專利名稱：減毒活疫苗的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及可用在疫苗組合物中的在個體中維持的減毒活細菌的產(chǎn)生，具體而言，本發(fā)明涉及去除細菌的至少一種ABC-轉運蛋白的功能，從而產(chǎn)生在個體中維持并可用在疫苗組合物中的減毒細菌。
背景技術：
細菌感染由于導致發(fā)病和大量死亡而對畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失，并且對人類健康具有顯著影響。具體而言，呼吸道感染和敗血病是常見的感染性疾病，其可在整個動物群或人(個體)群中蔓延并對那些個體的健康產(chǎn)生不利影響。這可導致生產(chǎn)率顯著下降， 并最終導致個體的死亡。例如病原菌，尤其是支原體屬屬(Mycoplasma)的病原菌是呼吸道疾病的主要誘因。敗血病通常由大腸桿菌(E.coli)引起。據(jù)了解，包含經(jīng)減毒的諸如細菌或病毒的病原微生物的疫苗組合物可在被接種的動物和人體中有效產(chǎn)生保護性的免疫應答。這種減毒活疫苗是有利的，因為免疫后，由疫苗所依賴的病原有機體所產(chǎn)生的后續(xù)激發(fā)導致最初由接種所誘導的免疫應答的快速再次激發(fā)。該作用為抑制病原體增殖并防止臨床相關疾病的發(fā)展。通常，通過完全或部分去除一種或多種毒力因子使得有機體不再是病原性的來實現(xiàn)用在疫苗中的病原有機體的減毒。所公知的毒力因子具有直接致病和/或允許有機體在宿主中維持的那些特性。促進有害宿主應答的那些特性也是公知的毒力因子。通常的毒力因子包括例如，毒素、附著胞器(attachment organelle)和免疫逃避機制。這提出的問題在于多種毒力因子參與誘導免疫，并且因此毒力因子的缺失使得以這種方式被減毒的有機體的免疫原性減弱。減毒活疫苗優(yōu)選仍是抗原性的，并且因此能誘導充足水平的宿主免疫， 同時是非病原性的。通常，減毒活疫苗不在個體中維持，并且這可歸于疫苗所依賴的減毒活有機體的免疫原性的降低。盡管諸如毒素的某些毒力因子是用于減毒的明顯靶標，但是不被認為是毒力因子的因子不是用于減毒的明顯靶標。那些因子對有機體毒力的減毒效應不明顯或不容易預測。ABC(ATP-結合盒)轉運蛋白超家族的成員通常不被認為是毒力因子。ABC轉運蛋白包含功能是穿過細胞內(nèi)膜和細胞外膜轉送底物的膜蛋白。由ABC轉運蛋白運送的物質(zhì)包括肽、寡肽、蛋白質(zhì)、代謝產(chǎn)物、脂質(zhì)、固醇和藥物。ABC轉運蛋白的序列比較表明，該超家族的基因和蛋白質(zhì)在遠源相關的門類中是保守的。本發(fā)明基于這個出人意料的發(fā)現(xiàn)如在在宿主-疾病模型系統(tǒng)中所評價的，病原有機體中ABC-轉運蛋白基因的功能突變?nèi)笔乖摬≡袡C體減毒，但是該減毒有機體保持免疫原性，且在個體中維持。
發(fā)明概述第一方面，提供了通過至少一種ABC轉運蛋白基因的突變而被減毒的細菌，其中所述突變使得相應的ABC轉運蛋白沒有功能，并且其中所述減毒細菌在個體中維持。第二方面，提供了使細菌減毒的方法，所述方法包括使至少一種ABC轉運蛋白基因突變，并且其中所述減毒細菌在個體中維持。第三方面，提供了包含至少一種第一方面的減毒細菌的免疫原性組合物。第四方面，提供了疫苗組合物，包含免疫原性有效量的至少一種第一方面的減毒細菌和藥理學上可接受的載體。第五方面，提供了用于治療或預防疾病的疫苗組合物的用途，其中所述疫苗組合物包含至少一種第一方面的減毒細菌。第六方面，提供了預防或改善個體疾病的方法，所述方法包括給予所述個體治療有效劑量的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物包含至少一種第一方面的減毒細菌。第七方面，提供了預防疾病的方法，所述方法包括給予需要預防的個體治療有效劑量的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物包含至少一種第一方面的減毒細菌。在一個實施方案中，可以通過插入、缺失、取代或以上的任意組合來產(chǎn)生突變，所述插入突變例如可以通過同源重組、轉座子誘變和序列標簽誘變來產(chǎn)生。在一個實施方案中，所述ABC轉運蛋白基因可以是編碼ABC-肽轉運蛋白的基因。 例如 CvaB、CylB, SpaB、NisT、EpiT、ComA, PedD, LcnC、McbEF, OppD 和 DppD 以及它們的同源物，并且特別是ABC轉運蛋白基因可以編碼OppD。在一個實施方案中，所述細菌可以選自禽桿菌屬(Avikicterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、布魯氏菌屬(Brucella)、巴爾通氏體菌屬(Bartonella)、博德特氏菌屬(Bordetella)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、弧菌屬(Vibrio)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、梭菌屬(Clostridium)、彎曲桿菌屬 (Campylobacter)、衣原體屬(Chalmydia)、考克斯氏體屬(Coxiella)、丹毒絲菌屬 (Erysipelothrix)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、李斯特氏菌屬(Listeria)、放線
(Actinobacillus) > Bf ifil ^ M (Haemophilus) > ff ^ M (Helicobacter)、H 胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Streptococcus)、志賀氏菌屬(Shigella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、支原體屬(Mycoplasma)、分支桿菌屬 (Mycobacterium)、曼海姆氏菌屬(Mannheimia)、鳥桿菌屬(Ornithobacterium)、立克次氏體屬(Rickettsia)、尿支原體屬(Ureaplasma)和巴斯德氏菌屬(Pasteurella)。減毒細 ^X^nT^^SOXl^ff ‘ (Avibacterium paragallinarum) >-^ff ^ ‘ (Bordetella avium) > - If lif (Ornithobacterium rhinotracheale)Π 1 lif (Salmonella
enteritidis)、出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血曼海姆氏菌 (Mannheimia haemolytica)、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、無乳支原體(Mycoplasma agalactiae)、甲鳥支原體(Mycoplasma anatis)、鵝支原體(Mycoplasma anseris)、模仿支原體(Mycoplasma imitans)、產(chǎn)喊支原體(Mycoplasma alkalescens)、 精氨酸支原體(Mycoplasma arginini)、微小脲原體(Ureaplasma parvum)、關節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritidis)、牛生殖道支原體(Mycoplasma bovigenitalium)、牛鼻支原體(Mycoplasma bovirhinis)、牛支原體(Mycoplasma bovis)、牛目艮支原體(Mycoplasma bovoculi)、力口禾Ij福尼亞支原體(Mycoplasma californicum)、山羊支原體(Mycoplasma capricolum)、殊異支原體(Mycoplasma dispar)、涯貓支原體(Mycoplasma felis)、 發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)、生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)、人型支原體(Mycoplasma hominis)、豬月市炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)、豬關節(jié)液支原體(Mycoplasma hyosynoviae)、衣阿華支原體(Mycoplasma iowae)、蕈狀支原體蕈狀亞種(Mycoplasma mycoides subsp mycoides)大集落和小集落、雞敗血支原體(Mycoplasma gallis印ticum)、關節(jié)液支原體(Mycoplasma synoviae)、□腔支原體(Mycoplasma orale)、穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、羊月市炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)、雞氣管支原體(Mycoplasma pullorum)、Mycoplasma alligatorus、月市炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、Mycoplasma maleagridis、貓血支原體(Mycoplasma haemofelis)、Mycoplasma haemominutum、 Mycoplasma haematoparvum0 在一個實施方案中，細菌可以是禽病原性大腸桿菌菌株E956或雞敗血支原體菌株Ap3AS。 在一個實施方案中，所述減毒活細菌可以表達異源抗原。所述異源抗原可以由另一種病原有機體的核酸編碼。編碼異源抗原的核酸可從以下屬中分離禽桿菌屬、芽孢桿菌屬、布魯氏菌屬、巴爾通氏體菌、博德特氏菌屬、伯克氏菌屬、弧菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、梭菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬、考克斯氏體屬、丹毒絲菌屬、弗朗西絲氏菌屬、李斯特氏菌屬、放線桿菌屬、嗜血菌屬、螺桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、志賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬、支原體屬、分支桿菌屬、曼海姆氏菌屬、鳥桿菌屬、立克次氏體屬、葡萄球菌Staphylococci)、尿支原體屬和巴斯德氏菌屬。編碼異源抗原的核酸尤其可來源于副雞禽桿菌、鳥博德特氏菌、鼻腔鳥桿菌、腸炎沙門氏菌、出血敗血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬肺炎支原體、雞敗血支原體或關節(jié)液支原體、副雞禽桿菌、鳥博德特氏菌、鼻腔鳥桿菌、無乳支原體、產(chǎn)堿支原體、鴨支原體、鵝支原體、模仿支原體、精氨酸支原體、微小脲原體、關節(jié)炎支原體、牛生殖道支原體、牛鼻支原體、牛支原體、牛眼支原體、加利福尼亞支原體、山羊支原體、殊異支原體、貍貓支原體、發(fā)酵支原體、生殖道支原體、人型支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬關節(jié)液支原體、衣阿華支原體、蕈狀枝原體蕈狀亞種大集落和小集落、雞敗血支原體、關節(jié)液支原體、口腔支原體、穿透支原體、羊肺炎支原體、雞氣管支原體、Mycoplasma alligatorus、肺炎支原體、支原體屬、Mycoplasma maleagridis、貓血支原體、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum。編石馬異源抗原的核酸可從選自以下的病毒分離新城疫病毒(Newcastle Disease virus)、傳染性支氣管炎病毒、禽肺病毒、鳥痘病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽流感病毒、鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、雛雞傳染性貧血病毒、馬立克氏病病毒。
所述個體為脊椎動物，包括人類、牛類、犬類、貓類、山羊類、綿羊類、豬類、駱駝類 (camelid)、馬類和禽類。所述牛類個體可以是母牛、公牛、野?；蛩?。所述犬類個體可以是狗。所述貓類個體可以是貓。所述山羊類個體可以是山羊。所述綿羊類個體可以是綿羊。所述豬類個體可以是豬。所述駱駝類個體可以是駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝、瘦駝或駱馬。所述馬類個體可以是馬、驢、斑馬或騾。所述禽類個體可以是任何商購的或馴養(yǎng)的禽類。特別是，所述禽類可以是雛雞(包括矮腳雞)、火雞、鴨、鵝、雉、鵪鶉、山鶉、鴿、珍珠雞、 鴕鳥、鴯鹋或孔雀。所述疫苗組合物和免疫原性組合物還可以包含至少一種藥學上可接受的載體或稀釋劑，例如水、鹽水、培養(yǎng)液、穩(wěn)定劑、碳水化合物、蛋白質(zhì)、諸如牛血清或脫脂乳的含蛋白質(zhì)的試劑和緩沖液或以上的任意組合。所述穩(wěn)定劑可以是SPGA。所述碳水化合物包括例如，山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、 葡萄糖、葡聚糖或以上的組合。此外，諸如白蛋白或酪蛋白的蛋白質(zhì)或諸如牛血清或脫脂乳的含蛋白質(zhì)的試劑可用作藥學上可接受的載體或稀釋劑。用作藥學上可接受的載體或稀釋劑的緩沖液包括馬來酸鹽、磷酸鹽、CABS、哌啶、 甘氨酸、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸鹽、 琥珀酸鹽、MES、組氨酸、雙-tris (bis-tris)、磷酸鹽、乙醇胺、ADA、碳酸鹽、ACES、PIPES、咪唑、雙三羥基甲氨基丙烷、BES、MOPS、HEPES, TES、MOPSO, MOBS、DIPSO、TAPSO, TEA、焦磷酸鹽、HEPPSO、POPSO、三(羥甲基)甲基甘氨酸(tricine)、胼、雙甘氨肽、TRIS、EPPS、二(羥乙基)甘氨酸、HEPBS, TAPS、AMPD, TABS、AMPS0、?；撬?、硼酸鹽、CHES、甘氨酸、氫氧化銨、 CAPS0、碳酸鹽、甲胺、哌嗪、CAPS或以上的任意組合。所述疫苗組合物和免疫原性組合物可以是低壓凍干的或冷凍干燥的。在某些實施方案中，所述疫苗組合物或免疫原性組合物海可以包含至少一種佐劑。佐劑的實例包括弗氏完全佐劑或弗氏不完全佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物油、植物油、卡波姆氫氧化鋁、磷酸鋁、氧化鋁、油乳劑(例如Bayol F 或Marcol 52 中的)、皂苷或維生素-E增溶劑或以上的任意組合。在某些實施方案中，所述疫苗組合物可以包含尤其可應用于粘膜的佐劑，例如大腸桿菌不耐熱毒素或霍亂毒素。所述疫苗組合物或免疫原性組合物可以經(jīng)鼻內(nèi)給藥、眼科給藥、皮內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、口服給藥、氣霧劑(噴霧接種)給藥、經(jīng)泄殖腔或肌內(nèi)給藥。當個體是禽類時，優(yōu)選滴眼劑和氣霧劑給藥。當將疫苗組合物或免疫原性組合物給予大量的個體而言，尤其優(yōu)選噴霧給藥。所述免疫原性組合物或疫苗組合物每劑量可以包含至少約IO3-約IO5個減毒細菌、或者約IO5-約IO7個減毒細菌、或者約IO7-約IO9個減毒細菌、或者約IO9-約IO11個減毒細菌、或者約IO11-約IO13個減毒細菌、或者約IO13-約IO15個減毒細菌、或者約IO15-約 IO17個減毒細菌、或者約IO17-約1019、或者至少約IO19個減毒細菌。定義如在本申請中所用，單數(shù)形式“a (—個)”、“an (一個)，，和"the (這個)”包括復數(shù)形式，除非文中明確指出不是復數(shù)。例如術語“an ABC轉運蛋白”也包括多個ABC轉運蛋白。在本說明書的背景下，術語“包含(comprising)”表示“主要包括，而不是必需只包含”。此外，該詞“包含(comprising)”的變體，例如“包含(comprise) ”和“包含 (comprises)，，具有相應變化的含義。本文所用的術語“免疫原性有效的”表示接種時或給予免疫原性組合物時，給予的減毒活細菌的量足以在個體中誘導針對毒力形式的細菌的有效免疫應答。
本文所用的術語“治療(treating) ”和“治療(treatment) ”指的是治療疾病狀況或癥狀、預防疾病狀況或疾病建立或無論以任何方式預防、阻止、延遲或逆轉疾病狀況或疾病的進程或其它不需要的癥狀的任何或全部用途。本文所用的術語“維持(persist) ”和“維持(persistent) ”指的是建立和/或維持至少一部分個體的感染或建群。維持包括有機體在組織中存活的狀態(tài)，無論復制與否。維持可與臨床相關疾病有關或無關。附圖簡要說明

圖1是成分和實驗方案的示意性設計。A.信號標記的轉座子(signature-tagged transposon) ^ *結構。B· /[言號 +示i己的"(signature-tagged mutagenesis, STM)實驗的設計圖2是對特定標簽的檢測。利用P2/P4引物對通過PCR篩查顯示出色變的肉湯培養(yǎng)物(broth culture)，以檢測各自的信號標簽。每一樣品與DNA大小標志物(用HaeIII 消化的PUC18) —起在2%的瓊脂糖凝膠中電泳。泳道1，攜帶標簽02的ST突變體；泳道2， 攜帶標簽03的ST突變體；泳道3，攜帶標簽04的ST突變體；泳道4，攜帶標簽06的ST突變體；泳道5，攜帶標簽07的ST突變體；泳道6，陰性對照。泳道7，含有攜帶標簽02的轉座子的質(zhì)粒作為模板的陽性對照。圖3是對STM轉化體的證實。利用P2/P4引物對通過PCR篩查顯示出色變的轉化體，以證實個體信號標簽的存在。每一樣品(ample)與用HaeIII消化的pUC18d的DNA大小標志物一起在2%的瓊脂糖凝膠中電泳。泳道1，含有標簽02的重組Mg ；泳道2，標簽03 轉化體；泳道3，標簽04克??；泳道4，標簽06轉化體；泳道5，攜帶標簽07的轉化體；+，用標簽02質(zhì)粒作為模板的陽性對照。_，未添加模板的陰性對照。圖4是確證篩選的實驗設計。圖5是ST突變體的序列和Southern印跡分析。A.直接測序所獲得的電色圖譜。(I).攜帶單轉座子的ST突變體沈-2，具有的可讀序列并入基因組。在ST突變體15-1(11)和25-1(111)中，在轉座子和宿主菌株基因組的連接點處能觀察到混合的序列信號。B.通過Southern印跡所檢測的多重插入。泳道1，ST突變體15-1 ；泳道2，ST突變體15-2 ；泳道3，ST突變體15-3 ；泳道4，ST突變體25_1 ；泳道5，ST突變體25_2 ；泳道 6，ST突變體25-3。DNA大小標準品是用HindIII消化的噬菌體λ DNA。圖6是毒力和感染力研究中鳥的RSA的分布和氣囊損傷評分。Α.感染2周后的 RSA評分。B.氣囊損傷評分。組1，陰性對照；組2，經(jīng)ST突變體04-1感染；組3，經(jīng)ST突變體33-1感染；組4，經(jīng)ST突變體03-1感染；組5，經(jīng)ST突變體感染；組6，經(jīng)ST突變體18-1感染；組7，經(jīng)ST突變體20-1感染；組8，經(jīng)ST突變體22_1感染；組9，陽性對照 (經(jīng)野生型Ap3AS感染)。圖7是鳥的RSA分布和氣囊損傷評分。A.第28天時的RSA評分。B.氣囊損傷評分。6個不同氣囊評分的總和。組1，陰性對照；組2，陽性對照(經(jīng)野生型Ap3AS感染)； 組3，接種對照(接種ST突變體沈-1)；組4，經(jīng)接種(ST突變體26-1)和激發(fā)(經(jīng)野生型 Ap3AS 感染)。圖8.用于同源重組的PCR構建體的示意圖。用所述的寡核苷酸引物產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。利用引物對TX/TY擴增卡那霉素基因，用于oppA和dppD基因構建體。對于oppD，通過利用WS/WU和WY/WT的其它PCR產(chǎn)物或對于dppD，通過在PCR中利用60個核苷酸的引物 WE/WF來產(chǎn)生和添加構建體臂。圖9.利用PCR對同源重組的檢測。dppD(A面)和oppD(B面)基因的寡核苷酸引物用在PCR中，以利用oppD的引物對WS/WT和dppD的引物對TZ/UA在大腸桿菌菌株中擴增各自的區(qū):Ε956 (Α和B面的泳道1)、Δ dppD (Α面的泳道1)和Δ oppD (B面的泳道1)。圖10.大腸桿菌E956dppD和oppD敲除體的Southern印跡。對卡那霉素、dppD和 oppD探針進行放射性標記，并用來探測I3Stl限制性的大腸桿菌E956、Δ dppD和Δ oppD的基因組DNA，分別為泳道1、2和3。詳細描述本發(fā)明涉及在個體中維持的減毒活細菌及其在疫苗組合物中的用途。所述減毒細菌由于編碼ABC轉運蛋白的核酸發(fā)生突變而缺少至少一種功能性的ABC轉運蛋白?？梢越柚魏问侄问沟肁BC轉運蛋白沒有功能，但是這通常通過編碼ABC轉運蛋白的核酸的突變來實現(xiàn)。通常，所述突變是插入、缺失或移碼突變或以上的任何組合。在某些實施方案中， 所述減毒活細菌還可以表達異源抗原。任何類型的細菌均可以按本發(fā)明被減毒，但是脊椎動物病原菌且尤其是禽病原菌的減毒是優(yōu)選的。細菌在一個實施方案中，本發(fā)明涉及用在疫苗組合物中的減毒活細菌但不限于放線桿菌屬、氣單胞菌屬、禽桿菌屬、桿菌屬、布魯氏菌屬、巴爾通氏體菌、博德特氏菌屬、伯克氏菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、梭菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬、考克斯氏體屬丹毒絲菌屬、弗朗西絲氏菌屬、李斯特氏菌屬、放線桿菌屬、嗜血菌屬、螺桿菌屬、李斯特氏菌屬、氣單胞菌屬、巴斯德氏菌屬、鏈球菌屬、志賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬、支原體屬、分支桿菌屬、鳥桿菌屬、曼海姆氏菌屬、弧菌屬、立克次氏體屬、假單胞菌屬、葡萄球菌、尿支原體屬和巴斯德氏菌屬。這些菌屬包括對禽和各種不同的動物包括人是病原性的大多數(shù)物種。特別是，減毒細菌可以是但不限于副雞禽桿菌、鳥博德特氏菌、鼻腔鳥桿菌、腸炎沙門氏菌、出血敗血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬肺炎支原體、雞敗血支原體、關節(jié)液支原體、無乳支原體、產(chǎn)堿支原體、鴨支原體、鵝支原體、模仿支原體、精氨酸支原體、微小脲原體、關節(jié)炎支原體、牛生殖道支原體、牛鼻支原體、牛支原體、牛眼支原體、加利福尼亞支原體、山羊支原體、殊異支原體、貍貓支原體、發(fā)酵支原體、生殖道支原體、人型支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬關節(jié)液支原體、衣阿華支原體、蕈狀枝原體蕈狀亞種大集落和小集落、雞敗血支原體、關節(jié)液支原體、口腔支原體、穿透支原體、羊肺炎支原體、雞氣管支原體、Mycoplasma alligatorus、肺炎支原體、支原體屬、Mycoplasma maleagridis、貓血支原體、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum。在一個實施方案中，所述減毒活細菌可以選自大腸桿菌或雞敗血支原體。所述大腸桿菌可以是禽病原性大腸桿菌E956，以及所述雞敗血支原體可以是雞敗血支原體Ap3AS。在個體中維持所述減毒活細菌在個體中維持。減毒細菌的維持優(yōu)選在個體-疾病模型系統(tǒng)中評價，但是也可以在已經(jīng)給予了本文描述的疫苗組合物或免疫原性組合物的個體中維持?？梢酝ㄟ^觀察臨床體征和/或癥狀來評價減毒細菌的維持?？蛇x地或此外，可以通過測定采自個體的樣品中減毒細菌的存在來評價維持。所述樣品可以是組織樣品(例如血液、皮膚毛發(fā)、口腔拭子(buccal scraping))或者身體分泌物或排泄物樣品，例如粘液、尿、糞便、淚液?？梢栽趥€體活著時或者在尸檢或驗尸時采集樣品?？梢酝ㄟ^培養(yǎng)、諸如ELISA或PCR 的分子方法或本領域內(nèi)已知的任何方法來評估樣品中減毒細菌的存在。此外，在尸檢或驗尸時觀察個體的受影響的部位也可以確定減毒細菌在個體中的維持。ABC轉運蛋白ATP-結合盒轉運蛋白(ABC轉運蛋白)形成了最大的蛋白質(zhì)和基因超家族之一，在從原核生物到人類的所有門類中均有代表。ABC轉運蛋白是利用ATP來運送物質(zhì)穿過細胞膜的跨膜蛋白。這些物質(zhì)包括代謝物、肽、寡肽、脂質(zhì)和固醇和藥物。 在細菌中，根據(jù)每種ABC轉運蛋白轉送底物的類型，將ABC轉運蛋白細分成三個主要的組。這些組是蛋白質(zhì)轉運蛋白、肽轉運蛋白和運送非蛋白質(zhì)底物的系統(tǒng)。按照本發(fā)明，可以通過使任何這些類別中的至少一種ABC轉運蛋白基因發(fā)生突變，使得細菌缺少至少一種功能性的ABC轉運蛋白來產(chǎn)生減毒活細菌。特別感興趣的是ABC-肽轉運蛋白，其包括例如，CvaB(大腸桿菌)、CylB(糞腸球菌(Enterococcus faecalis) )、SpaB (枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis))、NisT (乳酸乳球菌(Lactococcus lactis) 6F3)、EpiT (表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis))、 ComA (月市炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)), PedD (乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici))、LcnC(乳酸乳球菌乳酸亞禾中(Lactococcus lactis subsp. Lactis))、 McbEF(大腸桿菌)、OppD和DppD (大腸桿菌和雞敗血支原體(M. gallisepticum))以及它們在其它物種中的同源物。個體預期被給予所述減毒活細菌的個體可以是任何脊椎動物，包括人類、牛類、犬類、 貓類、山羊類、綿羊類、豬類、駱駝類、馬類和禽類。所述牛類個體可以是母牛、公牛、野?；蛩?。所述犬類個體可以是狗。所述貓類個體可以是貓。所述山羊類個體可以是山羊。所述綿羊類個體可以是綿羊。所述豬類個體可以是豬。所述駱駝類個體可以是駱駝、單峰駱駝、美洲駝、羊駝、瘦駝或駱馬。所述馬類個體可以是馬、驢、斑馬或騾。所述禽類個體可以是任何商購的或馴養(yǎng)的禽類。特別是，所述禽類可以是雛雞(包括矮腳雞)、火雞、鴨、鵝、 雉、鵪鶉、山鶉、鴿、珍珠雞、鴕鳥、鴯鹋或孔雀。突變用于產(chǎn)生非功能性的ABC轉運蛋白的突變可以是插入、缺失或取代突變或以上的組合，只要所述突變導致不能表達功能性的ABC轉運蛋白。ABC轉運蛋白可具有多種功能， 例如ATP-結合或寡肽結合功能。非功能性的ABC轉運蛋白包括至少一種功能是缺陷的ABC 轉運蛋白。這類突變可以是插入、缺失、取代突變或以上的任意組合，只要所述突變導致不能表達功能性的ABC轉運蛋白。在優(yōu)選的實施方案中，所述突變是敲除突變，其中編碼ABC轉運蛋白的核酸的至少實質(zhì)性部分是缺失的。例如可以通過同源重組、轉座子誘變或序列標簽誘變來產(chǎn)生插入突變。
可以通過多種方式來獲得用于本發(fā)明的減毒活細菌。例如可以通過用誘變劑處理野生型細菌來制備減毒活細菌，所述誘變劑例如嘌呤或嘧啶類似物、紫外線、電離輻射、DNA 嵌入劑、溫度處理、轉座子誘變。這些方法不會將突變靶向特定的基因，因此需要通過本領域內(nèi)已知的方法來篩查處理過的減毒的細菌，例如通過對靶基因的DNA序列分析并聯(lián)合病原性研究。利用諸如定點誘變的已知方法的重組DNA技術可用來在特定基因(例如oppD)的預定位點引入突變。定點誘變可用來引入諸如一個或多個核苷酸的插入、缺失、替代的突變，使得該突變的基因不再表達功能性的ABC轉運蛋白。這類突變例如可通過若干核酸的缺失來產(chǎn)生。少至單個堿基，進而產(chǎn)生移碼的缺失能使得ABC蛋白沒有功能。在某些實施方案中，缺失更多的堿基。在其它實施方案中，可以缺失大多數(shù)或全部編碼ABC轉運蛋白的基因。引入終止密碼子或移碼的突變適于獲得非功能性的ABC轉運蛋白。編碼ABC轉運蛋白的基因不僅包含編碼序列，還包含調(diào)控序列，例如啟動子?；蜻€包含用于糾正mRNA翻譯所必需的區(qū)域，例如核糖體結合位點。因此，減毒活細菌所包含的突變不僅可以在編碼區(qū)中，還可以或可選擇地在轉錄和翻譯所必需的序列中，例如在啟動子和核糖體結合位點中。與自發(fā)突變所產(chǎn)生的減毒細菌相反，由諸如缺失ABC轉運蛋白基因片段或缺失全部ABC轉運蛋白基因或插入異源DNA片段或以上的組合的突變所產(chǎn)生的減毒細菌具有不能恢復為野生型病原菌的優(yōu)勢。因此，在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明提供了其中至少一種ABC 轉運蛋白基因包含插入和/或缺失的減毒活細菌。表達異源抗原的減毒細菌在一個實施方案中，所述減毒活細菌可以用作編碼其它病原菌或病毒抗原的異源基因的載體。這允許減毒活細菌用來激發(fā)對多種疾病的免疫應答。編碼ABC轉運蛋白的基因可用作異源基因的插入位點。使用ABC轉運蛋白基因作為插入點是有利的，因為編碼異源抗原的序列的插入既失活了 ABC轉運蛋白又引入了編碼一種或多種異源抗原的序列?？梢岳帽绢I域內(nèi)已知的標準技術常規(guī)地進行這類重組細菌的構建。另一個實施方案涉及選自禽桿菌屬、葡萄球菌屬Staphylococcus)、埃希氏菌屬、布魯氏菌屬、沙門氏菌屬、博德特氏菌屬、伯克氏菌屬、弧菌屬、嗜血菌屬、鳥桿菌屬、曼海姆氏菌屬、巴斯德氏菌屬、梭菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬、考克斯氏體屬、丹毒絲菌屬、 弗朗西絲氏菌屬、李斯特氏菌屬、放線桿菌屬、嗜血菌屬、螺桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、志賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬、支原體屬、分支桿菌屬、立克次氏體屬、尿支原體屬和鏈球菌屬的減毒活重組細菌，其不能產(chǎn)生功能性的ABC轉運蛋白并且在其中插入了異源核酸。 異源核酸可以編碼選自另一種病原微生物或病毒的抗原。核酸可以編碼選自以下病原有機體的抗原副雞禽桿菌、鳥博德特氏菌、鼻腔鳥桿菌、腸炎沙門氏菌、出血敗血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、豬肺炎支原體、雞敗血支原體或關節(jié)液支原體、無乳支原體、產(chǎn)堿支原體、鴨支原體、鵝支原體、模仿支原體、精氨酸支原體、微小脲原體、關節(jié)炎支原體、牛生殖道支原體、牛鼻支原體、牛支原體、牛眼支原體、加利福尼亞支原體、山羊支原體、殊異支原體、貍貓支原體、發(fā)酵支原體、生殖道支原體、人型支原體、豬鼻支原體、豬關節(jié)液支原體、衣阿華支原體、蕈狀枝原體蕈狀亞種大集落和小集落、口腔支原體、穿透支原體、羊肺炎支原體、雞氣管支原體、Mycoplasma alligatorus、肺炎支原體、支原體屬、Mycoplasma maleagridis、貓血支原體、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum，或可以編碼選自以下但不限于以下病毒的抗原新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽肺病毒、鳥痘病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽流感病毒、 鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、雛雞傳染性貧血病毒和馬立克氏病病毒。在另一個實施方案中，ABC轉運蛋白基因可以完全或部分由編碼功能為引發(fā)或提高免疫應答的蛋白質(zhì)的核酸替代，所述蛋白質(zhì)例如白細胞介素或干擾素。疫苗組合物所述減毒活細菌適于用在疫苗組合物中。所述疫苗組合物可以包含能在個體中維持的免疫原性有效量的減毒活細菌和藥學上可接受的載體或稀釋劑。本文所述的疫苗組合物或免疫原性組合物可經(jīng)鼻內(nèi)給藥、眼科給藥、皮內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、口服給藥、經(jīng)泄殖腔給藥、氣霧劑(噴霧接種)或肌內(nèi)給藥。特別是，當個體是禽類時， 優(yōu)選滴眼劑和氣霧劑給藥。當將疫苗組合物或免疫原性組合物給予大量的個體而言，尤其優(yōu)選噴霧給藥。在一種形式中，本發(fā)明提供了用于預防或治療動物和人抗其非減毒形式包含ABC 轉運蛋白基因的細菌感染的減毒活疫苗組合物。藥學上可接受的載體或稀釋劑可以選自水、鹽水、培養(yǎng)液、穩(wěn)定劑、碳水化合物、蛋白質(zhì)、諸如牛血清或脫脂乳的含蛋白質(zhì)的試劑和緩沖液或以上的任意組合。所述穩(wěn)定劑可以是SPGA (每升 SPGA 含 74. 62g 蔗糖、0. 52g KH2PO4U. 25g K2HPO4, 0. 912g谷氨酸鉀和IOg血清白蛋白)。用作藥學上可接受的載體或稀釋劑的碳水化合物例如是山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖或以上的組合。此外，諸如白蛋白或酪蛋白的蛋白質(zhì)或諸如牛血清或脫脂乳的含蛋白質(zhì)的試劑可用作藥學上可接受的載體或稀釋劑。同藥學上可接受的載體或稀釋劑磷酸緩沖液一樣的緩沖液可以選自馬來酸鹽、磷酸鹽、CABS (環(huán)己胺基)-1- 丁磺酸)、哌啶、甘氨酸、檸檬酸鹽、雙甘氨肽、蘋果酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸鹽、琥珀酸鹽、MES(2-(N-嗎啉代)乙磺酸水合物、4-嗎啉乙磺酸)、組氨酸、雙-tris(2，2-雙(羥甲基)-2，2'，2〃 -三乙醇胺)、磷酸鹽、乙醇胺、ADA(N-乙酰氨基)亞氨基二乙酸、N-(氨基甲酰甲基)亞氨基二乙酸)、碳酸鹽、ACES (N-(2-乙酰氨基)-2-氨基乙磺酸)、PIPES (1，4-哌嗪二乙磺酸)、咪唑、雙三羥基甲氨基丙烷(1，3_雙[三(羥甲基)甲氨基]丙烷)、BES(N，N-雙(2-羥乙基)-2-氨基乙磺酸)、M0PS(3-(N-嗎啉代)丙磺酸)、HEPES(4-(2-羥乙基)哌嗪-1-乙磺酸)、TES(2-[(2-羥基-l，l-雙(羥甲基)乙基)氨基]乙磺酸)、M0PS0 (3-嗎啉-2-羥基丙磺酸)、MOBS (4- (N-嗎啉代)丁磺酸)、DIPSO (3- (N, N-雙[2-羥乙基]氨基)-2-羥基丙磺酸)、TAPSO (2-羥基-3-[三(羥甲基)甲氨基]-1-丙磺酸)、TEA (三乙醇胺)、焦磷酸鹽、HEPPSO (4-(2-羥乙基)哌嗪-1-(2-羥基丙磺酸)水合物)、P0PS0 (無水哌嗪-1， 4-雙(2-羥基丙磺酸))、三羥甲基甲基甘氨酸、胼、雙甘氨肽、TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)、EPPSG-(2-羥乙基)-1-哌嗪丙磺酸)、二(羥乙基)甘氨酸、HEPBS(N-(2-羥乙基) 哌嗪-N' -(4-丁磺酸))、TAPS([(2-羥基-1，1-雙(羥甲基)乙基)氨基]-1-丙磺酸)、 AMPD(2-氨基-2-甲基-1，3-丙二醇)、TABS(N-三(羥甲基)甲基_4_氨基丁磺酸)、AMPSO (N- (1，1-二甲基-2-羥乙基)-3-氨基-2-羥基丙磺酸)、牛磺酸、硼酸鹽、CHES (2-(環(huán)己胺基)乙磺酸)、AMP(2-氨基-2-甲基-1-丙醇)、甘氨酸、氫氧化銨、CAPSO (3-(環(huán)己胺基)-2-羥基-1-丙磺酸)、碳酸鹽、甲胺、哌嗪、CAPS (3-(環(huán)己胺基)-1-丙磺酸)或以上的任意組合。通過添加穩(wěn)定劑，所述疫苗組合物適于按照本領域內(nèi)已知的方法低壓干燥或冷凍干燥。因此，在實施方案中，所述疫苗組合物是冷凍干燥的或低壓凍干的。在某些實施方案中，所述疫苗組合物可以包含至少一種具有佐劑活性的化合物。 適于用在疫苗組合物中的佐劑的實例可以選自弗氏完全或弗氏不完全佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物油、植物油、卡波姆氫氧化鋁、磷酸鋁、氧化鋁、油乳劑(例如Bayol F 或Marcol 52 中的)、皂苷或維生素-E增溶劑或以上的任意組合。 在某些實施方案中，所述疫苗組合物可以包含尤其可應用于粘膜的佐劑，例如大腸桿菌不耐熱毒素或霍亂毒素?？梢詫⒈景l(fā)明的疫苗組合物配制成氣霧劑(噴霧疫苗)使用?？梢葬槍ρ劭朴猛九渲票景l(fā)明的疫苗組合物，例如以滴眼劑的形式配制。例如滴眼劑可以是水性滴眼劑、非水性滴眼劑、懸浮液滴眼劑或乳化滴眼劑。通過將減毒活細菌懸浮在水性溶劑或非水性溶劑中來制備滴眼劑，所述水性溶劑例如無菌蒸餾水、生理鹽水溶液等，所述非水性溶劑例如包括棉籽油、大豆油、芝麻油、花生油的植物油、礦物油等。任選地，可以添加等滲劑、PH調(diào)節(jié)劑、增稠劑、懸浮劑、乳化劑和防腐劑。等滲劑包括例如氯化鈉、硼酸、硝酸鈉、硝酸鉀、D-甘露醇、葡萄糖。pH調(diào)節(jié)劑包括硼酸、無水亞硫酸鈉、鹽酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、乙酸、醋酸鉀、碳酸鈉、硼砂和本文列出的任何緩沖液。增稠劑可以選自甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、聚乙烯醇、硫酸軟骨素鈉、聚乙烯吡咯烷酮或以上的任意組合。懸浮劑可以選自聚山梨醇酯80、聚氧乙烯氫化蓖麻油60、聚氧蓖麻油或以上的組合。此外，乳化劑的實例包括蛋黃卵磷脂和聚山梨醇酯80。此外可以使用的防腐劑例如苯扎氯胺、芐索氯銨、氯代丁醇、苯基乙醇、對羥基苯甲酸或以上的組合。劑量除了給藥方式和接種所針對的病原體類型之外，給藥劑量通常隨年齡、體重和待接種的動物而改變。所述疫苗組合物可以包含足以激發(fā)免疫應答的任何劑量的細菌。例如劑量可以包含至少約IO3-約IO5個減毒細菌、或者約IO5-約IO7個減毒細菌、或者約IO7-約IO9個減毒細菌、或者約IO9-約IO11個減毒細菌、或者約IO11-約IO13個減毒細菌、或者約IO13-約IO15 個減毒細菌、或者約IO15-約IO17個減毒細菌、或者約IO17-約1019、或者至少約IO19個減毒細菌。在一個實施方案中，所述疫苗組合物可以作為氣霧劑給藥。治療1立方米的劑量可以包含至少IO6-約IO8個減毒細菌或約IO8-約101°個減毒細菌、或約101°-約1012、或約 IO12-約IO14個減毒細菌、或約IO16-約IO18個減毒細菌、或約IO8-約102°個減毒細菌、或至少約102°個減毒細菌。給藥方式本發(fā)明的疫苗組合物可以經(jīng)鼻內(nèi)給藥、皮內(nèi)給藥、經(jīng)泄殖腔給藥、靜脈內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、皮下給藥、口服給藥、氣霧劑(噴霧接種)給藥、于飲用水中給藥、于食物中給藥或肌內(nèi)給藥。為了應用于家禽，優(yōu)選借助氣霧劑和滴眼劑給藥來給予。在存在待接種的多個個體的情況下，噴霧接種是特別優(yōu)選的，因為其允許通過簡單地使疫苗組合物霧化或產(chǎn)生疫苗組合物的氣霧劑來接種大量的個體。疫苗組合物的霧化產(chǎn)生該疫苗組合物(減毒活細菌)的氣霧劑，當該氣霧劑被動物吸入時，減毒活病毒便被遞送至動物，并侵入呼吸道，從而以呼吸道疾病的形象呈現(xiàn)。該接種方法特別有效，因為不需要對動物進行耗時的單獨處理?，F(xiàn)在通過參考以下具體的實施例來進一步更詳細地描述本發(fā)明，不應以任何方式將這些實施例解釋成對范圍的限制。
實施例實施例1 雞敗血支原體突變體文庫的創(chuàng)建和鑒定利用信號標記的誘變(STM)來產(chǎn)生并鑒定雞敗血支原體突變體文庫。STM策略顯示在圖1中。將特有的DNA標簽并入用來轉化病原體的轉座子，從而使該信號標簽隨機插入基因組中。偶爾，該信號標簽(圖1A)可以整合進基因并使其失活，產(chǎn)生插入突變。然后利用陰性選擇過程在合適的動物模型中篩查ST突變體庫。利用個體標簽的PCR擴增，隨后通過雜交，對輸入庫和從所述動物回收的ST突變體進行比較。該技術鑒定在輸入庫(預篩) 中存在，但在動物個體傳代后回收的庫中丟失的個體突變體(圖1B)。這些丟失的突變體最可能在負責在個體中建群和生長的基因中含有突變，因此這些基因最可能編碼毒力相關的決定因子。材料和方法細菌菌株和培養(yǎng)條件雞敗血支原體(Mg)Ap3AS最初從澳大利亞肉用仔雛雞的氣囊分離得到，并且是高度病原性的。使它于37°C在含10%豬血清的改良Frey肉湯(modified Frey，s broth,MB) 中生長，直到對數(shù)晚期(PH約6. 8)。信號標記的轉座子利用攜帶轉座子Tn4001mod的質(zhì)粒ρ ISM 2062. 2來制備ST突變體文庫，該質(zhì)粒含有慶大霉素抗性基因。每個信號標簽由特有的40bp的寡核苷酸DNA序列([NK]20;N = A、 C、G或T，K = G或Τ)組成，該DNA序列的側翼是兩個20bp的恒定臂，其能通過利用引物對 P2/P4或P3/P5的PCR來擴增和標記該特有區(qū)。將信號標簽克隆入pISM 2062. 2的KpnI限制性位點(圖1A)。各個信號標簽的序列列于表1中。表1本研究所用的信號標簽的DNA序列
權利要求
1.通過至少一種ABC轉運蛋白基因的突變而被減毒的細菌，其中所述突變使得相應的 ABC轉運蛋白沒有功能，并且其中所述減毒細菌能在個體中維持。
2.如權利要求1所述的細菌，其中所述突變由插入、缺失、取代或以上的任意組合來產(chǎn)生。
3.如權利要求2所述的細菌，其中所述插入突變由同源重組、轉座子誘變和序列標簽誘變中的任一種或任意組合來產(chǎn)生。
4.如權利要求1所述的細菌，其中所述ABC轉運蛋白基因編碼ABC-肽轉運蛋白。
5.如權利要求4所述的細菌，其中所述ABC-肽轉運蛋白基因選自CvaB、CylB,SpaB, NisT, EpiT, ComA, PedD, LcnC, McbEF, OppD 和 DppD 以及它們的同源物。
6.如權利要求5所述的細菌，其中所述ABC轉運蛋白基因是OppD。
7.如權利要求1所述的細菌，其中所述細菌選自禽桿菌屬(Avikicterium)、芽孢桿菌屬(Bacillus)、布魯氏菌屬(Brucella)、巴爾通氏體菌屬(Bartonella)、博德特氏菌屬(Bordetella)、伯克氏菌屬(Burkholderia)、弧菌屬(Vibrio)、埃希氏菌屬(Escherichia)、沙門氏菌屬(Salmonella)、梭菌屬(Clostridium)、彎曲桿菌屬(Campylobacter)、衣原體屬(Chalmydia)、考克斯氏體屬(Coxiella)、丹毒絲菌屬(Erysipelothrix)、弗朗西絲氏菌屬(Francisella)、李斯特氏菌屬(Listeria)、放 ^ff ^M (Actinobacillus) > Bf ifil ^ M (Haemophilus) > ff ^ M (Helicobacter) > 單胞菌屬(Aeromonas)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、鏈球菌屬(Str印tococcus)、志賀氏菌屬(Shigella)、耶爾森氏菌屬(Yersinia)、支原體屬(Mycoplasma)、分支桿菌屬 (Mycobacterium)、曼海姆氏菌屬(Mannheimia)、鳥桿菌屬(Ornithobacterium)、立克次氏體屬(Rickettsia)、尿支原體屬(Ureaplasma)禾口巴斯德氏菌屬(Pasteurella)。
8.如權利要求7所述的細菌，其中所述細菌是副雞禽桿菌(Avihcterium paragal 1 inarum) > - fl|# 1 lif (Bordetella avium) > #- ff lif (Ornithobacterium rhinotracheale)、腸炎沙門氏菌(Salmonella enteritidis)、出血敗血性巴斯德氏菌(Pasteurella multocida)、溶血曼海姆氏菌(Mannheimia haemolytica)、大腸桿菌(E. coli)、產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)、無乳支原體(Mycoplasma agalactiae) ^zfeM^Hi.{φ (Mycoplasma alkalescens) > ？-1 !! .^ (Mycoplasma anatis) > 鵝支原體(Mycoplasma anseris)、模仿支原體(Mycoplasma imitans)、精氨酸支原體 (Mycoplasma arginini)、微小服原體(Ureaplasma parvum)、關節(jié)炎支原體(Mycoplasma arthritidis)、牛生殖道支原體(Mycoplasma bovigenitalium)、牛鼻支原體(Mycoplasma bovirhinis)、牛支原體(Mycoplasma bovis)、牛目艮支原體(Mycoplasma bovoculi)、力口利福尼亞支原體(Mycoplasma californicum)、山羊支原體(Mycoplasma capricolum)、殊異支原體(Mycoplasma dispar)、貍貓支原體(Mycoplasma felis)、發(fā)酵支原體(Mycoplasma fermentans)、生殖道支原體(Mycoplasma genitalium)、人型支原體(Mycoplasma hominis)、豬月市炎支原體(Mycoplasma hyopneumoniae)、豬鼻支原體(Mycoplasma hyorhinis)、豬關節(jié)液支原體(Mycoplasma hyosynoviae)、衣阿華支原體(Mycoplasma iowae)、蕈狀支原體蕈狀亞種(Mycoplasma mycoides subsp mycoides)大集落禾口小集落、 雞敗血支原體(Mycoplasma gallisepticum)、關節(jié)液支原體(Mycoplasma synoviae) > 口腔支原體(Mycoplasma orale)、穿透支原體(Mycoplasma penetrans)、羊月市炎支原體(Mycoplasma ovipneumoniae)、雞氣管支原體(Mycoplasma pullorum)、Mycoplasma alligatorus、月市炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、支原體屬(Mycoplasma)、Mycoplasma maleagridis、貓血支原體(Mycoplasma haemofelis)、Mycoplasma haemominutum、 Mycoplasma haematoparvum0
9.如權利要求8所述的細菌，其中所述細菌是禽病原性大腸桿菌菌株E956或雞敗血支原體菌株Ap3AS。
10.如前述權利要求中任一項所述的細菌，其中所述減毒細菌表達異源抗原。
11.如權利要求10所述的細菌，其中所述異源抗原由來自相同或另一種病原有機體的核酸編碼。
12.如權利要求11所述的細菌，其中所述編碼異源抗原的核酸從選自以下的屬中分離禽桿菌屬、芽孢桿菌屬、布魯氏菌屬、巴爾通氏體菌屬、博德特氏菌屬、伯克氏菌屬、弧菌屬、埃希氏菌屬、沙門氏菌屬、梭菌屬、彎曲桿菌屬、衣原體屬、考克斯氏體屬、丹毒絲菌屬、 弗朗西絲氏菌屬、李斯特氏菌屬、放線桿菌屬、嗜血菌屬、螺桿菌屬、氣單胞菌屬、假單胞菌屬、鏈球菌屬、志賀氏菌屬、耶爾森氏菌屬、支原體屬、分支桿菌屬、曼海姆氏菌屬、鳥桿菌屬、立克次氏體屬、尿支原體屬和巴斯德氏菌屬或以上的任意組合。
13.如權利要求12所述的細菌，其中所述編碼異源抗原的核酸來源于副雞禽桿菌、鳥博德特氏菌、鼻腔鳥桿菌、腸炎沙門氏菌、出血敗血性巴斯德氏菌、溶血曼海姆氏菌、大腸桿菌、產(chǎn)氣莢膜梭菌、無乳支原體、產(chǎn)堿支原體、鴨支原體、鵝支原體、模仿支原體、精氨酸支原體、微小脲原體、關節(jié)炎支原體、牛生殖道支原體、牛鼻支原體、牛支原體、牛眼支原體、加利福尼亞支原體、山羊支原體、殊異支原體、貍貓支原體、發(fā)酵支原體、生殖道支原體、人型支原體、豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬關節(jié)液支原體、衣阿華支原體、蕈狀支原體蕈狀亞種大集落和小集落、雞敗血支原體、關節(jié)液支原體、口腔支原體、穿透支原體、羊肺炎支原體、雞氣管支原體、Mycoplasma alligatorus、月市炎支原體、支原體、Mycoplasma maleagridis、貓血支原體、Mycoplasma haemominutum、Mycoplasma haematoparvum 或以上的任意組合。
14.如權利要求13所述的細菌，其中所述編碼異源抗原的核酸從選自以下的病毒分離新城疫病毒、傳染性支氣管炎病毒、禽肺病毒、鳥痘病毒、傳染性法氏囊病病毒、傳染性喉氣管炎病毒、禽流感病毒、鴨病毒性肝炎病毒、鴨瘟病毒、雛雞傳染性貧血病毒、馬立克氏病病毒或以上的任意組合。
15.如權利要求1所述的細菌，其中所述個體是脊椎動物。
16.如權利要求15所述的細菌，其中所述脊椎動物選自人類、牛類、犬類、貓類、山羊類、綿羊類、豬類、駱駝類、馬類和禽類。
17.如權利要求15所述的細菌，其中所述牛類個體可以是母牛、公牛、野?；蛩?。所述犬類個體可以是狗。所述貓類個體可以是貓。所述山羊類個體可以是山羊。所述綿羊類個體可以是綿羊。所述豬類個體可以是豬。所述駱駝類個體可以是駱駝、單峰駱駝、美洲駝、 羊駝、瘦駝或駱馬。所述馬類個體可以是馬、驢、斑馬或騾。
18.如權利要求15所述的細菌，其中所述禽類個體可以是任何商購的或馴養(yǎng)的禽類。
19.如權利要求18所述的細菌，其中所述禽類選自雛雞(包括矮腳雞)、火雞、鴨、鵝、 雉、鵪鶉、山鶉、鴿、珍珠雞、鴕鳥、鴯鹋或孔雀。
20.使細菌減毒的方法，所述方法包括使至少一種ABC轉運蛋白基因突變，并且其中權利要求1-19中任一項所述的減毒細菌在個體中維持。
21.預防或改善個體疾病的方法，所述方法包括給予所述個體治療有效劑量的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物包含至少一種權利要求 1-19中任一項所述的減毒細菌。
22.預防疾病的方法，所述方法包括給予需要預防的個體治療有效劑量的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物包含至少一種權利要求1-19 中任一項所述的減毒細菌。
23.免疫原性組合物，包含至少一種權利要求1-19中任一項所述的減毒細菌。
24.疫苗組合物，包含免疫原性有效量的至少一種權利要求1-19中任一項所述的減毒細菌和藥理學上可接受的載體。
25.用于治療或預防疾病的疫苗組合物的用途，其中所述疫苗組合物包含至少一種權利要求1-19中任一項所述的減毒細菌。
26.如權利要求23所述的免疫原性組合物或如權利要求M所述的疫苗組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物還包含至少一種藥學上可接受的載體或稀釋劑，所述藥學上可接受的載體或稀釋劑選自水、鹽水、培養(yǎng)液、穩(wěn)定劑、碳水化合物、蛋白質(zhì)、諸如牛血清或脫脂乳的含蛋白質(zhì)的試劑和緩沖液或以上的任意組合。
27.如權利要求沈所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述穩(wěn)定劑可以是 SPGA。
28.如權利要求沈所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述碳水化合物選自山梨醇、甘露醇、淀粉、蔗糖、葡萄糖、葡聚糖或以上的組合。
29.如權利要求沈所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述蛋白質(zhì)是白蛋白或酪蛋白。
30.如權利要求沈所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述含蛋白質(zhì)的試劑是牛血清或脫脂乳。
31.如權利要求沈所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述緩沖液選自馬來酸鹽、磷酸鹽、CABS、哌啶、甘氨酸、檸檬酸鹽、蘋果酸鹽、甲酸鹽、琥珀酸鹽、醋酸鹽、丙酸鹽、哌嗪、嘧啶、甲次砷酸鹽、琥珀酸鹽、MES、組氨酸、雙-tris、磷酸鹽、乙醇胺、ADA、碳酸鹽、ACES、 PIPES、咪唑、雙三羥基甲氨基丙烷、BES、MOPS、HEPES、TES、M0PS0、MOBS、DIPS0、TAPS0、TEA、 焦磷酸鹽、HEPPS0、P0PS0、三羥甲基甲基甘氨酸、胼、雙甘氨肽、TRIS、EPPS、二(羥乙基)甘氨酸、HEPBS, TAPS、AMPD, TABS、AMPS0、牛磺酸、硼酸鹽、CHES、甘氨酸、氫氧化銨、CAPS0、碳酸鹽、甲胺、哌嗪、CAPS或以上的任意組合。
32.如前述權利要求中任一項所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物是低壓凍干的或冷凍干燥的。
33.如前述權利要求中任一項所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，還包含至少一種佐劑。
34.如權利要求33所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述佐劑選自弗氏完全佐劑、弗氏不完全佐劑、維生素E、非離子型嵌段聚合物、胞壁酰二肽、皂苷、礦物油、植物油、 卡波姆氫氧化鋁、磷酸鋁、氧化鋁、油乳劑皂苷、維生素-E增溶劑或以上的任意組合。
35.如權利要求33所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述佐劑是大腸桿菌不耐熱毒素或霍亂毒素。
36.如權利要求23-35中任一項所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物經(jīng)鼻內(nèi)給藥、眼科給藥、皮內(nèi)給藥、腹膜內(nèi)給藥、靜脈內(nèi)給藥、皮下給藥、口服給藥、泄殖腔給藥、氣霧劑(噴霧接種)或肌內(nèi)給藥。
37.如權利要求23-36中任一項所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物經(jīng)翼網(wǎng)(wing web)或滴眼劑給藥。
38.如權利要求23-37中任一項所述的疫苗組合物或免疫原性組合物，其中所述疫苗組合物或免疫原性組合物每劑量包含至少約IO3-約IO5個減毒細菌、或者約IO5-約IO7個減毒細菌、或者約IO7-約IO9個減毒細菌、或者約IO9-約IO11個減毒細菌、或者約IO11-約 IO13個減毒細菌、或者約IO13-約IO15個減毒細菌、或者約IO15-約IO17個減毒細菌、或者約 IO17-約1019、或者至少約IO19個減毒細菌。
全文摘要
本發(fā)明涉及通過至少一種ABC轉運蛋白基因的突變而被減毒的細菌，其中所述突變使得相應的ABC轉運蛋白沒有功能，并且其中所述減毒細菌在個體中維持。
文檔編號C12N1/36GK102317439SQ201080007679
公開日2012年1月11日 申請日期2010年2月17日 優(yōu)先權日2009年2月20日
發(fā)明者曾啟文, 格倫·弗朗西斯·布朗寧, 菲利普·弗朗西斯·馬卡姆 申請人:澳大利亞家禽Crc有限公司