫助穩(wěn)定活的減毒病毒疫苗中的病毒的添加劑也已經(jīng)被確定(參見例如Burke，Hsu等1999)。這些穩(wěn)定劑典型地包括一種或者多種以下的成分二價陽離子、緩沖鹽溶液、螯合劑、尿素、糖(例如，蔗糖、乳糖、海藻糖)、多元醇(例如，甘油、甘露醇、山梨糖醇、聚乙二醇)、氨基酸、蛋白水解物(例如，酪蛋白水解物、乳清蛋白水解物、蛋白胨)、蛋白質(zhì)(例如，明膠、人血清白蛋白)或者聚合物(例如，葡聚糖)。本文考慮的組合物可以提高活的減毒病毒的穩(wěn)定性和/或減少活的減毒病毒的失活和/或降解，所述活的減毒病毒包括，但不限于活的減毒黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、瘟病毒(pestivims)、小RNA病毒、杯狀病毒、呼腸孤病毒、細小病毒(parvovirus)、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒、或痘病毒。其他實施方式涉及活的減毒病毒組合物和方法，其涉及能夠減少或者防止由本文考慮的一種或者多種病毒引起的醫(yī)學狀況發(fā)作的疫苗組合物。根據(jù)這些實施方式，醫(yī)學狀況可以包括但不限于，西尼羅河感染、登革熱、日本腦炎、庫阿撒魯爾森林病(Kyasanurforestdisease)、澳洲墨萊溪谷月囟炎(murrayvalleyencephalitis)、Alkhurma出血熱、圣路易腦炎(St.Louisencephalitis)、蜱源腦炎、黃熱病和丙型肝炎病毒感染。在其他實施方式中，表面活性劑可以包括但不限于，普魯羅尼克(Pluronic)F127、普魯羅尼克F68、普魯羅尼克P123，或者其他大于3,000-4,000MW的EO-PO嵌段共聚物。00019]在一些實施方式中，疫苗組合物可以包括但不限于，一種或者多種是血清白蛋白的蛋白質(zhì)劑；一種或者多種是海藻糖的糖劑；以及一種或者多種是EO-PO嵌段共聚物普魯羅尼克F127的表面活性劑聚合物。00020本文的一些實施方式涉及部分地或者全部脫水的活的減毒病毒組合物。根據(jù)這些實施方式，組合物可以是20%或者以上、30%或者以上、40%或者以上、50%或者以上、60%或者以上、70%或者以上、80%或者以上、或者90%或者以上脫水的。00021其他實施方式涉及用于減少活的減毒病毒失活的方法，其包括但不限于將一種與多種活的減毒病毒與能夠減少活的減毒病毒失活的組合物組合，該組合物包括但不限于，一種或者多種蛋白質(zhì)劑；一種或者多種糖類或者多元醇劑；以及一種或者多種高分子量表面活性劑，其中該組合物減少活的減毒病毒的失活。根據(jù)這些實施方式，活的減毒病毒可以包括但不限于，黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、瘟病毒、小RNA病毒、杯狀病毒、呼腸孤病毒、細小病毒、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒。此外，本文公開的方法和組合物可以包括冷凍干燥或者其他組合的脫水方法。依照這些方法和組合物，該方法和組合物減少冷凍干燥的或者部分或者全部脫水的活的減毒病毒的失活。在其它方法中，減少活的減毒病毒的失活的組合物可以包括含水組合物，或者可以包括脫水后再水合的組合物。本文描述的組合物能夠增加含水或者再水合的活的減毒病毒的保存期。其他實施方式涉及用于降低活的減毒病毒組合物失活的試劑盒，其包括但不限于，容器；和組合物，所述組合物包括但不限于一種或者多種蛋白質(zhì)劑、一種或者多種糖或者多元醇劑、和一種或者多種EO-PO嵌段共聚物劑，其中所述組合物減少活的減毒病毒的失活和/或降解。根據(jù)這些實施方式，試劑盒組合物可以包括一種或者多種血清白蛋白的蛋白質(zhì)劑；一種或者多種海藻糖的糖劑；以及一種或者多種EO-PO嵌段共聚物劑。此外，本文考慮的試劑盒還可以包括一種或者多種活的減毒病毒，所述活的減毒病毒包括但不限于黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、瘟病毒、小RNA病毒、杯狀病毒、呼腸孤病毒、細小病毒、乳多空病毒、腺病毒、皰疹病毒或痘病毒。某些實施方式中，本文的組合物可以包括作為糖劑的海藻糖。根據(jù)這些實施方式，海藻糖濃度可以等于或者大于5%(W/V)。在某些實施方式中，本文組合物可以包括作為EO-PO嵌段共聚物劑的聚合物F127。根據(jù)這些實施方式，聚合物F127濃度可以是大約O.l到大約4。/。(w/v)。00025其他實施方式中，本文考慮的組合物可以包括痕量或者無二價陽離子。例如，本文考慮的組合物可以具有痕量或者無鈣/鎂(Ca2+/Mg2+)。附圖簡述以下附圖形成本說明書的的部分并且被包括以進一步說明本文具體實施方式的某些方面。通過參考一個或多個這些附圖連同本文提供的詳細描述，實施方式可以被更好地理解。圖2代表對于示例性病毒DEN-2PDK53病毒在各種示例性組合物中在37。C的病毒失活的動力學分析的示例性圖。圖3代表示例性病毒DEN-2PDK53病毒在37。C貯藏21小時的分析的示例性直方圖。數(shù)值被表示為在溫育后剩余的病毒效價相對于輸入效價的百分比。制劑百分比參照各個賦形劑(w/v)。圖6代表示例性病毒DEN-2PDK53病毒被儲存在不同制劑中時在兩個凍-融循環(huán)后的示例性直方圖分析。數(shù)值被表示為在凍-融循環(huán)后剩余的病毒效價相對于輸入效價的百分比。包括以下實施例以說明本文提供的某些實施方式。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識到實施例中公開的技術(shù)代表發(fā)現(xiàn)在實踐本文公開中運作良好的技術(shù)，并且因此可以考慮組成用于其實踐的優(yōu)選方式。然而，根據(jù)本公開，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該意識到在公開的具體實施方式中可以進行許多變化并且在不偏離本文的精神和范圍的情況下仍然獲得相同或類似的結(jié)果。實施例1DEN-2PDK53黃病毒在液相中的基礎(chǔ)穩(wěn)定性000741在一個說明性方法中，研究了黃病毒在液相中的熱穩(wěn)定性。依照這個方法，測定儲存在磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)中的DEN-2PDK53親代疫苗載體在不同溫度下的基礎(chǔ)穩(wěn)定性(表1)。在一個實施例中，在2ml的螺蓋小瓶中，在4。C、室溫(2rC)或37。C下溫育在0.5mlPBS的總體積中的lxl(^pfb的DEN-2PDK53病毒。在溫育24小時后，通過中性紅瓊脂糖覆蓋蝕斑滴定試驗(NeutralRedagaroseoverlayplaquetitrationassay),在非洲綠猴腎細胞(Verocdls)中測定病毒效價和活性。如表1中說明，在PBS中、4。C溫育DEN-2PDK53導致病毒效價平均減少四倍，而在37。C溫育相同時間段導致病毒效價完全喪失。這些結(jié)果說明DEN-2PDK53黃病毒在不存在穩(wěn)定賦形劑時的穩(wěn)定性相對差。表1Den-2PDK53病毒在不同溫度貯存24小時的穩(wěn)定性溫度制劑病毒效價喪失的百分比=化^~PBS75~~~~21°CPBS7837。CPBS10026實施例2組合物的穩(wěn)定作用[00075在某些示例性組合物中，本文考慮的有助于活的病毒疫苗的熱穩(wěn)定性的藥學上可接受的賦形劑在本領(lǐng)域是已知的。在一個示例性方法中，PBS作為基礎(chǔ)組合物使用，以評估不同賦形劑的穩(wěn)定作用。這些實施例中，每種賦形劑的儲備溶液在PBS中制成并且用NaOH調(diào)整pH到大約7.1，除了殼聚糖，殼聚糖的儲備溶液的pH調(diào)整到大約6.S。賦形劑在PBS中稀釋到顯示的終濃度(w/v乂表2)。依照這個方法，在無血清培養(yǎng)基中，將1x104pfb的DEN-2PDK53病毒加入到0.5ml的每種組合物中并在37t:貯存24小時。在溫育后，如以上所描述，通過在非洲綠猴腎細胞中的蝕斑滴定測定病毒活性和效價。如在表2中說明，包括單種賦形劑的組合物在與先前試驗實施例的濃度相當?shù)牟煌瑵舛认碌姆€(wěn)定作用是最小的。然而，一些賦形劑例如，海藻糖和重組人血白蛋白(rHSA)在37。C對于穩(wěn)定DEN-2PDK53病毒比其它的賦形劑更有效。在表2中表示的研究結(jié)果也顯示，幾種賦形劑增加的穩(wěn)定作用——包括rHSA和海藻糖——可以在這些賦形劑的某些濃度范圍內(nèi)獲得。在此具體的實施例中，海藻糖在15。/。(w/v)濃度以上更有效而F127在0.5和3%之間的濃度更有效。表2當在37"貯存24小時時，不同賦形劑對DEN-2PDK53穩(wěn)定性的作用制劑病毒效價喪失的百分比PBS100.010%蔗糖99.915%蔗糖98.320%蔗糖96.425%蔗糖93.42%海藻糖98.35%海藻糖97.010%海藻糖93.315%海藻糖83.3<table>tableseeoriginaldocumentpage28</column></row><table>包括特定賦形劑組合的組合物的穩(wěn)定作用示例性數(shù)據(jù)在圖4中進一步地圖解。圖4表示DEN-2PDK53病毒在含有不同表面活性劑的組合物中的穩(wěn)定性。DEN-2PDK53在每種制劑中在37"C下貯存23小時。這個實施例中評估的表面活性劑包括正辛基-P-D-吡喃葡萄糖苷((3-0G)、聚山梨糖醇酯20(P20)、聚山梨糖醇酯80(P80)和F127(F)。其它制劑成分包括海藻糖(T)和rHSA(A)。數(shù)值表示為在溫育后剩余病毒效價相對于輸入效價的百分比。實施例5不同組合物穩(wěn)定作用的比較在一個示例性方法中，說明了選擇組合物以在凍-融循環(huán)后保存病毒活性的能力。在螺帽小瓶中，lxl04pfu的DEN-2PDK53疫苗病毒懸浮在0.5ml的每種組合物中。對于第一個凍-融循環(huán)，在-80r將小瓶冷凍24小時并在37。C快速解凍。這緊接著第二個凍-融循環(huán)，在該循環(huán)中小瓶在-8(TC冷凍1小時并且在37。C快速解凍。病毒效價和活性隨后通過如實施例1中描述的蝕斑滴定試驗進行測定。如圖6中所說明，包括海藻糖、F127和rHSA的特定組合物經(jīng)過兩個凍-融循環(huán)后，有效地保存全部病毒活性。另外，包括這三種賦形劑的組合物比只含有單個賦形劑的組合物更有效。此具體的說明性試驗的結(jié)果表明本文公開的組合物和方法對于黃病毒疫苗是有效冷凍保護劑，并且在冷凍干燥、噴霧干燥或其它脫水技術(shù)過程中可以幫助病毒保存。實施例7其它活的減毒病毒的穩(wěn)定先前說明的實施例顯示在包括海藻糖、F127和rHSA的組合物中，數(shù)種活的減毒黃病毒的有效的液相穩(wěn)定。預期本文公開的實施方式在穩(wěn)定其它活的減毒病毒也可以為有效的。例如，包括海藻糖、F127和rHSA的制劑可以用于穩(wěn)定活的減毒麻疹病毒、減毒辛德畢斯病毒、減毒流感病毒、重組減毒腺病毒或重組減毒痘苗病毒。在一個示例性方法中，這些非黃病毒-病毒可以在從細胞培養(yǎng)物中收獲后直接懸浮和并保持在液相中，在包括海藻糖、F127和rHSA的組合物中。在另一說明性方法中，非黃病毒-病毒在冷凍或噴霧干燥之前、或之后可以懸浮在組合物中。統(tǒng)計學上提高的病毒穩(wěn)定性可以說明本實施方式的制劑是可以應(yīng)用于黃病毒家族之外的其它減毒病毒疫苗。本領(lǐng)域技術(shù)人員認識到應(yīng)用可以隨后被延伸到其它活的減毒病毒。實施例8安全和體內(nèi)免疫原性000831賦形劑和分子或細胞成分之間的分子相互作用不僅可以用來增強病毒疫苗的穩(wěn)定性，而且可以引起體內(nèi)細胞或組織損傷的增加。制劑可以減少這些病毒疫苗在活的動物中的免疫原性。在本實施例中，說明了示例性組合物在皮下注射后是安全的并且基本是無免疫活性的。選擇四種不同示例性組合物用于小鼠中的檢驗，如下。制劑l:15%海藻糖、2%F-127、l%rHSA制劑2:15%海藻糖、2%F-127、1%rHSA、lmMCaCl2/0.5mMMgS04制劑3:15%海藻糖、2%F-127、l°/。rHSA、0.5%殼聚糖制劑4:22.5%海藻糖、3%F-127、1.5%rHSA制劑5:PBS根據(jù)本公開，在沒有過分試驗的情況下，可以制備和執(zhí)行本文公開和要求保護的所有的組合物和方法。雖然根據(jù)優(yōu)選的實施方式已經(jīng)描述了組合物和方法，但在不偏離本文的概念、精神和范圍的情況下，變化可以應(yīng)用到本文描述的組合物和方法以及方法的步驟中或方法的步驟的順序中，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是明顯的。更具體地，某些化學和生理相關(guān)的劑可以替換本文描述的劑，同時獲得相同或相似的結(jié)果。對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，明顯的所有這些類似取代和修改都被認為在所附權(quán)利要求所限定的精神、范圍和概念內(nèi)。0090本申請中引用的所有文獻或文獻部分，包括但不限于專利、專利申請、文章、書和專著，通過引用全文明確并入本文。權(quán)利要求1.活的減毒病毒組合物，其包括一種或者多種活的減毒病毒；一種或者多種高分子量表面活性劑；一種或者多種蛋白質(zhì)劑，和一種或者多種糖劑；其中所述組合物能夠減少所述活的減毒病毒的失活。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、痘病毒家族和其組合。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述活的減毒病毒是黃病毒o4.根據(jù)權(quán)利要求l所述的病毒組合物，其中所述組合物為含水的形式。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述組合物是部分或全部脫水的。6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述表面活性劑具有1500或更大的分子量。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述表面活性劑還包括一種或者多種共聚物，其中所述所述表面活性劑的分子量是3000或更大。8.根據(jù)權(quán)利要求l所述的病毒組合物，其中所述表面活性劑由一種或者多種EO-PO嵌段共聚物組成。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述蛋白質(zhì)劑選自乳清蛋白、血清白蛋白、甲胎蛋白、維生素D結(jié)合蛋白、源于脊椎動物種的(X白蛋白和其組合。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述蛋白質(zhì)劑為源于脊椎動物種的血清白蛋白。11.根據(jù)權(quán)利要求l所述的病毒組合物，其中所述糖劑是糖類、多元醇或其組合的至少一種。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述糖劑的一種或多種選自海藻糖、蔗糖、殼聚糖、山梨糖醇、甘露醇和其組合。13.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中所述糖劑是海藻糖。14.根據(jù)權(quán)利要求1所述的病毒組合物，其中至少一種表面活性劑是EO-PO嵌段共聚物普魯羅尼克F127，至少一種蛋白質(zhì)劑是血清白蛋白，和至少一種糖劑是海藻糖。15.根據(jù)權(quán)利要求14所述的病毒組合物，其中所述EO-PO嵌段共聚物普魯羅尼克F127濃度為0.1%到4%(w/v)，其中所述血清白蛋白濃度為0.001%到3%(w/v)，并且所述海藻糖濃度為5%到50%(w/v)。16.減少活的減毒病毒組合物的失活的方法，其包括將一種或者多種活的減毒病毒與組合物組合，所述組合物包括一種或者多種高分子量表面活性劑、一種或者多種蛋白質(zhì)劑和一種或者多種糖類，其中所述組合物能夠減少所述活的減毒病毒的失活。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、痘病毒家族和其組合。18.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，水。19.根據(jù)權(quán)利要求18所述的方法，物部分或全部再水合。20.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，物的保存期。21.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，毒的失活減少24小時或更長。其還包括使所述組合部分或全部脫其還包括在施用之前，使所述組合其中所述組合物增加含水病毒組合其中所述組合物使含水活的減毒病22.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述組合物在一個或多個凍融循環(huán)期間減少含水活的減毒病毒的失活。23.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中至少一種高分子量表面活性劑是EO-PO嵌段共聚物普魯羅尼克F127，至少一種所述蛋白質(zhì)劑是血清白蛋白，和至少一種所述糖劑是海藻糖。24.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其中所述病毒組合物被施用給對象以減少健康狀況的發(fā)作或預防健康狀況。25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中所述健康狀況選自西尼羅河感染、登革熱、日本腦炎、庫阿撒魯爾森林病、澳洲墨萊溪谷腦炎、圣路易腦炎、蜱源腦炎、黃熱病和丙型肝炎病毒感染。26.減少活的減毒病毒組合物失活的試劑盒，其包括至少一個容器；和組合物，所述組合物包括一種或者多種蛋白質(zhì)劑、一種或者多種糖劑和一種或者多種高分子量表面活性劑，其中所述組合物減少活的減毒病毒的失活。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中至少一種表面活性劑是EO-PO嵌段共聚物普魯羅尼克F127,至少一種蛋白質(zhì)劑是血清白蛋白，和至少一種糖劑是海藻糖。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述海藻糖濃度為5%到50%(w/v)。29.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述EO-PO嵌段共聚物普魯羅尼克F127濃度為0.P/。至U4%(w/v)。30.根據(jù)權(quán)利要求27所述的試劑盒，其中所述血清白蛋白濃度為0.001%至1」3%(w/v)。31.根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其中所述組合物還包括一種或多種活的減毒病毒。32.根據(jù)權(quán)利要求31所述的試劑盒，其中所述活的減毒病毒選自黃病毒、披膜病毒、冠狀病毒、棒狀病毒、線狀病毒、副黏病毒、正黏病毒、布尼亞病毒、沙粒病毒、反轉(zhuǎn)錄病毒、嗜肝DNA病毒、皰疹病毒、痘病毒家族和其組合。全文摘要公開了減少包括疫苗的活的減毒病毒失活和/或降解的一種或多種活的減毒病毒和組合物。這個組合物可以包括至少一種糖類、至少一種蛋白質(zhì)和至少一種高分子量表面活性劑。文檔編號C12N7/04GK101679954SQ200880018784公開日2010年3月24日申請日期2008年4月4日優(yōu)先權(quán)日2007年4月6日發(fā)明者D·T·斯廷奇克姆,J·E·奧索里奧,O'n·威根申請人:伊維拉根公司