專(zhuān)利名稱(chēng)：：有用的真菌菌株的選擇的制作方法有用的真菌菌林的選擇1.相關(guān)申請(qǐng)的引用本申請(qǐng)要求于2007年6月15日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列號(hào)US60/934，677的優(yōu)先權(quán)，其全文并入到本文中作為參考。2.政府資助部分本工作得到隸屬美國(guó)能源部基本合同No.DE-AC36-99G010337的國(guó)立再生能源實(shí)驗(yàn)室的分包合同No.ZCO-30017-Ol的資助。因此，美國(guó)政府可以對(duì)本發(fā)明要求一定權(quán)利。3.引言絲狀真菌是纖維素酶的有效生產(chǎn)菌，已探討過(guò)它們生產(chǎn)纖維素酶的能力。纖維素酶是在紡織、洗滌劑和造紙業(yè)中具有經(jīng)濟(jì)價(jià)值的，并且對(duì)于生物燃料的生產(chǎn)日益重要，生物燃料的生產(chǎn)需要將植物物質(zhì)水解為可發(fā)酵的糖。發(fā)現(xiàn)了三種主要類(lèi)型的酶活性外切葡聚糖酶或外切纖維二糖水解酶、內(nèi)切葡聚糖酶和P-葡糖苷酶。這三種不同類(lèi)型的纖維素酶協(xié)同作用，將纖維素轉(zhuǎn)化為葡萄糖。需要鑒別理想的絲狀真菌，特別是具有理想的蛋白質(zhì)產(chǎn)率和產(chǎn)量，例如高纖維素酶產(chǎn)率和/或產(chǎn)量的絲狀真菌。4.概述本文教導(dǎo)的內(nèi)容至少部分基于這樣的發(fā)現(xiàn)，即在篩選理想的絲狀真菌的過(guò)程中可以組合一些參數(shù)。因此，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了基于至少兩種參數(shù)來(lái)篩選理想的絲狀真菌的方法，例如與代謝和碳利用相關(guān)的參數(shù)，及其獲得的絲狀真菌。用于篩選理想的絲狀真菌的方法。本文中，在測(cè)試的絲狀真菌群體中篩選具有預(yù)定的代謝速率的絲狀真菌亞群。基于預(yù)定的選擇參數(shù)，從絲狀真菌亞群中選擇理想的絲狀真菌，所述預(yù)定的選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的碳利用效率。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了通過(guò)該篩選方法獲得的絲狀真菌。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了用于篩選理想的絲狀真菌的方法。本文中，基于第一選擇參數(shù)和第二選擇參數(shù)來(lái)篩選測(cè)試的絲狀真菌群體。第一選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的代謝速率，第二選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌^^抗抗生素的能力。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了用于篩選理想的絲狀真菌的方法。本文中，測(cè)試的絲狀真菌群體是預(yù)選擇抗抗生素的絲狀真菌群體，并且基于預(yù)定的選擇參數(shù)進(jìn)行篩選，所述預(yù)定的選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的代謝速率。下文提出了本文教導(dǎo)的內(nèi)容的各方面特征。5.附圖的簡(jiǎn)要說(shuō)明本領(lǐng)域技術(shù)人員可以理解附圖僅用于示例目的。附圖并非意在以任何方式限制本教導(dǎo)的范圍。圖1顯示與41G菌林相比，A83菌林的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的改善。圖2顯示與A83菌林相比，41G菌林的比活性?xún)?yōu)勢(shì)。圖3顯示A83菌林的改進(jìn)，以及產(chǎn)率(灰色框)和產(chǎn)量(白色框)的提高。圖4顯示41G和A83在糖化作用測(cè)定中的性能。6.不同實(shí)施方案的詳細(xì)說(shuō)明僅利用下列定義和實(shí)例，通過(guò)參照詳細(xì)的描述本文教導(dǎo)的內(nèi)容。本文中除非另外定義，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)都具有本發(fā)明所屬領(lǐng)域的普通技術(shù)人員理解的相同含義。數(shù)值范圍包含了定義該范圍的數(shù)字。本文提供的標(biāo)題不是各方面或?qū)嵤┓桨傅南拗?，可以通過(guò)參考說(shuō)明書(shū)整體得出。因此，通過(guò)參考說(shuō)明書(shū)整體更全面的定義了下文直接定義的術(shù)語(yǔ)。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"多肽，，指由通過(guò)肽鍵連接的氨基酸殘基單鏈組成的化合物。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"蛋白質(zhì)"與術(shù)語(yǔ)"多肽"可互換使用。術(shù)語(yǔ)"核酸"與術(shù)語(yǔ)"多核苷酸"是可互換的使用的，涵蓋了單鏈或雙鏈DNA、RNA、cDNA及其化學(xué)修飾。因?yàn)檫z傳密碼是簡(jiǎn)并的，可以使用一個(gè)以上的密碼子編碼特定的氨基酸，因此本發(fā)明涵蓋了編碼特定氨基^列的所有多核苷酸。術(shù)語(yǔ)"回收的"、"分離的，，和"分隔的"在本文中是可互換的使用的，指從中去除了與其天然相關(guān)的至少一種組分的蛋白質(zhì)、細(xì)胞、核酸、氨基酸等。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"基因，，指涉及生產(chǎn)多肽鏈的多核苷酸(例如，DNA片段)，可以包括或不包括在編碼區(qū)前后的區(qū)域，例如，5，非翻譯(5，UTR)或"前導(dǎo)，，序列，和3，UTR或"拖尾，，序列，以及位于單個(gè)編碼區(qū)段(外顯子)之間的間插序列(內(nèi)含子)。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)，，指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"表達(dá)"指基于基因的核酸序列產(chǎn)生多肽的過(guò)程。該過(guò)程包括轉(zhuǎn)錄和翻譯。術(shù)語(yǔ)"分泌蛋白"指在蛋白質(zhì)分泌過(guò)程中從細(xì)胞釋放的多肽的區(qū)域。在一些實(shí)施方案中，分泌蛋白是從本發(fā)明的重組融合多肽中釋放或切割的蛋白質(zhì)。術(shù)語(yǔ)"分泌"指蛋白質(zhì)在宿主細(xì)胞中跨過(guò)膜到胞外空間和周?chē)|(zhì)中的選擇性移動(dòng)。如本文中使用的，特別當(dāng)涉及蛋白質(zhì)或酶時(shí)，術(shù)語(yǔ)"生產(chǎn)"或"產(chǎn)生"指蛋白質(zhì)或酶的表達(dá)和/或分泌。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"培養(yǎng)"指在液體、半固體或固體培養(yǎng)基的合適條件下生長(zhǎng)細(xì)胞群體。如本文中使用的，"取代，，或"修飾"是可互換的使用的，指序列(例如氨基酸系列或核酸序列)，其包含天然發(fā)生序列的缺失、插入、取代或中斷。通常，在本發(fā)明的上下文中，取代的序列應(yīng)該指例如天然存在的殘基的取代。如本文中使用的，"修飾的酶"指酶，其包含天然發(fā)生序列的缺失、插入、取代或中斷。術(shù)語(yǔ)"變體"指蛋白質(zhì)的區(qū)域，其與對(duì)照蛋白質(zhì)例如天然存在的或野生型的蛋白質(zhì)相比包含一個(gè)或多個(gè)不同的氨基酸。如本文中使用的，術(shù)語(yǔ)"親代菌林"指在暴露于產(chǎn)生遺傳多樣性的試劑前存在的真菌細(xì)胞林。在一些實(shí)施方案中，親代菌株已經(jīng)是高產(chǎn)菌林，或具有有利的或理想的特征。在暴露于試劑之后，"親代細(xì)胞"成為遺傳多樣的測(cè)試細(xì)胞群體。由于產(chǎn)生遺傳多樣性的過(guò)程的隨機(jī)本質(zhì)，預(yù)期產(chǎn)生許多不同類(lèi)型的細(xì)胞。因此，當(dāng)使用選擇技術(shù)時(shí)，大量不同的測(cè)試細(xì)胞處于選擇中。術(shù)語(yǔ)"測(cè)試細(xì)胞"或"測(cè)試的絲狀真菌群體"在本文中可互換的使用，通常指從絲狀真菌親代菌林產(chǎn)生的遺傳多樣的真菌細(xì)胞。術(shù)語(yǔ)還涵蓋了測(cè)試細(xì)胞的任何后代。根據(jù)在上文描述的測(cè)定中確定的，根據(jù)生長(zhǎng)特性、酶產(chǎn)量水平和/或其它選擇標(biāo)準(zhǔn)，分離"改良的細(xì)胞"。該術(shù)語(yǔ)還涵蓋了改良的細(xì)胞的任何后代。可以分離并增殖改良的細(xì)胞，來(lái)建立新的改良真菌菌林。改良細(xì)胞的非限制性實(shí)例表現(xiàn)出下列特征(i)與親代細(xì)胞相比增加的密碼子利用效率；(ii)與親代細(xì)胞相比，產(chǎn)生的一種或多種蛋白質(zhì)或酶的改良的比活性；(iii)通過(guò)例如測(cè)量每克碳輸入產(chǎn)生的蛋白質(zhì)或酶的克數(shù)，確定的整體提高的產(chǎn)率；(hO在正常溫度下，一種或多種蛋白質(zhì)或酶的較高的生產(chǎn)水平；和/或(v)在升高的溫度下，比親代細(xì)胞更好的維持蛋白質(zhì)或酶產(chǎn)量的能力。作為非限制性實(shí)例，里氏木霉(7V/c/^^nwfl-r^se/)生產(chǎn)纖維素酶的正常溫度范圍是24。C至28。C。根據(jù)本文教導(dǎo)的內(nèi)容，用于里氏木霉的選擇溫度可以是25。C、26。C、27。C、28。C、29。C、30。C、310C、32。C、330C、34。C、35。C、36。C、37。C、38。C、39。C、40oC、41QC、42。C、43。C、44。C、45。C、46°C、47。C或48。C。在一些實(shí)施方案中，在液相中實(shí)施培養(yǎng)。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，可以使用一系列選擇溫度。選擇用于培養(yǎng)的選擇溫度依賴(lài)于其它因素，例如但不限于生長(zhǎng)速率、存活力和測(cè)試細(xì)胞產(chǎn)生的不同類(lèi)型纖維素酶的分布，并且可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定。術(shù)語(yǔ)"纖維素酶"或"纖維素水解酶"可互換的使用，指能夠?qū)⒗w維素(P-l，4-葡聚糖或pD-糖苷鍵)多聚物水解為更短的纖維寡糖寡聚物、纖維二糖和/或葡萄糖的一類(lèi)酶。通常，酶的種類(lèi)包括但不限于，(i)內(nèi)切葡聚糖酶(EG)或1，4-卩-d-葡聚糖-4-葡聚糖水解酶(EC3.2.1.4)，(ii)外切葡聚糖酶，包括1,4-P-d-葡聚糖葡聚糖水解酶(也稱(chēng)為纖維糊精酶)(EC3.2.1.74)和1，4-p-d-葡聚糖纖維二糖水解酶(外切-纖維二糖水解酶，CBH)(EC3.2.1.91)，和(iii)j5-葡糖苷酶(BG)或卩-葡糖苷葡糖水解酶(EC3.2.1.21)。術(shù)語(yǔ)"外切-纖維二糖水解酶，，(CBH)指分類(lèi)為EC3.2.1.91和/或在一些GH家族中的纖維素酶，包括但不限于在GH家族5、6、7、9或48中的那些。這些酶也已知是外切葡聚糖酶或纖維二糖水解酶。CBH酶從纖維素的還原端或非還原端水解纖維素。通常，CBHI型的酶優(yōu)先從纖維素的還原端水解纖維素，CBHII型的酶優(yōu)先水解纖維素的非還原端。術(shù)語(yǔ)"纖維二糖水解酶活性"在本文中定義為1，4-D-葡聚糖纖維二糖水解酶活性，其催化纖維素、纖維四糖或任何含有p-l,4-連接的葡萄糖的聚合物中的1，4-P-D-糖苷鍵水解，從鏈的末端釋放纖維二糖。如本文中使用的，通過(guò)Lever等人，1972,爿mi/.5/oc/^附.47:273-279的PHBAH方法測(cè)量從纖維素釋放的水溶性還原糖，來(lái)確定纖維素水解酶的活性。通過(guò)相似的測(cè)量從取代纖維素(例如，羧曱基纖維素或雍乙基纖維素)釋放的還原糖來(lái)區(qū)分纖維二糖水解酶的外切葡聚糖酶攻擊模式和內(nèi)切葡聚糖酶攻擊模式(Ghose，1987，尸"/r<feC7ie附.59:257-268)。與取代的纖維素相9比，真實(shí)的纖維二糖水解酶對(duì)未取代的纖維素將具有非常高的活性比例(Bailey等入，1993，必/ofec^wo/.J/;/^必/oc/^附.17:65-76)。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)切葡聚糖酶"(EG)指分類(lèi)為EC3.2.1.4和/或在一些GH家族中的纖維素酶組，包括但不限于在GH家族5、6、7、8、9、12、17、31、44、45、48、51、61、64、74或81中的那些。EG酶水解纖維素內(nèi)部的p-l，4-糖苷鍵。術(shù)語(yǔ)"內(nèi)切葡聚糖酶"在本文中定義為內(nèi)-l，4-(l，3;l，4)-p-D-葡聚糖4-葡聚糖水解酶，其催化纖維素、纖維素衍生物(例如，羧曱基纖維素)、地衣淀粉、混合了卩-l，4鍵的卩-l,3-葡聚糖(例如，谷p-D-葡聚糖或木聚糖)和含有纖維素組分的其他植物材料中的1，4-P-D-糖苷鍵的內(nèi)水解。如本文中使用的，根據(jù)Ghose，1987，尸"/rC7^附.59:257-268的程序，利用羧曱基纖維素(CMC)水解來(lái)確定內(nèi)切葡聚糖酶活性。術(shù)語(yǔ)"P-葡糖苦酶"在本文中定義為分類(lèi)為EC3.2.1.21和/或在一些GH家族中的p-D-葡糖苷葡糖水解酶，包括^a不限于在GH家族1、3、9或48中的，其催化纖維二糖的水解，釋放p-D-葡萄糖。如本文中使用的，可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法，例如HPLC測(cè)量(5-葡糖普酶活性。"纖維素分解活性，，涵蓋了外切葡聚糖酶活性、內(nèi)切葡聚糖酶活性或兩類(lèi)酶活性，以及P-葡糖普酶活性。術(shù)語(yǔ)"絲狀真菌"意指本領(lǐng)域技術(shù)人員識(shí)別的任何的和所有的絲狀真菌。通常，絲狀真菌是真核微生物，包括真菌亞門(mén)的所有絲狀形式。這些真菌的特征是具有包含幾丁質(zhì)、P-葡聚糖和其他復(fù)雜多糖的細(xì)胞壁的營(yíng)養(yǎng)菌絲。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的絲狀真菌與酵母是形態(tài)學(xué)、生理學(xué)和遺傳學(xué)不同的。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌包括但不限于下列屬曲霉屬(A/wgW/ws)、枝丁貞孑包屬(y4c尸簡(jiǎn)0w/w附)、短梗霉屬(jw6"57VZ/w附)、白4畺菌屬(^eawveWfl)、頭孑包屬(0/7尨ff/o5/70r/w附)、Ceriporiopsis、毛殼屬(CAfl^to附/w附)、金小孑包子屬(Orrj;5yw/7tfn'w附)、麥角菌屬(C7"Wce/7s)、^走孢腔菌屬(Cochiobolus)、隱3求酵母屬(CVy/7toc^T附)、黑蛋巢菌屬(Q;"狄M)、內(nèi)座殼屬(Em/o狄Z")、鐮孢屬(Fwsflr/w附)、粘帚霉屬(Gilocladi腿)、腐質(zhì)霉屬(i/畫(huà)b/fl)、稻溫病菌屬(Magnaporthe)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(AfjrW/^d"附)、毛霉屬(入鏈孑包審屬(7Vewnw/;o尸fl)、Phanerochaete、柄抱殼屬(/^cfospon)、4以青霉屬(尸fled/o附戸s)、青霉屬(尸wd肌畫(huà))、Pyricularia、根毛霉屬(/f/^o/micw)、才艮霉屬(i^izo^"s)、裂褶菌屬(iSc/r/w/^^"附)、殼多孢屬(Stagonospora)、踝節(jié)菌屬(r"/fl^o附j(luò);c&s)、木霉屬(7Wc/ro^fer附")、Thermomyces、嗜熱子嚢菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium、發(fā)褲菌屬(7Wc/^/，/^;toM)、和栓菌屬(7>fl/wetes>、側(cè)耳屬(/^wwms)。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌包括^f旦不限于下列構(gòu)巢曲霉(A.niger)、泡盛曲霉(A.awomari)，例如NRRL3112、ATCC22342(NRRL3112)、ATCC44733、ATCC14331和菌林UVK143f、米曲霉(A.oryzae),例如ATCC11490，粗糙鏈孢霉(N.crassa)、里氏木霉(Trichodermareesei)，例如NRRL15709、ATCC13631、56764、56765、56466、56767和綠色木霉(Trichodermaviride),例如ATCC32098和32086。本文中使用的術(shù)語(yǔ)"木霉"或"木霉種"指曾經(jīng)分類(lèi)為木霉種或菌林，或者目前分類(lèi)為木霉種或菌種，或肉座菌屬種或菌抹的任何真菌生物。在一些實(shí)施方案中，種包括長(zhǎng)枝木霉(Trichodermalongibrachiatum)、里氏木霉、綠色木霉或紅褐肉座菌(Hypocreajecorina)。還考慮用作原始菌林的是纖維素-過(guò)量生產(chǎn)菌林，例如長(zhǎng)枝/里氏木霉RL-P37(Shdr-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology,20(1984)第46-53頁(yè)；MontenecourtB.S.，Can.,1-20，1987)和RUT-C30(ATCCNo.56765)和菌林QM9414(ATCCNo.26921)。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了用于篩選理想的絲狀真菌的方法，通過(guò)在測(cè)試的絲狀真菌群體中基于預(yù)定的選擇參數(shù)篩選具有預(yù)定的代謝速率的絲狀真菌亞群，從絲狀真菌亞群中選擇理想的絲狀真菌。測(cè)試的絲狀真菌群體可以是從中可選擇理想的絲狀真菌的合適群體。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌群體是遺傳多樣的絲狀真菌群體。獲得遺傳多樣的測(cè)試絲狀真菌群體的方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，本文中描述了示例性的方法。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌群體是暴露于突變誘導(dǎo)條件之后的絲狀真菌群體。根據(jù)本文教導(dǎo)的內(nèi)容，可以通過(guò)將絲狀真菌群體暴露于在細(xì)胞基因組中產(chǎn)生遺傳多樣性的試劑下，來(lái)獲得遺傳多樣的絲狀真菌群體。在一個(gè)實(shí)施方案中，產(chǎn)生遺傳多樣性的試劑是導(dǎo)致基因組中局部核苷酸改變的誘變劑。可以通過(guò)此類(lèi)誘變劑，利用本領(lǐng)域已知的任何方法，誘變親代細(xì)胞和測(cè)試細(xì)胞。例如，可以通過(guò)輻射實(shí)現(xiàn)細(xì)胞誘變，例如紫外光、X-射線(xiàn)或Y輻射?？蛇x的，可以通過(guò)用化學(xué)誘變劑處理來(lái)實(shí)現(xiàn)誘變，例如，亞硝酸、亞硝胺、曱基亞硝基胍、曱磺酸乙酯和堿基類(lèi)似物例如5-溴尿嘧啶。在一個(gè)實(shí)施方案中，利用轉(zhuǎn)座子、限制性酶介導(dǎo)的整合(REMI)或農(nóng)桿菌-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，進(jìn)行插入突變。在一些實(shí)施方案中，在親代細(xì)胞或測(cè)試細(xì)胞中產(chǎn)生遺傳多樣性的試劑是導(dǎo)致基因組總體改變的細(xì)胞遺傳學(xué)劑，通常在細(xì)胞遺傳學(xué)或染色體水平，例如但不限于同源多倍體形成、微核形成、多核體形成、染色體重排、染色體再分布、染色體畸變、染色單體缺失、大規(guī)^莫重組等。許多此類(lèi)試劑是已知的，包括但不限于秋水仙堿(通常以0.1%v/v使用)。在一些實(shí)施方案中，誘變劑用于親代菌林或測(cè)試菌林的孢子，存活的孢子接種在固體培養(yǎng)基上。以不同的細(xì)胞密度接種細(xì)胞以有利于生長(zhǎng)和通過(guò)視覺(jué)觀察或其它方法鑒別。在其它實(shí)施方案中，在遺傳多樣化步驟中還可以使用除孢子以外的其它形式的真菌生物體。在一些實(shí)施方案中，試劑是誘變劑，其施用劑量是產(chǎn)生約1-99.9%致死率的劑量。在不同的實(shí)施方案中，試劑是誘變劑，其施用的劑量產(chǎn)生約50%、約60%、約70%、約80%、約90%或約95%的致死率。在一些實(shí)施方案中，誘變劑是亞硝基胍(N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍-MNNG)或曱磺酸乙酯(氮芥子氣)。(參見(jiàn)Gerhardt等人,1994，Methodsforgeneralandmolecularbacteriology,AmericanSocietyformicrobiology,第297-316頁(yè))?？梢酝ㄟ^(guò)任何目前已知的或本領(lǐng)域后來(lái)發(fā)現(xiàn)的方法，在測(cè)試的絲狀真菌群體中篩選具有預(yù)定的代謝速率的絲狀真菌亞群。在一些實(shí)施方案中，遺傳多樣的測(cè)試絲狀真菌群體培養(yǎng)在包含絲狀真菌代謝底物的培養(yǎng)基中，具有預(yù)定的代謝速率的絲狀真菌亞群是表現(xiàn)出比剩余的絲狀真菌群體更高生長(zhǎng)速率的真菌。用于確定代謝速率的底物可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的允許代謝速率存在可區(qū)分的差異的任何底物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域用于培養(yǎng)絲狀真菌的任何已知的基礎(chǔ)培養(yǎng)基來(lái)制備培養(yǎng)基。在一些實(shí)施方案中，底物是耐受微生物降解的。在一些實(shí)施方案中，底物是纖維素。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基包含纖維素，且纖維素是唯一的碳源和能量來(lái)源。在一些實(shí)施方案中，培養(yǎng)基基本不含二糖和單糖。在一些實(shí)施方案中，在能夠批量培養(yǎng)和篩選大群體測(cè)試細(xì)胞的固相中實(shí)施培養(yǎng)。在一些實(shí)施方案中，纖維素是純化的纖維素，包括但不限于微晶纖維素，例如溶于水的AVICEL(FMCBiopolymer，Philadelphia,PA)，剪切后形成三維基質(zhì)，包含不可溶的微晶體，其形成特別穩(wěn)定的觸變凝膠。在一些實(shí)施方案中，可以在固相測(cè)定中對(duì)測(cè)試的絲狀真菌群體進(jìn)行亞群體的篩選。固相測(cè)定的合適的、非限制性的實(shí)例是纖維素平板篩選(CPS)。測(cè)試的絲狀真菌群體培養(yǎng)在兩層固體培養(yǎng)基中，每層培養(yǎng)基包含纖維素作為能量或碳的唯一來(lái)源或有限來(lái)源。兩層可以保護(hù)相同的成分，甚至相同濃度的成分，優(yōu)選在平板中制備。固體培養(yǎng)基優(yōu)選的包含瓊脂，例如1.5%(w/v)瓊脂。底層包含測(cè)試細(xì)胞群體，優(yōu)選孢子，而頂層不包含任何真菌細(xì)胞。將包含頂層和位于底層的真菌細(xì)胞的平板在一定溫度下孵育一定時(shí)間，使真菌細(xì)胞在固體培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。頂層的厚度在整個(gè)平板是均一并受控的，使得消耗纖維素的生長(zhǎng)最快的真菌細(xì)胞出現(xiàn)在頂層的表面。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌亞群的改進(jìn)的細(xì)胞是表現(xiàn)出比所述測(cè)試細(xì)胞群體生長(zhǎng)速率的50th、60th、70th、80th、卯"、95th或98th百分位更高的生長(zhǎng)速率的細(xì)胞。突破頂層表面的測(cè)試細(xì)胞是可目測(cè)檢測(cè)的，可以方便的通過(guò)本領(lǐng)域已知的技術(shù)分離。典型的，頂層的厚度范圍從約2.5mm、5mm、7.5mm、10mm、12.5mm、15mm、17.5mm、20mm、25mm至約30mm。在一些實(shí)施方案中，該固相測(cè)定可以獨(dú)立的使用或在選擇方案的結(jié)束時(shí)使用，以有利于分離改良的細(xì)胞和通過(guò)在纖維素中的生長(zhǎng)速率來(lái)評(píng)定改良的細(xì)胞。在一些實(shí)施方案中，還可以在這樣的溫度下實(shí)施固相測(cè)定，所述溫度高于測(cè)試的絲狀真菌群體通常產(chǎn)生纖維素酶的溫度。本文教導(dǎo)的內(nèi)容還提供了基于預(yù)定的選擇參數(shù)，從絲狀真菌亞群中選擇理想的絲狀真菌的方法。預(yù)定的選擇參數(shù)可以是任何可測(cè)定的參數(shù)和指標(biāo)，例如測(cè)試的絲狀真菌的碳利用效率。可以通過(guò)多種參數(shù)測(cè)定碳利用效率，包括但不限于通過(guò)絲狀真菌產(chǎn)生的一種或多種理想多肽或酶的產(chǎn)率，絲狀真菌的生產(chǎn)力，和絲狀真菌產(chǎn)生的酶的比活性。在一些實(shí)施方案中，預(yù)定的選擇參數(shù)表示確定的熱力學(xué)穩(wěn)定性，例如，通過(guò)在普通溫度下一種或多種蛋白質(zhì)或酶的較高生產(chǎn)水平，或通過(guò)在較高溫度下維持比親代細(xì)胞更好的蛋白質(zhì)或酶生產(chǎn)水平。根據(jù)本文教導(dǎo)的內(nèi)容，可以通過(guò)例如測(cè)量每克碳輸入產(chǎn)生的多肽或酶的量(克)來(lái)確定產(chǎn)率。在一些實(shí)施方案中，碳輸入對(duì)應(yīng)于提供給絲狀真菌的碳量，或者，它可以對(duì)應(yīng)于測(cè)試的絲狀真菌消耗的碳量?？梢酝ㄟ^(guò)例如測(cè)量蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，例如相對(duì)于預(yù)定量的測(cè)試絲狀真菌，在預(yù)定的時(shí)間段內(nèi)產(chǎn)生的多肽或酶的量(克)，來(lái)確定產(chǎn)量。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的方法提供了絲狀真菌的選擇，所述絲狀真菌產(chǎn)生具有增加的產(chǎn)率、增加的生產(chǎn)力、增加的比活性或其任意的組合的多肽或酶。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌還產(chǎn)生具有改善的熱穩(wěn)定性的多肽或酶。本文教導(dǎo)的理想的酶或多肽包括但不限于纖維素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纖維素酶。在一些實(shí)施方案中，選擇參數(shù)表示產(chǎn)生纖維素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纖維素酶的絲狀真菌的碳利用效率。在一些實(shí)施方案中，選擇參數(shù)還包括與測(cè)試的絲狀真菌中表達(dá)的纖維素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纖維素酶的產(chǎn)量相對(duì)應(yīng)的指標(biāo)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌群體是預(yù)選擇的絲狀真菌。預(yù)選擇的標(biāo)準(zhǔn)可以是任何可測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于對(duì)抗生素試劑的耐受性?？股乜梢允潜绢I(lǐng)域已知的任何抗生素，包括但不限于雙丙氨膦、cyclohexamidine、衣霉素、灰黃霉素、尼柯霉素Z、卡泊芬凈、放線(xiàn)菌素D、布雷菲德菌素A和潮霉素，以及多烯類(lèi)抗生素。多烯類(lèi)抗生素的合適的非限制性實(shí)例包括制霉菌素和兩性霉素B。本文教導(dǎo)的方法可用于篩選絲狀真菌的任何理想菌林。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌選自曲霉屬(^5/7e/^i7/附)、枝頂孢屬(Jcn附om'"附)、《豆梗霉屬(爿Mfeo6a5iWw附)、白"f畺菌屬(Jea"veWfl)、頭孢屬(Ce/7Afl/o5/w/"附)、Ceriporiopsis、毛殼屬(Or"eto附/ww)、金小孑包子屬(Or/jsas/w/77i附)、麥角菌屬(C7ffWce/w)、旋孑包腔菌屬(Cochiobolus)、隱球酵母屬(Oj/toacc附)、黑蛋巢菌屬(Q;fl^"s)、內(nèi)座殼屬(￡Vi^A/a)、嫌抱屬(F"5w/"附)、粘帚霉屬(Gilocladium)、腐質(zhì)霉屬(/T"附Zco/fl)、稻溫病菌屬(Magnaporthe)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Afj;rC/rwM附)、毛霉屬(Af"cor乂鏈孢霉屬(vVewo5/wrff)、Phanerochaete、柄孑包殼屬()、擬青霉屬(/W"7o附y(tǒng)c^)、青霉屬(/^w/"7Z/w附)、Pyricularia、才艮毛霉屬(W/^om""/")、根霉屬(//^o/7附)、裂褶菌屬(iScA,'zo/7/^/w附)、殼多孑包屬(Stagonospora)、躁節(jié)菌屬(r"/flromj^s1)、木審屬(7V/c/rofifer附a)、Thermomyces、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孑包殼屬(Thielavia)、Tolypocladium、發(fā)褲菌屬(7WV/f(7//r,w)、檢菌屬(7V"meteO和側(cè)耳屬(/7/e"r^MS)。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌是木霉。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌里氏木霉。在一些實(shí)施方案中，測(cè)試的絲狀真菌是使用纖維素作為碳源的里氏木霉。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了通過(guò)上述方法獲得的絲狀真菌。在一些實(shí)施方案中，絲狀真菌是木霉，例如里氏木霉。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)本文教導(dǎo)的方法獲得的絲狀真菌是里氏木霉，其產(chǎn)生具有預(yù)定活性的纖維素酶混合物?；钚钥梢允蔷哂懈牧夹再|(zhì)的菌林理想的任何活性。在一些實(shí)施方案中，活性是糖化作用。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了篩選理想的絲狀真菌的方法，包括基于兩種或多種選擇參數(shù)的組合來(lái)篩選測(cè)試的絲狀真菌群體。在一些實(shí)施方案中，基于兩種選擇參數(shù)，第一選擇參數(shù)和第二選擇參數(shù)來(lái)篩選測(cè)試的絲狀真菌群體?？梢赃x擇選擇參數(shù)的任意組合來(lái)獲得理想的絲狀真菌改良菌林。在一些實(shí)施方案中，第一選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的代謝速率，第二選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌抵抗抗生素的能力。在一些實(shí)施方案中，第一選擇參數(shù)表示代謝耐受微生物降解的底物的速率，例如纖維素。在一些實(shí)施方案中，本文教導(dǎo)的內(nèi)容提供了篩選理想的絲狀真菌的方法，包括基于預(yù)定的選擇參數(shù)來(lái)篩選測(cè)試的絲狀真菌群體，所述選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌代謝例如耐受微生物降解的底物的速率。本文中，測(cè)試的絲狀真菌群體已經(jīng)針對(duì)抗生素進(jìn)行預(yù)選擇。根據(jù)下列實(shí)施例可以進(jìn)一步理解本文教導(dǎo)的各方面，所述實(shí)施例不應(yīng)理解為對(duì)本文教導(dǎo)內(nèi)容范圍的限制。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，可以在不脫離本文教導(dǎo)內(nèi)容的條件下，對(duì)材料和方法實(shí)施許多修飾。7.實(shí)施例實(shí)施例7.1突變體制備，培養(yǎng)基和溶液使用纖維素酶篩選培養(yǎng)基來(lái)分離具有改良的蛋白質(zhì)產(chǎn)量的變體。纖維素酶篩選培養(yǎng)基包含20ml的50XVogds母液，0.5gAVICEL(FMCBiopolymer,Philadelphia,PA)，和20g的瓊脂，980mldH20。50XVogels母液是通過(guò)溶解以下物質(zhì)制備的(1)150g檸檬酸鈉.2H2O;10gMgS04.7H20;和溶于300ml的dH20中的5gCaCl2.2H20;(2)溶于500dH20的250gKH2P04;(3)溶于200mldH20中的100gNH4N03。一起加入溶液，并加入5ml的Vogels微量元素溶液和2.5ml的Vogels生物素溶液。Vogels樣i量元素溶液含有1升dH20，50g檸檬酸；50gZnS04，7H20;10gFe(NH4)2SO,6H20;2.5gCuS045H20;0.5gMnS04.4H20;0.5gH3BO3(硼酸)；和0.5gNaMoO4.2H2O。(參見(jiàn)Davis等人，1970，MethodsinEnzymology17A，79-143;和Davis等人，2000，Neurospora,ContributionsofaModelOrganism,OxfordUniversityPress,forinformationonVogds16minimalmedium)。Vogels生物素溶液包含溶于1升水中的O.lgd-生物素。通過(guò)在28。C下，250ml搖瓶中，150rpm孵育突變體96h，檢測(cè)搖瓶中的總蛋白質(zhì)產(chǎn)量，搖瓶含有50mL乳糖基本培養(yǎng)基，如Ilmen等人，1997，々，/;￡>m>wfM/ctM,》/63，1298-1306中描述的，只是包含lOOmMp底嚷-N,N'-雙(2-乙磺酸)(PIPES;Calbiochem)用來(lái)維持pH在5.5。在TCA沉淀后，利用Pierce(Rockford，IL)提供的BCA測(cè)定法對(duì)上清液進(jìn)行蛋白質(zhì)測(cè)定?？梢允褂帽绢I(lǐng)域用于培養(yǎng)絲狀真菌的任何已知的基本培養(yǎng)基來(lái)制備在培養(yǎng)步驟中使用的培養(yǎng)基。用里氏木霉菌林A83開(kāi)始下列實(shí)驗(yàn)，相對(duì)于菌林RL-P37，A83菌抹是高產(chǎn)菌林。為了產(chǎn)生遺傳多樣性，用甲基化化合物N-甲基-N'-硝基-N-亞硝基胍(NTG)突變細(xì)胞。NTG是可使用的最有效的誘變劑之一；它主要誘導(dǎo)GC向AT型的堿基轉(zhuǎn)換突變(但是也以低頻率產(chǎn)生AT向GC的轉(zhuǎn)變、顛換和移碼)。當(dāng)?shù)谝淮瓮蛔兙謺r(shí)，制備殺死曲線(xiàn)。從零時(shí)開(kāi)始，每30分鐘采樣并進(jìn)行活孢子計(jì)數(shù)。一旦建立了殺死曲線(xiàn)，僅進(jìn)行零時(shí)和最終的活力計(jì)數(shù)，以保證獲得正確的％殺死。例如，通過(guò)分別用NTG孵育孢子1.5小時(shí)和3小時(shí)，制備了50%殺死文庫(kù)和99%殺死文庫(kù)。從RL-P37衍生的改良菌抹包括利用99%殺死文庫(kù)獲得的A83、T4、NY27和41G。在孵育后，通過(guò)在水中洗滌孢子至少3次去除NTG。制備突變孢子的等分試樣，并在-70。C儲(chǔ)存于甘油中。制備新鮮的真菌平板，用于獲得含有約1x109孢子形成單位/1111的孢子懸浮液。利用血球計(jì)數(shù)器確定孢子形成單位數(shù)/ml。在DMSO中新鮮制備N(xiāo)TG(Aldrich-4991)的溶液，濃度為15mg/mL,并添加終濃度為1.0mg/mL的真菌孢子懸浮液。然后在室溫下黑暗中孵育真菌孢子懸浮液,直到獲得理想的99%殺死。分離T4。制備纖維素酶篩選培養(yǎng)基，在水浴中冷卻至55i:。在小的培養(yǎng)皿(82mm)中，在平板中心和邊緣之間約1/2c處以圓圏分散含有約1百萬(wàn)突變孢子的等分試樣，并加入10ml的纖維素酶篩選培養(yǎng)基(上述)。然后，旋轉(zhuǎn)平板使孢子分散在平板的中央，但不分散至邊緣，放置硬化約5-10分鐘。加入25ml纖維素酶篩選培養(yǎng)基，使其硬化。然后加入另外10ml纖維素酶篩選培養(yǎng)基，在28。C孵育平板過(guò)夜。第二天，利用解剖顯微鏡每4小時(shí)檢查平板的表面的生長(zhǎng)情況。對(duì)于每個(gè)文庫(kù)，確定菌落到達(dá)平板表面的大致時(shí)間。利用無(wú)菌刀片收集到達(dá)瓊脂表面的前1-3個(gè)分離抹，忽略在邊緣出現(xiàn)的菌落。在顯微鏡下觀察菌落，使用刀片接觸菌落的表面，注意不要挖入瓊脂內(nèi)。去除小片的菌絲體，并置于PDA上，在28。C孵育。一旦生長(zhǎng)，在搖瓶中評(píng)估分離抹的總蛋白產(chǎn)量。在第一輪篩選后，發(fā)現(xiàn)T4產(chǎn)生比親代A-83多25%的總蛋白(表l)。表l.RLP-37、A-83、T4、NY27和41G在搖瓶中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。<table>tableseeoriginaldocumentpage18</column></row><table>分離NY27。用NTG突變T4孢子，直到如上述獲得99%殺死。將突變的"包子接種在含有10ng/mL制霉菌素的PDA瓊脂(Difco)上。多烯類(lèi)抗生素例如制霉菌素，與真菌細(xì)胞膜中的固醇、麥角固醇結(jié)合,引起細(xì)胞膜泄漏而導(dǎo)致死亡。不受任何理論約束，改良的蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以是由于改良的分泌作用，所述分泌作用獲得自細(xì)胞膜的改變而導(dǎo)致的增加的滲透性和/或流出轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的過(guò)表達(dá)。分離耐受制霉菌素的菌落，并在搖瓶中檢查總蛋白產(chǎn)量。一林最佳的突變體是NY27，比T4在搖瓶中產(chǎn)生多33%的總蛋白(表l)。分離41G。用NTG突變NY27，直到獲得99%殺死。以分離T4相同的方式篩選突變的孢子。制備纖維素酶篩選培養(yǎng)基，在水浴中冷卻至55。C。在小的培養(yǎng)亞(82mm)中，在平板中心和邊緣之間約1/2c處以圓圏分散含有約1百萬(wàn)突變孢子的等分試樣，并加入10ml的纖維素酶篩選培養(yǎng)基(上述)。然后，旋轉(zhuǎn)平板使孢子分散在平板的中央，但不分散至邊緣，放置硬化約5-10分鐘。加入25ml纖維素酶篩選培養(yǎng)基，使其硬化。然后加入另外10ml纖維素酶篩選培養(yǎng)基，在28。C孵育平板過(guò)夜。第二天，利用解剖顯微鏡每4小時(shí)檢查平板的表面的生長(zhǎng)情況。對(duì)于每個(gè)文庫(kù)，確定菌落到達(dá)平板表面的大致時(shí)間。利用無(wú)菌刀片收集到達(dá)瓊脂表面的前1-3分離抹，忽略在邊緣出現(xiàn)的克隆。在顯微鏡下觀察菌落，使用刀片接觸菌落的表面，注意不要挖入瓊脂內(nèi)。去除小片的菌絲體，并置于PDA上，在28。C孵育。一旦生長(zhǎng)，在搖瓶中評(píng)估分離林的總蛋白產(chǎn)量。發(fā)現(xiàn)突變體41G產(chǎn)生比親代NY27多25%的總蛋白(表l)。圖l顯示了120h內(nèi)在14L纖維素酶發(fā)酵中A83和41G產(chǎn)生的總蛋白?？偟鞍滓訟83(對(duì)照)的％顯示。干細(xì)胞重(DCW)以g/L表示。通過(guò)過(guò)濾已知量的總菌湯而去除細(xì)胞團(tuán)塊，干燥細(xì)胞團(tuán)塊，并確定每升總菌湯的重量(g)，來(lái)測(cè)量DCW。圖2顯示了120h內(nèi)在14L纖維素酶發(fā)酵中41G與A-83對(duì)照相比的比生產(chǎn)力。比生產(chǎn)力(每克DCW/LH的蛋白質(zhì)克數(shù))以A83(對(duì)照)的。/。顯示。干細(xì)胞重(DCW)以g/L顯示。圖3顯示了利用纖維素平板篩選(CPS)和制霉菌素抗性篩選對(duì)41G的進(jìn)化，以及41G和41G譜系的菌抹在14L發(fā)酵罐中的產(chǎn)率(蛋白質(zhì)克數(shù)/克碳/LH)以及生產(chǎn)力(蛋白質(zhì)克數(shù)/LH)的改善。結(jié)果顯示為A83(對(duì)照)的％。突變體T4和41G生長(zhǎng)在14L發(fā)酵罐中，使用Ihnen等人，1997,AppEnvironMicrobiol63，1298-1306中描述的培養(yǎng)基進(jìn)行纖維素酶生產(chǎn)的優(yōu)化補(bǔ)料分批發(fā)酵，所述培養(yǎng)基中還包含lOOmM哌噪-1^'-雙(2-乙磺酸)(PIPES;Calbiochem)。其它方法對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是常規(guī)的。圖3顯示了相對(duì)于菌林A-83的生產(chǎn)力和產(chǎn)率的改善。實(shí)施例7.2糖化作用在50。C下，在標(biāo)準(zhǔn)的微量滴定板中用酸預(yù)處理的玉米秸稈(13%固體，約7。/。纖維素)進(jìn)行T4反應(yīng)5天，每克纖維素加入5、10和20毫克纖維素酶。對(duì)17種不同的A83發(fā)酵樣品(一式兩份進(jìn)行)取平均，對(duì)4種不同的T4樣品(一式兩份和一式四份進(jìn)行)取平均。在平板測(cè)定中T4纖維素酶在性能上勝過(guò)A-83纖維素酶。對(duì)于41G,在含有4.3%(w/v)PYP固體(稀酸預(yù)處理的北美鵝掌楸(yellowpoplar),其含有2.5%(w/v)纖維素)的8mg/g纖維素中投放等量的A-83和41G，在38°C，pH5.0下孵育，通過(guò)翻轉(zhuǎn)(每20分鐘)在密封的管中持續(xù)的混合168h。隨時(shí)間測(cè)定PYP纖維素的％糖化作用。利用T4生權(quán)利要求1、用于篩選理想的絲狀真菌的方法，包括在測(cè)試的絲狀真菌群體中篩選具有預(yù)定代謝速率的絲狀真菌亞群，并基于預(yù)定的選擇參數(shù)從絲狀真菌亞群中選擇理想的絲狀真菌，其中所述選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的碳利用效率。2、權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)基于底物的代謝速率選擇絲狀真菌來(lái)獲得絲狀真菌亞群，其中底物抗孩i生物的降解。3、權(quán)利要求1的方法，其中所述選擇參數(shù)對(duì)應(yīng)于相對(duì)于提供給測(cè)試的絲狀真菌的預(yù)定碳量，測(cè)試的絲狀真菌中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。4、權(quán)利要求1的方法，其中所述選擇參數(shù)對(duì)應(yīng)于相對(duì)于提供給測(cè)試的絲狀真菌的預(yù)定碳量，測(cè)試的絲狀真菌所表達(dá)的纖維素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纖維素酶的產(chǎn)量。5、權(quán)利要求l的方法，其中所迷選擇參數(shù)對(duì)應(yīng)于相對(duì)于測(cè)試的絲狀真菌消耗的預(yù)定碳量，測(cè)試的絲狀真菌中的蛋白質(zhì)產(chǎn)量。6、權(quán)利要求l的方法，其中所述選擇參數(shù)還包括與測(cè)試的絲狀真菌中的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)力相對(duì)應(yīng)的指標(biāo)。7、權(quán)利要求l的方法，其中通過(guò)相對(duì)于預(yù)定量的測(cè)試絲狀真菌，測(cè)試的絲狀真菌在預(yù)定時(shí)間段內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量，來(lái)確定測(cè)試的絲狀真菌中的蛋白質(zhì)的生產(chǎn)力。8、權(quán)利要求1的方法，其中所述選擇參數(shù)還包括相對(duì)于預(yù)定量的測(cè)試絲狀真菌，與測(cè)試的絲狀真菌表達(dá)的纖維素酶、木聚糖酶、葡糖淀粉酶、淀粉酶、漆酶、蛋白酶、植酸酶或半纖維素酶的產(chǎn)量相對(duì)應(yīng)的指標(biāo)。9、權(quán)利要求l的方法，其中在固相測(cè)定中進(jìn)行從測(cè)試的絲狀真菌群體中篩選亞群。10、權(quán)利要求l的方法，其中測(cè)試的絲狀真菌群體是針對(duì)抗生素預(yù)選擇的絲狀真菌群體。11、權(quán)利要求l的方法，其中測(cè)試的絲狀真菌群體是針對(duì)多烯類(lèi)抗生素預(yù)選擇的絲狀真菌群體。12、權(quán)利要求10的方法，其中所述抗生素選自制霉菌素、兩性霉素B、雙丙氨膦、cyclohexamidine、衣霉素、灰黃霉素、尼柯霉素Z、卡泊芬凈、放線(xiàn)菌素D、布雷菲德菌素A和潮霉素。13、權(quán)利要求1的方法，其中測(cè)試的絲狀真菌選自曲霉屬()、枝丁貞孑包屬"cmmm'"附)、短梗霉屬(Jweo6flw^w/w)、白僵菌屬(5evw'")、頭抱屬(Cep/r"/os/w/w/M)、Ceriporiopsis、毛殼屬(Orfletoww'w/M)、金小孢子屬(C/fo^os/7on7/附)、麥角菌屬(C7"v/ce/>*)、旋孢腔菌屬(Cochiobolus)、隱球酵母屬(Oy/toocc附)、黑蛋巢菌屬(Q^狄"s)、內(nèi)座殼屬(￡>/W/^fl)、鐮孢屬(尸"s"/7'w附)、粘帚霉屬(Gilocladhim)、腐質(zhì)霉屬(/T"/w/co/tf)、稻溫病菌屬(Magnaporthe)、毀絲霉屬(Myceliophthora)、漆斑菌屬(Afyro幼e"'"附)、毛霉屬(人鏈孑包霉屬(A^ms/;cmi)、Phanerochaete、柄抱殼屬(/Wtw/wa)、擬青審屬(尸fle"7o附j(luò);(^s)、青審屬(尸ew/c/〃/w附)、Pyricularia、才艮毛審屬(//r&"w<w)、根霉屬、裂褶菌屬(Xc/r/鄉(xiāng)/ry/M附)、殼多孑包屬(Stagonospora)、棵節(jié)菌屬(rfl/flra考"s)、木霉屬(7Wc/ic^/mwfl)、Thermomyces、嗜熱子囊菌屬(Thermoascus)、梭孢殼屬(Thielavia)、Tolypocladium、發(fā)痺菌屬(7>/c/i。/7/^tow)、和檢菌屬(7>"附《^^和側(cè)耳屬(/j/ewro似5")。14、權(quán)利要求l的方法，其中測(cè)試的絲狀真菌是里氏木霉，并且所述里氏木霉使用纖維素作為碳源。15、權(quán)利要求l的方法，其中測(cè)試的絲狀真菌使用纖維素作為碳源。16、通過(guò)權(quán)利要求l的方法獲得的絲狀真菌。17、通過(guò)權(quán)利要求l的方法獲得的絲狀真菌，其中該絲狀真菌是里氏木霉，并且它產(chǎn)生具有預(yù)定活性的纖維素酶的混合物。18、權(quán)利要求17的絲狀真菌，其中所述活性是糖化作用。19、用于篩選理想的絲狀真菌的方法，包括基于第一選擇參數(shù)和第二選擇參數(shù)來(lái)篩選測(cè)試的絲狀真菌群體，其中第一選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的代謝速率，第二選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌抗抗生素的能力。20、權(quán)利要求19的方法，其中第一選擇參數(shù)表示代謝底物的速率，所述底物耐受微生物降解。21、用于篩選理想的絲狀真菌的方法，包括基于預(yù)定的選擇參數(shù)來(lái)篩選測(cè)試的絲狀真菌群體，其中預(yù)定的選擇參數(shù)表示測(cè)試的絲狀真菌的代謝速率，并且其中測(cè)試的絲狀真菌群體是針對(duì)抗生素預(yù)選擇的絲狀真菌群體。22、權(quán)利要求21的方法，其中所述預(yù)定的選擇參數(shù)表示代謝底物的速率，所述底物耐受微生物降解。全文摘要本發(fā)明提供了用于篩選理想的絲狀真菌的方法，所述絲狀真菌更有效的產(chǎn)生纖維素酶和/或具有增加的比活性。還提供了更有效的產(chǎn)生纖維素酶的絲狀真菌。文檔編號(hào)C12Q1/34GK101680019SQ200880020296公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年6月10日優(yōu)先權(quán)日2007年6月15日發(fā)明者E·A·博迪,E·A·拉雷納斯申請(qǐng)人:丹尼斯科美國(guó)公司