專利名稱：：新型全人源抗vap-1單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及能夠編碼識(shí)別人類內(nèi)皮細(xì)胞粘附蛋白VAP-1的全人源單克隆抗體的核酸序列，并且具體涉及一種全人源單克隆抗體，稱為BTT-1023,其識(shí)別VAP-1的功能表位。背景才支術(shù)本文所用的出版物和其他材料被納入?yún)⒖?，用于闡明發(fā)明背景，特別是在實(shí)踐方面提供更多細(xì)節(jié)。一般來(lái)說(shuō)，完整的抗體通常都具有Y形結(jié)構(gòu)，由兩個(gè)相同的輕鏈和兩個(gè)相同的重鏈組成。這4個(gè)多肽亞基以下列方式進(jìn)4亍裝配，兩個(gè)重鏈連在一起，并且每個(gè)重鏈都通過(guò)二疏鍵連有一輕鏈。構(gòu)成抗體的每個(gè)多肽由一個(gè)可變區(qū)和一個(gè)恒定區(qū)組成?？勺儏^(qū)位于Y形抗體的臂部，決定抗體的抗原結(jié)合特異性。該區(qū)域包含用于抗原與其抗體連接的短氨基酸序列。這些區(qū)域被稱為互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)?？勺儏^(qū)的其余部分對(duì)于形成抗原結(jié)合口袋的整體構(gòu)象是很重要的?？贵w的恒定區(qū)位于重鏈的基底，決定抗體通過(guò)與特定受體的相互作用激活免疫反應(yīng)的能力。這些區(qū)域通常是高度保守的，其可變性限于五個(gè)基本的同種型IgA、IgD、IgE、IgG和IgM。血管粘附蛋白-1(VAP-1)是一種在血管內(nèi)皮細(xì)胞上表達(dá)的非典型的、能誘導(dǎo)炎癥的粘附分子，其在血管內(nèi)皮細(xì)胞上介導(dǎo)白細(xì)胞在生理剪切下滾動(dòng)，在這種作用中，作為正常免疫監(jiān)視過(guò)程的一部分，VAP-1通過(guò)次級(jí)淋巴組織的高內(nèi)皮孩t靜脈(HEV)對(duì)淋巴細(xì)胞的再循環(huán)起作用。但是，在炎癥情況下，VAP-1促進(jìn)白細(xì)胞向發(fā)炎組織浸潤(rùn)，從而形成6和維持炎癥反應(yīng)。這種浸潤(rùn)本身對(duì)慢性炎癥性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、4艮屑病和許多自身免疫病以及其他炎性疾病是有損害的。在其他情況下，在由心肌梗塞、中風(fēng)和其他疾病造成嚴(yán)重組織損傷后，促炎細(xì)胞進(jìn)入組織中的大量浸潤(rùn)會(huì)造成在這些急性炎性反應(yīng)所見(jiàn)的組織破壞。通過(guò)用阻斷抗體阻止VAP-1功能來(lái)減少細(xì)胞進(jìn)入炎癥部位的浸潤(rùn)，很可能能夠消除炎癥，并且改善這些疾病的臨床癥狀。美國(guó)專利US5580780描述了一種單克隆抗體(mAb)lB2，其能識(shí)別VAP-1并且能夠在冷凍切片檢測(cè)中阻斷淋巴細(xì)胞與扁桃腺HEV的結(jié)合。單克隆抗體1B2是一種鼠源IgM抗體，為對(duì)VAP-1特異的。使用鼠源單克隆抗體作為治療物的潛力有限，因?yàn)槿祟惖拿庖呦到y(tǒng)會(huì)將鼠源抗體識(shí)別為外源物質(zhì)，并且產(chǎn)生人的抗鼠抗體(HAMA)將它們從身體中清除。在需要重復(fù)給藥的時(shí)候，這種免疫反應(yīng)是應(yīng)用鼠源抗體進(jìn)行長(zhǎng)期治療的主要限制。臨床上使用鼠源抗VAP-1抗體可能只能局限于使用免疫抑制劑的患者，從而較不易產(chǎn)生HAMA反應(yīng)，也只能局限于那些可以只給藥一次抗體的治療方案，如急性梗塞或急性呼吸窘迫綜合癥的局部缺血再灌注損傷。在治療中使用鼠源IgM抗VAP-1抗體的另一個(gè)缺點(diǎn)是這種抗體不利的動(dòng)力學(xué)特性，也是就說(shuō)，其半衰期短，這致使它們不適合用于慢性病，例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病、4艮屑病和許多其他疾病。在本領(lǐng)域內(nèi)已知有幾種產(chǎn)生免疫原性較低的單克隆抗體的方法。優(yōu)選的方法包括"人源化，，抗體。常用策略為制造嵌合單克隆抗體、人源化的單克隆抗體或全人源單克隆抗體。嵌合單克隆抗體中，其抗體可變區(qū)是鼠源的，恒定區(qū)是人源的。在嵌合抗體中，通常嚙齒類抗體分子大約有70%替換為相應(yīng)的人類序列，同時(shí)保留具有具體特異性和親和性的鼠類抗原結(jié)合位點(diǎn)。人源化的抗體中，其抗體可變區(qū)可為鼠源的，但是已經(jīng)突變，使其更類似于人類抗體，并且可能具有人源的恒定區(qū)。全人源抗體中，其抗體的可變區(qū)和恒定區(qū)都是人源的。國(guó)際專利乂>開(kāi)WO03/093319公開(kāi)了一種嵌合抗VAP-1單克隆抗體7BTT-1002,其與相應(yīng)的鼠源抗體相比，具有降低免疫原性的潛力。但是，作為一種嵌合抗體，BTT-1002仍然具有相應(yīng)于直接來(lái)源于原始小鼠抗體且未經(jīng)修飾的抗體可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列。當(dāng)對(duì)人類給藥時(shí)，這種抗體仍然有可能被識(shí)別為外源抗體且具有免疫原性。其藥理學(xué)性質(zhì)，例如消除半衰期和功能特性，可能也會(huì)由于其免疫原性和由于針對(duì)其產(chǎn)生的抗體而受到影響。因此，在本領(lǐng)域需要具有降低的免疫原性和改進(jìn)的藥理學(xué)活性的全人源抗VAP-1抗體。發(fā)明概述本發(fā)明廣泛地涉及新的全人源抗VAP-1抗體、該抗體的制備方法以及該抗體的用途。本發(fā)明還涉及編碼所述抗VAP-1抗體的多核苷酸。本發(fā)明的目的是提供用于體內(nèi)診斷和/或治療的全人源單克隆抗體，其具有降低的引發(fā)患者免疫反應(yīng)的可能性，并且具有利于治療目的的藥理學(xué)性質(zhì)。本發(fā)明的另一目的是提供全人源抗VAP-1抗體的重鏈和輕鏈，或其片段。本發(fā)明另一目的是提供編碼全人源抗VAP-1抗體的核酸或其片段，以及并入這些核酸以用于重組表達(dá)抗VAP-1抗體的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案涉及通過(guò)重組生產(chǎn)方法制備本發(fā)明全人源抗VAP-1抗體的方法。本發(fā)明還公開(kāi)了包含該抗體的藥物組合物及其治療用途。附圖簡(jiǎn)述下面本發(fā)明將參照附圖通過(guò)優(yōu)選實(shí)施方案進(jìn)行更詳細(xì)的說(shuō)明，其中附圖為圖1至圖5為抗VAP-1抗體8C10(圖1A-B)、8A4(圖2A-B)、3F10(圖3A-B)、5F12(圖4A-B)和4B3(圖5A-B)可變區(qū)的核苷序列及相應(yīng)的氬基酸序列?？勺冚p鏈(V"(A)和可變重鏈(VH)(B)的M酸序列由克隆的cDNA演繹而來(lái)。每個(gè)M酸鏈中的三個(gè)CDR以粗體表示，其相應(yīng)的核苷序列以下劃線表示。圖6為8C10、8A4、3F10、5F12和4B3VH重鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列比對(duì)，顯示其共有序列(圖6A)。圖6B、圖6C和圖6D為顯示具有共有序列的VH重鏈CDR1至3的比對(duì)。圖6E為8C10、8A4、3F10、5F12和4B3Vi輕鏈可變區(qū)的蛋白質(zhì)序列比對(duì)，顯示其共有序列。圖6F、圖6G和圖6H為顯示具有共有序列的Vi輕鏈CDR1至3的比對(duì)。圖7通過(guò)BTT-1023染色的AxVAP-1細(xì)胞對(duì)比對(duì)照染色的細(xì)胞的FACS(熒光激活細(xì)胞分類)分析，顯示重組全人源抗體r8C10(BTT-1023)與Ax細(xì)胞上的VAP-1的結(jié)合，其中Ax細(xì)胞在細(xì)胞表面上表iiAVAP-1。圖8說(shuō)明了BTT-1023對(duì)體外白細(xì)胞遷移的影響。圖中顯示的是經(jīng)過(guò)BTT-1023或?qū)φ湛贵w處理后，穿過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞單層遷移的外周血單核細(xì)胞(PBMC)的數(shù)量。誤差條為平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差，N=6。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及全人源，優(yōu)選為通過(guò)重組生產(chǎn)的，特異性識(shí)別人血管粘附蛋白-l(VAP-l)的單克隆抗體(mAb)。本發(fā)明的全人源單克隆抗體與相應(yīng)的人源化抗體和相比具有減小的免疫原性，因此適用于治療許多自身免疫性疾病，結(jié)締組織、皮膚、胃腸道、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和肺系的炎性病癥和疾病，例如慢性關(guān)節(jié)炎、炎性腸病和慢性皮膚病。全人源VAP-1抗體還能進(jìn)一步用于體內(nèi)和體外的診斷應(yīng)用，包括炎癥部位的體內(nèi)免疫閃爍成像。本文所用術(shù)語(yǔ)"保守序列變體，，，意在包括不顯著改變本發(fā)明全人源抗VAP-1抗體結(jié)合性質(zhì)的核苷酸和M酸序列修飾。保守核苷酸序列變體包括源于遺傳密碼簡(jiǎn)并和沉默突變的變體。核苷酸的替代、缺失和增加也包含在內(nèi)。保守M酸序列變體包括源于本領(lǐng)域所熟知的相似氨基酸替代的變體。氮基酸的缺失和增加也包含在內(nèi)。本發(fā)明包含的那些多肽和聚核苷酸，與下面描述的全人源抗VAP-1抗9體或抗體的編碼聚核苷酸具有至少80%的同一性，或至少85%、卯％、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。本發(fā)明提供全人源抗VAP-1抗體重鏈，其包含至少一種CDR共有序列，其中CDR共有序列選自a)序列X,X2X3X4X5(SEQIDNO1)，其中X,為小的極性或堿性氨基酸，例如S、N或R，X2為芳香性或小的極性氨基酸，例如Y或S,X3為小的疏水性或芳香性氨基酸，例如A、G或W，X4為疏水性氨基酸，例如M或I，及Xs為小的極性或堿性氨基酸，例如H或S;b)序列X,X2X3X4X5GX6X7XsX9X,。XnDSVX,2G(SEQIDN02)，其中Xj為小氨基酸，例如V、A或N，X2為小的脂肪族氨基酸，例如I或L，X3為芳香性、堿性或疏水性氨基酸，例如W、G或K，X4為芳香性或脂肪族疏水性氨基酸、或極性氨基酸，例如F、Q、V或Y，Xs為小的酸性氨基酸或小氨基酸，例如D或G，X6為小的氛基酸或脂肪族氛基酸，例如S、G或I，X7為極性氬基酸，例如N、E或Y，或者沒(méi)有氨基酸，Xs為極性氨基酸，例如E、K或T，X9為極性氨基酸，例如Y、D或N，X^為芳香性氨基酸，例如Y或H，Xn為小的疏水性氨基酸，例如V或A,并且Xu為帶電的堿性氨基酸，例如K或R;并且c)序列X，X2X3X4XsX6X7X8X9XmXuX,2DY(SEQIDN03)，其中X,為帶電的酸性氨基酸，例如D或E,X2為小的或疏水性氨基酸，例如A、G、K、P或Y，10X;j為芳香性氨基酸或小的氨基酸，例如W、F、G或N，X4為芳香性氨基酸或小的氬基酸，例如F或G，或者沒(méi)有氨基酸，Xs為小氛基酸，例如G或S，或者沒(méi)有氨基酸，X6為小氬基酸，例如G，或沒(méi)有氨基酸，X7為小的極性氨基酸，例如T，或沒(méi)有氨基酸，Xs為極性芳香性氨基酸，例如Y，或沒(méi)有氨基酸，X9為帶電的酸性氨基酸，或芳香性氛基酸，例如E或F，或者沒(méi)有氨基酸，X,o為芳香性氨基酸或小氨基酸，例如F、G、S、V或W，Xn為小氛基酸或極性芳香性氬基酸，例如Y或G，并且X12為芳香性或脂肪族疏水性氬基酸，例如F或I。更特別的，本發(fā)明提供全人源抗VAP-1抗體重鏈，其包含第一CDR氨基酸序列，其選自SEQIDNO:4至8及其保守序列變體，和/或第二CDR^i^酸序列，其選自SEQIDNO:9至13及其保守序列變體，和/或第三CDR氨基^列，其選自SEQIDNO:14至18及其保守序列變體。本發(fā)明所述特別抗體重鏈包含可變區(qū)，其選自SEQIDNO:19至23及其保守序列變體。本發(fā)明還提供全人源抗VAP-1抗體輕鏈，其包含至少一種CDR共有序列，其中CDR共有序列選自a)序列RASQX,X2SX;jX4XsLA(SEQIDN024)，其中Xj為小氬基酸，例如G或S,X2為脂肪族氨基酸，例如I或V，X3為小極性或正電荷氨基酸，例如S或R，X4為小極性氬基酸，例如S，或沒(méi)有氬基酸，并且Xs為小疏水性或芳香性疏水性氨基酸，例如A、F、W或Y;b)序列X,ASX2X:jX4X5(SEQIDN025)，其中Xi為小的酸性絲酸或小絲酸，例如D或G，X2為小極性氨基酸，例如S或N，X3為脂肪族或正電荷氨基酸，例如L或R，X4為小氨基酸或極性氨基酸，例如A，E或Q，并且Xs為極性或正電荷氨基酸，例如S，T或R;及c)序列QQ&X2X3X4PXsT(SEQIDN026)，其中X,為芳香性或正電荷氨基酸，例如F、Y或R,X2為小氬基酸，例如N、G或S，X3為小極性氨基酸，例如S或N，X4為芳香性或小極性氨基酸，例如Y、F、W或S，并且X5為脂肪族或正電荷氬基酸，例如L或R。更特別的，本發(fā)明提供全人源抗VAP-1抗體輕鏈，包含第一CDR氨基^列，其選自SEQIDNO:27至31及其保守序列變體，和/或第二CI)R氨基酸序列，其選自SEQIDNO:32至36及其保守序列變體，和/或第三CDR氨基酸序列，其選自SEQIDNO:37至41及其保守序列變體。本發(fā)明所述特別抗體輕鏈包含可變區(qū)，其選自SEQIDNO:42至46及其保守序列變體。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供包括根據(jù)本發(fā)明所述重鏈和輕鏈的全人源抗VAP-1抗體。本發(fā)明的抗體分子與鏈可包括完全天然抗體分子，其具有全長(zhǎng)重鏈和輕鏈；其片段，如Fab、Fab'、F(ab，)2或Fv片段；輕鏈或重鏈單體或二聚體；或單鏈抗體，例如單鏈Fv，其中的重鏈和輕鏈可變區(qū)由多肽接頭連接；或任何其他重組的、或CDR接枝分子。同樣，重鏈和輕鏈可變區(qū)可結(jié)合其他適當(dāng)?shù)目贵w區(qū)域。本領(lǐng)域眾所周知，CDR3區(qū)域獨(dú)立于CDR1和/或CDR2區(qū)域，該CDR3區(qū)域能夠獨(dú)自確定抗體對(duì)同源抗原(cognateantigen)的結(jié)合特異性，并且可以基于共有的CDR3序列，預(yù)見(jiàn)性地生成多種具有相同結(jié)合特異性的抗體。因此，本公開(kāi)提供的單克隆抗體包括一個(gè)或多個(gè)源自人類或非人類動(dòng)物的抗體重鏈和/或輕鏈的CDR3區(qū)域，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合VAP-1。在某些方面，本^^開(kāi)提供的單克隆抗體包括一個(gè)或多個(gè)源自非人12類抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)域，例如小鼠或大鼠抗體，其中該單克隆抗體能夠特異性結(jié)合VAP-1。在一些實(shí)施方案中，這種發(fā)明的抗體包含一個(gè)或多個(gè)源自非人類抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)域，這樣的抗體與相應(yīng)的親本非人類抗體(a)能竟?fàn)幗Y(jié)合；(b)保留了其功能特性；(c)結(jié)合到同樣的表位；和/或(d)具有類似的結(jié)合親和性。在其他方面，本公開(kāi)提供的單克隆抗體包括一個(gè)或多個(gè)源自人類抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)域，例如，從非人類動(dòng)物中獲得的人類抗體，其中該人類抗體能夠特異性結(jié)合VAP-1。在其他方面，本公開(kāi)提供的單克隆抗體包括一個(gè)或多個(gè)源自第一人類抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)域，例如，從非人類動(dòng)物得到的人類抗體，其中該第一人類抗體能夠特異性結(jié)合VAP-1，并且其中該源自第一人類抗體的CDR3區(qū)域替換了人類抗體中缺乏對(duì)VAP-1的結(jié)合特異性的CDR3區(qū)域，以產(chǎn)生能夠特異性結(jié)合VAP-1的第二人類抗體。在一些實(shí)施方案中，這種發(fā)明的抗體包含的一個(gè)或多個(gè)源自第一人類抗體的重鏈和/或輕鏈CDR3區(qū)域，這樣的抗體與相應(yīng)的親本第一人類抗體(a)能竟?fàn)幗Y(jié)合；(b)保留功能特性；(c)結(jié)合到同樣的表位；和/或(d)具有類似的結(jié)合親和性。本公開(kāi)的抗體還可具有抗VAP-1抗體的各種物理性質(zhì)的特征?；谶@些物理性質(zhì)，可以利用各種化驗(yàn)檢測(cè)和/或區(qū)分不同類的抗體。在一些實(shí)施方案中，本公開(kāi)的抗體可以在輕鏈或重鏈可變區(qū)包含一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)。如本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，在可變區(qū)中存在的一個(gè)或多個(gè)糖基化位點(diǎn)可以導(dǎo)致增強(qiáng)的抗體免疫原性，或者由于改變了抗原結(jié)合而改變抗體的藥物動(dòng)力學(xué)。已知糖基化發(fā)生在含有N-X-S/T序列的基序?？墒褂肎lycoblot分析檢測(cè)可變區(qū)糖基化，其切割抗體以產(chǎn)生Fab，然后利用測(cè)量高碘酸鹽氧化作用和席夫堿形成的試驗(yàn)檢測(cè)糖基化。另外，可使用戴安薄層色i普(Dionexlightchromatography)(Dionex畫LC)測(cè)試可變區(qū)糖基4匕，其將來(lái)自Fab的糖化物切割成單糖并分析各自的糖含量。在某些實(shí)例中，不包含可變區(qū)糖基化的抗VAP-1抗體是優(yōu)選的。要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以通過(guò)選擇可變區(qū)中不包含糖基化基序的抗體，也可以通過(guò)使用本本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)突變糖基化基序內(nèi)的殘基。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本公開(kāi)的抗體不包含天冬酰胺異構(gòu)位點(diǎn)。脫酰胺基或異天冬氨酸作用可以分別對(duì)N-G或D-G序列發(fā)生影響?？梢允褂玫犬a(chǎn)量線分析法測(cè)量異天冬氨酸的產(chǎn)生，其采用反相高效液相色譜法測(cè)試異天冬氨酸。每個(gè)抗體會(huì)有一個(gè)特有的等電點(diǎn)(pl)，但是一般地，抗體會(huì)落入6至9.5的pH范圍之間。IgGl抗體的pl的通常落入7-9.5pH值范圍，IgG4抗體的pI通常落入6-8的pH值范圍?？贵w可以有此范圍之外的pl。可以使用毛細(xì)管等電聚焦法測(cè)試等電點(diǎn)，正如本領(lǐng)域所熟知，該方法產(chǎn)生pH梯度，并可以利用激光聚焦提高精度。在某些實(shí)例中，包舍落入正常范圍內(nèi)的pl值的抗VAP-1抗體是優(yōu)選的。要實(shí)現(xiàn)這一點(diǎn)，可以通過(guò)選擇具有正常范圍內(nèi)pl的抗體，也可以通過(guò)使用本本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)使帶電的表面殘基突變。每個(gè)抗體會(huì)有一個(gè)指示熱穩(wěn)定性的解鏈溫度。較高的熱穩(wěn)定性表明抗體在體內(nèi)更大的整體穩(wěn)定性?？墒褂弥T如差示掃描量熱法的技術(shù)測(cè)量抗體解鏈溫度。TM1指示抗體開(kāi)始解折疊的溫度。TM2指示抗體完全解折疊的溫度。一般來(lái)i兌，本公開(kāi)抗體的TM1優(yōu)選為大于60°C，優(yōu)選為大于65°C,更加優(yōu)選為大于70'C?？蛇x地，可使用本領(lǐng)域熟知的圓二色譜測(cè)量抗體的熱穩(wěn)定性。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，選取不會(huì)迅速降解的抗體。如本領(lǐng)域內(nèi)熟知的，可以使用毛細(xì)管電泳(CE)和基質(zhì)輔助激光解吸電離質(zhì)鐠法(MALDI-MS)測(cè)量抗VAP-1抗體的斷裂。在另一優(yōu)選的實(shí)施方案中，選擇具有最小聚集效應(yīng)的抗體。聚集可能導(dǎo)致觸發(fā)不必要的免疫反應(yīng)和/或改變的或不利的藥代動(dòng)力學(xué)特性。一般地，可以接受的抗體聚集是25°/?；蚋?，優(yōu)選地是20%或更少，更優(yōu)選地是15%或更少，更優(yōu)選地是10%或更少，甚至更優(yōu)選地是5%或更少?？梢酝ㄟ^(guò)本領(lǐng)域內(nèi)熟知的若干技術(shù)測(cè)量聚集，包括尺寸排阻柱(SEC)高效液相色譜(HPLC)，和光散射，以識(shí)別單體、二聚體、三聚體和多聚體。根據(jù)本發(fā)明的抗體優(yōu)選地為IgG型和更優(yōu)選地為IgG4型。不過(guò)，其他抗體同種型，如IgGl、IgG2、IgG3、IgM和IgE包括在內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的抗體包括重鏈和輕鏈可變區(qū)，其氨基酸序列與本文描述的優(yōu)選抗體的M酸序列同源，其中該抗體保留了本發(fā)明抗VAP-1抗體期望的功能特性。例如，本發(fā)明提供了分離的單克隆抗體，或其抗原結(jié)合部分，包含重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)，其中U)該重鏈可變區(qū)包含M酸序列，其與選自于SEQIDNO:19至23的M^列至少有80%的同源性；(b)該輕鏈可變區(qū)包含的M酸序列與選自于SEQIDNO:42至46的氨基齡列至少有80%的同源性;(c)抗體以1x1(T或更低的Kd結(jié)合人類VAP-1。在另一實(shí)施方案中，該Vh和/或Vl^^酸序列與上述序列可以85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%同源。具有VH和VL區(qū)域的抗體與上述序列的VH和VL區(qū)域具有高(即80%或更高)同源性，其可以通過(guò)誘變(例如，定點(diǎn)i秀變或PCR介導(dǎo)的i秀變)編碼SEQIDNO:19至23和42至46的核酸而獲得，接著對(duì)所編碼的改變的抗體測(cè)試其保留的功能。的百分比同一性。該兩個(gè)序列之間的百分比同一性是這些序列共同的相同位點(diǎn)數(shù)量的函數(shù)(即％同源性=相同位點(diǎn)#/總的位點(diǎn)#xl00)，考慮到缺口數(shù)量，和每一個(gè)缺口的長(zhǎng)度，需要引入這些進(jìn)行這兩個(gè)序列的最佳比對(duì)?？梢酝ㄟ^(guò)使用本領(lǐng)域熟知的標(biāo)準(zhǔn)方法，進(jìn)行序列比較和測(cè)定兩個(gè)序列之間的百分比同一性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明的抗體可以被設(shè)計(jì)為在Fc區(qū)域內(nèi)包^4奮改，通常是改變抗體的1個(gè)或多個(gè)功能特性，如血清半衰期、補(bǔ)體結(jié)合、Fc受體結(jié)合、和/或抗原依賴的細(xì)胞毒性。此外，本發(fā)明的抗體可以被化學(xué)修飾(如，可以將一個(gè)或多個(gè)化學(xué)基團(tuán)連接于抗體)，或被修飾以改變其糖基化，從而再改變抗體的一個(gè)或多個(gè)功能特性。例如，可以通過(guò)替代選自于氨基酸殘基234、235、236、237、297、318、320和322的至少有一個(gè)氛基酸殘基而改變?cè)揊c區(qū)域(Fc區(qū)域中殘15基的編號(hào)為Kabat的EU指數(shù)的編號(hào))，這些氛基酸殘基可以被替代成不同的氮基酸殘基，這樣該抗體對(duì)效應(yīng)配體(effectorligand)有改變的親和力，但保留了親本抗體的抗原結(jié)合能力。針對(duì)其改變了親和力的效應(yīng)配體可以是例如Fc受體或補(bǔ)體的CI部分。這種方法在，例如美國(guó)專利5,624,821和5，648，260中有更詳細(xì)的描述。本發(fā)明設(shè)想對(duì)本文的抗體的另一個(gè)修飾是聚乙二醇化?？贵w可被聚乙二醇化從而，例如，增加抗體的生物(如血清)半衰期。為了使抗體聚乙二醇化，該抗體或其片段通常在適合于一個(gè)或多個(gè)聚乙二醇(PEG)集團(tuán)連接到該抗體或抗體片段的條件下，與PEG反應(yīng)，如聚乙二醇的活性酯或醛4汁生物。優(yōu)選地，該聚乙二醇化是通過(guò)與活性的PEG分子(或類似的活性水溶性聚合物)進(jìn)行酰化反應(yīng)或烷基化反應(yīng)而實(shí)現(xiàn)。本文中所使用的術(shù)語(yǔ)"聚乙二醇"意在包括曾被用于衍生其他蛋白質(zhì)的任何形式的聚乙二醇，例如單(CI-CIO)烷氧基或芳氧基聚乙二醇或者聚乙二醇馬來(lái)酰亞胺。在某些實(shí)施方案中，該待聚乙二醇化的抗體是糖基化的抗體。蛋白質(zhì)聚乙二醇化的方法是本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的并且可用于本發(fā)明的抗體。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了特異的全人源抗VAP-1抗體8C10、8A4、3F10、4B3和5F12。在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了重組全人源抗VAP-1抗體，如重組8C10、8A4、3F10、4B3和5F12。在重組r8C10(BTT-1023)中，該重鏈由SEQIDNO:47中所描迷的^J^列組成，輕鏈由SEQIDNO:48中所描述的^^齡列組成。表l.全人源抗VAP-1M酸序列<table>tableseeoriginaldocumentpage16</column></row><table>63F10重鏈CDRl75F12重鏈CDRl84B3重鏈CDRl98C10重鏈CDR2ioi、'8A4重鏈CDR2113F10重鏈CDR2125F12重鏈CDR2134B3重鏈CDR2148C10重鏈CDR3158A4重鏈CDR3163F10重鏈CDR3175F12重鏈CDR3184B3重鏈CDR3198C10重鏈可變區(qū)208A4重鏈可變區(qū)213F10重鏈可變區(qū)225F12重鏈可變區(qū)234B3重鏈可變區(qū)24輕鏈CDR1共有25輕鏈CDR2共有26輕鏈CDR3共有278C10輕鏈CDR1288A4輕鏈CDR1293F10輕鏈CDR1305F12輕鏈CDR1314B3輕鏈CDR1328C10輕鏈CDR2178A4輕鏈CDR2343F10輕鏈CDR2355F12輕鏈CDR2364B3輕鏈CDR2378C10輕鏈CDR3388A4輕鏈CDR3393F10輕鏈CDR3405F12輕鏈CDR3414B3輕鏈CDR3428C10輕鏈可變區(qū)438A4輕鏈可變區(qū)443F10輕鏈可變區(qū)455F12輕鏈可變區(qū)464B3輕鏈可變區(qū)47重組r8C10重鏈48_______重組r8C10輕鏈優(yōu)選地，全人源抗VAP-1抗體的制備是通過(guò)免疫小鼠，其中該天然的d、鼠免疫球蛋白基因被滅活并且功能上^^類免疫球蛋白基因所有組成部分的全部或部分所取代。將這種小鼠用VAP-1抗原免疫，并然后使用標(biāo)準(zhǔn)的程序從小鼠產(chǎn)生生產(chǎn)人類抗體的雜交瘤。然后識(shí)別產(chǎn)生與VAP-1抗原有反應(yīng)性的單克隆抗體的克隆的雜交瘤細(xì)胞，并擴(kuò)展以產(chǎn)生純化的全人源單克隆抗體。其他制造人類抗體的方法包括，將動(dòng)物抗體的特異性轉(zhuǎn)移至人免疫球蛋白。例如，用VAP-1抗原免疫小鼠，并然后使用標(biāo)準(zhǔn)的程序從小鼠產(chǎn)生生產(chǎn)抗體的雜交瘤細(xì)胞。然后識(shí)別產(chǎn)生與VAP-1抗原有反應(yīng)性的單克隆抗體的克隆的雜交瘤細(xì)胞，并擴(kuò)展以產(chǎn)生純化的全人源單克隆抗體。測(cè)定抗體重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA序列并識(shí)別互補(bǔ)決定區(qū)(CDR)。該重鏈和輕鏈的CDR氨基酸序列被用來(lái)替換匹配的人類抗體的CDRM酸序列，以此方式將嚙齒動(dòng)物抗VAP-1抗體的特異性轉(zhuǎn)移到人類抗體。由此產(chǎn)生的抗VAP-1抗體在此意義上是全人源的，因?yàn)殡m然原始的CDRM酸序列是源于嚙齒動(dòng)物的，但是在人源性抗體中能夠產(chǎn)生相同的J^^列，且并不能^:正確定義為是對(duì)嚙齒類特異的。為了產(chǎn)生生產(chǎn)本發(fā)明的人類單克隆抗體的雜交瘤，可將源自免疫小鼠的脾細(xì)胞和/或淋巴節(jié)細(xì)胞分離，并適當(dāng)?shù)臒o(wú)限增殖化細(xì)胞系融合，如小鼠骨髓瘤細(xì)胞系?？梢院Y選由此產(chǎn)生的生產(chǎn)抗原特異性抗體的雜交瘤。例如，可用50%PEG令源自免疫小鼠的脾淋巴細(xì)胞單細(xì)胞懸浮液融合六分之一數(shù)量的P3X63-Ag8.653非分泌性小鼠骨髓瘤細(xì)胞(ATCC，CRL1580)。以約2x105將細(xì)胞在平底微滴定板中鋪板，隨后在含有20%的胚胎克隆血清(fetalCloneSerum)、18°/。的"653，，條件培養(yǎng)基、5%三曱氧唑辛(IGEN)、4mML-谷氨酰胺、lmM丙酮酸鈉、5mMHEPES、0.055mM2-巰基乙醇、50單位/ml青霉素、50mg/ml鏈霉素、50mg/ml慶大霉素和1xHAT(Sigma;該HAT在融合后24小時(shí)加入)的選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)兩周。大約兩周后，細(xì)胞可以在以HT取代HAT的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。然后可以通過(guò)ELISA對(duì)各孔篩選人類單克隆IgM和IgG抗體。一旦發(fā)生雜交瘤大量生長(zhǎng)，則通?？稍?0-14天后觀察培養(yǎng)基。該分泌抗體的雜交瘤可以重新鋪板，再次篩選，且如果仍然呈人類IgG陽(yáng)性，則該單克隆抗體可通過(guò)有P艮稀釋亞克隆至少兩次。然后可以在體外培養(yǎng)該穩(wěn)定的亞克隆以在組織培養(yǎng)基中產(chǎn)生少量的抗體用于表征。為了純化人類單克隆抗體，可以將選定的雜交瘤在2升的轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)以用于單克隆抗體純化。在用蛋白質(zhì)A瓊脂糖(Pharmacia,piscataway，NJ.)進(jìn)4亍親和層析前，可以過(guò)濾和濃縮上清液。可以通過(guò)凝膠電泳和高效液相色語(yǔ)法檢查洗脫的IgG,以確保純度。緩沖液可交換為PBS，并且使用消光系數(shù)1.43以O(shè)D280確定濃度?？梢詫⒃搯慰寺】贵w分裝并存儲(chǔ)在-80TC。還可以從噬菌體展示文庫(kù)中生產(chǎn)全人源抗體，噬菌體展示文庫(kù)利用遺傳改造的噬菌體在重組噬菌體表面展示和生產(chǎn)人類抗體蛋白質(zhì)，通過(guò)篩選19選擇對(duì)任何給定耙標(biāo)具有高親和性和特異性的單鏈抗體，并然后可以從該噬菌體分離抗體序列以產(chǎn)生重組全人源抗體。這種分離人類抗體的噬菌體展示方法是本領(lǐng)域內(nèi)已確立的。也可以使用SCID小鼠制備根據(jù)本發(fā)明的全人源單克隆抗體，其中人類免疫細(xì)胞已經(jīng)在該SCID小鼠中重建，以致進(jìn)行免疫時(shí)可以產(chǎn)生人類抗體響應(yīng)。這種小鼠在例如美國(guó)專利5，476，996和5，698，767中描述。當(dāng)需要時(shí)，編碼抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)的DNA，可被分離和融合到編碼任何需要的人類、或修飾的人類恒定區(qū)的DNA,以便產(chǎn)生的DNA構(gòu)建體可插入到表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染至合適的表達(dá)宿主以產(chǎn)生重組全人源抗體。這樣，也可以使用例如本領(lǐng)域內(nèi)眾所周知的重組DNA技術(shù)和基因轉(zhuǎn)染方法的組合，在宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)染瘤中生產(chǎn)根據(jù)本發(fā)明的抗體。例如，要表達(dá)該抗體或其抗體片段，可通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)的分子生物學(xué)技術(shù)(如利用表達(dá)目標(biāo)抗體的雜交瘤的PCR擴(kuò)增或cDNA克隆)獲得編碼部分或全長(zhǎng)輕鏈和重鏈的DNA，且該DNA可以被插入表達(dá)載體，使該基因有效地連接于轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列。上下文中，術(shù)語(yǔ)"有效地連接"是為了表示，抗體基因以這樣的方式連接到載體中，使得載體內(nèi)的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制序列起到他們預(yù)期的調(diào)節(jié)抗體基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的功能。選擇與使用的表達(dá)宿主細(xì)胞相容的表達(dá)載體和表達(dá)調(diào)控序列。該抗體輕鏈基因和抗體重鏈基因可以插入到不同的載體，或者更通常地，這兩種基因都被插入到同一個(gè)表達(dá)栽體中。通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法(例如，連接抗體基因片段和載體上的互補(bǔ)性限制位點(diǎn)，或者，如果不存在限制位點(diǎn)，進(jìn)行平端連接)將該抗體.基因插入到表達(dá)載體中。本文所述的該抗體的輕鏈和重鏈可變區(qū)可用于產(chǎn)生任何抗體同類型的全長(zhǎng)抗體基因，其通過(guò)已這樣的方式將它們插入到已經(jīng)編碼期望的同種型的重鏈恒定區(qū)和輕鏈恒定區(qū)的表達(dá)載體，使得VH片段有效連接到載體中的重鏈恒定(Ch)片段，VK片段有效連接到載體中的輕鏈恒定(Cl)片段。此外或可選地，該重組表達(dá)載體可以編碼促進(jìn)宿主細(xì)胞分泌抗體鏈的信號(hào)肽。該抗體鏈基因可以被克隆到栽體中，使得信號(hào)肽符合讀框地連接抗體鏈基因的^J^端。該信號(hào)肽可以M疫球蛋白信號(hào)肽或異源信號(hào)肽(即源自非免疫球蛋白的信號(hào)肽)。除了抗體鏈基因之外，本發(fā)明的重組表達(dá)載體還攜帶控制抗體鏈基因Jr/r^S二'一D^Ji電，4"丄厶JffitA點(diǎn)丄一士Jft^丄Jt人Hl^田UJEt》";屈松在3^"佐<白j￡-$w/JCiT^j^trvi^K乂/r"j。xy々、7只^從廠/1/pj》kh'j，/、t^T^J在/^夕'J意在包括控制抗體鏈基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的啟動(dòng)子、增強(qiáng)子和其他表達(dá)調(diào)控元件(例如，多腺苷酸化信號(hào))。本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員能意識(shí)到，表達(dá)載體的設(shè)計(jì)(包括選擇調(diào)控序列)，可取決于這些因素，如被轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的選擇、所需的蛋白質(zhì)的表達(dá)水平等。哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)優(yōu)選的調(diào)控序列包括指導(dǎo)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中蛋白質(zhì)高水平表達(dá)的病毒元件，如源自巨細(xì)胞病毒(CMV)猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期啟動(dòng)子(AdMLP)和多瘤病毒的啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子。另外，可以使用非病毒調(diào)控序列，如泛素啟動(dòng)子或P-球蛋白啟動(dòng)子。再者，由不同來(lái)源的序列組成的調(diào)控元件，例如SRalpha啟動(dòng)子體系，它包含了源自SV40早期啟動(dòng)子的序列和1型人類T細(xì)胞白血病病毒的長(zhǎng)末端重復(fù)序列。除了抗體鏈基因和調(diào)控序列，本發(fā)明的重組表達(dá)載體可載有另外的序列，諸如控制載體在宿主細(xì)胞中復(fù)制的序列(例如，復(fù)制起點(diǎn))和可選擇的標(biāo)記基因。如本領(lǐng)域眾所周知，該可選擇的標(biāo)記基因便于篩選已經(jīng)轉(zhuǎn)入了栽體的宿主細(xì)胞。例如，選擇標(biāo)記基因通常為已經(jīng)轉(zhuǎn)入了載體的宿主細(xì)胞提供了對(duì)如G418、潮霉素或甲氨蝶呤的抗藥性。優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因包括二氫葉酸還原酶(DHFR)基因(用于二氫葉酸還原酶缺陷型宿主細(xì)胞的甲氨蝶呤的篩選/擴(kuò)增)和neo基因(用于G418篩選)。為表達(dá)輕鏈和重鏈，通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)將編碼重鏈和輕鏈的表達(dá)載體轉(zhuǎn)入宿主細(xì)胞。"轉(zhuǎn)染"一詞的各種形式是意在涵蓋通常用于將外源DNA引入原核或真核宿主細(xì)胞的各種^支術(shù)，如電穿孔、磷酸鉀沉淀、經(jīng)DEAE-葡聚糖轉(zhuǎn)染等。雖然從理論上在原核和真核宿主細(xì)胞中都可以表達(dá)本發(fā)明的抗體，但是在真核細(xì)胞中(最優(yōu)選在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中)表達(dá)抗體是最優(yōu)選的，因?yàn)檫@樣的真核細(xì)胞，特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞，比原核細(xì)胞更傾向于組裝和分泌正確折疊的且為免疫活性的抗體。已有報(bào)道，抗體基因的原核表達(dá)對(duì)產(chǎn)生高產(chǎn)的活性抗體是無(wú)效的。表達(dá)本發(fā)明重組抗體的優(yōu)選的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括，中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢(CHO細(xì)胞)(包括該本領(lǐng)域熟悉的二氫葉酸還原酶缺陷型CHO細(xì)胞)、NSO骨髓瘤細(xì)胞、COS細(xì)胞和SP2細(xì)胞。當(dāng)編碼抗體基因的重組表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞，通過(guò)培養(yǎng)宿主細(xì)胞足夠長(zhǎng)的時(shí)間以使抗體在宿主細(xì)胞中表達(dá)而產(chǎn)生抗體，或者更優(yōu)選地，將抗體分泌到宿主細(xì)胞生長(zhǎng)的培養(yǎng)基中。可以使用標(biāo)準(zhǔn)的蛋白質(zhì)純化的方法從培養(yǎng)基中回收抗體。本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了，編碼全人源抗VAP-1抗體重鏈可變區(qū)的DNA分子，其包括第一DNA序列，選自于SEQIDNO:49至53及其保守序列變體，和/或第二DNA序列，選自于SEQIDNO:54至58及其保守序列變體，和/或第三DNA序列，選自于SEQIDNO:59至63及其保守序列變體，所述DNA序列分別編碼CDR區(qū)域l至3。4艮據(jù)一具體方面，本發(fā)明提供了編碼重鏈可變區(qū)的DNA分子，并包括選自于SEQIDNO:64至68及其保守序列變體的DNA序列。本發(fā)明的另一方面還提供了編碼全人源抗VAP-1抗體輕鏈可變區(qū)的DNA分子，其包括第一DNA序列，選自于SEQIDNO:69至73及其保守序列變體，和/或第二DNA序列，選自于SEQIDNO:74至78及其保守序列變體，和/或第三DNA序列，選自于SEQIDNO:79至83及其保守序列變體，所迷DNA序列分別編碼CDR區(qū)域1至3。才艮據(jù)一具體方面，本發(fā)明提供了編碼輕鏈可變區(qū)的DNA分子，并包括選自于SEQIDNO:84至88及其保守序列變體的DNA序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了編碼重組全人源抗VAP-1抗體的DNA分子，例如重組8C10、8A4、3F10、4B3和5F12。在重組r8C10(BTT-1023)中，由包含SEQIDNO:89中描述的多核苷^f列的DNA編碼該重鏈，并且由包含SEQIDNO:卯中描述的多核香酸序列的DNA編碼該輕鏈。表2.全人源抗VAP-1核苦酸序列SEQIDNO序列描述22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>本發(fā)明還提供了包含上述核苷酸序列的表達(dá)載體。適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體包括的栽體包含在哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞中對(duì)蛋白質(zhì)的表M分泌重要的元件。該載體可包括編碼人類重鏈恒定區(qū)、或輕鏈恒定區(qū)、或兩者兼而有之的DNA。重鏈和輕鏈二者可以都用同樣的載體表達(dá)，或者可選的，可以使用含有或輕或重鏈恒定區(qū)的不同載體。在根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，該表達(dá)載體包括人類IgG4的重鏈恒定區(qū)，其通過(guò)用亮氨酸235取代丙氨酸，而修飾以減少FcyRI結(jié)合以及抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，如美閨專利5,624,821中所描述。Fc區(qū)域中的殘基編號(hào)為Kabat的EU指數(shù)的編號(hào)。本發(fā)明還提供了宿主細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化了根據(jù)本發(fā)明的表達(dá)栽體?？梢杂萌魏魏线m的宿主細(xì)胞/載體系統(tǒng)來(lái)表達(dá)編碼全人源抗體重鏈和輕鏈的DNA序列?？梢允褂眉?xì)菌，如大腸桿菌，和其他微生物系統(tǒng)，特別是用于諸如Fab和F(ab')2片段的抗體片段的表達(dá)，尤其是Fv片段和單鏈抗體片段如單鏈Fv片段。真核生物的例如植物、酵母或哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)或轉(zhuǎn)基因植物和動(dòng)物，可被用于生產(chǎn)更大的抗體產(chǎn)品，包括完整的抗體分子，和/或糖基化的產(chǎn)品，如果需要的話。適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物宿主細(xì)胞包括如上所述的CHO(中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢)細(xì)胞和骨髓瘤或雜交瘤細(xì)胞系。優(yōu)選的宿主細(xì)胞是CHO細(xì)胞。本發(fā)明的另一個(gè)方面意在提供生產(chǎn)重組全人源抗VAP-1抗體的方法，該方法包括，在適當(dāng)?shù)膯?dòng)子和分泌信號(hào)的控制下，用包括編碼根據(jù)本發(fā)明的全人源抗體重鏈和輕鏈DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞，以及在每個(gè)鏈被表達(dá)的條件下繁殖所述宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中分離所述被表達(dá)和裝配的全人源抗VAP-1抗體或其具有生物活性的衍生物。可以構(gòu)建載體的一般方法、轉(zhuǎn)染方法和培養(yǎng)方法是本領(lǐng)域內(nèi)熟知的。本發(fā)明還提供了藥物組合物，其包括可藥用載體或稀釋劑，及作為活性成分的根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體。本發(fā)明的組合物包括根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體，其數(shù)量上足以對(duì)抗(全部或部分)病人的天然VAP-1對(duì)需要這種對(duì)抗的病人中的VAP-1生物配體的結(jié)合，特別是對(duì)存在于白細(xì)月包的VAP-1配體的結(jié)合。治療炎癥相關(guān)疾病的臨床領(lǐng)域的普通技術(shù)人員可以容易地確定，根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體的給藥數(shù)量和方案。一般來(lái)說(shuō)，全人源抗VAP-1抗體治療的劑量會(huì)不同，其取決于考慮以下考慮年齡、性別和待治患者的整體健康狀況；同步治療種類，如果有的話；治療的頻率和預(yù)期效果的性質(zhì)；組織損害的程度；癥狀的持續(xù)時(shí)間；以及由醫(yī)生個(gè)人調(diào)整的其他變量?？梢栽谝环N或多種應(yīng)用中實(shí)施所需的劑量，以取得預(yù)期的結(jié)果?？梢砸詥挝粍┝啃问焦┙o根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。可以用任何適當(dāng)?shù)乃幚磔d體施用根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物用于治療。可以以任何影響預(yù)防、緩解、預(yù)防或治療VAP介導(dǎo)的人類或動(dòng)物患者醫(yī)學(xué)病癥的形式施用它們。用于腸胃外給藥和局部給藥時(shí)，根椐本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體藥物組合物包括無(wú)菌水或非水溶劑、懸液和乳劑。非水溶劑的例子是丙二醇、聚乙二醇、植物油、魚油、和可注射的有機(jī)酯。水性載體包括水、水-乙醇溶液，其中包括鹽和緩沖的一般腸胃外載體，其包括氯化鈉溶液、林格氏葡萄糖溶液、葡萄糖加氯化鈉溶液、含有乳糖的林格氏液、或非揮發(fā)性油。靜脈栽體包括流體和營(yíng)養(yǎng)補(bǔ)充劑、電解質(zhì)補(bǔ)充劑，如那些基于林格氏葡萄糖等的電解質(zhì)補(bǔ)充劑。根據(jù)本發(fā)明的水性組合物可能包括適當(dāng)?shù)木彌_劑，如取決于耙定pH值范圍的鈉和鉀的磷酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、碳酸鹽或氨基乙酸緩沖液。利用氯化鈉作為滲漲度調(diào)節(jié)劑也是很有用的。組合物^Z，jjj>1TVV_，，</p",、，、_4v，A、一、一titrfl*/_<rAia-btlVHA士口J宵&'6肌"刑，，恩疋1。風(fēng)刑-XW刑。炎"JH、疋肌"刑面活性劑(聚山梨酯20&80、泊咯沙姆407)、聚合物(聚乙二醇，聚乙烯吡咯酮)、糖類(蔗糖、甘露醇、葡萄糖、乳糖)、醇(山梨醇，甘油丙二醇，乙二醇)、適當(dāng)?shù)牡鞍踪|(zhì)(白蛋白)、合適的氨基酸(甘氨酸，谷氨酸)、脂肪酸(乙醇胺)、抗氧化劑(抗壞血酸，半胱氨酸等)、螯合劑(EDTA鹽類、組氨酸、天門冬氨酸)或金屬離子H丐、鎳、鎂、錳)。有用的防腐劑有苯甲醇、氯代丁醇、苯扎氯銨，也可使用對(duì)羥基苯曱酸酯類?？梢砸詽饪s的形式或者以粉末的形式以根據(jù)需要重構(gòu)提供根據(jù)本發(fā)明的藥物組合物。在這類情況下，對(duì)用于注射/輸注溶液的粉劑，可以使用上述賦形劑。在冷凍干燥的情況下，某些冷凍保護(hù)劑是優(yōu)選的，其包括聚合物(聚乙烯吡咯酮、聚乙二醇、葡聚糖)、糖(蔗糖、葡萄糖、乳糖)、氨基酸(甘氨酸、精氨酸、谷氨酸)和白蛋白。如果重構(gòu)溶液被添加到包裝，其可以包括如注射用純凈水或氯化鈉溶液或葡聚糖和葡萄糖溶液。本發(fā)明的組合物適用于診斷或治療涉及炎癥反應(yīng)的任何疾病，其中VAP-1粘附起到介導(dǎo)白細(xì)胞從血液到炎癥位置的遷移和浸潤(rùn)的作用。因此，該組合物可用于"^斷或治療炎性關(guān)節(jié)炎和結(jié)締組織疾病，如反應(yīng)性關(guān)節(jié)病、傳染病后的關(guān)節(jié)病、炎性多關(guān)節(jié)病、全身結(jié)締組織疾病、炎癥性脊推病、肌炎、滑膜炎、賴特爾病、血清陽(yáng)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、其它類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、關(guān)節(jié)外類風(fēng)濕病、牛皮癬關(guān)節(jié)病和腸病性關(guān)節(jié)病、少年關(guān)節(jié)炎、未明示的26(unspecified)關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和相關(guān)疾病、其他壞死性血管病變、皮多肌炎(dermatopolymyositis)、全身性硬化癥、涉及全身性結(jié)締組織的其他疾病、強(qiáng)直性脊柱炎和其它炎癥性脊推病。此外，炎癥性腸疾病諸如克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎、皮膚病如大皰病、皮炎、丘疹鱗屑性病、紅斑、萎縮性硬化性苜痺、外陰干皺癥、盤狀紅斑狼癡、硬斑病、天皰瘡、類天皰瘡、皰滲樣皮炎、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性接觸性皮炎、刺激性接觸性皮炎、未明示的接觸性皮炎、牛皮癬、多形性紅斑、其他炎癥性疾病如多發(fā)性硬化癥、神經(jīng)炎癥、炎性肌病、急性播散性腦脊髓炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、Sj6grens綜么-癥、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑多良論、孝喘和炎性肝臟疾病、格雷夫斯病和甲狀腺炎、動(dòng)脈粥樣硬化、眼睛炎癥包括葡萄膜炎、虹膜炎、虹膜睫狀體炎、酒精性肝炎、同種異體移植、異種移植、腎小J求腎炎、再灌注損傷和心肌梗死和中風(fēng)后的急性炎癥疾病可能適合用本發(fā)明的組合物進(jìn)行診斷或治療。根據(jù)本發(fā)明的治療上有用的全人源抗VAP-1抗體可以以化學(xué)方法或者通過(guò)基因工程與其他因子綴合，這些因子提供將抗體靶向所需功能位點(diǎn)的作用。另外，其他化合物可以以化學(xué)方法或者通過(guò)基因工程與才艮據(jù)本發(fā)明的抗體結(jié)合，從而為抗體提高或提供其他性能，尤其是對(duì)于VAP-1結(jié)合介導(dǎo)的有害效果，提高抗體促進(jìn)對(duì)該有害效果的緩解的能力的性能。根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體可以以化學(xué)方法或者通過(guò)基因工程標(biāo)記，以提供可檢測(cè)的抗體。這種標(biāo)記抗體可成為人體炎癥部位成像，特別是炎癥部位的體內(nèi)免疫閃爍成像的有用工具。這種類型的影像可取代目前使用的較繁瑣和昂貴的白細(xì)胞成像方法。為了成像目的，抗體片段的使用將比用于抗炎療法的完整抗體更適合，且源自全人源性抗體的片段也應(yīng)該比它們的嵌合或小鼠等同物安全。在另一個(gè)方面，本發(fā)明是涉及對(duì)需要這種治療的人類患者在人體內(nèi)通過(guò)施用有效水平的根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體，來(lái)減少或治療人類體內(nèi)炎癥的方法。術(shù)語(yǔ)"治療"或"處理"意在包括為受治療者施用全人源抗VAP-1抗體，其目的可以包括預(yù)防、改善、預(yù)防或治療VAP-1粘附事件介導(dǎo)的疾病。屬于本發(fā)明的方法主題的特定的抗VAP-1抗體，是本發(fā)明的純化的重組全人源抗VAP-1抗體。全人源抗VAP-1抗體的"有效水平"是指對(duì)VAP-1介導(dǎo)事件的有害影響至少有所改善的水平。本發(fā)明的抗體的有效量是，足以阻斷或部分阻斷白細(xì)胞的內(nèi)皮結(jié)合，從而抑制白細(xì)胞浸潤(rùn)炎癥位點(diǎn)，在該位點(diǎn)這種浸潤(rùn)是有害的或不期望的。治療炎癥相關(guān)疾病的臨床領(lǐng)域普通技術(shù)人員能很容易地確定該全人源抗VAP-1抗體的給藥量和方案。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體在血管內(nèi)的供給間隔范圍是，每星期一次至每3個(gè)月一次之間，劑量范圍為0.01至20mg/kg，更優(yōu)選是在O.i到i0mg/kg的范圍內(nèi)，最優(yōu)選是0.5至5mg/kg。可選地，根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-1抗體皮下供給間隔范圍是，每星期一次至每3個(gè)月一次之間，劑量范圍為0.1至20mg/kg，更優(yōu)選是在0.2到10mg/kg的范圍內(nèi)，最優(yōu)選是0.5至5mg/kg。下列實(shí)施例是為了進(jìn)一步更詳細(xì)地闡明本發(fā)明，但并不是要限制本發(fā)明的范圍。本領(lǐng)域的技術(shù)人員，即熟悉炎癥性疾病及其治療方法的臨床醫(yī)生，能很容易理解其它的應(yīng)用和用途。實(shí)施例實(shí)施例1表ii^類抗VAP-1單克隆抗體的雜交瘤的分離用人免疫球蛋白轉(zhuǎn)基因小鼠品系(HuMAb小鼠⑧；MedarexIne)產(chǎn)生表i^A類抗VAP-1單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞。該HuMAb小鼠⑧包含編碼未重排的人類重鏈(]Li和Y)和K輕鏈免疫球蛋白序列的人免疫球蛋白基因微衛(wèi)星基因座(miniloci)，連同滅活內(nèi)源性ji和K鏈基因座的耙向突變(見(jiàn)例如，Lonberg，等(1994)Nature368(6474):856-859)。因此，小鼠表現(xiàn)出小鼠IgM或K表達(dá)的減少，且響應(yīng)免疫時(shí)，引入的人類重鏈和輕鏈轉(zhuǎn)基因經(jīng)過(guò)類別轉(zhuǎn)換和體細(xì)胞突變以產(chǎn)生高親和力的人IgGK單克隆抗體。HuMab鼠的制備和使用，以及這些鼠攜帶的基因組修改，描述于例如美國(guó)專利5，545，806、5,569,825、5,625,126、5，633，425、5,789,650、5,877,397、5,661,016、5,814,318、5,874,299和5,770,429，所有都屬于Lonberg和Kay;美國(guó)專利5,545,807，屬于Surani等；PCT^S布WO92/03918、WO93/12227、WO94/25585、WO97/13852、WO98/24884和WO99/45962，所有都屬于Lonberg和Kay;和PCT公布WO01/14424,屬于Korman等。用重組人類VAP-1(rhVAP-l)免疫該轉(zhuǎn)基因小鼠后，小鼠產(chǎn)生特異于人類VAP-1的人類IgG抗體。免疫方案如下通過(guò)多重腹腔和皮下注射純化自CHO細(xì)胞的rhVAP免疫小鼠，該CHO細(xì)胞穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了包含人VAP-1cDNA的表達(dá)質(zhì)粒并表達(dá)人VAP-1(Smith等，J.Exp.Med.(1998)188:17-27)，rhVAP-1混合全弗氏佐劑，然后使用的rhVAP-1混合不完全弗氏佐劑或rhVAP-1與Ribi佐劑混合。使用固定化rhVAP-1和熒光微體積測(cè)定技術(shù)(FMAT)，利用穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了包含人VAP-1cDNA的表達(dá)質(zhì)粒并表iiAVAP-1的CHO細(xì)胞，通過(guò)抗體捕獲EUSA分析源自免疫小鼠的血清樣本進(jìn)行免疫情況監(jiān)測(cè)。在脾臟切除前，對(duì)靜脈注射和腹腔施行最后加強(qiáng)注射rhVAP-l。l吏用聚乙二醇(PEG)作為融合劑，通過(guò)將P3X63Ag8.653骨髓瘤細(xì)胞(ATCCCRL1580)與上述免疫小鼠的脾細(xì)胞融合，得到表達(dá)人類抗VAP-1單克隆抗體的雜交瘤。通過(guò)ELISA法初步篩選具有k輕鏈的人IgG抗體存在的雜交瘤上清液。然后用ELISA法對(duì)于rhVAP-1篩選人類IgG陽(yáng)性細(xì)胞，通過(guò)FMAT針對(duì)對(duì)在穩(wěn)定地轉(zhuǎn)染了包含人VAP-1cDNA的表達(dá)質(zhì)粒的CHO細(xì)胞表面表達(dá)的VAP-1的結(jié)合，來(lái)篩選人類IgG陽(yáng)性細(xì)胞。選中五個(gè)人類抗VAP-1IgG,雜交瘤克隆，即5F12、4B3、3F10、8A4和8C10。實(shí)施例2全人源抗體5F12、4B3、3F10、8A4和8C10的VAP-1結(jié)合性質(zhì)利用時(shí)間分解免疫熒光分析法定量檢驗(yàn)5F12、4B3、3F10、8A4和8C1029對(duì)rhVAP-l的結(jié)合。將微量滴定板涂布rhVAP-l,然后用牛血清白蛋白溶液封閉。隨后添加2至4320ng/ml之間的量抗體以結(jié)合rhVAP-l，并通過(guò)綴合銪的鼠抗人抗體(PerkinElmerInc.)檢測(cè)該結(jié)合的抗體。通過(guò)在615nm測(cè)量時(shí)間分解菱光(Victor3多標(biāo)簽計(jì)數(shù)器，PerkinElmerInc)檢測(cè)該標(biāo)簽。焚光計(jì)數(shù)直接與結(jié)合其粑標(biāo)的抗體多少相關(guān)聯(lián)。然后對(duì)照參考的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣本數(shù)據(jù)。該數(shù)據(jù)顯示，5F12、4B3、3F10、8A4和8C10結(jié)合rhVAP-1，親和力(Kd)如表3所示。表3.5F12、4B3、3F10、8A4和8C10mAb與rhVAP畫l的結(jié)合mAbKd(nM)8C100.213F100.254B30.318A40.285F120.65實(shí)施例3全人源抗體5F12、4B3、3F10、8A4和8C10的可變區(qū)的cDNA的制備、克隆和測(cè)序?yàn)榱藰?gòu)建重組抗體，將實(shí)施例1中獲得的編碼抗體的人類重鏈和輕鏈可變區(qū)的cDNA分離，并克隆至質(zhì)粒載體進(jìn)行序列分析。通過(guò)下面的方法，>^達(dá)抗VAP-1的雜交瘤細(xì)胞5F12、4B3、3F10、8A4和8C10得到人類免疫球蛋白(Ig)重鏈可變(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)的cDNA克隆。使用來(lái)自Qiagen的RNeasy試劑盒，從5xl()6雜交瘤細(xì)胞制備總RNA。通過(guò)反轉(zhuǎn)錄RNA制備VL和VhcDNA，接著使用"SMARTRACEcDNA擴(kuò)增試劑盒，，和來(lái)自BDBiosciencesClontech的高保真"Advantage-HF2PCR試劑盒"進(jìn)行"cDNA末端快速擴(kuò)增(RACE)，，程序。然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物純化、克隆到栽體pCR4-TOPOTA(Invitrogen),并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌林TOP10(Invitrogen)。對(duì)5F12、4B3、3F10、8A4和8C10各自的VL和VH質(zhì)?？寺〉男×刻崛NA進(jìn)行測(cè)序，且核苷酸極其推導(dǎo)的相應(yīng)的蛋白質(zhì)序列如圖1至圖6所示。實(shí)施例4表達(dá)重組r8C10mAb的哺乳動(dòng)物表達(dá)載體的構(gòu)建將8C10可變區(qū)插入適當(dāng)?shù)牟溉閯?dòng)物表達(dá)載體，該載體包含適當(dāng)?shù)闹劓満洼p鏈恒定區(qū)，如下所述，以便在CHO細(xì)胞中產(chǎn)生功能性重組r8C10抗體(即BTT-1023)。已知抗體的Fc區(qū)域確定抗體/抗原復(fù)合物指導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。目的是生產(chǎn)治療性抗體，該抗體能阻止白細(xì)胞結(jié)合血管內(nèi)皮，而不是引起任何效應(yīng)功能。因此，在表達(dá)栽體使用了人類IgG4重鏈恒定區(qū)，其通過(guò)用氨基酸亮氨酸235取代丙氨酸而被修飾，以減少FcYRI結(jié)合和抗體依賴性細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性(ADCC)，如美國(guó)專利5624821中所述。用PCRSupermix(Invitrogen)擴(kuò)增8C10Vl和VHcDNA，以在5'端包含適當(dāng)?shù)目寺∥稽c(diǎn)和最佳Kozak共有序列。；殳計(jì)的正向和反向PCR引物，以具有適當(dāng)?shù)南拗菩钥寺∥稽c(diǎn)。分別包含天然Vl和Vh信號(hào)序列的PCR產(chǎn)物，被純化并克隆到攜帶人k輕鏈恒定區(qū)和人Y4重鏈的質(zhì)粒載體中，其中Y4重鏈栽有絲氨酸228突變?yōu)楦彼岷土涟彼?35突變?yōu)楸彼?，并被稱為plCO-g4PA(VAP1.8C10),隨后將產(chǎn)生的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌TOP10細(xì)胞中。對(duì)質(zhì)粒的Vl和VH區(qū)域進(jìn)行測(cè)序以確定克隆的PCR產(chǎn)物的完整性。PCR擴(kuò)增該8C10輕鏈，以在5'端含有歷wdIII克隆位點(diǎn)和最佳Kozak共有序列，以及在3'端含有五"RI克隆位點(diǎn)，其利用plCO-g4PA(VAP1.8C10)質(zhì)粒作為模板和PCRSupermix。包括天然8C10輕鏈信號(hào)序列的PCR產(chǎn)物，被歷VidlU和EcoRI消化，純化并克隆到表達(dá)載體pEE12.4的歷"dIII和五coRI位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒2116,其中pEE12.4獲得自LonzaBiologies。將該2116質(zhì)豐立轉(zhuǎn)4匕到DH5aMaxEfficiency(Invitrogen公司)感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中。PCR擴(kuò)增8C10重鏈，以在5'端含有歷m/i^克隆位點(diǎn)和最佳Kozak共有序列，以及在3'端含有克隆位點(diǎn)，其利用plCO-g4PA(VAP1.8C10)質(zhì)粒作為模板和PCRSupermix。包括天然8C10重鏈信號(hào)序列的PCR產(chǎn)物，被歷'm/Z"和消化。包含8C10重鏈的片段被純化并克隆到Lonza載體pEE6.4中的///'"fif/Z/和五caR/位點(diǎn)，產(chǎn)生質(zhì)粒2117,其中pEE6.4獲得自LonzaBiologies。將該2117質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到DH5aMaxEfficiency感受態(tài)細(xì)胞中。用Sfl/I和7VWI消化質(zhì)粒2116和2117，并用T4DNA連接酶連接從每個(gè)酶切中得到的最大片段，產(chǎn)生質(zhì)粒2118|2118-pEE12.4-VAPl(8C10)l。將質(zhì)粒2118轉(zhuǎn)化到DH5ocMaxefficiency感受態(tài)細(xì)胞中。對(duì)整個(gè)編碼重鏈和輕鏈的DNA進(jìn)行測(cè)序，以確定序列準(zhǔn)確性和完整性。實(shí)施例5重組全人源抗體BTT-1023在CHO細(xì)胞中的表達(dá)由CHO細(xì)胞生產(chǎn)全人源抗體BTT-1023如下。用尸v"/線性化2118-pEE12.4-VAPl(8C10)質(zhì)粒DNA。通過(guò)電穿孔將該DNA轉(zhuǎn)染至由LonzaBiologies得到的CHOKISV細(xì)胞中。然后，將這些細(xì)胞以50^L/孔鋪于96孔板(2.5x103細(xì)胞/孔)中，在限定化學(xué)成分(CD)的CHO(目錄編號(hào)#04-0119，GibcoInvitrogenInc)轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)基(不含L-谷氨酰胺的CDCHO+1xGS(谷氨酰胺合成酶)補(bǔ)劑+2.16mg/L胸苷)中。然后隨后將板在150pL/孔的CDCHO選擇培養(yǎng)基(不含L-谷氨酰胺的CDCHO+1xGS補(bǔ)劑+2.16mg/L胸普+66.6pMMSX(^J^亞砜蛋氨酸(MethionineSulfoximine))或133.3pMMSX)中培養(yǎng)24小時(shí)，MSX最后的總濃度在50pM或100nM。利用人IgG夾心ELISA法測(cè)定由MSX抗性菌落生產(chǎn)的抗體水平。才4選生產(chǎn)高水平抗體的菌落，在CDCHO擴(kuò)展培養(yǎng)基(不含L-谷氨酰胺的CDCHO+1xGS補(bǔ)劑+2.16mg/L胸苷+50iaMMSX或lOOyMMSX)中進(jìn)行擴(kuò)展，首先置于24孔板，然后置于方瓶(T-flask)。在搖瓶中擴(kuò)展這些細(xì)胞，然后制備5小瓶轉(zhuǎn)染瘤細(xì)胞庫(kù)(TCB)。從50iaMMSX板中挑選細(xì)胞系15B7,并將其保持在含50jLiMMSX的CDCHO擴(kuò)展培養(yǎng)基中。通過(guò)培養(yǎng)該上述轉(zhuǎn)染的CHO細(xì)胞產(chǎn)生抗體，以產(chǎn)生條件性培養(yǎng)基，可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)從其中純化BTT-1023，以從培養(yǎng)上清中純化單克隆抗體。實(shí)施例6重組全人源抗體BTT-1023的結(jié)合特性用時(shí)間分解免疫分析法，定量考察rhVAP-l與BTT-1023的結(jié)合。將微量滴定板涂布rhVAP-l，然后用牛血清白蛋白溶液封閉。隨后將2至4320ng/ml之間的量的BTT-1023添加以結(jié)合VAP-l,并通過(guò)銪綴合的鼠抗人抗體(PerkinElmerlnc.)檢測(cè)該結(jié)合的BTT-1023。通過(guò)在615nm測(cè)量時(shí)間分解熒光(Victor3多標(biāo)簽計(jì)數(shù)器，PerkinElmerInc)檢測(cè)該標(biāo)簽。熒光計(jì)數(shù)直接與結(jié)合其靶標(biāo)的BTT-1023的多少相關(guān)聯(lián)。然后對(duì)照參考的標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣本數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)顯示，BTT-1023結(jié)合到重組人VAP-l的親和力(Kd)為0.38nM。使用Biacore表面等離子體共振法的實(shí)時(shí)直接結(jié)合分析法分析rhVAP-1與BTT-1023的結(jié)合動(dòng)力學(xué)。固定在抗生蛋白鏈菌素包被的芯片(BiacoreAB)上的生物素化的蛋白質(zhì)G'(Sigma)被用于從流動(dòng)相中捕獲BTT-1023。每次運(yùn)行包含兩個(gè)連續(xù)的階段注射BTT-1023mAb和注射配體結(jié)合分析物(rhVAP-l)。對(duì)于飽和濃度的mAb(配體)，用固定量的rhVAP-l作為分析物。使用BIAlite設(shè)備(BiacoreAB)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，使用Biacore軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。數(shù)據(jù)顯示，重組人VAP-l結(jié)合BTT-1023的親和力(Kd)為0.13nM。通過(guò)免疫熒光染色和流式細(xì)胞卩義分析全人源BTT-1023對(duì)VAP-l的結(jié)合。對(duì)于流式細(xì)胞儀，使用源自鼠內(nèi)皮細(xì)胞系(Ax細(xì)胞)的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，其表達(dá)人VAP-lcDNA(Smith等，J.Ex.Med.(1998)188:17-27)。這些被培養(yǎng)在175cm3燒瓶中，處于RPMI1640培養(yǎng)基(Sigma)中，其中補(bǔ)加20。/。FCS(胎牛血清)、2mML-谷氨酰胺、lmM丙酮酸鈉、10nMP-ME(P33-巰基乙醇)、1%非必需氨基酸、100U/ml青霉素、100jag/ml鏈霉素和0.75mg/mlGeneticin。為了釋出這些細(xì)胞，用PBS(磷酸鹽緩沖液)洗滌兩次，并在10毫升細(xì)胞解離緩沖液(GibcoBRL)中在37'C孵育3分鐘。加入10毫升的培養(yǎng)基后，將細(xì)胞離心(5分鐘，1000g，在室溫下)，以106細(xì)胞/ml懸浮于洗滌緩沖液[PBS、0.1%(w/v)BSA(牛血清白蛋白)、0.1%(v/v)疊氮鈉l并在冰上保存。將細(xì)胞懸浮液(100微升/孔)轉(zhuǎn)入96孔板，將細(xì)胞離心(4分，1000g，IOC)，100nl等份的抗體溶液加入孔中。經(jīng)過(guò)30分鐘的水浴，以150ul洗滌緩沖'^7孔洗滌細(xì)胞兩次，然后用100pi39照/ml的FITC綴合的(異疏氰酸熒光素)抗人IgG(Fc特異的，Sigma)在冰上孵育30分鐘。最后，按前面洗滌這些細(xì)胞，并通過(guò)加入含1%(v/v)甲醛的100pl洗滌緩沖液而固定，并保持在4°C，直至在流式細(xì)胞儀中分析。對(duì)照樣本只用FITC-綴合的抗人IgG二級(jí)抗體染色。在FACScanTM(BectonDickinson)上分析所有流式細(xì)胞儀樣本。對(duì)于每個(gè)樣本，收集至少10000門控事件(gatedevents)的數(shù)據(jù)并用LysysII軟件計(jì)算熒光的幾何平均通道。與人VAP-1特異結(jié)合的BTT-1023以表面表達(dá)VAP-1的經(jīng)轉(zhuǎn)染Ax細(xì)胞的染色顯示。(圖7)實(shí)施例7BTT-1023的功能特點(diǎn)使用體外遷移分析來(lái)檢測(cè)，BTT-1023抑制白細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮單層遷移的功能能力。為了在其表面表達(dá)重組人VAP-1而轉(zhuǎn)染大鼠內(nèi)皮細(xì)胞單層，該大鼠內(nèi)皮細(xì)胞單層被培養(yǎng)在Transwell儀器(BectonDickinson)的上層培養(yǎng)室。新鮮分離的人外周血單核細(xì)胞置于在頂部培養(yǎng)室，并允許其向底部培養(yǎng)室的單核細(xì)胞趨化肽fMLP(N-甲酰-甲硫氨酰-亮氨酰-苯丙氨酸，100nM)遷移2小時(shí)。該單分子層經(jīng)過(guò)BTT-1023處理，或經(jīng)過(guò)BTT-1008(具有人恒定區(qū)的非結(jié)合的陰性對(duì)照抗體(Kirton等，Eur.J.Immunol.(2005)已知阻斷VAP-1介導(dǎo)的粘附和遷移的陽(yáng)性對(duì)照嵌合抗VAP-1mAb)處理。從底部培養(yǎng)室收集遷移過(guò)單層的細(xì)胞，并在顯微鏡下計(jì)數(shù)。BTT-1023將遷移通過(guò)內(nèi)皮細(xì)胞單層的細(xì)胞顯著減少至10ngml",并將遷移阻斷在1mr1。陰性對(duì)照抗體BTT-1008在1ftgml"已經(jīng)無(wú)效，而陽(yáng)性對(duì)照BTT-1002還完全地將遷移阻止在1照ml",如圖8所示。實(shí)施例8重組全人源抗體BTT-1023相對(duì)于嵌合抗體BTT-1002改進(jìn)的藥代動(dòng)力學(xué)特性對(duì)兩個(gè)雌性狨(非人靈長(zhǎng)類)各靜脈團(tuán)注25mg/kgBTT-1023。給藥10分鐘、1、3、6、24、48、72和144小時(shí)后，收集血液樣本進(jìn)行BTT-1023濃度分析。用于定量分析物(BTT-1002或BTT-1023)在狨血清中濃度的時(shí)間分解免疫熒光分析，利用生物素綴合的分析物特異性兔多克隆抗體作為抗生物素蛋白鏈菌素涂布的微滴定板上的捕獲單元。這種多克隆抗體是通過(guò)用BTT-1002或BTT-1023多次免疫兔，收集血清和親和純化得到的抗BTT-1002或抗BTT-1023多克隆抗體而產(chǎn)生。利用銪綴合的二級(jí)抗體檢測(cè)結(jié)合的分析物。通過(guò)測(cè)量時(shí)間分解熒光(Victor3多標(biāo)簽計(jì)數(shù)器，PerkinElmerInc.)在615nm檢測(cè)該標(biāo)簽。焚光計(jì)數(shù)與樣本中存在的分析物多少直接相關(guān)。然后對(duì)比參照標(biāo)準(zhǔn)曲線分析樣本數(shù)據(jù)。采用非房室才莫型分析(non-compartmentalanalysis)確定藥物4戈謝動(dòng)力學(xué)參數(shù)。從利用BTT-1002進(jìn)行的類似研究中得到數(shù)據(jù)，其中對(duì)兩只雌狨中的每一只進(jìn)行40mg/kg的靜脈施用，當(dāng)與該數(shù)據(jù)相比較時(shí)，全人源VAP-1抗體顯示出改良的藥物代謝動(dòng)力學(xué)特性，包括改良的隨時(shí)間推移的血清濃度(AUC)性質(zhì)^J^長(zhǎng)的消除半衰期(表4)。表4.BTT-1023與BTT-1002藥代動(dòng)力學(xué)特性對(duì)比<table>tableseeoriginaldocumentpage36</column></row><table>*n=2的平均值實(shí)施例9全人源抗體的藥物組合物包括根據(jù)本發(fā)明的全人源抗VAP-l抗體的藥物組合物的實(shí)例，適合用于腸胃外給藥，其作為注射或作為輸注的溶液或者作為這種溶液的濃縮劑。1毫升中組成成分的百分?jǐn)?shù)0.1-10%0.5-1.5%0.1-2%0.1-2%0.5-10%0.01-1%至l毫升抗VAP-l抗體氯化鈉或氯化鉀二水合磷酸氫二鈉磷酸二氫鐘或鈉聚山梨酯20或80注射用水1毫升中組成成分的百分?jǐn)?shù)抗VAP-l抗體氯化鈉EDTA/DTPA甘露醇聚山梨酯20或80二水合檸檬酸鈉0.1-10%0.5-1.5%0.01-1.5%0.1-5%0.01-1%0.5-5%注射用水至l毫升實(shí)施例10全人源抗體在體內(nèi)炎癥模型中的療效全人源VAP-1抗體在恒河猴膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎中的治療療效在恒河猴中膠原誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎(CIA)的模型中評(píng)估全人源抗體的效果，其針對(duì)收集關(guān)于BTM023抗體在關(guān)節(jié)炎適應(yīng)癥中有效性的數(shù)據(jù)。研究選擇MHCA26陰性的成年恒河猴，其具有CIA發(fā)病率為99%,用牛II型膠原蛋白免疫。將10個(gè)動(dòng)物分為5個(gè)動(dòng)物一組的兩組。通過(guò)在動(dòng)物的背部10個(gè)點(diǎn)上注射弗氏完全佐劑中的3-5mg牛膠原誘發(fā)關(guān)節(jié)炎。使用這種方法免疫3-5周后關(guān)節(jié)炎在臨床上明顯且通常持續(xù)7-9周。當(dāng)連續(xù)兩個(gè)記錄檢測(cè)到CRP水平>20mg/L時(shí)，開(kāi)始四個(gè)星期的全人源抗體靜脈注射治療，每星期兩次劑量在1和50mg/kg之間。給對(duì)照動(dòng)物施以載體溶液。使用綜合臨床體評(píng)分(0=無(wú)關(guān)節(jié)炎臨床征兆，0.5=發(fā)燒(>0.5°C)，1=冷漠、活動(dòng)減少和食欲減退，2=體重下降、四肢和/或關(guān)節(jié)發(fā)熱、疼痛但沒(méi)有軟組織腫脹(STS)，3^中度發(fā)紅和關(guān)節(jié)STS、四肢靈活性正常，4^嚴(yán)重紅肺和關(guān)節(jié)STS，伴有關(guān)節(jié)僵直，5^關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重到建i義安樂(lè)死)，和CfA嚴(yán)重程度評(píng)分(軟組織腫脹的嚴(yán)重程度、靈活性和骨擦音以-到+++的尺度計(jì)分-無(wú)，±不確定，+中度，++嚴(yán)重，+++極端嚴(yán)重)評(píng)價(jià)動(dòng)物的健康狀況。所有這些參數(shù)結(jié)果是CIA嚴(yán)重程度的綜合臨床分?jǐn)?shù)，這是一個(gè)半定量衡量。全人源VAP-1抗體在治療人源化VAP-1鼠的膠原蛋白抗體誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎中的療效在內(nèi)皮表ii^VAP-l的轉(zhuǎn)基因小鼠中，全人源抗體對(duì)膠原蛋白抗體誘發(fā)性關(guān)節(jié)炎的療效可以被評(píng)價(jià)。通過(guò)注射抗體混合物，接著3天后腹膜內(nèi)注射脂多糖誘發(fā)迅速發(fā)展的關(guān)節(jié)炎。在第1、3和7天給小鼠靜脈注射劑量為3、10或30mgkg-'的全人源抗體。對(duì)照動(dòng)物接受載體?？梢燥@示出，37與對(duì)照相比，關(guān)節(jié)炎評(píng)分在統(tǒng)計(jì)上的顯著降低證明關(guān)節(jié)炎疾病的減少。VAP-1抗體在治療牛皮痺的人源化小鼠模型中的療效近來(lái)對(duì)人源化異種移植模型確立和驗(yàn)證已經(jīng)為增加對(duì)這一疾病的了解和測(cè)試新藥物療法提供了有用的工具(MckoloffBJ.ExpertOpln.Investig.Drugs.(1999)8:393-401)。在此模型中，將源于牛皮癬患者的非損傷全厚度皮膚活組織檢驗(yàn)，移植到約7-9周齡的重癥聯(lián)合免疫缺陷(SCID)麻醉小鼠，如前所述(Wrone-SmithT.等.丄Clin.Invest.(1996)98:1878-1887)。在誘發(fā)疾病前，允許這些動(dòng)物從外科手術(shù)恢復(fù)至少2-3周。從取自活檢并用抗原SEB(金黃色葡萄球菌腸毒素B)活化的血液樣本分離人外周血單核細(xì)胞(PBMC)。向異種移植物中靜脈注射或真皮內(nèi)注射活化的PBMC，誘發(fā)疾病。進(jìn)行靜脈注射或皮下注射全人源VAP-1抗體或載體。不同持續(xù)時(shí)間的預(yù)防和治療的劑量方案都是可能的。此外，在全人源VAP-1抗體治療后，可靜脈注射標(biāo)記的人T細(xì)胞，以便更詳細(xì)調(diào)查對(duì)細(xì)胞浸潤(rùn)的影響。在治療期結(jié)束時(shí)，處死小鼠并將移植物連同周圍的小鼠皮膚切除并在福爾馬林中固定或者在氮中速凍。進(jìn)行組織學(xué)和免疫組織化學(xué)，以便評(píng)定病理變化，像表皮厚度的變化、細(xì)胞浸潤(rùn)的變化、以及粘附分子表達(dá)的變化?？梢燥@示出，與對(duì)照相比，評(píng)分在統(tǒng)計(jì)上的顯著降低證明牛皮癬病的減少。全人源VAP-1抗體在治療炎性肝病中的治療效果，其中該炎性肝病由對(duì)VAP-1人源化小鼠施用CC14引起在由施用CCl4引起的小鼠肝纖維癥模型中評(píng)定全人源VAP-1抗體對(duì)炎性肝病和纖維化影響。對(duì)在內(nèi)皮表ii^VAP-1的轉(zhuǎn)基因小鼠腹腔注射12周的0.25ul/gCCU，每周兩次。廣泛的肝臟炎癥和瘢^J^展超過(guò)12個(gè)星期，但隨著停止注射CCU，瘢痕徹底消退。利用這一模型，全人源抗體靜脈內(nèi)給藥或者腹腔注射用藥劑量在1至25mg/kg之間，每周兩次，以防止損傷和消除現(xiàn)有纖維癥，其效果的研究通過(guò)肝臟中的病理和組織學(xué)變化計(jì)分?？梢燥@示出，與對(duì)照相比，得分在統(tǒng)計(jì)上的顯著降低證明疾病的減少。VAP-1抗體在麻醉兔急性心肌梗死模型中的治療效果對(duì)機(jī)械通氣的麻醉新西蘭白兔進(jìn)行左側(cè)胸廓切開(kāi)術(shù)。暴露心臟，分離并閉合左冠狀動(dòng)脈(LCA)。閉合開(kāi)始25分鐘后，靜脈注射全人源VAP-1抗體?？贵w給藥5分鐘后，除去閉合，然后再灌注該區(qū)域達(dá)6小時(shí)。用過(guò)量所使用的麻醉劑殺死動(dòng)物，切除心臟并用生理鹽水洗滌。再次閉合LCA，并用單星藍(lán)或伊文思藍(lán)灌注通過(guò)心臟，染色心肌但留下風(fēng)險(xiǎn)區(qū)域未被染色。冷凍心臟并將左心室切分為薄切片。用圖像分析系統(tǒng)測(cè)定總切面和危險(xiǎn)區(qū)域。然后將各切片用1%的氯化三苯四唑(TTC)溶液的磷酸鹽緩沖溶液孵育隨后在10%的中性緩沖的福爾馬林中孵育。有生機(jī)的心肌被TTC孵育染成紅色，且因此梗塞面積通過(guò)測(cè)量不染色組織面積確定，并裙束示為確定的危險(xiǎn)面積百分比?？梢燥@示出，與對(duì)照相比，危險(xiǎn)面積百分?jǐn)?shù)在統(tǒng)計(jì)上的顯著降低證明組織損傷的減少。VAP-1抗體在兔mBSAi秀發(fā)性關(guān)節(jié)炎中的治療效果溶解在生理鹽水中的甲基化牛血清白蛋白(mBSA)與等體積的弗氏完全佐劑混合，并制成乳液。通過(guò)兩次皮內(nèi)注射該乳劑免疫新西蘭白兔，該兩次相i巨14天。第二次免疫大約10天之后，從該動(dòng)物收集血清，并施行皮內(nèi)注射mBSA溶液。選擇顯示出陽(yáng)性皮膚反應(yīng)的動(dòng)物，并基于抗mBSAIgG的血清滴度將它們隨機(jī)分入治療組。第二次免疫后14天，僅在mBSA溶液注入右膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)之前進(jìn)行靜脈注射或皮下注射VAP-1抗體或載體。向每個(gè)動(dòng)物的左膝注射生理鹽水。在整個(gè)研究中每周一次或兩次實(shí)施VAP-1抗體或陰性對(duì)照注射。在整個(gè)研究中從誘發(fā)之日(0天)起，通過(guò)日常觀察和觸診觀察兔的39行為和外觀，并在指定的時(shí)間間隔記錄體重。通過(guò)對(duì)比發(fā)炎的(右側(cè))和非發(fā)炎的(左側(cè))膝蓋，在預(yù)先確定的時(shí)間點(diǎn)評(píng)價(jià)膝關(guān)節(jié)腫脹。在研究的實(shí)驗(yàn)部分結(jié)束時(shí)(21天)處死動(dòng)物。收集滑液以便測(cè)定總的白血球數(shù)量和蛋白質(zhì)含量。從每個(gè)動(dòng)物的膝蓋關(guān)節(jié)處解剖滑膜并在膝蓋骨的位置將其縱向分成兩個(gè)樣本。將一個(gè)在液氮中深冷凍以便測(cè)定VAP-1抗體和VAP-1表達(dá)，并將另一滑膜樣本和剩余膝關(guān)節(jié)組織固定在10%的中性緩沖福爾馬林中以便用蘇木素和伊紅(HE)和磷鎢酸蘇木精(PTAH)染色。用HE染色片評(píng)價(jià)炎癥反應(yīng)，和PTAH-染色片評(píng)價(jià)纖維蛋白在滑膜表面的沉積?？梢燥@示出，與對(duì)照相比，得分在統(tǒng)計(jì)上的顯著降低證明關(guān)節(jié)炎疾病的減少。總之，這些實(shí)施例表明，全人源抗VAP-1抗體保留了抗VAP-1抗體特異的VAP-1識(shí)別性能(實(shí)施例2和6),阻斷了白細(xì)胞通過(guò)內(nèi)皮的VAP-1依賴性遷移(實(shí)施例7)，并且與先前的抗VAP-1單克隆抗體相比具有改善的藥代動(dòng)力學(xué)特性(實(shí)施例8)。對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)顯而易見(jiàn)的是，隨著技術(shù)的進(jìn)步，發(fā)明的概念可以以不同的方式實(shí)施。該發(fā)明及其具體實(shí)施方案并不限于上述的例子，而可以在^又利要求范圍內(nèi)變化。權(quán)利要求1.抗VAP-1抗體重鏈多肽，其特征在于是全人源的。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的多肽，其中包括至少一種CDR氨基酸序列，其選自于由SEQIDNO:4至8及其保守序列變體組成的第一組，和/或由SEQIDNO:9至13及其保守序列變體組成的笫二組，和/或由SEQIDNO:14至18及其保守序列變體組成的笫三組。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的多肽，其包括氨基酸序列，選自于SEQIDNO:19至23及其保守序列變體。4.才艮據(jù)權(quán)利要求3所述的多肽，其包括在SEQIDNO47中描述的氨基酸序列或其保守序列變體。5.抗VAP-1抗體輕鏈多肽，其特征在于是全人源的。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的多肽，其中包括至少一種CDR氨基酸序列，其選自于，由SEQIDNO:27至31及其保守序列變體組成的第一組，和/或由SEQIDNO:32至36及其保守序列變體組成的第二組，和/或由SEQIDNO:37至41及其保守序列變體組成的第三組。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的多肽，其包括氨基酸序列，選自于SEQIDNO:42至46及其保守序列變體。8.才艮據(jù)權(quán)利要求7所述的多肽，其包括在SEQIDNO48中描述的氨基酸序列或其保守序列變體。9.抗VAP-1抗體，其特征在于是全人源的。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的抗體，包括根據(jù)權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的重鏈多肽，和根據(jù)權(quán)利要求5至8任一項(xiàng)所述的輕鏈多肽。11.根據(jù)權(quán)利要求9和10任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體片段是Fab、Fab'、F(ab')2、Fv或單鏈Fv。12.根據(jù)權(quán)利要求8至11任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體選自于8C10、8A4、3F10、5F12和4B3。13.根據(jù)權(quán)利要求8至12任一項(xiàng)所述的抗體，其中所述抗體是重組抗體。14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的抗體，其中所述抗體是BTT-1023。15.分離的編碼全人源抗VAP-1抗體重鏈的核酸分子。16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的核酸分子，其包括至少一種編碼CDR的DNA序列，該DNA序列選自于，由SEQIDNO:49至53及其保守序列變體組成的第一組，和/或由SEQIDNO:54至58及其保守序列變體組成的第二組，和/或由SEQIDNO:59至63及其保守序列變體組成的第三組。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的核酸分子，其包括核苷酸序列，選自于SEQIDNO:64至68及其保守序列變體。18.才艮據(jù)權(quán)利要求17所述的核酸分子，其包括在SEQIDNO89中描述的核苷酸序列或其保守序列變體。19.分離的編碼全人源抗VAP-1抗體輕鏈的核酸分子。20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的核酸，其包括至少一種編碼CDR的DNA序列，該DNA序列選自于，由SEQIDNO:69至73及其保守序列變體組成的第一組，和/或由SEQIDNO:74至78及其保守序列變體組成的第二組，和/或由SEQIDNO:79至83及其保守序列變體組成的第三組。21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的核酸分子，其包括核苷酸序列，選自于SEQIDNO:84至88及其保守序列變體。22.根據(jù)權(quán)利要求21所述的核酸分子，其包括在SEQIDNO90中描述的核苷酸序列或其保守序列變體。23.表達(dá)栽體，其包括根據(jù)權(quán)利要求15至22任一項(xiàng)所述的核酸序列。24.宿主細(xì)胞或有機(jī)體，其包括根據(jù)權(quán)利要求23所述的表達(dá)栽體。25.生產(chǎn)全人源抗VAP-1抗體的方法，其包括步驟a)用至少一種根據(jù)權(quán)利要求24所述的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化適合的宿主，b)在利于表達(dá)的條件下培養(yǎng)所述的宿主，以及c)從培養(yǎng)基中純化裝配好的全人源抗體。26.藥物組合物，包含根據(jù)權(quán)利要求8至14任一項(xiàng)所述的全人源抗VAP-1抗體。27.治療或診斷有需要的患者的VAP-1介導(dǎo)的炎性疾病的方法，所述方法包括向所述患者提供有效量的根據(jù)權(quán)利要求26所述的藥物組合物。28.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的炎性疾病選自于關(guān)節(jié)炎和結(jié)締組織疾病、炎性腸疾病、皮膚病、多發(fā)性硬化癥、炎癥性神經(jīng)病、炎性肌病、急性播散性腦脊髓炎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)血管炎、Sj6grens綜合癥、糖尿病、系統(tǒng)性紅斑狼齊、哞喘、炎癥性肝病、格雷夫斯病和甲狀腺炎。29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所迷的關(guān)節(jié)炎和結(jié)締組織疾病選自于反應(yīng)性關(guān)節(jié)病、感染后關(guān)節(jié)病、炎性多發(fā)性關(guān)節(jié)病、系統(tǒng)性結(jié)締組織病、炎性脊推病、肌炎、滑膜炎、賴特氏癥、血清陽(yáng)性類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、其他類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎，關(guān)節(jié)外類風(fēng)濕病、牛皮癉和腸病性關(guān)節(jié)病、少年關(guān)節(jié)炎、未明示的關(guān)節(jié)炎、結(jié)節(jié)性多動(dòng)脈炎和相關(guān)疾病、其他壞死性血管病變、皮多肌炎，系統(tǒng)性硬化癥，涉及全身性結(jié)締組織的其他疾病，強(qiáng)直性脊柱炎和其它炎性脊推病。30.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的炎性腸病選自于克羅恩氏病和潰瘍性結(jié)腸炎。31.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中所述的皮膚病選自于大皰性疾病、皮炎、丘滲鱗屑性疾病、紅斑、萎縮硬化性苜癬、外陰干皺癥、盤狀紅斑狼疳、硬斑病、天皰疳、類天皰疳、皰滲樣皮炎、特應(yīng)性皮炎、過(guò)敏性接觸性皮炎、刺激性接觸性皮炎、未明示的接觸性皮炎、牛皮癬、多形性紅斑。32.根據(jù)權(quán)利要求27所述的方法，其中所述的炎性疾病選自于動(dòng)脈粥樣硬化、眼部炎癥包括葡萄膜炎、虹膜炎、虹膜睫狀體炎、酒精性肝炎、同種異體移植，異種移植，腎小球腎炎，再灌注損傷以及心肌梗塞和中風(fēng)后的急性炎癥。全文摘要本發(fā)明公開(kāi)了新型全人源抗VAP-1抗體及其片段。還給出了編碼抗VAP-1抗體或其片段的核酸，以及為了重組表達(dá)抗VAP-1抗體而并入這些核酸的表達(dá)載體和宿主細(xì)胞。還公開(kāi)了包括所述抗體的藥物組合物及其治療用途。文檔編號(hào)C12N15/11GK101679523SQ200880020904公開(kāi)日2010年3月24日申請(qǐng)日期2008年4月17日優(yōu)先權(quán)日2007年4月20日發(fā)明者D·史密斯,J·瓦伊尼奧,J·米科拉,P·沃里奧,P·瓦伊尼奧申請(qǐng)人:生物結(jié)治療公司