專利名稱：具有改進(jìn)的經(jīng)修飾的寡核苷酸的定向核苷酸交換的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種通過(guò)向細(xì)胞中引入寡核苷酸而特異地和選擇性地改變靶細(xì)胞中特定的DNA位點(diǎn)上的核苷酸序列的方法。結(jié)果是定向改變了一個(gè)或多個(gè)核苷酸，以致在其 不同的地方修改了靶DNA的序列。更特別地是，本發(fā)明涉及使用經(jīng)修飾的寡核苷酸的定向 核苷酸交換。本發(fā)明進(jìn)一步涉及寡核苷酸和試劑盒。本發(fā)明還涉及該方法的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
遺傳修飾是在活細(xì)胞的遺傳物質(zhì)中故意產(chǎn)生變化的過(guò)程，其目的是修飾該細(xì)胞或 生物的一個(gè)或多個(gè)遺傳編碼的生物學(xué)特征，所述細(xì)胞形成所述生物的一部分或再生形成所 述生物。這些改變可以是下列形式刪除部分遺產(chǎn)物質(zhì)、加入外源性遺傳物質(zhì)或改變遺傳物 質(zhì)的現(xiàn)有核苷酸序列。遺傳修飾真核生物的方法被人們知道已經(jīng)超過(guò)20年，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其廣 泛地在植物、人類和動(dòng)物細(xì)胞和微生物中應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、人類健康、食品質(zhì)量和環(huán)境保護(hù)領(lǐng)域 中的改善。遺傳修飾的常見方法由以下組成向細(xì)胞的基因組中加入外源DNA片段，然后將 賦予細(xì)胞或其生物除了由已經(jīng)存在的基因所編碼的性質(zhì)之外的新性質(zhì)(包括已經(jīng)存在的 基因的表達(dá)將因此被抑制的應(yīng)用)。雖然許多這樣的例子在獲得所需性質(zhì)中有效，但是這些 方法不十分精確，因?yàn)閷?duì)外源DNA片段插入的基因組位置沒(méi)有控制(因此無(wú)法控制最終的 表達(dá)水平)，并且因?yàn)樗璧男Ч麑⑿枰C實(shí)其優(yōu)于原始和均衡的基因組所編碼的天然性 質(zhì)。相反，將引起預(yù)先確定的基因組位點(diǎn)中的核苷酸的加入、刪除或轉(zhuǎn)換的遺傳修飾的方法 將允許精確地修飾現(xiàn)有基因。寡核苷酸指引的定向核苷酸交換(TNE)是一種基于向真核細(xì)胞核中遞送合 成性寡核苷酸(由在Watson-Crick堿基配對(duì)性質(zhì)上與DNA相似的短段核苷酸樣半體 (moiety)組成的分子，但是可以在化學(xué)上與DNA不同)的方法(Alexeev和Yoon，Nature Biotechnol. 16 1343,1998 ；Rice, Nature Biotechnol. 19 321,2001 ；Kmiec, J.Clin. Invest, m =632，2003)。通過(guò)故意在寡核苷酸的同源序列中設(shè)計(jì)錯(cuò)配核苷酸，該錯(cuò)配核苷 酸可以導(dǎo)致基因組DNA序列中的改變。該方法允許在靶標(biāo)中轉(zhuǎn)換單個(gè)或最多幾個(gè)核苷酸， 但是可以應(yīng)用于在現(xiàn)有基因中產(chǎn)生終止密碼子，導(dǎo)致其功能的破壞，或產(chǎn)生密碼子改變，導(dǎo) 致編碼具有改變的氨基酸組成(蛋白工程)的蛋白的基因。在植物、動(dòng)物和酵母細(xì)胞中已經(jīng)有定向核苷酸交換(TNE)的描述。第一次TNE報(bào) 道應(yīng)用了被設(shè)計(jì)插入染色體靶標(biāo)位點(diǎn)的所謂的DNA:RNA自我互補(bǔ)寡核苷酸。該嵌合體含 有在形成模板的DNA鏈上的錯(cuò)配核苷酸，所述模板用于將突變引入染色體靶標(biāo)。使用嵌合 體DNA:RNA寡核苷酸的第一個(gè)例子來(lái)自動(dòng)物細(xì)胞(在Igoucheva等人.2001Gene Therapy 8, 391-399中有綜述)。許多實(shí)驗(yàn)室的深入研究已經(jīng)顯示使用這樣的寡核苷酸的TNE頻率 是可變的，并且平均非常低，并且取決于這樣的因素如靶標(biāo)的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)、細(xì)胞周期的影響和 轉(zhuǎn)化的細(xì)胞類型。在植物細(xì)胞中已經(jīng)證明使用嵌合體DNA:RNA寡核苷酸的TNE(Beetham 等人 1999Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 :8774_8778 ；Zhu 等人 1999Proc. Natl. Acad. Sci.USA 96,8768-8773 ；Zhu 等人 2000Nature Biotech. 18,555-558 ；Kochevenko 等人2003PlantPhys. 132 174-184 :Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep. 22 509-512) 通常，在 植物和動(dòng)物研究中報(bào)道的頻率對(duì)于在非可選擇的染色體位點(diǎn)上實(shí)際應(yīng)用TNE是太低了。還發(fā)現(xiàn)使用嵌合體寡核苷酸的TNE難以重復(fù)(Ruiter等人(2003)Plant Mol. Biol. 53,715-729)，這導(dǎo)致對(duì)另外的給出更可靠結(jié)果的寡核苷酸設(shè)計(jì)的尋找。幾個(gè)實(shí)驗(yàn)室 已經(jīng)集中精力于為TNE而使用單鏈(ss)寡核苷酸。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這些在植物和動(dòng)物細(xì)胞中給 出更可重復(fù)的結(jié)果(Liu 等人 2002Nuc. Acids Res. 30 :2742_2750 ；review, Parekh-Olmedo 等人 2005Gene Therapy 12 :639_646 ；Dong 等人 2006PlantCell Rep. 25 :457_65)。 幾個(gè)小組已經(jīng)顯示可以在體外使用總細(xì)胞蛋白提取物模仿TNE過(guò)程。這樣的TNE 活性分析被稱為無(wú)細(xì)胞分析。該分析包括通過(guò)將載有這樣報(bào)告體的質(zhì)粒與來(lái)自特定細(xì)胞類型的細(xì)胞蛋白和寡 核苷酸孵育而修復(fù)使細(xì)菌報(bào)告體基因(如LacZ或抗生素抗性基因)失活的突變。孵育后， 將質(zhì)粒電穿孔至用作測(cè)定TNE效率的讀出系統(tǒng)的大腸桿菌(E.coli)中。無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)已經(jīng) 與嵌合體 DNA:RNA(Cole-Strauss 等人 1999NucleicAcids Res. 27 1323-1330 ；Gamper 等 人 2000Nucleic Acids Res.28,4332-4339 ；Kmiec 等人 2001Plant J. 27 267-274 ；Rice 等人 2001 迎857-868 ;Thorpe 等人 2002 J. GeneMedicine i，195-204)和單鏈寡核苷酸 (Igoucheva 等人 2001 Gene Therapy 8,391-399 ；Kren 等人 2003DNA Repair 2,531-546 ； Olsen 等人 2005 J. Gene Medicine[，1534-1544)聯(lián)合使用。在這樣的實(shí)驗(yàn)中，寡核苷酸通常通過(guò)將終止密碼子(TAG)改變?yōu)橹付ò被岬拿?碼子而影響置換。另外，無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)還可以用于研究使用寡核苷酸產(chǎn)生單核苷酸插入的可 能性。可以產(chǎn)生具有從細(xì)菌報(bào)告體基因中刪除單個(gè)核苷酸而產(chǎn)生移框突變的質(zhì)粒。在無(wú)細(xì) 胞分析中，通過(guò)加入由寡核苷酸介導(dǎo)的核苷酸的刪除而修復(fù)該刪除。相似地，含有原本不存 在于靶標(biāo)的一個(gè)或多個(gè)額外的核苷酸的寡核苷酸還可以用于向靶序列中引入一個(gè)或多個(gè) 核苷酸。TNE在高等生物中如植物的細(xì)胞中應(yīng)用所面臨的最大問(wèn)題是迄今已經(jīng)報(bào)道的低效 率。在玉米中Zhu等人(2000Nature Biotech. 18 555-558)報(bào)道IxliT4的轉(zhuǎn)換頻率。隨后 在煙草(Kochevenko 等人 2003Plant Phys. 132 174-184)和水稻(Okuzaki 等人 2004Plant Cell Rep. 22 :509_512)中的研究分別報(bào)道1χ1(Γ6和IxlO"4的頻率。這些頻率對(duì)于TNE的 實(shí)際應(yīng)用仍然太低。使用嵌合體DNA =RNA寡核苷酸的TNE已經(jīng)在Kmiec的各種專利申請(qǐng)中有描述，特 別是 W00173002、W003/027265、W001/87914、W099/58702、W097/48714、W002/10364。在 WO 01/73002考慮到，使用未經(jīng)修飾的DNA寡核苷酸獲得的基因改變的低效率相信大多是由存 在于靶細(xì)胞的反應(yīng)混合物中的核酸酶降解供體寡核苷酸的結(jié)果。為了校正這一問(wèn)題，建議 的是引入給予獲得的寡核苷酸核酸酶抗性的經(jīng)修飾的核苷酸。通常的例子包括具有磷硫酰 連接或2’-0-甲基類似物的核苷酸。這些修飾優(yōu)選位于寡核苷酸的末端，令中心DNA結(jié)構(gòu)域 包圍錯(cuò)配的核苷酸。另外，公開物規(guī)定轉(zhuǎn)換寡核苷酸和參與轉(zhuǎn)換的蛋白之間包括特異性化 學(xué)相互作用。不能預(yù)測(cè)使用除了磷硫酰連接或2’-0_甲基類似物引入寡核苷酸以外的修飾 而產(chǎn)生核酸酶抗性末端的這樣的化學(xué)相互作用的效果，因?yàn)檫€不知道，并且根據(jù)W00173002 的發(fā)明人，不能預(yù)測(cè)參與改變過(guò)程的蛋白及其與寡核苷酸取代物的化學(xué)相互作用。使用經(jīng)修飾的單鏈寡核苷酸的TNE已經(jīng)在專利申請(qǐng)WO 02/26967中有描述。該申請(qǐng)證明給予寡核苷酸增加的核酸酶抗性的經(jīng)修飾的核苷酸對(duì)于使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)的TNE效 率的作用。然后該申請(qǐng)繼續(xù)顯示使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)鑒定的經(jīng)修飾的核苷酸(當(dāng)引入單鏈寡核 苷酸中時(shí))還增強(qiáng)哺乳動(dòng)物染色體靶標(biāo)上的TNE。這證實(shí)在體外無(wú)細(xì)胞分析中獲得的信息 可應(yīng)用于體內(nèi)染色體位點(diǎn)。該申請(qǐng)還要要求保護(hù)幾個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，例如C5-丙炔嘧 啶，而不是被鎖定的核酸，還可以用于增加TNE的效率。作者陳述(第16頁(yè))“引入寡核 苷酸的修飾將不改變對(duì)生物活性負(fù)責(zé)的細(xì)胞功能，在這個(gè)情況下是指重組和修復(fù)活性”。相 反，我們?cè)诒旧暾?qǐng)中證明WO 02/26967所述的顯示增加的結(jié)合活性的幾個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸 在TNE過(guò)程中無(wú)生物學(xué)活性，因此預(yù)測(cè)經(jīng)修飾的核苷酸在TNE過(guò)程中的有用性不能只基于 增加結(jié)合親和力而做出。
由于現(xiàn)在的TNE方法效率相對(duì)低(如前面說(shuō)明的在10_6至10_4之間，盡管報(bào)道的 寡核苷酸的90%的高遞送率)，本領(lǐng)域中有必要得到更有效的TNE的方法。因此，本發(fā)明人 開始改進(jìn)現(xiàn)有的TNE技術(shù)。

發(fā)明內(nèi)容
現(xiàn)在本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)通過(guò)向用于TNE的供體寡核苷酸引入經(jīng)修飾的核苷酸組 合(其能夠比相應(yīng)的未經(jīng)修飾的核苷酸如A、C、T或G更強(qiáng)結(jié)合受體DNA，可以顯著增加TNE 的速率。不限于理論，本發(fā)明人相信，通過(guò)向供體寡核苷酸引入經(jīng)修飾的核苷酸，供體寡核 苷酸更強(qiáng)地結(jié)合受體DNA，因此增加TNE的比率。另外，本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)修飾的核苷酸增加TNE的能力依賴兩個(gè)重要性質(zhì) (1)與正常未經(jīng)修飾的DNA相比其對(duì)其靶標(biāo)增加的結(jié)合親和力，⑵其對(duì)于TNE過(guò)程的生物 學(xué)活性。反義技術(shù)也應(yīng)用寡核苷酸在細(xì)胞中誘導(dǎo)效應(yīng)。在這種情況下，將寡核苷酸設(shè)計(jì)成 與互補(bǔ)靶標(biāo)mRNA結(jié)合。這個(gè)DNA:RNA雜合體由切割雜合體的RNA鏈的RNaseH識(shí)別，抑制 基因表達(dá)。增加的結(jié)合親和力和增強(qiáng)的核酸酶抗性，獲得有效反義反應(yīng)所需的寡核苷酸特 征也是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)對(duì)于增加TNE頻率重要的特征。已經(jīng)在文獻(xiàn)中報(bào)道了許多顯示增加的結(jié)合 親和力和/或核酸酶抗性的經(jīng)修飾的核苷酸，但是關(guān)鍵步驟是證明含有這樣經(jīng)修飾的核苷 酸的寡核苷酸對(duì)于TNE過(guò)程仍然保持生物學(xué)活性。本發(fā)明人已經(jīng)使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)為了其增強(qiáng)TNE能力而篩選了許多經(jīng)修飾的核苷 酸并且已經(jīng)發(fā)現(xiàn)這不能通過(guò)研究經(jīng)修飾的核苷酸的物理性質(zhì)而預(yù)測(cè)。另外，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)， 許多用于增加反義寡核苷酸性質(zhì)的經(jīng)修飾的核苷酸實(shí)際上抑制無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的TNE。因此， 本發(fā)明人鑒定了對(duì)增加TNE本身效率特異的經(jīng)修飾的核苷酸。另外相信，本寡核苷酸顯示 出有利的立體化學(xué)和空間構(gòu)型。本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)含有接近但不(直接)毗鄰錯(cuò)配，即位于距離錯(cuò)配至少一個(gè)核 苷酸的位置上的一個(gè)或多個(gè)LNA的寡核苷酸，與C7-丙炔修飾的嘌呤和/或C5-丙炔修飾 的嘧啶一起(一起被稱為丙炔化的核苷酸)增加TNE的效率至迄今未預(yù)料的程度，特別地 增加體內(nèi)即不在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中，但是例如在原生質(zhì)體系統(tǒng)中的TNE的效率。為此，已經(jīng)研究了使用在寡核苷酸中不同位置上引入一個(gè)或多個(gè)LNA和一個(gè)或多 個(gè)丙炔化核苷酸的寡核苷酸對(duì)于無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中TNE頻率的效果。這樣的寡核苷酸的TNE活 性與由正常DNA構(gòu)成的或由只用LNA或丙炔化核苷酸修飾的寡核苷酸構(gòu)成的寡核苷酸的 TNE活性比較。發(fā)現(xiàn)含有在距離錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的位置上的一個(gè)或多個(gè)LNA并聯(lián)合增加量的丙炔化核苷酸的寡核苷酸增加無(wú)細(xì)胞分析中置換和插入的TNE效率至迄今未觀察 到的水平。特別地，通過(guò)插入核苷酸，即在給定的位置插入一個(gè)或多個(gè)核苷酸而獲得了有利 的效果，并且特別是在體內(nèi)系統(tǒng)，如原生質(zhì)體系統(tǒng)中，效率顯著增加。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)當(dāng)經(jīng)修飾的寡核苷酸用于西紅柿葉子原生質(zhì)體中的TNE時(shí)(其給出 寡核苷酸的未有先例的增加)這種增強(qiáng)也可以通過(guò)改變LNA的數(shù)目和位置而被增加。例如 其中將LAN位于至少間隔2個(gè)核苷酸，優(yōu)選至少3個(gè)核苷酸，更優(yōu)選至少4個(gè)核苷酸。另外發(fā)現(xiàn)引入西紅柿基因組的核苷酸改變。這證明觀察到的增加為位點(diǎn)非依賴性的，表明具有在與錯(cuò)配相比特定位置上的經(jīng)修飾的核苷酸的本發(fā)明的寡核苷酸能夠以物種 不相關(guān)的方式，如在植物和動(dòng)物細(xì)胞中，提供增加的TNE頻率。因此本發(fā)明基于如下的發(fā)明考慮可以通過(guò)使用部分(即最多50%，優(yōu)選最多 40% )LNA修飾的進(jìn)一步含有丙炔化寡核苷酸的寡核苷酸而實(shí)現(xiàn)所需的定向核苷酸交換。 寡核苷酸修飾的位置、類型和數(shù)量可以在限定內(nèi)變化，如將在下面本文所討論的那樣。因此本發(fā)明在一個(gè)方面提供經(jīng)LNA修飾的和丙炔化寡核苷酸。因此修飾的單鏈寡 核苷酸可以用于在植物和動(dòng)物或人類細(xì)胞中引入特異的遺傳改變。本發(fā)明適用于生物醫(yī)學(xué) 研究、農(nóng)業(yè)領(lǐng)域并且構(gòu)建特異突變的植物和動(dòng)物，包括人類。本發(fā)明還適用于醫(yī)學(xué)和基因治 療領(lǐng)域。除了含有將堿基變化引入靶鏈的錯(cuò)配堿基的部分之外，本發(fā)明的寡核苷酸的序列 與靶鏈同源。錯(cuò)配堿基被引入靶序列。通過(guò)操作核苷酸的修飾(與常規(guī)的A、C、T或G相 比)，更特別地，通過(guò)操作引入錯(cuò)配的寡核苷酸修飾的位置和數(shù)量，可以增加效率(或DNA雙 鏈中所需位置的核苷酸改變的成功程度)。本發(fā)明的另一個(gè)方面在于一種通過(guò)將親代DNA雙鏈與寡核苷酸接觸而定向改變 親代DNA鏈(第一鏈、第二鏈)的方法，所述寡核苷酸含有與親代鏈相比至少一個(gè)錯(cuò)配的核 苷酸，其中供體寡核苷酸含有特定位置上以LNA修飾的區(qū)段從而當(dāng)能夠進(jìn)行定向核苷酸交 換的蛋白存在時(shí)，具有比親代(受體)鏈更高的結(jié)合能力。因此，本發(fā)明的發(fā)明要點(diǎn)在于以相對(duì)于未經(jīng)修飾的寡核苷酸來(lái)說(shuō)，具有經(jīng)修飾的 核苷酸的寡核苷酸(有時(shí)稱作供體)的結(jié)合能力的增加，其中LNA修飾位于與錯(cuò)配不相鄰 的一個(gè)或多個(gè)位置并且通常在未經(jīng)LNA修飾的位置和不在錯(cuò)配的位置上將丙炔化核苷酸 引入寡核苷酸。還通過(guò)使用根據(jù)本發(fā)明的具有組合的LNA和丙炔修飾物的寡核苷酸以插入DNA片 段中的插入物達(dá)到了有利的結(jié)果。特別令人驚訝值得注意的是其它經(jīng)修飾的已知本身增加 結(jié)合效率的寡核苷酸，在TNE中不如LNA和丙炔修飾的寡核苷酸的本組合有效。
具體實(shí)施例方式在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于定向改變雙鏈DNA序列的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列 含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補(bǔ)的第二 DNA序列，所述寡核苷酸含有能夠與第一 DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域相對(duì)于第一 DNA序列來(lái)說(shuō)含有至少一個(gè)錯(cuò)配，并且其中該 寡核苷酸包含至少一個(gè)區(qū)段，該區(qū)段含有至少兩個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，所述核苷酸與天然存 在的A、C、T或G核苷酸相比具有更高的結(jié)合親和力，其中-至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是位于與至少一個(gè)錯(cuò)配相距至少一個(gè)核苷酸的位置上的LNA，其中可選地，寡核苷酸含有最多約50%的LNA修飾的核苷酸；并且-至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及用于定向改變雙鏈DNA序列的經(jīng)修飾的寡核苷酸。該雙鏈DNA序列含有第一 DNA序列和第二 DNA序列。該第二 DNA序列與第一 DNA序列互補(bǔ)并且 與之配對(duì)而形成雙鏈。該寡核苷酸包括結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有相對(duì)于需要改變的雙鏈DNA 序列的至少一個(gè)錯(cuò)配。優(yōu)選，該結(jié)構(gòu)域是與第一鏈互補(bǔ)的包括至少一個(gè)錯(cuò)配的寡核苷酸的 一部分。優(yōu)選地，結(jié)構(gòu)域中的錯(cuò)配是相對(duì)于第一 DNA序列的錯(cuò)配。該寡核苷酸包含以至少 一個(gè)LNA修飾的區(qū)段和以至少一個(gè)丙炔化核苷酸修飾的區(qū)段，從而具有比第二 DNA序列 (對(duì)應(yīng)的部分)更高的結(jié)合親和力，同時(shí)保留了生物學(xué)活性。優(yōu)選地，至少一個(gè)經(jīng)修飾的LNA 核苷酸位于與至少一個(gè)錯(cuò)配相距至少一個(gè)核苷酸的位置，更優(yōu)選寡核苷酸含有最多約50% 的LNA修飾的核苷酸以及至少一個(gè)丙炔化核苷酸。含有錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域和含有經(jīng)修飾的核苷酸的區(qū)段，無(wú)論分別是LNA或是丙炔化 的，可以重疊。因此，在某些具體實(shí)施方式
中，相對(duì)于所考慮修飾的區(qū)段，含有錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域 位于寡核苷酸上的不同位置上。在某些具體實(shí)施方式
中，結(jié)構(gòu)域整合一個(gè)或多個(gè)區(qū)段。在 某些具體實(shí)施方式
中，區(qū)段可以整合結(jié)構(gòu)域。在某些具體實(shí)施方式
中，結(jié)構(gòu)域和區(qū)段可以位 于寡核苷酸的相同位置上并且具有相同的長(zhǎng)度，即區(qū)段在長(zhǎng)度和位置上是一致的。在某些具體實(shí)施方式
中，結(jié)構(gòu)域中可以有一個(gè)以上的區(qū)段。對(duì)于本發(fā)明，這意味含有為了改變DNA雙鏈的錯(cuò)配的寡核苷酸部分可以位于與修 飾的寡核苷酸部分不同的或移位的位置上。特別地，在某些具體實(shí)施方式
中，其中細(xì)胞的修 復(fù)系統(tǒng)(或至少參與該系統(tǒng)的蛋白，或至少參與TNE的蛋白)決定哪條鏈含有錯(cuò)配以及哪 條鏈將用作改正該錯(cuò)配的模板。LNA 變化鎖定的核酸(LNA)是具有非常有趣性質(zhì)的用于反義基因治療的DNA類似物。LNA 是二環(huán)和三環(huán)核苷和核苷酸類似物和含有這樣類似物的寡核苷酸。在各種出版物和專利 中，包括 WO 99/14226,WO 00/56748,W000/66604,WO 98/39352、美國(guó)專利 No. 6，043，060 和 美國(guó)專利No. 6，268，490中公開了 LNA的基本結(jié)構(gòu)和功能性特征以及相關(guān)的類似物，所有這 些全部通過(guò)參考全文并入本文。特別地，其結(jié)合了區(qū)分正確和非正確靶標(biāo)(高特異性)的能力，非常高的生物穩(wěn)定 性(低周轉(zhuǎn))和未有先例的親和力(非常高的對(duì)靶標(biāo)的結(jié)合強(qiáng)度)。事實(shí)上，以LNA記錄的 親和力的增加使得所有以前報(bào)道的類似物的親和力在低至中等的氛圍內(nèi)。LNA是RNA類似物，其中核糖在結(jié)構(gòu)上被2'-氧和4'-碳原子之間的亞甲基橋 所限制。該橋限制了呋喃核糖環(huán)的靈活性并且將結(jié)構(gòu)鎖至剛性的二環(huán)結(jié)構(gòu)。這個(gè)所謂的 N-型(或3'-內(nèi))構(gòu)象造成含有雙鏈的LNA的Tm增加，以及隨后的更高的結(jié)合親和力和 更高的特異性。NMR光譜研究實(shí)際上已經(jīng)證明LNA糖的鎖定的N-型構(gòu)象，但是還揭示LNA 單體能夠?qū)⑵浞切揎椀南噜徍塑账崤ぶ罭-型構(gòu)象。重要的是LNA的有利特征是不以其它 重要性質(zhì)為代價(jià)的，而核酸類似物則經(jīng)常觀察到是以其它重要性質(zhì)為代價(jià)?？梢詫NA與所有其它組成DNA類似物總體的化學(xué)物自由地混合。可以將LNA堿 基引入寡核苷酸作為短的全LNA序列或作為較長(zhǎng)的LNA/DNA嵌合體。可以將LNA置于內(nèi)部3'或5'位置。但是由于其剛性的二環(huán)構(gòu)象，LNA殘基有時(shí)妨礙核酸鏈的螺旋扭轉(zhuǎn)。因此 較不優(yōu)選的是設(shè)計(jì)具有兩個(gè)或兩個(gè)以上相鄰LNA殘基的寡核苷酸。優(yōu)選，LNA殘基由至少 一個(gè)(經(jīng)修飾的)不干擾螺旋扭轉(zhuǎn)的核苷酸(如常規(guī)的核苷酸A、C、T或G)分開。最初開發(fā)的和優(yōu)選的LNA單體⑶-D-氧-LNA單體)已經(jīng)被修飾成新的LNA單體。 新型a -L-氧-LNA對(duì)3’ -外切核酸酶活性顯示超穩(wěn)定性，并且還比0 _D_氧-LNA在設(shè)計(jì) 有力的反義寡核苷酸方面更有力和更萬(wàn)能。另外可以使用木-LNA(xylo-LNA)和L-核糖 LNA，如在W09914226、W000/56748、W000/66604中公開的。本發(fā)明中，任何上面類型的LNA 可以在實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目標(biāo)(即增加TNE效率)中有效，優(yōu)選是0-D-LNA類似物。TNE領(lǐng)域中，LNA修飾被列在作為TNE中的嵌合體分子的替代物的可能寡核苷酸修 飾的名單中。但是，迄今本領(lǐng)域中沒(méi)有顯示建議當(dāng)LNA位于距離錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸遠(yuǎn)時(shí) 和/或當(dāng)寡核苷酸不含約50%以上(四舍五入至最接近核苷酸整數(shù))的LNA時(shí)，LNA修飾 的單鏈DNA寡核苷酸顯著增加TNE效率至現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的程度。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸包括含有至少一個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選2個(gè) LNA修飾的核苷酸的區(qū)段。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸上的區(qū)段可以含有2、3、4、5、 6、7、8、9或10個(gè)以上的LNA修飾的核苷酸。 在某些具體實(shí)施方式
中，至少一個(gè)LNA位于距離錯(cuò)配最多10個(gè)核苷酸，優(yōu)選最多8 個(gè)核苷酸，更優(yōu)選最多6個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選最多4、3或2個(gè)核苷酸的距離。在更優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，至少一個(gè)LNA位于距離錯(cuò)配一個(gè)核苷酸的距離，即錯(cuò)配和LNA之間有一個(gè) 核苷酸。在某些涉及含有一個(gè)以上的LNA的寡核苷酸的具體實(shí)施方式
中，至少兩個(gè)LNA位 于距離錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的距離。在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，LNA彼此不相鄰并且由至少 一個(gè)核苷酸，優(yōu)選由兩個(gè)或三個(gè)核苷酸所分開。在某些具體實(shí)施方式
中，在兩個(gè)或兩個(gè)以上 (偶數(shù))LNA修飾寡核苷酸的情況下，修飾位于距離錯(cuò)配(約)相等的距離。換句話說(shuō)，優(yōu) 選LNA修飾對(duì)稱地位于錯(cuò)配的周圍。例如，在優(yōu)選的具體實(shí)施方式
中，兩個(gè)LNA對(duì)稱地位于 錯(cuò)配周圍距離錯(cuò)配1個(gè)核苷酸的距離(且彼此間隔3個(gè)核苷酸)，即...(LNA)-N-(錯(cuò)配) N-(LNA) 。在某些具體實(shí)施方式
中，最多40 %，優(yōu)選最多30 %，更優(yōu)選最多25 %，甚至更優(yōu)選 最多20%，和最優(yōu)選最多10%的寡核苷酸的經(jīng)修飾的核苷酸是LNA衍生物，即常規(guī)的A、C、 T或G被其LNA的對(duì)應(yīng)物所替代。在某些具體實(shí)施方式
中，可以引入一個(gè)以上的錯(cuò)配，或同時(shí)或相繼引入。寡核苷酸 可以在寡核苷酸相鄰或遠(yuǎn)離的位置上容納一個(gè)以上的錯(cuò)配。為此，寡核苷酸可以根據(jù)本文 所示的原則適應(yīng)為容納第二套LNA，只要它們不會(huì)由于寡核苷酸中的LNA的特定構(gòu)象(即 優(yōu)選位于錯(cuò)配周圍距離錯(cuò)配一個(gè)核苷酸的距離)而干擾彼此的增加的結(jié)合能力或保留的 生物學(xué)活性。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸可以包含可以是相鄰的或遠(yuǎn)距離的(即非 相鄰的)兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多錯(cuò)配核苷酸。寡核苷酸可以進(jìn)一步含有結(jié)構(gòu)域和區(qū)段以容 納這些，并且特別地可以含有幾個(gè)區(qū)段。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸可以整合一個(gè)潛 在的插入物以插入受體鏈。這樣的插入物的長(zhǎng)度可以從5個(gè)以上至100個(gè)核苷酸變化。以 相似的方式，在某些具體實(shí)施方式
中，可以引入相似長(zhǎng)度變化(從1至100個(gè)核苷酸)的刪 除?？梢酝ㄟ^(guò)電穿孔或其它能夠遞送至核或細(xì)胞質(zhì)的常規(guī)技術(shù)而完成寡核苷酸的遞送?？梢允褂萌鏦001/87914、W003/027265、W099/58702、W001/92512中所述的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng) 而實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法的體外測(cè)試。丙炔修飾在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸包括含有至少一個(gè)，優(yōu)選至少兩個(gè)，更優(yōu)選至少 三個(gè)丙炔修飾的核苷酸的區(qū)段，所述修飾的核苷酸獨(dú)立地選自C7嘌呤和/或C5嘧啶。在某 些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸上的區(qū)段可以含有4、5、6、7、8、9或10個(gè)以上丙炔修飾的核苷 酸。在某些具體實(shí)施方式
中，區(qū)段是完全修飾的，即所有寡核苷酸中的嘧啶都載有C5-丙炔 取代物和/或所有嘌呤都載有C7-丙炔取代物，然后LNA修飾可以位于區(qū)段的旁側(cè)。在某些具體實(shí)施方式
中，有經(jīng)LNA修飾的區(qū)段和經(jīng)丙炔修飾的區(qū)段。在某些具體實(shí)施方式
中，區(qū)段 同時(shí)含有LNA修飾的核苷酸和丙炔修飾的核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸包括 含有至少一個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)，更優(yōu)選至少3個(gè)丙炔修飾的核苷酸的區(qū)段。在某些具體實(shí)施 方式中，寡核苷酸上的區(qū)段可以含有4、5、6、7、8、9或10個(gè)以上丙炔修飾的核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，區(qū)段是完全修飾的，即所有寡核苷酸中的嘧啶都載有C5-丙炔取代物和/ 或所有嘌呤都載有C7-丙炔取代物。在某些具體實(shí)施方式
中，所有的嘌呤都可以被丙炔化 并且嘧啶可以被LNA所置換或反之亦然。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸中至少10%的 核苷酸被其丙炔化對(duì)應(yīng)物所替代。在某些具體實(shí)施方式
中，至少25，更優(yōu)選至少50%，更優(yōu) 選至少75%和在某些情況下優(yōu)選至少90%的核苷酸被其丙炔化對(duì)應(yīng)物所替代。包含在C5-位置上帶有丙炔基團(tuán)的嘧啶核苷酸的寡核苷酸形成相對(duì)于其對(duì)應(yīng)的 嘧啶衍生物而言更穩(wěn)定的雙鏈和三鏈。在7-位置上帶有相同丙炔取代物的嘌呤形成甚至 更穩(wěn)定的雙鏈并且因此是優(yōu)選的。因此，在某些具體實(shí)施方式
中，通過(guò)使用比C5-丙炔嘧啶 核苷酸增強(qiáng)結(jié)合親和力至甚至更大程度的7-丙炔嘌呤核苷酸(8-氮-7-脫氮-2，-脫氧鳥 苷和8-氮-7-脫氮-2’ -脫氧腺嘌呤的7-丙炔衍生物)進(jìn)一步增加了效率。這樣的核苷 酸特別在 He 和 Seela，2002 Nucleic Acids Res.迎5485_5496 中被公開。在某些具體實(shí)施方式
中，可以引入一個(gè)以上的錯(cuò)配，或同時(shí)或相繼引入。寡核苷酸 可以在寡核苷酸相鄰或遠(yuǎn)離的位置上容納一個(gè)以上的錯(cuò)配。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核 苷酸可以包含可以是相鄰的或遠(yuǎn)距離的(即非相鄰的)兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)或更多錯(cuò)配核苷 酸。寡核苷酸可以進(jìn)一步包含結(jié)構(gòu)域和區(qū)段以適應(yīng)這一狀況，并且特別可以包含幾個(gè)區(qū)段。 在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸可以整合潛在的需要插入受體鏈的插入物。這樣的插入 物的長(zhǎng)度可以從5個(gè)以上至100個(gè)核苷酸變化。以相似的方式在某些具體實(shí)施方式
中，可 以引入相似長(zhǎng)度變化(從1至100個(gè)核苷酸)的刪除。在本發(fā)明的某些有利的具體實(shí)施方式
中，使用本發(fā)明的寡核苷酸已經(jīng)實(shí)現(xiàn)核苷酸 的插入。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸可以整合潛在的需要插入受體鏈的插入物。這 樣的插入物的長(zhǎng)度可以從1、2、3、4、5至100個(gè)核苷酸變化。以相似的方式在某些具體實(shí)施 方式中，可以引入相似長(zhǎng)度變化(從1至100個(gè)核苷酸)的刪除。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸中至少10%的核苷酸被其丙炔化對(duì)應(yīng)物所替 換。在某些具體實(shí)施方式
中，至少25，更優(yōu)選至少50 %，更優(yōu)選至少75 %和在某些情況下優(yōu) 選至少90%的核苷酸被其丙炔化對(duì)應(yīng)物所替代。丙炔基團(tuán)是具有三鍵的三碳鏈。三鍵與位于嘧啶的C5位置和嘌呤核苷酸的7-位 上的核苷酸基本結(jié)構(gòu)共價(jià)結(jié)合(圖2)。胞嘧啶和尿嘧啶(替代寡核苷酸上的胸腺嘧啶)
11都可以裝備C5-丙炔基團(tuán)，分別形成C5-丙炔-胞嘧啶和C5-丙炔-尿嘧啶。單個(gè)C5-丙 炔-胞嘧啶殘基增加Tm 2.8°C，單個(gè)C5-丙炔-尿嘧啶增加1.7°C (Froehler等人1993 Tetrahedron Letters M1003-6 ；Lacroix 等人 1999 Biochemistry 38 1893-1901 ； Ahmadian等人 1998 Nucleic Acids Res 巡3127_3135 ;Colocci 等人 1994J. Am. Chem. Soc 116 785-786)。這是由于C5-位上的1_丙炔基團(tuán)的疏水性并且其還允許更好地堆積堿基， 因?yàn)楸不鶊F(tuán)相對(duì)于雜環(huán)堿基而言是平面的。已經(jīng)研究了含有C5-丙炔取代的嘧啶基團(tuán)的寡核苷酸的增加的結(jié)合性質(zhì)以改變 細(xì)胞過(guò)程。含有C5-丙炔基團(tuán)的反義寡核苷酸與其靶標(biāo)mRNA形成更穩(wěn)定的雙鏈，引起基因 表達(dá)抑制的增加(Wagner 等人 1993 Science 260 1510~1513 :Flanagan 等人 1996 Nature Biotech. 14 1139-1145 ；Meunier 等人 2001 Antisense&NucleicAcid Drug Dev. H 117-123)。另外，這些實(shí)驗(yàn)證明這樣的寡核苷酸有生物學(xué)活性并且可被細(xì)胞耐受。在TNE 的領(lǐng)域中，C5-丙炔嘧啶修飾被列在作為TNE中的嵌合體分子的替代物的可能寡核苷酸修 飾的名單中。但是，迄今本領(lǐng)域中沒(méi)有顯示建議與LNA修飾聯(lián)合的C5和/或C7修飾的單 鏈DNA寡核苷酸顯著增加TNE效率至現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的程度。寡核苷酸設(shè)計(jì)在本發(fā)明的進(jìn)一步方面，可以通過(guò)下列方法實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的設(shè)計(jì)-確定受體鏈的序列，或需要交換的核苷酸周圍序列的至少一個(gè)區(qū)段。這可以通常 是約與錯(cuò)配或所需插入位置相鄰的至少10個(gè)，優(yōu)選15、20、25或30個(gè)核苷酸，優(yōu)選在錯(cuò)配 的每一側(cè)，(例如GGGGGGXGGGGGG，其中X是錯(cuò)配或插入位置)；-設(shè)計(jì)與錯(cuò)配相鄰的一個(gè)或兩個(gè)區(qū)段互補(bǔ)的并且含有需要交換的核苷酸的供體寡 核苷酸(例如 CCCCCCYCCCCCC)；-給供體寡核苷酸提供(例如通過(guò)合成)所需位置上的LNA和丙炔修飾。修飾 可以根據(jù)環(huán)境廣泛變化。例子是 CCCmCCmCYCCmCCCmC、CCCmCCCYCCCmCCC、CCCCCCYCCCmCmCmCm、 CmCmCmCmCmCYCCCCCC、CCCCCmCYCCCmCCCCC等等，其中Cm代表LNA或丙炔修飾的核苷酸殘基。 對(duì)于不同的受體序列，例如ATGCGTACXGTCCATGAT，可以設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的供體寡核苷酸，例如具有 如上文概括的可變修飾的TACGCALGYCLGGTACTA(L = LNA或丙炔)。-當(dāng)存在能夠靶向核苷酸交換的蛋白(例如，并且特別地是在細(xì)胞的錯(cuò)配修復(fù)機(jī) 制中有功能的蛋白)時(shí)以供體寡核苷酸修飾DNA。不被理論所限制，增加的結(jié)合親和力被認(rèn)為增加寡核苷酸發(fā)現(xiàn)并且保持結(jié)合其靶 標(biāo)的可能性，因此增加了 TNE的效率。對(duì)糖骨架或堿基的許多不同化學(xué)修飾給予增加的結(jié) 合親和力。但是本發(fā)明人選擇集中于LNA修飾的寡核苷酸并且發(fā)現(xiàn)其在TNE中的活性依賴 寡核苷酸中的位置。如本文中使用的，供體寡核苷酸影響TNE的能力取決于引入供體寡核苷酸中經(jīng)修 飾的核苷酸的類型、位置和數(shù)目或相對(duì)數(shù)量。該能力被定量可以通過(guò)例如將常規(guī)核苷酸之 間的結(jié)合親和力(或結(jié)合能量(Gibbs自由能))標(biāo)準(zhǔn)化至1，即對(duì)于AT和GC，結(jié)合親和力 均標(biāo)準(zhǔn)化至1。對(duì)于本發(fā)明的寡核苷酸，每個(gè)修飾的核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力(RBA)為> 1。這在下面的公式中舉例說(shuō)明RBA = E RBA(經(jīng)修飾的)-1 RBA(未修飾的)> 0 nm其中RBA是總相對(duì)結(jié)合親和力，RBA (經(jīng)修飾的)是具有n個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的經(jīng)修飾 的寡核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力的和，RBA(未修飾的)是具有m個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的未修飾的寡 核苷酸的相對(duì)結(jié)合親和力的和。例如，對(duì)于含有10個(gè)修飾的lOObp寡核苷酸，每個(gè)具有1. 1 的相當(dāng)結(jié)合親和力。然后總 RBA 等于RBA = [(10*1. 1) +(90*1.0)]-(100*1.0) = 1。注意RBA的定義原則上不依賴需要比較的核苷酸鏈的長(zhǎng)度。但是，當(dāng)比較不同鏈 的RBA時(shí)，優(yōu)選的是鏈具有約相同的長(zhǎng)度或采用可比長(zhǎng)度的區(qū)段。注意RBA不考慮可以在鏈 上集合在一起的修飾。因此以鏈B相比，某些鏈A的較高程度修飾意味著RBA (A) > RBA (B)。 對(duì)于上游和下游區(qū)段，可以確定和使用對(duì)應(yīng)的(局部的)RBA值。為了容納經(jīng)修飾的核苷酸 的位置效應(yīng)，可以將重量因素引入RBA值。例如，經(jīng)修飾的核苷酸對(duì)于與錯(cuò)配相鄰的供體寡 核苷酸的效應(yīng)可以比位于距離錯(cuò)配5個(gè)核苷酸距離的經(jīng)修飾的核苷酸的效應(yīng)大。在本發(fā)明 的上下文中，RBA (供體)> RBA (受體)。在某些具體實(shí)施方式
中，供體的RBA值可以比受體的RBA至少大0. 1。在某些具 體實(shí)施方式中，供體的RBA值可以比受體的RBA值至少大0. 2,0. 3,0. 4,0. 5,0. 6,0. 7,0. 8、 0. 9,1. 0,1. 5,2. 0,2. 5。RBA值可以源自核苷酸的經(jīng)修飾的結(jié)合親和力的常規(guī)分析，例如通 過(guò)分子模擬法、熱力學(xué)測(cè)定等?；蛘?，可以通過(guò)測(cè)定修飾鏈和未修飾鏈之間的Tm差別而確 定它們?；蛘撸梢砸晕葱揎椇托揎楁溨gTm的差別表示RBA，或者是通過(guò)測(cè)量，或者是通 過(guò)使用用于計(jì)算一組核苷酸的Tm的常規(guī)公式，或者是計(jì)算和測(cè)量組合。根據(jù)本發(fā)明的供體寡核苷酸可以含有進(jìn)一步修飾以增加雜交特征，以致供體顯示 對(duì)靶標(biāo)DNA鏈增加的親和力，因此促進(jìn)了供體的插入。也可以進(jìn)一步修飾供體寡核苷酸以 使其對(duì)核酸酶更具抗性，以穩(wěn)定三鏈或四鏈結(jié)構(gòu)。對(duì)本發(fā)明的LNA修飾的供體寡核苷酸的 修飾可以包括硫磷酰修飾、2-OMe置換、在寡核苷酸的3和/或5’末端使用其它類型的LNA、 PNA(肽核酸)，核糖核苷酸和其它堿基，所述這些調(diào)節(jié)優(yōu)選為增加寡核苷酸和受體鏈之間 雜交體的穩(wěn)定性。這些修飾中特別有用的是PNA，其是寡核苷酸類似物，其中寡核苷酸的脫氧核糖骨 架被肽骨架所替代。一個(gè)這樣的肽骨架是由通過(guò)酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)甘氨酸重復(fù) 單位構(gòu)成。每個(gè)單位的肽骨架連接至核苷堿基(也稱為“堿基”)，其可以是天然存在的，非 天然存在的或經(jīng)修飾的堿基。PNA寡聚物結(jié)合具有比DNA或RNA更高的親和力的與DNA或 RNA特異性互補(bǔ)的序列。因此，獲得的PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈具有更高的熔解溫度(Tm)。 此外，PNA/DNA或PNA/RNA雙鏈的Tm比DNA/DNA或DNA/RNA雙鏈對(duì)鹽濃度較為不敏感。PNA 的聚酰胺骨架還對(duì)酶的降解更有抗性。PNA合成在例如W0 92/20702和W092/20703中有 描述，其內(nèi)容通過(guò)參考全文并入本文。其它PNA在例如W093/12129和1996年7月23日出 版的美國(guó)專利No. 5，539，082中有示例，其內(nèi)容通過(guò)參考全文并入本文。另外，許多科學(xué)出 版物描述了 PNA的合成以及其性質(zhì)和用途。見例如Patel，Nature，1993, 365,490,Nielsen 等人，Science, 1991，254，1497 ；Egholm, J.Am. Chem. Soc.，1992，114，1895、Knudson 等人， NucleicAcids Research, 1996，24，494、Nielsen 等人，J. Am. Chem. Soc.，1996，118，2287、 Egholm 等人，Science，1991,254，1497、Egholm 等人，J.Am. Chem. Soc.，1992，114，1895 和
13Egholm 等人，J Am. Chem. Soc.，1992，114，9677。本發(fā)明的寡核苷酸的進(jìn)一步有用的修飾還有從德國(guó)Epoch Biosciences獲得的 SuperA和Super T。這些經(jīng)修飾的核苷酸含有插入DNA大溝的另外的取代物，其中被認(rèn)為 增加DNA雙鏈的堿基堆積。在另外的具體實(shí)施方式
中，當(dāng)將根據(jù)本發(fā)明的經(jīng)修飾的寡核苷酸以外的進(jìn)一步的 修飾(其可以甚至更增加寡核苷酸對(duì)于受體鏈的親和力)引入寡核苷酸時(shí)，可以獲得有利 的結(jié)果。因此，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，進(jìn)一步包含C5-丙炔修飾的嘧啶和/或C7-丙炔修飾的嘌呤的根 據(jù)本發(fā)明的LNA修飾的寡核苷酸顯著增加TNE的效率。本發(fā)明的供體寡核苷酸還可以制成嵌合體，即含有DNA、RNA、LNA、PNA或其組合物 的區(qū)段。因此，在某些具體實(shí)施方式
中，本發(fā)明的寡核苷酸進(jìn)一步含有其它的可選的非甲 基化的經(jīng)修飾的核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸對(duì)核酸酶有抗性。這對(duì)于防止寡核苷酸被核酸 酶降解有利，并且增大供體寡核苷酸發(fā)現(xiàn)其靶標(biāo)(受體分子)的機(jī)會(huì)。在本發(fā)明的某些具體實(shí)施方式
中，可以修飾在寡核苷酸的錯(cuò)配位置上的核苷酸。 錯(cuò)配是否可以被修飾將很大程度上取決于定向核苷酸交換的確切機(jī)制或利用供體和受體 鏈間親和力的差別的細(xì)胞DNA修復(fù)機(jī)制。對(duì)于與錯(cuò)配相鄰或附近的其它修飾位置確切位置 也是這樣。但是，基于本文中顯示的公開，考慮到對(duì)于如本文其它地方所述的合適的測(cè)試過(guò) 程，可以容易地設(shè)計(jì)和測(cè)試這樣的寡核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，未修飾錯(cuò)配位置上的 核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，修飾在距離錯(cuò)配1個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的位置上，優(yōu)選距離錯(cuò)配2、 3、4、5、6或7個(gè)核苷酸遠(yuǎn)。在某些具體實(shí)施方式
中，修飾位于錯(cuò)配下游的位置。在某些具體 實(shí)施方式中，修飾位于錯(cuò)配上游的位置。在某些具體實(shí)施方式
中，修飾位于距離錯(cuò)配10bp 至10kb，優(yōu)選50至5000bp，更優(yōu)選距離錯(cuò)配100至500bp。用作供體的寡核苷酸的長(zhǎng)度可變化但是通常在10-500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度變化，優(yōu) 選為11-100個(gè)核苷酸，優(yōu)選為15-90個(gè)核苷酸，更優(yōu)選為20-70個(gè)核苷酸，最優(yōu)選為30-60 個(gè)核苷酸。在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及一種定向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括將雙鏈 受體DNA序列與供體寡核苷酸結(jié)合，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA 序列互補(bǔ)的第二 DNA序列，并且其中供體寡核苷酸包括含有相對(duì)于需要改變的雙鏈?zhǔn)荏w DNA序列(優(yōu)選相對(duì)于第一DNA序列)而言至少一個(gè)錯(cuò)配的結(jié)構(gòu)域，并且其中供體寡核苷酸 的區(qū)段以至少一個(gè)LNA和至少一個(gè)丙炔化核苷酸修飾，從而當(dāng)存在能夠靶向核苷酸交換的 蛋白時(shí)，表達(dá)與寡核苷酸中該位置上的未經(jīng)修飾的核苷酸比，較高程度的對(duì)第一 DNA序列 的親和力，其中LNA位于距離錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸的距離。本發(fā)明以其最廣泛的形式，通常適用于所有種類的生物如人類、動(dòng)物、植物、魚、爬 行動(dòng)物、昆蟲、真菌、細(xì)菌等等。本發(fā)明適用于任何類型的DNA的修飾，如源于基因組DNA的 DNA、線性DNA、人工染色體、核染色體DNA、細(xì)胞器染色體DNA、BAC、YAC的修飾。本發(fā)明可以 在體內(nèi)以及在體外進(jìn)行。本發(fā)明以其最廣泛的形式，適用于改變細(xì)胞、通過(guò)恢復(fù)至野生型而改正突變、誘導(dǎo) 突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)而滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)而修飾酶的生物活性、通過(guò)破壞編碼區(qū)而修飾蛋白的許多目的。本發(fā)明還涉及實(shí)質(zhì)上如以上所述的寡核苷酸的用途，其用于改變細(xì)胞、通過(guò)恢復(fù) 至野生型而改正突變、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)而失酶、通過(guò)改變編碼區(qū)而修飾生物活 性、通過(guò)破壞編碼區(qū)而修飾蛋白、錯(cuò)配修復(fù)、定向改變(植物)遺傳物質(zhì)，包括基因突變、定 向基因修復(fù)和基因敲除。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種試劑盒，其含有如本文其它地方所述的一個(gè)或多個(gè)寡核苷 酸，可選地與能夠誘導(dǎo)定向突變和特別地能夠進(jìn)行TNE的蛋白聯(lián)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的修飾的遺傳物質(zhì)，涉及含有修飾的遺 傳物質(zhì)的細(xì)胞和生物，涉及如此獲得的植物或植物部分?？梢酝ㄟ^(guò)電穿孔或其他能夠遞送至核或細(xì)胞質(zhì)的常規(guī)技術(shù)實(shí)現(xiàn)寡核苷酸的遞送。 可以使用如W001/87914、W003/027265、W099/58702、W001/92512中所述的無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)實(shí)現(xiàn) 本發(fā)明方法的體外測(cè)試。本發(fā)明以其最廣泛的形式，適用于改變細(xì)胞、通過(guò)恢復(fù)至野生型而改正突變、誘導(dǎo) 突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)而滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)而修飾生物活性、通過(guò)破壞編碼區(qū)而修飾 蛋白的許多目的。本發(fā)明還涉及實(shí)質(zhì)上如以上所述的寡核苷酸的用途，其用于改變細(xì)胞、通過(guò)恢復(fù) 至野生型而改正突變、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)而滅活酶、通過(guò)改變編碼區(qū)而修飾生物活 性、通過(guò)破壞編碼區(qū)而修飾蛋白、錯(cuò)配修復(fù)、定向改變(植物)遺傳物質(zhì)，包括基因突變、定 向基因修復(fù)和基因敲除。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種試劑盒，其含有如本文其它地方所述的一個(gè)或多個(gè)寡核苷 酸，可選地，與能夠誘導(dǎo)定向突變和特別地能夠進(jìn)行TNE的蛋白聯(lián)合。本發(fā)明進(jìn)一步涉及通過(guò)本發(fā)明的方法獲得的修飾的遺傳物質(zhì)，涉及含有修飾的遺 傳物質(zhì)的細(xì)胞和生物，涉及如此獲得的植物或植物部分。本發(fā)明特別涉及使用本發(fā)明的LNA和丙炔修飾的寡核苷酸的TNE方法用于提供植 物中的除草劑抗性的用途。特別地，本發(fā)明涉及提供了抗除草劑抗性的植物，特別是磺酰脲 除草劑(例如氯磺隆(chlorsulfuron)和草甘膦。本發(fā)明進(jìn)一步涉及一種增加雙鏈DNA的定向核苷酸交換效率的方法，該方法包括 下列步驟(a)獲得含有能夠與所述雙鏈的第一 DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域的寡核苷酸，其中所 述結(jié)構(gòu)域含有(i)至少一個(gè)相對(duì)于第一 DNA序列的錯(cuò)配；和(ii)至少一個(gè)具有增加的結(jié) 合親和力的經(jīng)修飾的核苷酸；和(b)將所述修飾的核苷酸和所述錯(cuò)配間的距離減小至約8 個(gè)或更少的核苷酸；(c)回收用于定向核苷酸交換的寡核苷酸。該方法基于寡核苷酸的現(xiàn) 有技術(shù)中給出的限制的觀察，即錯(cuò)配和寡核苷酸之間的距離必須是至少8個(gè)核苷酸的要求 不是本發(fā)明的寡核苷酸的要求。如從附屬的實(shí)施例中可見的，含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核 苷酸比未經(jīng)修飾的寡核苷酸在TNE中更有效。本發(fā)明進(jìn)一步涉及用于定向改變雙鏈DNA的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸包含能 夠與所述雙鏈的第一 DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域并且所述結(jié)構(gòu)域含有(a)至少一個(gè)相對(duì)于第 一 DNA序列的錯(cuò)配；(b)含有至少一個(gè)經(jīng)修飾的具有增加的結(jié)合親和力的核苷酸的至少一 個(gè)區(qū)段，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸是LNA或丙炔修飾的核苷酸，如本文其它地方所述，其中 所述經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配至少8個(gè)核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，區(qū)段含
15有兩個(gè)或兩個(gè)以上經(jīng)修飾的核苷酸，獨(dú)立選自如本文其它地方所述的LNA或丙炔修飾的核 苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，LNA位于距離錯(cuò)配至少一個(gè)但是不超過(guò)8個(gè)核苷酸。在某 些具體實(shí)施方式
中，經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配至多8個(gè)核苷酸。在某些具體實(shí)施 方式中，經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配至多6個(gè)核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，經(jīng)修 飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配至多4個(gè)核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，經(jīng)修飾的核苷酸 位于距離所述錯(cuò)配至多2個(gè)核苷酸。在某些具體實(shí)施方式
中，寡核苷酸含有能夠與雙鏈的 第一 DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域，其中所述結(jié)構(gòu)域含有2個(gè)LNA。另外，用于雙鏈DNA的定向核 苷酸交換的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有(a)經(jīng)修飾的核苷酸；和(b)相對(duì)于所述雙鏈 DNA鏈的錯(cuò)配，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配約1個(gè)核苷酸遠(yuǎn)。


圖1 圖解說(shuō)明定向核苷酸交換。將含有需要交換的核苷酸⑴的受體雙鏈 DNA鏈與LNA和C5-丙炔嘧啶修飾的含有需要插入的核苷酸(Y)的供體寡核苷酸(以 NNNmNNNmYNNmNNm圖解給出)接觸。將受體/供體結(jié)構(gòu)置于或者與能夠進(jìn)行TNE的環(huán)境接 觸或至少與能夠進(jìn)行TNE的蛋白接觸，如與已知的無(wú)細(xì)胞酶混合物或無(wú)細(xì)胞提取物(見 W099/58702, W001/73002)接觸。圖2 5-丙炔脫氧尿嘧啶、5-丙炔脫氧胞嘧啶、2 ‘-脫氧_7_丙炔_7_脫氮-腺 苷和2’脫氧-7-丙炔-7-脫氮鳥苷和鎖定的核酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)。圖3 自除草劑抗性的番茄愈傷組織擴(kuò)增的ALS P186/184密碼子的序列分析。在 這個(gè)情況下將單獨(dú)的PCR產(chǎn)物克隆并測(cè)序。
實(shí)施例實(shí)施例1 無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中的TNE含有C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸、LNA核苷酸或其組合購(gòu)自Trilink Biotech, GeneLink或Ribotask。含有其它修飾的核苷酸的寡核苷酸購(gòu)自Eurogentec。使用的寡核苷酸的序列在表1中顯示。用于實(shí)驗(yàn)的質(zhì)粒是含有提供卡那霉素和羧 芐青霉素的抗性基因的PCR2. ldnvitrogen)的衍生物。質(zhì)粒KmY22st0p具有卡那霉素0RF 中密碼子Y22上的TAT至TAG突變。在質(zhì)粒KmY22 A中，將Y22密碼子(TAI)的第三個(gè)核 苷酸去除以產(chǎn)生框架移動(dòng)。在兩個(gè)質(zhì)粒中，將卡那霉素0RF在相同的位置突變。因此，可以 通過(guò)分別以KmY22st0p或KmY22 A孵育測(cè)試單個(gè)核苷酸產(chǎn)生核苷酸取代或插入的效率。Km WT GAG AGG CTA TTC GGC TAT GAC TGG GCA CAA CAGERLFGYDWAQQKmY22stop GAG AGG CTA TTC GGC TAG GAC TGG GCA CAA CAGE R L F G 女KmY22A GAG AGG CTA TTC GGC TA_ GAC TGG GCA CAA CAGE R L F G 女顯示了卡那霉素0RF的相對(duì)序列和編碼的氨基酸。如前所述(Sawano等人2000 Nucleic Acids Res.28 :e78)引入單個(gè)核苷取代和刪除從而產(chǎn)生終止密碼子(TAG，*)。顯 示了用于實(shí)驗(yàn)的寡核苷酸的序列。在卡那霉素0RF中寡核苷酸結(jié)合區(qū)以下劃線標(biāo)示。
無(wú)細(xì)胞分析無(wú)細(xì)胞分析如下進(jìn)行。從擬南芥(Arabidopsis thaliana)(生態(tài)型Col_0)收集 花蕾并在液氮下研磨。加入200 ill蛋白分離緩沖液(20mM HEPES pH7. 5,5mM KC1，1. 5mM MgCl2, lOmM DTT, 10% (v/v)甘油，(w/v)PVP)。通過(guò) 14k RPM 離心 30 分鐘將植物碎片 沉淀并且將上清液儲(chǔ)存于-80°C。使用NanoOrange試劑盒(Molecular Probes, Inc)測(cè)定 蛋白濃度。通常分離形成約3-4i!g/ia的蛋白濃度。無(wú)細(xì)胞反應(yīng)物含有下列成分lyg 質(zhì)粒DNA (KmY22stop或KmY22 A )，100ng寡核苷酸，30 y g總植物蛋白，4 yl剪切的鮭精 DNA(3ug/u l),2u 1蛋白酶抑制劑混合物(50x濃度完全的無(wú)EDTA的蛋白酶抑制劑混合 物片，Roche Diagnostics) ,50 u 1 2x無(wú)細(xì)胞反應(yīng)緩沖液(400mM Tris pH7. 5,200mM MgCl2, 2mM DTT, 0. 4mM 亞精胺，50mM ATP, 2mM 每種 CTP，GTP，UTP，0. ImM 每種 dNTP 和 lOmM NAD)，以 水制成總體積100 yl。將混合物于37°C孵育1小時(shí)。然后將質(zhì)粒DNA按照如下分離向每 個(gè)反應(yīng)物中加入100 u 1 H20以增加體積，然后加入200 u 1堿緩沖的酚(pH8-10)。將其短時(shí) 振蕩，然后于13k rpm離心3分鐘。將上層水相轉(zhuǎn)移至新管然后加入200 yl氯仿。將其短時(shí) 振蕩，于13k rpm離心3分鐘并將水相轉(zhuǎn)移至新管中。通過(guò)加入0. 7倍體積的2-異丙醇沉淀 DNA，將沉淀重懸于TE。為了去除任何共純化的寡核苷酸，將DNA通過(guò)Qiagen PCR純化柱并 將質(zhì)粒DNA洗脫于最終體積30 ill。將2 ill質(zhì)粒DNA電穿孔至18 u 1 DH10B (Invitrogen) 電感受態(tài)細(xì)胞。電穿孔后，令細(xì)胞在S0C培養(yǎng)基中于37°C恢復(fù)1小時(shí)。這期間后，加入卡那 霉素至lOOy g/ml的濃度并將細(xì)胞繼續(xù)孵育3小時(shí)。通過(guò)計(jì)數(shù)獲自涂在含有培養(yǎng)基的羧芐 青霉素上的10-4至10_5電穿孔稀釋液的克隆數(shù)而計(jì)算電穿孔的效率。通過(guò)用卡那霉素抗 性克隆數(shù)除以從羧芐青霉素抗性克隆數(shù)計(jì)算來(lái)的總轉(zhuǎn)化細(xì)胞數(shù)而計(jì)算TNE的效率。結(jié)果使用KmY22stop的無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)顯示在表1中的引入寡核苷酸的經(jīng)修飾的核苷酸如下甲基磷酸酯(MP)是含有核酸酶抗性甲基磷酸酯連接而不是天然存在的帶負(fù)電的 磷酸二脂鍵的非離子核酸類似物。它們廣泛用于哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的反義方法。已知C-5甲基化嘧啶脫氧核苷酸(5Me_dC)比其對(duì)應(yīng)的嘧啶衍生物形成更穩(wěn)定的 雙鏈。例如，已經(jīng)顯示5-甲基-2’-脫氧胞苷(5-Me-dC)的取代增加Tm 1. 3°C /取代。合 成5-(1_丙炔)-2’ -脫氧尿苷(pdU)和5-(l-丙炔)-2’ -脫氧胞苷(pdC)已經(jīng)證明兩個(gè) 取代均增加雙鏈的穩(wěn)定性。在嘧啶C5的位置用1-丙炔取代甲基使得更好地堆積堿基，因 為與雜環(huán)堿基相比丙炔基團(tuán)是平的。同時(shí)，丙炔比甲基更疏水，這一性質(zhì)進(jìn)一步提供結(jié)合的 增加。雙鏈結(jié)合增加1. 7°C /pdU和1. 5°C /pdC殘基。嗎啉代寡核苷酸是DNA類似物，其中核糖被嗎啉半體替代，使用磷酸酰胺 (phosphoroamidate)亞基間連接替代磷酸二酯鍵。其廣泛用于斑馬魚中的基因敲除研究 (Genesis, Vol 30，2001)。其還用于改正突變3 _球蛋白前體mRNA的異常剪接(Lacerra 等人 2000，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 97，9591-9596)。首先由Wengel 和同事描述(Koshkin 等人 1998，Tetrahedron 54，3607-3630 ； Singh 等人，1998，Chem. Commun. 455-456)的和由 Imanishi 和同事(Okiba 等人 1998， Tetrahedron Lett. 39，5401-5404)描述的鎖定的核酸(0-D-LNA)是構(gòu)象限定的核苷酸 衍生物。其含有減少構(gòu)象靈活性并給核苷酸的糖半體提供RNA樣C3’ -內(nèi)構(gòu)象的亞甲基2，-0，4，-C 連接(Petersen 等人 2002，J.Am. Chem. Soc. 124,5974-5982)。與未經(jīng)修飾的 雙鏈比，這極大地增加了對(duì)于DNA靶標(biāo)的親和力，每個(gè)引入的LNA單體增加寡核苷酸的Tm 4-9°C (ffengel, J. 2001, In Crooke, S. T. (ed), Antisense DrugTechnology Principles, Strategies and Applications. Marcel Dekker, Inc. ,New York,Basle,pp. 339-357)。還石if 究了 0-D-LNA的立體異構(gòu)體a-L-LNA的性質(zhì)。熟知0-D-LNA用互補(bǔ)的DNA鎖至A-形式， 但是 a -L-LNA和 DNA 間的雙鏈采用 B 形式(Nielsen 等人 2002，Chem. Eur. J. 8,3001-3009)， 其是雙鏈DNA的天然形式。由于其增加的結(jié)合親和力，這些LNA形式都顯示增加寡核苷酸 的反義性質(zhì)(Kurreck 等人 2002，Nuc. Acids. Res. 30，1911-1918 ；Frieden 等人 2003，Nuc. AcidsRes. 31,6365—6372)。在兩個(gè)末端任一個(gè)或在序列內(nèi)帶有6-氯-2-甲氧吖啶分子的寡核苷酸具有有效 插入雙螺旋的能力。因此這樣的插入通過(guò)提供額外的結(jié)合能量而增加雜合體穩(wěn)定性。吖啶 標(biāo)記的寡核苷酸已經(jīng)用于那些寡核苷酸雜合體穩(wěn)定性的增加為重要的應(yīng)用。向寡核苷酸3’ 末端加入染料還保護(hù)寡核苷酸免受外切核酸酶的降解。由于形成額外的氫鍵，結(jié)合胸腺嘧啶的2-氨基腺嘌呤的穩(wěn)定性位于A: T和G: C堿 基對(duì)穩(wěn)定性的中間。2’ -0-甲基核苷酸，例如2’ -0-甲基肌苷對(duì)各種核糖核酸酶和脫氧核糖核酸酶有 抗性，也與互補(bǔ)序列形成更穩(wěn)定的雜合體。
18表1.無(wú)細(xì)胞分析中含有經(jīng)修飾的寡核苷酸的寡核苷酸的TNE效率。
DNA而大寫字母代表經(jīng)修飾的核苷酸(堿基，糖或磷酸鹽骨架修飾或其組合)和其在寡核苷 酸中的位置。說(shuō)明了每個(gè)寡核苷酸中包括的經(jīng)修飾的核苷酸。每個(gè)寡核苷酸的TNE效率表 示為與只有DNA的寡核苷酸(寡核苷酸1)的TNE效率相比TNE增加(或減少)的倍數(shù)。每 個(gè)寡核苷酸至少進(jìn)行了 4次重復(fù)，每個(gè)系列的實(shí)驗(yàn)還包括作為參考的寡核苷酸1的多次重 復(fù)。為了區(qū)分不同種類的位于相同寡核苷酸上的經(jīng)修飾的核苷酸，以粗體顯示一種類型的 經(jīng)修飾的寡核苷酸(例如寡核苷酸9、10、21和22)。pdC，5- (1-丙炔)-2’-脫氧胞苷；pdU, 5-(1_丙炔)_2’_脫氧尿苷；LNA，鎖定的核酸；MP，甲基磷酸酯連接；5Me-dC，5-甲基-脫氧 胞苷。對(duì)照實(shí)驗(yàn)中，當(dāng)從反應(yīng)中省略寡核苷酸或蛋白時(shí)，未獲得卡那霉素抗性克隆。將寡核苷酸設(shè)計(jì)為分別在KmY22st0p或KmY22A質(zhì)粒中產(chǎn)生單個(gè)核苷酸取代或插 入，恢復(fù)0RF功能。實(shí)驗(yàn)證明單鏈寡核苷酸中的0-D-LNA核苷酸的數(shù)量和位置是相關(guān)的。 其中3-D-LNA核苷酸被置于錯(cuò)配核苷酸旁邊的寡核苷酸(寡核苷酸2)與未經(jīng)修飾的寡核 苷酸相比顯示出較小的TNE活性。增加0-D-LNA核苷酸的數(shù)量(寡核苷酸3和4)產(chǎn)生生 物非活性寡核苷酸。但是，當(dāng)以3或4個(gè)包括錯(cuò)配核苷酸的正常DNA核苷酸(寡核苷酸5和 6)分開0 -D-LNA時(shí)，觀察到TNE效率的增加?？紤]到a -L-LNA核苷酸采用更多DNA構(gòu)象， 可以預(yù)期其還將增加TNE至與0 -D-LNA比相同的程度或也許甚至更好。但是顯示寡核苷酸 7和8在我們的分析中幾乎無(wú)活性，證明0 -D-LNA立體異構(gòu)體優(yōu)選用于增加TNE。2’ -氨 基-LNA與其他LNA形式比顯示較優(yōu)的DNA結(jié)合，由于向LNA核苷酸加入可以提供額外的DNA 相互作用的額外的基團(tuán)(Singh等人(1998) J. Org. Chem. 63,10035) 0但是，再次，雖然寡核 苷酸9和10的結(jié)合親和性假設(shè)是增加了，測(cè)試的2’ -氨基-LNA衍生物去除了這些寡核苷 酸的TNE活性并且因此是較不優(yōu)選的。與其提供給反義寡核苷酸的強(qiáng)烈增強(qiáng)相反，寡核苷 酸11、12、13和16在TNE中無(wú)活性。在每一端含有2個(gè)2’ -0-甲基肌苷的寡核苷酸14與 未經(jīng)修飾的寡核苷酸的活性一樣，但是當(dāng)2’ -0-甲基肌苷核苷酸在錯(cuò)配核苷酸的側(cè)面(寡 核苷酸15)時(shí)，該寡核苷酸變得無(wú)活性。插入劑6-氯-2-甲氧吖啶還使得寡核苷酸無(wú)活性 (寡核苷酸17和18)。我們的數(shù)據(jù)顯示含有C5-丙炔嘧啶的寡核苷酸顯示TNE的增強(qiáng)，其 至少部分依賴于寡核苷酸中經(jīng)修飾的嘧啶的數(shù)量。當(dāng)我們考慮含有C5-甲基胞嘧啶的等同 寡核苷酸(寡核苷酸13)是無(wú)活性時(shí)，這個(gè)結(jié)果令人驚訝。因此，我們觀察到的效果完全依 賴于連接至嘧啶C5-位置的基團(tuán)。最后，將具有優(yōu)化間距的0-D-LNA核苷酸與C5-丙炔嘧 啶組合于單個(gè)寡核苷酸上顯示出比未經(jīng)修飾的寡核苷酸增加平均13倍的TNE頻率。使用KmY22A的無(wú)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)還測(cè)試了優(yōu)化的寡核苷酸設(shè)計(jì)在質(zhì)粒KmY22A中插入單個(gè)核苷酸和恢復(fù)卡那霉 素0RF功能性的能力(見表2)。使用未經(jīng)修飾的DNA寡核苷酸，我們發(fā)現(xiàn)其通過(guò)TNE引入 插入的能力比其產(chǎn)生取代的能力低約5倍。當(dāng)我們測(cè)試含有LNA和/或C5-丙炔嘧啶核苷 酸的寡核苷酸5、19和20的引入插入的能力時(shí)，與我們的取代的數(shù)據(jù)相反，這些經(jīng)修飾的寡 核苷酸沒(méi)有將效率增加至以未經(jīng)修飾的寡核苷酸(寡核苷酸1)獲得的效率以上。但是，當(dāng) 使用寡核苷酸21或22時(shí)，獲得核苷酸插入效率的協(xié)同性增加。這證明LNA和C5-丙炔嘧 啶優(yōu)選存在于相同的寡核苷酸上以增加TNE的效率，其中核苷酸被插入靶標(biāo)。另外，寡核苷 酸20和寡核苷酸21間見到的效率的差別指示可以最大化寡核苷酸中C5-丙炔嘧啶核苷酸 的數(shù)量以獲得優(yōu)化的核苷酸插入效率。
序列分析無(wú)細(xì)胞TNE事件 將所有本研究中的寡核苷酸設(shè)計(jì)為將KmY22stop中的終止密碼子(TAG)轉(zhuǎn)換為TAC，恢復(fù)卡那霉素ORF的功能性。為了確定含有經(jīng)修飾的核苷酸的寡核苷酸修復(fù)的忠實(shí) 性，從以寡核苷酸1(未修飾的DNA)或寡核苷酸18 (其中所有嘧啶核苷酸由C5-丙炔嘧啶 所替代)修復(fù)后獲得的卡那霉素抗性克隆中純化質(zhì)粒。當(dāng)以寡核苷酸1進(jìn)行TNE反應(yīng)時(shí)， 所有40個(gè)測(cè)序的質(zhì)粒顯示在Y22上預(yù)期的TAC修復(fù)事件。但是，當(dāng)使用寡核苷酸20時(shí)， 28/38顯示在Y22上的TAC而其余10個(gè)質(zhì)粒在該位置含有TAT。因此，雖然C5-丙炔嘧啶 增加TNE頻率，其還影響修復(fù)反應(yīng)的結(jié)果，使其更傾向于錯(cuò)誤。證明使用體外TNE分析、無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)，含有C5-丙炔嘧啶核苷酸的寡核苷酸和錯(cuò)配 周圍的LNA的特異性間隔確實(shí)顯示與使用正常DNA寡核苷酸獲得的TNE效率比顯著高水平 的TNE。這種增加可以高至14倍?？梢酝ㄟ^(guò)靶向嘧啶豐富序列以便使C5-丙炔嘧啶核苷酸的 百分比最大化而進(jìn)一步提高這種增加。還可以通過(guò)使用增加結(jié)合親和力至比C5-丙炔嘧啶 核苷酸甚至更大程度的7-丙炔 嘌呤核苷酸而進(jìn)一步增加效率(He & Seela，2002 Nucleic Acids Res. 30 =5485-5496) 0將丙炔嘌呤和嘧啶組合允許產(chǎn)生其中所有核苷酸載有堿基上 的丙炔基團(tuán)的寡核苷酸。實(shí)施例2 煙草中的TNE煙草嫩芽培養(yǎng)這個(gè)實(shí)施例的材料來(lái)源是煙草體外嫩芽培養(yǎng)物，其無(wú)菌生長(zhǎng)于25/20°C (白天/夜 晚)溫度和光子流密度為80 μ Ε. πΓ2. S—1 (光周期為16/24h)的玻璃杯(750ml)中的MS20培 養(yǎng)基中。MS20培養(yǎng)基是基礎(chǔ)Murashige和Skoog氏培養(yǎng)基(Murashige，Τ.和Skoog，F(xiàn).， Physiologia Plantarum，！^ :473_497，1962)，其含有 2 % (w/v)蔗糖，沒(méi)有加入荷爾蒙和 0. 8% Difco瓊脂。將嫩芽每3周亞培養(yǎng)至新鮮的培養(yǎng)基。原生質(zhì)體分離為了分離葉肉原生質(zhì)體，收集3-6周齡的嫩芽培養(yǎng)物的完全展開的葉子。將葉子 切成Imm的薄條，然后將其轉(zhuǎn)移至大(lOOmmxlOOmm)的含有45ml MDE基本培養(yǎng)基的培養(yǎng) 皿以進(jìn)行前質(zhì)壁分離處理30分鐘的。MDE基本培養(yǎng)基含有0. 25g KClU.Og MgSO4. 7H20、 0. 136g KH2P04、2. 5g聚乙烯吡咯酮(MW 10，000)、6mg萘乙酸和2mg 6-芐氨基嘌呤，總體積 為900ml。將溶液的重量克分子滲透壓濃度用山梨醇調(diào)整至600m0sm. kg—1，將pH調(diào)整至5. 7。前質(zhì)壁分離后，向每個(gè)培養(yǎng)皿加入5ml的酶儲(chǔ)存液。每100ml酶儲(chǔ)存液含有750mg 纖維素酶Onozuka R10、500mg崩潰酶和250mg浸解酶R10，以Whatman紙過(guò)濾并過(guò)濾消毒。 將培養(yǎng)皿密封并在黑暗中25°C靜止孵育過(guò)夜以消化細(xì)胞壁。次日早晨，將原生質(zhì)體懸浮液通過(guò)500 μ m和100 μ m篩進(jìn)入250ml的Erlenmeyer 瓶中，與等體積的KCl洗滌培養(yǎng)基混合，并于50ml管中于85xg離心10分鐘。KCl洗滌100培 養(yǎng)基由2. Og的CaCl2. 2H20/L和足夠量的KCl組成以使重量克分子滲透壓濃度至540m0sm.
kg-1。將離心步驟重復(fù)兩次，首先以重懸于MLm洗滌培養(yǎng)基(其是一半的正常濃度的MS 培養(yǎng)基的宏量營(yíng)養(yǎng)素(Murashige, T. and Skoog,F. ,Physiologia Plantarum, 15 473~497, 1962)，2. 2g的CaCl2. 2H20/L和一定量的甘露醇以使重量克分子滲透壓濃度至540m0sm. kg"1)中的原生質(zhì)體進(jìn)行，最后以重懸于MLs培養(yǎng)基(其是甘露醇被蔗糖替代的MLm培養(yǎng)基) 中的原生質(zhì)體進(jìn)行。將原生質(zhì)體從蔗糖培養(yǎng)基中的漂浮帶回收并重懸于等體積的KCl洗滌培養(yǎng)基。用血細(xì)胞計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)其密度。隨后，將原生質(zhì)體在IOml玻璃管中于85xg再次離心5分鐘，將沉淀以IxlO5原生質(zhì)體/ml的密度重懸于電穿孔培養(yǎng)基中。使所有的溶液保持無(wú)菌，所有 操作在無(wú)菌條件下進(jìn)行。ALS靶標(biāo)基因和寡核苷酸的設(shè)計(jì)在煙草乙酰乳酸合成酶(ALS) SurA基因(Gene Bank登錄號(hào)X07644)中，氨基酸轉(zhuǎn) 換P194Q和W571L使得ALS蛋白對(duì)磺酰脲除草劑氯磺隆不敏感。將兩個(gè)寡核苷酸設(shè)計(jì)為 引入在編碼這些氨基酸的SurA密碼子中的堿基對(duì)突變。SEQ IDNO 23將產(chǎn)生P194Q突變， SEQ ID NO 24產(chǎn)生W571L突變。兩個(gè)寡核苷酸中所有的C和T殘基都被丙炔化(這樣的寡 核苷酸中，脫氧胸苷被5-(1_丙炔)-2’_脫氧尿苷替代)，除了寡核苷酸SEQ ID NO 231中 的脫氧胸苷錯(cuò)配核苷酸，其對(duì)應(yīng)于所要的點(diǎn)突變的位置。丙炔化胞嘧啶或尿嘧啶核苷酸在 SEQ ID NO 23和SEQ ID N024中標(biāo)示為Cp或Up。另外，在距離錯(cuò)配核苷酸任一側(cè)兩個(gè)核 苷酸遠(yuǎn)的位置上引入了 LNA殘基(在SEQ ID NO 23和SEQ ID NO 24中標(biāo)示為A"、T"、C" 或G~)。對(duì)照單鏈寡核苷酸只由具有相同核苷酸序列的正常DNA殘基(無(wú)C5-丙炔嘧啶也 無(wú)LNA殘基)組成。5，UpCpAGUpACpCpUpAUpCpAUpCpCpUpACpG"UpTGC"ACpUpUpGACpCpUpGUpUpAUpAG3， [SEQ ID NO 23]5，CpCpUpUpAUpAGAACpCpGAUpCpCpUpC“CpAAT"UpGAACpCpACpCpAUpUpCpCpCpAA3'[ SEQID NO 24]CodA靶標(biāo)基因和寡核苷酸的設(shè)計(jì)對(duì)于用于堿基對(duì)轉(zhuǎn)換的TNE，ALS基因是有用的選擇性標(biāo)記基因，因?yàn)樵谔禺愇恢?上的單個(gè)堿基變化導(dǎo)致單個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)換，這轉(zhuǎn)而提供對(duì)磺酰脲除草劑的抗性。對(duì)于用于產(chǎn) 生單個(gè)堿基插入或刪除(indel)的TNE，ALS不是有用的選擇性標(biāo)記基因，因?yàn)閱蝹€(gè)堿基 indel將導(dǎo)致基因的開放閱讀框的框架移動(dòng)，因此產(chǎn)生無(wú)功能性蛋白。因此對(duì)于磺酰脲除草 劑的篩選是不可能的。CodA是細(xì)菌的編碼胞嘧啶脫氨基酶的基因，可以用作負(fù)篩選標(biāo)記(Stougaard， Plant Journal755_761，1993)。表達(dá)該基因并暴露于5-氟胞嘧啶(5-FC)的植物將死 于由5-氟尿嘧啶(5-FU)的胸苷酸合成酶的不可逆抑制途徑，所述5-氟尿嘧啶是通過(guò)被 CodA的基因產(chǎn)物催化的5-FC的脫氨形成的。通過(guò)寡核苷酸的作用引入CodA序列的框架移 動(dòng)突變將使基因無(wú)功能，并且這樣的植物細(xì)胞對(duì)5-FC有抗性。在本實(shí)施例中，利用CodA負(fù)篩選系統(tǒng)來(lái)選擇由于寡核苷酸的作用進(jìn)行indel突變 的煙草細(xì)胞。為此,通過(guò)如 Stougaard (Plant Jlant Journal 3 755-761,1993)中所述的 土壤桿菌_介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化已經(jīng)產(chǎn)生從CaMV 35S啟動(dòng)子表達(dá)細(xì)菌CodA基因的煙草SRl植物。 已經(jīng)測(cè)試轉(zhuǎn)化植物對(duì)5-FC的正確反應(yīng)，并以如上所述的體外嫩芽培養(yǎng)物保持所述植物。本 實(shí)施例中，使用了 CodA基因的優(yōu)化用于植物密碼子的特異版本以便增加其在植物細(xì)胞中 的翻譯效率。密碼子優(yōu)化的CodA基因的序列是ATGTCTAACAACGCTCTTCAGACTATCATCAACGCTAGACTTCCTGGAGAAGAGGGACTTTGGCAGATTCATCTTCAGGATGGAAAGATCTCTGCTATCGATGCTCAGTCTGGAGTGATGCCTATCACTGAGAACTCTCTTGATGCTGAGCAGGGACTTGTTATTCCTCCTTTCGTGGAGCCTCACATCCATCTTGATACAACTCAGACTGCTGGACAACCTAATTGGAACCAGTCTGGAACTCTTT
TCGAGGGAATCGAAAGATGGGCTGAGAGAAAGGCTCTTCTTACTCACGATGATGTGAAGCAAAGGGCTTGGCAAACTCTTAAGTGGCAGATCGCTAACGGAATTCAGCATGTGAGGACTCATGTGGATGTGTCTGATGCTACTCTTACTGCTCTTAAGGCTATGCTGGAAGTGAAGCAGGAAGTCGCGCCGTGGATTGATCTTCAGATCGTGGCTTTCCCTCAAGAGGGAATCCTTTCTTACCCTAACGGAGAGGCTCTTCTTGAAGAGGCTCTTAGGCTTGGAGCTGATGTTGTTGGAGCTATCCCTCACTTCGAGTTCACTAGGGAATACGGAGTTGAGTCTCTTCACAAGACTTTCGCTCTTGCTCAGAAGTACGATAGGCTTATCGATGTTCACTGCGATGAGATCGATGATGAGCAGTCAAGATTCGTTGAGACTGTGGCTGCTCTTGCTCATCATGAAGGAATGGGAGCTAGAGTTACTGCTTCTCACACTACTGCTATGCACTCTTACAACGGAGCTTACACTTCTAGGCTTTTCGGCTTCTTAAGATGTCTGGTATCAACTTCGTGGCTAACCCTCTTGTGAACATCCATCTTCAGGGAAGATTCGATACTTACCCTAAGAGGAGGGGAATTACTAGGGTGAAGGAGATGCTTGAGTCAGGTATCAATGTGTGCTTCGGACACGATGATGTTTTCGATCCTTGGTATCCTCTTGGAACTGCTAACATGCTTCAGGTGTTGCATATGGGACTTCATGTGTGCCAACTTATGGGATACGGACAGATCAACGATGGACTTAACCTTATCACTCACCACTCTGCTAGGACTCTTAACCTTCAGGATTACGGAATTGCTGCTGGAAACTCTGCTAACCTTATCATCCTTCCTGCTGAGAATGGATTCGATGCTCTTAGGAGGCAAGTTCCTGTTAGGTACTCTGTTAGGGGAGGAAAGGTGATCGCTTCTACTCAACCTGCTCAGACTACTGTTTACCTTGAGCAGCCTGA[SEQ ID NO :25]。設(shè)計(jì)寡核苷酸用于在CodA基因5'末端的位置上引入單個(gè)堿基對(duì)插入。丙炔化胞 嘧啶或尿嘧啶核苷酸標(biāo)示為Cp或Up。自對(duì)應(yīng)于要插入(插入核苷酸，下劃線的)的核苷酸 任一端兩個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的位置上，引入LNA殘基(標(biāo)示為A~，T~，C~或G~)。對(duì)照單鏈寡核苷 酸只由具有相同核苷酸序列的正常DNA殘基(無(wú)C5-丙炔嘧啶也無(wú)LNA殘基)組成。5' GAAGUpCpUpAGCpGUpUpGAUpGA~Up￡AG~UpCpUpGAAGAGCpGUpUp⑶pUpAGA3' [SEQ ID NO 26]。原生質(zhì)體電穿孔使用PHBS 作為電穿孔培養(yǎng)基(10mM Hepes,pH 7. 2 ；0. 2M 甘露醇，150mMNaCl ；5mM CaCl2)，原生質(zhì)體在電穿孔化合物中的密度為約lX106/ml，電穿孔設(shè)置為250V(625V cnT1) 電荷和800 u F電容，脈沖和培養(yǎng)間恢復(fù)時(shí)間為10分鐘。對(duì)于每個(gè)電穿孔使用約每800微 升1-2 iiF寡核苷酸。電穿孔=25iig/ml。原生質(zhì)體再生和選擇電穿孔處理后，將原生質(zhì)體置于冰上恢復(fù)30分鐘，然后重懸于I；培養(yǎng)基，密度 為 lxlO5 原生質(zhì)體/ml。TQ 培養(yǎng)基含有(每升，pH5. 7)950mg KN03、825mgNH4N03、220mg CaCl2. 2H20、185mg MgS04. 7H20、85mg KH2P04、27. 85mgFeS04. 7H20、37. 25mg Na2EDTA. 2H20、根 據(jù) Heller 氏培養(yǎng)基的微量營(yíng)養(yǎng)素(Heller，R.，Ann Sci Nat Bot Biol Veg 14 :l-223, 1953)，根據(jù) Morel 和 Wetmore 氏培養(yǎng)基的維生素(Morel，G. and R. H. ffetmore, Amer. J. Bot.38 138-40,1951),2% (w/v)蔗糖、3mg萘乙酸、lmg 6-芐氨基嘌呤和一定量的使重 量克分子滲透壓濃度至540m0sm. kg—1的甘露醇。然后將重懸于T。培養(yǎng)基的原生質(zhì)體與等體積的I；培養(yǎng)基中的1. 6% SeaPlaque低 熔點(diǎn)瓊脂糖溶液混合，滅菌后于30°C水浴中保持液態(tài)。混合后，將懸浮液以2. 5ml等份輕柔 移至5cm培養(yǎng)皿中。將皿密封并在黑暗中于25/20°C (16/24h光周期)孵育。
在黑暗中孵育8-10天后，將瓊脂糖培養(yǎng)基切成餅狀的6等份，將其轉(zhuǎn)移至含有 22. 5ml液體MAPA0培養(yǎng)基的10cm培養(yǎng)皿中。該培養(yǎng)基由下列成分組成(每升，pH5. 7) 950mg KN03、825mg NH4N03、220mg CaCl2. 2H20、185mgMgS04. 7H20、85mg KH2P04、27. 85mg FeS04. 7H20、37. 25mg Na2EDTA. 2H20、根據(jù) Murashige 和 Skoog 氏培養(yǎng)基的十分之一原濃度 的微量營(yíng)養(yǎng)素(Murashige，T.和 Skoog，F(xiàn).，Physiologia Plantarum,15 :473_497，1962)， 根據(jù) Morel 和 Wetmore 氏培養(yǎng)基的維生素(Morel，G. and R. H. ffetmore, Amer. J. Bot. 38 138-40，1951)、6mg丙酮酸鹽、12mg蘋果酸、12mg反丁烯二酸和12mg檸檬酸、3% (w/v)蔗 糖、6% (w/v)甘露醇、0. 03mg萘乙酸和0. lmg 6-芐氨基嘌呤。為了選擇有成功TNE事件 的克隆，還向培養(yǎng)基中加入41nM氯磺隆或250iig/ml 5-FC。將培養(yǎng)皿于25/20°C光周期 為16/24h的弱光中(光子流密度為ZOyE.nT2. s—1)孵育。兩周后，將培養(yǎng)皿轉(zhuǎn)移至全光中 (SOiiE.n^.s—1)。在這個(gè)選擇期間內(nèi)，大多數(shù)原生質(zhì)體死亡。只有其中通過(guò)寡核苷酸的作 用，靶基因中發(fā)生堿基變化以致產(chǎn)生對(duì)除草劑或5-FC的抗性的原生質(zhì)體，分裂并繁殖成原 生質(zhì)體衍生的微克隆。分離后六至八周，將原生質(zhì)體衍生的克隆轉(zhuǎn)移至MAPi培養(yǎng)基。此時(shí)瓊脂糖珠子分 開至足以用廣口無(wú)菌移液管轉(zhuǎn)移微克隆，或者將它們單獨(dú)用鑷子轉(zhuǎn)移。MAPi培養(yǎng)基具有與 MAPiAO培養(yǎng)基相同的組成，但是以3% (w/v)甘露醇代替6%的甘露醇，并具有46. 2mg. F1 組氨酸(pH 5. 7)。其用0. 8% (w/v)Difco瓊脂固化。在該固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)2-3周后，將克隆轉(zhuǎn)移至再生培養(yǎng)基RP，每10cm培養(yǎng)皿有 50個(gè)克隆。RP培養(yǎng)基由下列成分組成(每升，pH5. 7) :273mg KN03、416mg Ca(N03)2. 4H20、 392mg Mg(N03)2. 6H20、57mg MgS04. 7H20、233mg(NH4)2S04、271mg KH2P04、27. 85mg FeS04. 7H20、 37. 25mg Na2EDTA. 2H20、根據(jù)Murashige和Skoog氏培養(yǎng)基的五分之一發(fā)表濃度的微量營(yíng)養(yǎng) 素(Murashige, T. and Skoog, F. , Physiologia Plantarum，！^ :473_497，1962)、根據(jù) Morel 和 Wetmore 氏培養(yǎng)基的維生素(Morel，G.和 R. H. ffetmore, Amer. J. Bot. 38 138-40,1951)、 0. 05% (w/v)蔗糖、1.8% (w/v)甘露醇、0. 25mg 玉米素和 41nM 氯磺隆或 250ii g.mH-FC， 并用0. 8% (w/v)Difco瓊脂固化。靶基因的PCR擴(kuò)增使用DNeasy試劑盒(Qiagen)從氯磺隆或5-FC抗性煙草微克隆分離DNA， 并用作PCR反應(yīng)的模板。使用下列引物檢測(cè)煙草ALS基因中定向密碼子的轉(zhuǎn)換 5，GGTCAAGTGCCACGTAGGAT[SEQ ID NO 27]和 5’ GGGTGCTTCACTTTCTGCTC[SEQ ID NO: 28]，其擴(kuò)增該基因的776bp片段，包括密碼子194。引物5’ CCCGTGGCAAGTACTTTGAT[SEQ ID NO: 29]和 5，GGATTCCCCAGGTATGTGTG[SEQ ID NO 30]同樣用于擴(kuò)增煙草 ALS 基因 的794bp的片段，包括密碼子571。為了 PCR擴(kuò)增5-FC抗性煙草愈傷組織中的經(jīng)修飾 的 CodA 基因，設(shè)計(jì)下列引物組5 ‘ GTGGAAAAAGAAGACGTTCCAAC3 ‘ [SEQID N0 31]和 5' AGCATCGATAGCAGAGATCTTTC3‘ [SEQ ID N0 :32]。測(cè)序以證明核苷酸轉(zhuǎn)換通過(guò)測(cè)序獲自這樣愈傷組織中的DNA的PCR產(chǎn)物以證實(shí)除草劑抗性煙草愈傷組織 中的核苷酸轉(zhuǎn)換。煙草ALS P194密碼子(CCA至CAA)的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致密碼子第二位置上的雙 峰(C/A)。最后，煙草ALS W571密碼子(TGG至TTG)的轉(zhuǎn)換導(dǎo)致第二密碼子位置上的雙峰 (G/T)。
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實(shí)施例3 小鼠胚胎干細(xì)胞中的TNE為了具有選擇性系統(tǒng)以證明小鼠細(xì)胞中的TNE，使用了表達(dá)提供培養(yǎng)物中G418抗 性的選擇性標(biāo)記基因(neo)的小鼠胚胎干(ES)細(xì)胞系，但是通過(guò)故意的突變使其無(wú)功能。 該TNE實(shí)驗(yàn)的目的是修復(fù)該突變并恢復(fù)neo基因的功能性，形成G418中這樣的細(xì)胞的選 擇。小鼠ES細(xì)胞系通過(guò)引入由MC1啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的缺陷性neo基因而衍生自E14系(Te Riele 等人，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 :5128_5132，1992)。該缺陷性 neo 基因含有 neo 的ATG起始密碼子的緊接下游的兩個(gè)額外的核苷酸GT，引起框架移動(dòng)(Dekker等人，Nucl. Acids Res. 31，No. 6e27，2003)。該細(xì)胞生長(zhǎng)于BRL條件化培養(yǎng)基中。為了 TNE實(shí)驗(yàn)，將細(xì)胞以7X 105/孔的密度分配于6孔培養(yǎng)板24小時(shí)。然后向 每孔加入1.4ml無(wú)血清培養(yǎng)基、10 iig寡核苷酸和63 ill TransFast lipofection試劑 (Promega)。1小時(shí)后，加入4ml含有血清的培養(yǎng)基，將細(xì)胞孵育過(guò)夜。無(wú)選擇孵育24小時(shí) 后，令細(xì)胞生長(zhǎng)于含有100mg. 1^418的選擇性培養(yǎng)基中。10天后，計(jì)數(shù)G418抗性克隆。用于修復(fù)框架移動(dòng)突變的寡核苷酸由對(duì)應(yīng)于ATG起始密碼子周圍的neo基因區(qū)域 的編碼鏈的序列的36聚體組成，但是不具有被引入neo中為了產(chǎn)生框架移動(dòng)突變的GT核 苷酸。另外，所有的胞嘧啶或胸腺嘧啶核苷酸被丙炔化，下面通過(guò)Cp或Tp標(biāo)示。自距離框 架移動(dòng)插入任一端兩個(gè)核苷酸遠(yuǎn)的位置，引入LNA殘基(標(biāo)示為A~，T~，C~或G~)。對(duì)照單 鏈寡核苷酸只由正常DNA殘基(無(wú)C5丙炔嘧啶也無(wú)LNA殘基)組成，并含有GT框架移動(dòng) 突變。寡核苷酸序列如下5 ‘ TpCpTpAGAGCpCpGCpCpACpCpAT“GAT“CpACpCpGATpGCpATpCpGAG3 ‘ [SEQ ID NO 33]。從G418抗性克隆中抽提DNA，并進(jìn)行PCR以便擴(kuò)增neo起始密碼子周圍的區(qū)域。 隨后測(cè)序該P(yáng)CR片段以便證實(shí)正確修復(fù)框架移動(dòng)突變。實(shí)施例4使用C5-丙炔和LNA修飾的寡核苷酸在番茄(Solanum lycopersicum)中的定向 核苷酸交換乙酰乳酸合成酶(ALS，也稱為乙酰羥酸合成酶；AHAS)是第一個(gè)在生物合成途徑 中合成支鏈氨基酸纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的共同的酶。該途徑存在于植物和微生物， 如細(xì)菌、真菌和藻類中。ALS是至少4種結(jié)構(gòu)上不同類的除草劑，包括磺脲(SU)、咪唑啉酮 (IMI)、三唑并嘧啶磺酰胺(triazolopyrimidinesulfonamides) (TP)和嘧啶水楊酸(PS) 的首要作用靶點(diǎn)。在番茄中，ALS是多拷貝基因，因?yàn)閮蓚€(gè)全長(zhǎng)EST存在于植物轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù) 庫(kù)(http://planta.tiRr. org)中。在我們的研究中，我們將轉(zhuǎn)錄物TA3727_44081定義為 ALS1，將轉(zhuǎn)錄物TA37275_4081定義為ALS2。ALS1編碼659AA的蛋白而ALS2編碼657AA的 蛋白。ALS1和ALS2分別在DNA和蛋白水平上顯示93%和96%的同一性。兩個(gè)蛋白主要的 差別在于負(fù)責(zé)葉綠體定向的蛋白的信號(hào)肽區(qū)。雖然有這些差別，ALS1和ALS2蛋白都被預(yù) 測(cè)為靶向葉綠體。以前的研究已經(jīng)顯示保守殘基上的幾個(gè)氨基酸變化足以給予植物對(duì)除草 劑的抗性，如水稻ALS中的P171Q、W548L和S627I突變。生物間的ALS的保守是高度的并 且許多生物中相同的突變?cè)斐上嗨频某輨┛剐员硇?。在本研究中，我們向設(shè)計(jì)用于改變 ALS2中的P184密碼子(或ALS1中的P184)的番茄葉子原生質(zhì)體中引入正常DNA寡核苷酸
27或C5-丙炔和LNA修飾的寡核苷酸以便產(chǎn)生對(duì)磺酰脲類除草劑氯磺隆的抗性。由于經(jīng)修飾 的和未經(jīng)修飾的寡核苷酸的序列相同，因此當(dāng)使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)時(shí)我們觀察到的任何TNE效 率的差別一定是由于C5-丙炔和LNA修飾造成的。材料和方法寡核苷酸含有P184/186密碼子(大寫字母)的ALS1和ALS2區(qū)的序列顯示如下。ALS1和 ALS2之間的單核苷酸多態(tài)性以粗體顯示。ALS1 gattgttgctattac a ggtcaagtgCC A aggaggatgattggtactgatgcgt P186 [SEQ ID N034]ALS2 gattgttgctattac c ggtcaagtgCC G aggaggatgattggtactgatgcgt P184 [SEQ IDNO 35]設(shè)計(jì)表3中的寡核苷酸44和95用于產(chǎn)生ALS2中的P184Q改變。兩個(gè)都是“反 義”寡核苷酸，與ALS基因的非轉(zhuǎn)錄鏈互補(bǔ)。寡核苷酸80由C5-丙炔和LNA修飾的核苷酸 的GATC重復(fù)組成并作為對(duì)照。該設(shè)計(jì)包括末端4個(gè)核苷酸間的磷硫酰連接因?yàn)檫@樣的修 飾已知部分保護(hù)寡核苷酸免受核酸酶的降解。表3 y = 5-丙炔-2'-脫氧胞苷；z = 5-丙炔-2'-脫氧尿嘧啶；s = LNA A ;v = LNA T ;w = LNAC ；x = LNA G ;U =脫氧尿嘧啶；* =磷硫酰連接。所有的寡核苷酸通過(guò) Eurogentec合成和HPLC純化。與靶標(biāo)形成錯(cuò)配的核苷酸加下劃線。番茄葉子原牛質(zhì)體的分離和轉(zhuǎn)化以前已經(jīng)描述了番茄葉子原生質(zhì)體的分離和再生(Shahin，1985Theor. Appl. Genet. M :235_240 ；Tan 等人 1987 Theor. Appl. Genet. 75 105-108 ；Tan 等人 1987 Plant Cell R印.5:172-175)，可以在這些發(fā)表物中找到所需溶液。簡(jiǎn)單地說(shuō)，將番茄(Solanum Lycopersicum)的種子以0. 1 %的次氯酸鹽滅菌，體外在16/8小時(shí)光周期于20001ux于 25°C和50-70%相對(duì)濕度生長(zhǎng)于無(wú)菌MS20培養(yǎng)基中。將lg新鮮收集的葉子置于含有5ml CPW9M的皿中，使用解剖刀片每毫米垂直于主干切割。將其轉(zhuǎn)移至25ml酶溶液(CPW9M， 其含有 2%纖維素 onozuka RS、0. 4%浸解酶 onozuka R10、2. 4_D (2mg/ml)，NAA(2mg/ml)、 BAP(2mg/ml), pH5. 8)的新鮮板中并在黑暗中于25°C進(jìn)行消化過(guò)夜。然后通過(guò)將其置于軌 道振蕩器上(40-50rpm) 1小時(shí)而釋放原生質(zhì)體。通過(guò)將其通過(guò)50 y m的篩子而將原生質(zhì)體
28從細(xì)胞碎片中分離，并以CPW9M洗滌篩子2次。以85g離心原生質(zhì)體，棄去上清液，然后吸 收于一半體積的CPW9M。最后將原生質(zhì)體吸收于3ml CPW9M，然后小心加入3ml CPW18S以 避免兩種溶液混合。將原生質(zhì)體以85g離心10分鐘，并使用長(zhǎng)巴斯德移液管收集漂浮于相 間層的活原生質(zhì)體。通過(guò)加入CPW9M增加原生質(zhì)體的體積至10ml并在血細(xì)胞計(jì)數(shù)器中測(cè) 定回收的原生質(zhì)體的數(shù)目。使用Gene Pulser (BioRad)用電穿孔將寡核苷酸引入番茄原生質(zhì)體。將原生質(zhì)體 以lX106/ml的密度重懸于0. 4cm電穿孔杯中的作為電穿孔培養(yǎng)基(10mM HEPES，pH 7. 2 ； 0. 2M甘露醇，150mM NaCl,5mM CaCl2)的PHBS中。將5 y g寡核苷酸加入到1ml原生質(zhì)體懸 浮液中，電穿孔在250V(625C cnT1)和800 y F電容下進(jìn)行。然后小心地從杯中移出原生質(zhì) 體并轉(zhuǎn)移至新管，加入8ml 9M培養(yǎng)基。然后將其于85g離心5分鐘，去除上清液，加入2ml 新鮮的9M培養(yǎng)基。將原生質(zhì)體植入藻酸鹽溶液以再生。加入2ml藻酸鹽溶液(甘露醇90g/l， CaCl2. 2H20 140mg/l，藻酸鈉20g/l (Sigma A0602))并通過(guò)倒置重復(fù)混合。將其lml平均地 鋪在Ca-瓊脂板(72. 5g/l甘露醇，7. 35g/l CaCl2. 2H20，8g/l瓊脂)上并令其聚合。然后 將藻酸鹽盤轉(zhuǎn)移至含有4ml K8p培養(yǎng)基的4cm培養(yǎng)皿中并在黑暗中于30°C孵育7天。然后 將盤切成5mm寬的條并鋪在含有20nM氯磺隆的TM-DB愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基上。30°C孵育 4-5周后，除草劑抗性愈傷組織出現(xiàn)，然后將個(gè)體轉(zhuǎn)移至GM-ZG培養(yǎng)基進(jìn)一步生長(zhǎng)。在該培 養(yǎng)基上2-3周后，將部分愈傷組織用于DNA分離。分析番茄愈傷組織使用植物DNAeasy試劑盒(Qiagen，#69104)從5周齡的愈傷組織中分離基因組 DNA。將引物設(shè)計(jì)為特異性擴(kuò)增ALS1或ALS2。對(duì)于ALS1我們使用引物08Z769 (5，GAAAGG GAAGGTGTTACGGATGTA SEQ ID NO 39)和 08Z770(5，CTTGATTGCGAACACCCACC SEQ ID NO 40)；對(duì)于 ALS2 使用引物 08Z773(5，GAAAGGGAAGGGGTTAAGGATGTG SEQ ID NO 41)禾口 08Z774(5，CTCGACTGTGAACACCCACC SEQ ID NO 42)。使用校正性酶 rTth DNA 聚合酶 XL (Roche)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并直接測(cè)序獲得的PCR片段。為了證實(shí)核苷酸改變，使用Taq DNA 聚合酶向用校正性酶產(chǎn)生的平端PCR片段加A-尾(lOOng產(chǎn)物(5 ill)+1 ill PCR緩沖液 +1 u 1 dNTP's (20mM) +1U Taq DNA 聚合酶 +2. 8 ii 1 H20 ；72°C 10 分鐘)。然后使用 PCR 純化 試劑盒(Qiagen)純化PCR片段，并將10ng克隆至T0P0 TA克隆試劑盒(Invitrogen)。轉(zhuǎn) 化至大腸桿菌(E. coli)后，使用rTth DNA聚合酶XL (Roche)使用退火至載體中的位點(diǎn)和 插入點(diǎn)旁側(cè)的M13引物在白色、卡那霉素抗性克隆上進(jìn)行PCR反應(yīng)。然后使用M13引物直 接測(cè)序這些PCR產(chǎn)物。MM進(jìn)行兩個(gè)獨(dú)立的實(shí)驗(yàn)以測(cè)試使用含有C5-丙炔和LNA修飾的寡核苷酸是否增加了 番茄中TNE的效率。結(jié)果在表4中顯示。表 4 含有C5-丙基和LNA修飾的核苷酸的寡核苷酸44給出比由未經(jīng)修飾的DNA組成 的寡核苷酸95多約8倍的愈傷組織。這些寡核苷酸的序列是相同的。寡核苷酸80是也含 有經(jīng)修飾的核苷酸的“亂序的”寡核苷酸。該寡核苷酸對(duì)于ALS1或ALS2都不特異并作為 對(duì)照以證明寡核苷酸單獨(dú)存在于植物細(xì)胞中不足以產(chǎn)生除草劑抗性愈傷組織。另外，當(dāng)將 寡核苷酸從原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化混合物中去除時(shí)，未觀察到除草劑抗性愈傷組織，表明番茄原生 質(zhì)體中的自發(fā)除草劑抗性低于可檢測(cè)水平。為了證明氯磺隆抗性愈傷組織在期望的位點(diǎn)確實(shí)含有突變，將3個(gè)愈傷組織(1個(gè) 來(lái)自寡核苷酸95(D)，2個(gè)來(lái)自寡核苷酸44 (E和F))測(cè)序。對(duì)來(lái)自ALS1或ALS2的PCR產(chǎn) 物的序列分析顯示在所有3個(gè)愈傷組織中混合峰存在于靶標(biāo)密碼子。這證明除草劑抗性表 型確實(shí)是由于由寡核苷酸產(chǎn)生的核苷酸改變并且愈傷組織對(duì)于核苷酸改變是半合的。然后 我們進(jìn)行了克隆并對(duì)源自ALS1或ALS2的單個(gè)PCR產(chǎn)物測(cè)序。序列分析的結(jié)果在圖5中顯 示。愈傷組織D和E分別顯示ALS2和ALS1上的CCA至TCA改變(P186S)，而愈傷組織G顯 示ALS1上的CCA至TTA的改變(P186L)。煙草中的研究已經(jīng)顯示在煙草ALS直系同源物 (SurA或SurB)中保守脯氨酸殘基上的任何氨基酸改變給予氯磺隆抗性(Kochevenko等人 2003PlantPhys. 132 174-184)。因此ALS1或ALS2的P186/184密碼子用于檢測(cè)未預(yù)期的 核苷酸改變是理想的，因?yàn)檫@樣的事件也將引起除草劑抗性表型。我們的結(jié)果證明通常C5-丙炔和LNA修飾不抑制基因組中，特別是番茄的基因組 中的核苷酸改變的產(chǎn)生。另外，這種類型的修飾通常顯著增加植物細(xì)胞中定向核苷酸交換 的效率，在番茄的情況下約增加8倍。這種類型的組合修飾(如本文所述的LNA和丙炔) 提供在體外的相對(duì)于以前描述的那些只使用LNA修飾的寡核苷酸或只使用丙炔修飾的核 苷酸的無(wú)細(xì)胞分析(即體外)的顯著增加。這里特別值得注意的是從無(wú)細(xì)胞分析至體外分 析的步驟。令人驚訝的是我們沒(méi)有發(fā)現(xiàn)預(yù)期的核苷酸改變(ALS2上的CCG至CAG，P184Q)。相 反在愈傷組織D和E中，我們觀察到對(duì)靶標(biāo)核苷酸密碼子的核苷酸5’上的改變(C至T)。 另外，我們來(lái)自愈傷組織G的數(shù)據(jù)顯示與靶序列共享單個(gè)錯(cuò)配的寡核苷酸能夠誘導(dǎo)2個(gè)核 苷酸的改變。將完全PCR產(chǎn)物(500bp)的序列與ALS1或ALS2的相比，除了靶標(biāo)脯氨酸密 碼子上的改變，未觀察到其它核苷酸的變化。因此，寡核苷酸能夠誘導(dǎo)植物基因的特異密碼 子上的突變。使用無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)和DNA寡核苷酸產(chǎn)生的TNE事件的分析確實(shí)給出預(yù)期的核苷 酸改變。在我們對(duì)愈傷組織D的分析中，使用未經(jīng)修飾的DNA寡核苷酸，我們觀察到未預(yù)期的核苷酸改變。這顯示細(xì)胞中可能有其它因素，其影響在無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中不起作用的修復(fù)過(guò) 程，使得從無(wú)細(xì)胞分析至體外分析的步驟不簡(jiǎn)單。但是，我們顯示含有C5-丙炔修飾的寡核 苷酸確實(shí)產(chǎn)生無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)中未預(yù)期的核苷酸變化，揭示經(jīng)修飾的核苷酸本身引起更“傾向 于錯(cuò)誤的”修復(fù)。因此值得注意的是使用經(jīng)修飾的寡核苷酸產(chǎn)生了顯示CCA至TTA改變的 愈傷組織G。 幾個(gè)研究提示用寡核苷酸處理后在人類細(xì)胞中產(chǎn)生的核苷酸變化是由于在靶位 點(diǎn)整合了寡核苷酸(Radecke等人2006 J. Gene Med. 8 217-218) 0但是寡核苷酸整合不能 解釋我們?cè)诜阎蝎@得的結(jié)果。首先寡核苷酸整合將引起預(yù)期的核苷酸改變(P184Q)，這我 們未觀察到。第二，我們使用靶向ALS2的寡核苷酸還發(fā)現(xiàn)ALS1中的核苷酸改變。在ALS1 上整合該寡核苷酸還將改變存在于P 186/184密碼子的第三個(gè)核苷酸的單核苷酸多態(tài)性。 因?yàn)槲从^察到此，我們得出結(jié)論，寡核苷酸整合不能解釋我們的結(jié)果。這可以反映動(dòng)物和植 物細(xì)胞間的TNE機(jī)制的差別。我們傾向于下列機(jī)制寡核苷酸結(jié)合其基因組靶標(biāo)并誘導(dǎo)靶 密碼子上的突變過(guò)程，隨之寡核苷酸隨后被降解。
權(quán)利要求
一種用于定向改變雙鏈DNA序列的寡核苷酸，該雙鏈DNA序列含有第一DNA序列和與第一DNA序列互補(bǔ)的第二DNA序列，該寡核苷酸含有能夠與第一DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有相對(duì)于第一DNA序列的至少一個(gè)錯(cuò)配，并且該寡核苷酸包括至少一個(gè)區(qū)段，該區(qū)段含有與天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有較高的結(jié)合親和力的至少兩個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，其中-至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是位于距離至少一個(gè)錯(cuò)配至少一個(gè)核苷酸距離的LNA，并且其中，可選地，該寡核苷酸含有最多約50％的LNA修飾的核苷酸；并且-至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的寡核苷酸，其中至少2個(gè)，優(yōu)選至少3個(gè)，更優(yōu)選至少4個(gè)，甚 至更優(yōu)選至少5個(gè)和最優(yōu)選至少6個(gè)核苷酸是LNA。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的寡核苷酸，其中LNA在距離錯(cuò)配兩端最多10個(gè)核苷酸， 優(yōu)選最多8個(gè)核苷酸，更優(yōu)選最多6個(gè)核苷酸，甚至更優(yōu)選最多4、3或2個(gè)核苷酸的距離獨(dú) 立地分布。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3所述的寡核苷酸，其中2個(gè)，優(yōu)選3個(gè)，更優(yōu)選4個(gè)，甚至更優(yōu)選5 個(gè)和最優(yōu)選6個(gè)核苷酸是LNA。
5.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸的最多40%，優(yōu)選最多 30 %，更優(yōu)選最多25 %，甚至更優(yōu)選最多20 %，和最優(yōu)選最多10 %的經(jīng)修飾的核苷酸是LNA 衍生物。
6.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸獨(dú)立位于錯(cuò)配的 5’側(cè)和/或3’側(cè)。
7.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中位于錯(cuò)配5’或3’側(cè)的兩個(gè)LNA修 飾的核苷酸被至少1個(gè)，優(yōu)選至少2個(gè)堿基對(duì)(核苷酸)彼此分開。
8.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中嘌呤是腺嘌呤或鳥嘌呤和/或嘧啶 是胞嘧啶、尿嘧啶或胸腺嘧啶脫氧核苷。
9.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中，獨(dú)立地至少10%，優(yōu)選至少50%， 更優(yōu)選至少75%和最優(yōu)選至少90%的嘧啶和/或嘌呤被其各自的丙炔化衍生物替代。
10.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸是嘧啶。
11.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸是嘌呤。
12.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中至少兩個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是丙炔 化核苷酸，獨(dú)立地選自丙炔化嘌呤或丙炔化嘧啶。
13.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中寡核苷酸包含至少2個(gè)區(qū)段，優(yōu)選 至少3個(gè)區(qū)段，所述區(qū)段獨(dú)立地含有至少2個(gè)，更優(yōu)選至少3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)經(jīng)修飾 的核苷酸。
14.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中區(qū)段位于或接近3’末端、5’末端 和/或包括錯(cuò)配位置或在錯(cuò)配位置旁側(cè)。
15.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸，其中位于錯(cuò)配位置的核苷酸不經(jīng)修飾。
16.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中至少一個(gè)丙炔修飾的核苷酸位于錯(cuò)配 的附近，優(yōu)選在錯(cuò)配的2、3、4、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸以內(nèi)。
17.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其具有10至500個(gè)核苷酸的長(zhǎng)度。
18.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)的寡核苷酸，其中(經(jīng)修飾的)區(qū)段是結(jié)構(gòu)域。
19.根據(jù)前述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的寡核苷酸。
20.一種定向改變雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列的方法，其包括將雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列與供體寡核 苷酸結(jié)合，其中雙鏈?zhǔn)荏wDNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補(bǔ)的第二 DNA序 列，并且其中供體寡核苷酸包括結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有相對(duì)于需要改變的雙鏈?zhǔn)荏wDNA序 列，優(yōu)選相對(duì)于第一 DNA序列的至少一個(gè)錯(cuò)配，并且其中寡核苷酸包括區(qū)段，該區(qū)段含有與 天然存在的A、C、T或G相比具有較高的結(jié)合親和力的至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，并且其中 當(dāng)存在能夠定向核苷酸交換的蛋白時(shí)，與天然存在的與第一 DNA序列中相反位置上的核苷 酸互補(bǔ)的核苷酸相比經(jīng)修飾的核苷酸與第一 DNA序列中相反位置上的核苷酸的結(jié)合更強(qiáng)， 并且其中經(jīng)修飾的寡核苷酸如權(quán)利要求1-19中所定義。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中改變是在細(xì)胞內(nèi)，所述細(xì)胞優(yōu)選選自植物細(xì)胞、 真菌細(xì)胞、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞、靈長(zhǎng)類細(xì)胞、人類細(xì)胞或酵母細(xì)胞。
22.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中蛋白來(lái)自細(xì)胞提取物。
23.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞提取物選自植物細(xì)胞提取物、 真菌細(xì)胞提取物、嚙齒動(dòng)物細(xì)胞提取物、靈長(zhǎng)類細(xì)胞提取物、人類細(xì)胞提取物或酵母細(xì)胞提 取物。
24.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中改變是刪除、取代或插入至少一個(gè) 核苷酸。24.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中細(xì)胞是真核細(xì)胞、植物細(xì)胞、非人 類哺乳動(dòng)物細(xì)胞或人類細(xì)胞。
25.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中靶DNA來(lái)自真菌、細(xì)菌、植物、哺乳 動(dòng)物或人類。
26.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的方法，其中雙鏈DNA來(lái)自基因組DNA、線性 DNA、哺乳動(dòng)物人工染色體、細(xì)菌人工染色體、酵母人工染色體、植物人工染色體、核染色體 DNA、細(xì)胞器染色體DNA、游離DNA。
27.根據(jù)前述方法權(quán)利要求任一項(xiàng)的方法，其用于改變細(xì)胞、通過(guò)恢復(fù)至野生型而改正 突變、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)而使酶失活，通過(guò)改變編碼區(qū)而修飾酶的生物學(xué)活性、通 過(guò)破壞編碼區(qū)而修飾蛋白。
28.如權(quán)利要求1-19中所定義的寡核苷酸的用途，其用于改變細(xì)胞、通過(guò)恢復(fù)至野生 型而改正突變、誘導(dǎo)突變、通過(guò)破壞編碼區(qū)而使酶失活、通過(guò)改變編碼區(qū)而修飾酶的生物學(xué) 活性、通過(guò)破壞編碼區(qū)而修飾蛋白、錯(cuò)配修復(fù)、定向改變(植物)遺傳物質(zhì)包括基因突變、定 向基因修復(fù)和基因敲除。
29.如權(quán)利要求1-19所定義的寡核苷酸的用途，其用于增加雙鏈DNA序列的定向改變， 該雙鏈DNA序列含有第一 DNA序列和與第一 DNA序列互補(bǔ)的第二 DNA序列，寡核苷酸含有 能夠與第一 DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域含有相對(duì)于第一 DNA序列的至少一個(gè)錯(cuò)配，并 且其中寡核苷酸包括區(qū)段，該區(qū)段含有與天然存在的A、C、T或G核苷酸相比具有較高結(jié)合 親和力的至少兩個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，其中-至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是位于距離至少一個(gè)錯(cuò)配為至少一個(gè)核苷酸的LNA，并且 其中，可選地，寡核苷酸含有最多約50%的LNA修飾的核苷酸；并且-至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸是C7-丙炔嘌呤或C5-丙炔嘧啶。
30.如權(quán)利要求1-19所定義的寡核苷酸在用于為植物提供除草劑抗性的方法中的用途。
31.含有如權(quán)利要求1-19所定義的寡核苷酸的試劑盒。
32.通過(guò)權(quán)利要求13-27所述的方法產(chǎn)生的經(jīng)修飾的遺傳物質(zhì)。
33.含有權(quán)利要求32所述的經(jīng)修飾的遺傳物質(zhì)的細(xì)胞。
34.一種增加雙鏈DNA定向核苷酸交換效率的方法，其包括(a)獲得含有能夠與所述雙鏈的第一DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域的寡核苷酸，其中所述結(jié) 構(gòu)域含有(i)相對(duì)于第一DNA序列的至少一個(gè)錯(cuò)配；和(ii)具有增加的結(jié)合親和力的至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，和(b)減少所述經(jīng)修飾的核苷酸和所述錯(cuò)配之間的距離至約8個(gè)或更少的核苷酸；和(c)回收用于定向核苷酸交換的寡核苷酸。
35.一種用于定向改變雙鏈DNA的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有能夠與所述雙鏈 的第一 DNA序列雜交的結(jié)構(gòu)域并且所述結(jié)構(gòu)域含有(a)相對(duì)于第一DNA序列的至少一個(gè)錯(cuò)配；(b)至少一個(gè)區(qū)段，該區(qū)段含有具有增加的結(jié)合親和力的至少一個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，其 中所述經(jīng)修飾的核苷酸是LNA，其中所述經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配最多8個(gè)核苷酸。
36.根據(jù)權(quán)利要求35所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配最多8 個(gè)核苷酸。
37.根據(jù)權(quán)利要求35所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配最多6 個(gè)核苷酸。
38.根據(jù)權(quán)利要求35所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配最多4 個(gè)核苷酸。
39.根據(jù)權(quán)利要求35所述的寡核苷酸，其中經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配最多2 個(gè)核苷酸。
40.根據(jù)權(quán)利要求35所述的寡核苷酸，其中所述結(jié)構(gòu)域含有兩個(gè)LAN。
41.一種用于雙鏈DNA的定向核苷酸交換的寡核苷酸，其中所述寡核苷酸含有(a)經(jīng)修飾的核苷酸；和(b)相對(duì)于所述雙鏈DNA鏈的錯(cuò)配；其中所述經(jīng)修飾的核苷酸位于距離所述錯(cuò)配約1個(gè)核苷酸遠(yuǎn)。
全文摘要
一種用于雙鏈DNA序列的定向核苷酸交換的方法和寡核苷酸，其中供體寡核苷酸含有至少兩個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，至少其中一個(gè)是丙炔化嘌呤和/或嘧啶并且至少其中一個(gè)是LNA，所述經(jīng)修飾的核苷酸與天然存在的A、C、T或G相比具有較高的結(jié)合親和力和/或與天然存在的與第一DNA序列中相反位置上的核苷酸互補(bǔ)的核苷酸相比更強(qiáng)地結(jié)合至第一DNA序列中相反位置上的核苷酸。
文檔編號(hào)C12N15/10GK101868542SQ200880020319
公開日2010年10月20日 申請(qǐng)日期2008年6月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年6月22日
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