專利名稱：：血凝素多肽中有變化的b型流感病毒的制作方法血凝素多肽中有變化的B型流感病毒
背景技術(shù)：
：流感病毒由包含分區(qū)段的單鏈RNA基因組的內(nèi)部核糖核蛋白核心和具有基質(zhì)蛋白襯里的外層脂蛋白包膜組成。A型流感病毒和B型流感病毒各含有8個(gè)區(qū)段的負(fù)極性單鏈RNA。B型流感病毒的8個(gè)基因座區(qū)段編碼ll種蛋白。最大的3種基因編碼RNA聚合酶的諸組分，PB1、PB2和PA。區(qū)段4編碼HA蛋白。區(qū)段5編碼NP。區(qū)段6編碼NA蛋白和NB蛋白。NA和NB這兩種蛋白均從雙順反mRNA的重疊讀框翻譯。B型流感病毒的區(qū)段7還編碼兩種蛋白M1和BM2。最小的區(qū)段編碼兩種產(chǎn)物NS1從全長(zhǎng)RNA翻譯，而NS2從剪接的mRNA變體翻譯。能產(chǎn)生流感病毒的特異性保護(hù)免疫應(yīng)答的疫苗已經(jīng)生產(chǎn)了50年以上。這些疫苗可表征為全病毒疫苗、裂解病毒疫苗、表面抗原疫苗和減毒的活病毒疫苗。雖然這些疫苗類型中任何一種的合適制劑均能產(chǎn)生全身性免疫反應(yīng)，但減毒的活病毒疫苗還能在呼吸道內(nèi)剌激局部粘膜免疫力。FluMist是一種減毒活疫苗，可保護(hù)兒童和成人不患流感(Belshe等，(1998)，"冷適應(yīng)的三價(jià)鼻內(nèi)減毒活流感疫苗對(duì)兒童的效應(yīng)"(Theefficacyofliveattenuated,cold-ad即ted，trivalent，intranasalinfluenzavirusvaccineinchildrerO，NEnglJMed338:1405-12;Nichol等，(1999)，"鼻內(nèi)減毒活流感疫苗對(duì)健康的、工作的成年人的效應(yīng)隨機(jī)對(duì)照臨床試驗(yàn)，，(Effectivenessoflive，atterumtedintranasalinfluenzavirusvaccineinhealthy,workingadults:arandomizedcontrolledtrial)，JAMA282:137-44)。FluMist疫苗株含有來(lái)源于當(dāng)前流行的野生型病毒株的HA和NA基因區(qū)段及來(lái)源于共同主供體病毒(commonmasterdonorvirus)(MDV)的六個(gè)基因區(qū)段。到目前為止，美國(guó)所有商品化流感疫苗都在含胚雞蛋內(nèi)繁殖。B型流感病毒的許多毒株在雞蛋中生長(zhǎng)不良，必須變得"適應(yīng)雞蛋"。然而，B型流感病毒對(duì)雞蛋的適應(yīng)性導(dǎo)致HA多肽的氨基酸殘基196或197處喪失N-連接的糖基化位點(diǎn)。N-連接的糖基化位點(diǎn)喪失影響病毒的抗原性以及相應(yīng)的疫苗效力。穩(wěn)定雞蛋中生長(zhǎng)的B型流感病毒中的N-連接糖基化位點(diǎn)對(duì)于B型流感病毒生產(chǎn)等意義重大。發(fā)明概述本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式包括制備B型流感病毒的方法。在B型流感病毒基因組中引入造成HA141位的氨基酸取代成精氨酸的突變。突變的B型流感病毒基因組在產(chǎn)生B型流感病毒的條件下復(fù)制。本發(fā)明的另一實(shí)施方式包括制備B型流感病毒的方法。將多個(gè)載體引入一群宿主細(xì)胞。所述載體包含對(duì)應(yīng)于以下的核苷酸序列(a)第一B型流感病毒株的至少6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段，和(b)至少第二B型流感病毒株中編碼HA和NA多肽的一個(gè)或多個(gè)基因組區(qū)段。HA多肽在氨基酸141處包含精氨酸。該宿主細(xì)胞群在不超過(guò)35t:的溫度培養(yǎng)。回收流感病毒。附圖簡(jiǎn)述圖1:pAD3000質(zhì)粒的示意圖。圖2:產(chǎn)生B型流感病毒的8個(gè)質(zhì)粒系統(tǒng)的示意圖。圖3A-D:A和B，通過(guò)RT-PCR表征重組MDV-B病毒；C和D，通過(guò)RT-PCR表征重組B/Yamanashi/166/98病毒。圖4A禾PB:GeneBank格式的pAD3000的序列(SEQIDNO:3)。圖5A-AE:MDV-B和8種質(zhì)粒的序列比對(duì)，A_E，PB1區(qū)段(SEQIDNO:4);F-J，PB2區(qū)段(SEQIDNO:5);K-O，PA區(qū)段(SEQIDNO:6);P_S，HA區(qū)段(SEQIDNO:7);T_W，NP區(qū)段(SEQIDNO:8);X-Z，NA區(qū)段(SEQIDNO:9);AA-AC，M區(qū)段(SEQIDNO:10);AD-AE，NS區(qū)段(SEQIDNO:11)。圖6:同時(shí)擴(kuò)增B型流感病毒株的HA和NA區(qū)段得到的RT-PCR產(chǎn)物。圖7:描述重組和重配病毒的相對(duì)滴度的柱狀圖。圖8:在PA、NP和M1蛋白中含有野生型殘基的三-基因重組體的示意圖。圖9:單-基因和雙_基因重組病毒的生長(zhǎng)列表。圖10:核蛋白中對(duì)應(yīng)于非-ts表型的氨基酸殘基的列表。圖11:描述重配病毒的差別復(fù)制的柱狀圖。灰框表示野生型氨基酸殘基。虛線表示截?cái)鄿囟?shut-offtemperature)(ts)為2.01og10。圖12:幾種雞蛋擴(kuò)增B型流感病毒株的196/197糖基化位點(diǎn)附近的HA序列的比對(duì)。Victoria譜系病毒與參比毒株B/Victoria/2/87(SEQIDNO:12)比對(duì)。Yamagata譜系病毒與B/Yamagata/16/88(SEQIDNO:13)病毒。比對(duì)中只顯示不同于參比毒株的殘基。下劃線和箭頭標(biāo)出了196/197位可能的N-糖基化位點(diǎn)(N-X-T/S)。"."表示B/Yamagata譜系中的氨基酸缺失。"x"表示混合氨基酸(mixedaminoacid)。圖13:通過(guò)蛋白質(zhì)印跡驗(yàn)證HA糖基化。用10%SDS-PAGE對(duì)具有所示196_199序列的B/Shanghai/361/02(B/SH)、6:2B/Jilin/20/03(B/幾)和6:2B/Jiangsu/10/03(B/JS)進(jìn)行電泳。利用多克隆抗HA抗體，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)HA1和HA2蛋白。下劃線表示病毒雞蛋分離物中存在的原始序列。圖14:在HA殘基141處含精氨酸的雞蛋培養(yǎng)的病毒保留殘基196-197處的糖基化(位點(diǎn))。在141和196/197處具有所示殘基的6:2B/Shanghai/361/02(B/SH)、6:2B/0hio/l/05(B/0hio)和6:2B/Jiangsu/10/03(B/JS)在雞蛋中培養(yǎng)，用10%SDS-PAGE對(duì)病毒進(jìn)行電泳。利用多克隆抗HA抗體，通過(guò)蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)HA1和HA2蛋白。遷移較慢的HA1表明196/197位點(diǎn)被糖基化，如*所示。下劃線表示病毒雞蛋分離物中存在的原始序列。詳述本發(fā)明包括通過(guò)將載體引入培養(yǎng)細(xì)胞而產(chǎn)生B型流感病毒的系統(tǒng)。該方法產(chǎn)生的B型流感病毒在特定位置可具有影響病毒在雞蛋中復(fù)制能力，或可影響病毒在雞蛋中復(fù)制后的特征的氨基酸殘基。除非另有定義，所有科學(xué)和技術(shù)術(shù)語(yǔ)應(yīng)理解為具有與本發(fā)明所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
常規(guī)使用的相同含義。出于本發(fā)明的目的，定義了以下術(shù)語(yǔ)。"核酸"、"多核苷酸"、"多核苷酸序列"和"核酸序列"可以是單鏈或雙鏈脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，或其嵌合體或類似物。這些術(shù)語(yǔ)還可以包括天然核苷酸類似物的聚合物，其具有天然核苷酸的本質(zhì)屬性，能夠以與天然產(chǎn)生核苷酸(如肽核酸)類似的方式雜交單鏈核酸(例如肽核酸)。"基因"指有生物功能的任何核酸。基因包括編碼序列和/或其表達(dá)所需的調(diào)節(jié)序列。"基因"可以指具體的基因組序列，也指基因組序列所編碼的cDNA或mRNA?；蜻€包括非表達(dá)的核酸區(qū)段，如形成其他蛋白的識(shí)別序列。非表達(dá)的調(diào)節(jié)序列包括"啟動(dòng)子"和"增強(qiáng)子"，調(diào)節(jié)蛋白如轉(zhuǎn)錄因子可與之結(jié)合從而轉(zhuǎn)錄毗鄰或附近的序列。"組織特異性"的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子是在某特定組織類型或細(xì)胞類型，或多種類型中調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子。"載體"可以是用于在微生物、細(xì)胞或細(xì)胞組分之間增殖和/或轉(zhuǎn)移核酸的工具。載體包括質(zhì)粒、病毒、噬菌體、原病毒、噬菌粒、轉(zhuǎn)座子和人工染色體等，載體可自主復(fù)制或整合到宿主細(xì)胞的染色體內(nèi)。載體還可以是裸RNA多核苷酸、裸DNA多核苷酸、由位于同一條鏈內(nèi)的DNA和RNA組成的多核苷酸、多聚賴氨酸偶聯(lián)的DNA或RNA、肽偶聯(lián)的DNA或RNA、脂質(zhì)體偶聯(lián)的DNA等，這些載體不能自主復(fù)制。"表達(dá)載體"可以是能啟動(dòng)表達(dá)以及復(fù)制摻入其中的核酸的載體，如質(zhì)粒。所表達(dá)的核酸可以"操作性連接"于啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子，并受到啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。"雙向表達(dá)載體"通常表征為相對(duì)于位于兩個(gè)啟動(dòng)子之間的核酸，在方向上相反的兩個(gè)備選啟動(dòng)子，從而可在任一方向開始表達(dá)以轉(zhuǎn)錄出正(+)或正義鏈和負(fù)(_)或反義鏈RNA。另夕卜，雙向表達(dá)載體可以是雙義載體，病毒mRNA和病毒基因組RNA(例如，cRNA)從同一條鏈上表達(dá)。當(dāng)"分離的"指生物學(xué)材料，例如核酸或蛋白質(zhì)時(shí)，其可以是基本上不含在其天然環(huán)境中與其正常相伴或相互作用的組分的生物材料。分離的材料還可以任選包含其天然環(huán)境，如細(xì)胞中不存在的材料。"重組體"可表示經(jīng)人工或合成(非天然)改變的材料(如核酸或蛋白)。這種改變可以對(duì)處于其天然環(huán)境或狀態(tài)，或從其天然環(huán)境或狀態(tài)中取出的材料進(jìn)行。重配病毒包括含有源自一種以上親本病毒株或來(lái)源的遺傳和/或多肽組分的病毒。例如，7:l重配株包含源于第一親本病毒的7個(gè)病毒基因組區(qū)段(或基因區(qū)段)和第二親本病毒的一個(gè)病毒基因組區(qū)段，如，編碼血凝素或神經(jīng)氨酸酶的區(qū)段。6:2重配株包含第一親本病毒的6個(gè)基因組區(qū)段，最常見的是6個(gè)內(nèi)部基因以及第二親本病毒的兩個(gè)基因組區(qū)段，例如血凝素和神經(jīng)氨酸酶(的編碼區(qū)段)。6:i:i重配株包含第一親本病毒的6個(gè)基因組區(qū)段(最常見的是6個(gè)內(nèi)部基因)、編碼血凝素的第二親本病毒的1個(gè)基因組區(qū)段和編碼神經(jīng)氨酸酶的第三親本病毒的l個(gè)基因組區(qū)段。所述6個(gè)內(nèi)部基因也可以是多個(gè)親本病毒的那些基因。弓I入載體或核酸可以指將核酸摻入真核或原核細(xì)胞中。載體或核酸可以通過(guò)摻入其基因組(例如，染色體、質(zhì)粒、質(zhì)體或線粒體DNA)而摻入細(xì)胞，可以轉(zhuǎn)化成自主復(fù)制子或者可以瞬時(shí)表達(dá)(例如，轉(zhuǎn)染mRNA)。引入包括諸如"感染"、"轉(zhuǎn)染"、"轉(zhuǎn)化"和"轉(zhuǎn)導(dǎo)"等方法。可通過(guò)電穿孔、磷酸鈣沉淀或脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(脂轉(zhuǎn)染)(lipofection)將核酸引入細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是含有異源核酸，如載體，并支持核酸復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲細(xì)胞、兩棲類動(dòng)物細(xì)胞、鳥類細(xì)胞或哺乳動(dòng)物細(xì)胞，包括人細(xì)胞。宿主細(xì)胞包括Vero細(xì)胞(非洲綠猴腎細(xì)胞)、Per.C6細(xì)胞(人胚胎視黃醛細(xì)胞)、BHK細(xì)胞(幼倉(cāng)鼠腎細(xì)胞)、原代雞腎細(xì)胞(PCK)、馬_達(dá)二氏(Madin-Darby)犬腎(MDCK)細(xì)胞、馬-達(dá)二氏牛腎(MDBK)細(xì)胞、293細(xì)胞(如293T細(xì)胞)和COS細(xì)胞(如C0S1、C0S7細(xì)胞)。術(shù)語(yǔ)宿主細(xì)胞還包括細(xì)胞的組合或混合物，如不同細(xì)胞類型或細(xì)胞系的混合培養(yǎng)物(例如，Vero和CEK細(xì)胞)。例如，2004年12月22日提交的PCT/US04/42669描述了電穿孔Vero細(xì)胞的共同培養(yǎng)。與33t:相比，B型流感病毒株的溫度敏感的(ts)病毒在37t:的滴度下降100倍或更多。冷適應(yīng)(ca)的病毒通常顯示25t:的生長(zhǎng)在其33t:生長(zhǎng)的100倍以內(nèi)。減毒的(att)病毒通常在雪貂的上呼吸道內(nèi)復(fù)制但在肺組織內(nèi)檢測(cè)不到，也不能引起動(dòng)物出現(xiàn)流感樣疾病。生長(zhǎng)是通過(guò)滴度、噬斑大小或形態(tài)、顆粒密度或本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的其他量度來(lái)表示的病毒量。人工改造的病毒、病毒核酸或病毒編碼產(chǎn)物，如多肽、疫苗是含有通過(guò)重組方法，如定向誘變、PCR誘變等引入至少一個(gè)突變的病毒、核酸或產(chǎn)物。含有一個(gè)或多個(gè)核苷酸突變和/或氨基酸取代的人工改造的病毒(或病毒成分或產(chǎn)物)指編碼病毒(或病毒成分或產(chǎn)物)的病毒基因組或基因組區(qū)段不是源自天然來(lái)源，如天然產(chǎn)生的或通過(guò)非重組方法(如在25t:下累進(jìn)傳代)制備的已有實(shí)驗(yàn)室病毒株，例如野生型的或冷適應(yīng)A/A皿Arbor/6/60或B/AnnArbor/1/66毒株。在本發(fā)明包括的一些方法中，可以將對(duì)應(yīng)于B型流感病毒的8個(gè)區(qū)段的每一個(gè)的病毒基因組區(qū)段插入多種載體以供操作和產(chǎn)生流感病毒。該多種載體可包括8種載體；包含對(duì)應(yīng)于一種或多種B型流感病毒的8個(gè)基因組區(qū)段的核酸序列的8種載體。該多種載體可包括更多或更少的載體。例如，該多種載體可包括11種載體；包含對(duì)應(yīng)于11種B型流感病毒蛋白編碼序列的核酸序列的11種載體?；蛘?，該多種載體可包括一種載體；包含一種或多種B型流感病毒的8個(gè)基因組區(qū)段的每一個(gè)的一種載體。該多種載體還可包括2、3、4、5、6、7、9或10種載體。載體可以是病毒載體、質(zhì)粒、粘粒、噬菌體或人工染色體。如果載體是質(zhì)粒，質(zhì)粒可以提供能夠在細(xì)菌和真核細(xì)胞中發(fā)揮功能的一個(gè)或多個(gè)復(fù)制起點(diǎn)，以及任選的標(biāo)記以便篩選或選擇摻入該質(zhì)粒序列的細(xì)胞。示例性的載體是圖l所示的pAD3000。如果載體是質(zhì)粒，該質(zhì)?？梢允请p向表達(dá)載體，該載體可以在任一方向上啟動(dòng)病毒基因組區(qū)段的轉(zhuǎn)錄，從而產(chǎn)生(+)鏈RNA和(_)鏈病毒RNA分子。為實(shí)現(xiàn)雙向轉(zhuǎn)錄，每個(gè)病毒基因組區(qū)段都插入到含有至少兩個(gè)獨(dú)立啟動(dòng)子的載體內(nèi)，這樣第一RNA聚合酶啟動(dòng)子(即PolI)可從一條鏈上轉(zhuǎn)錄病毒基因組RNA的拷貝，而第二RNA聚合酶啟動(dòng)子(即PolII)合成病毒mRNA。因此，兩個(gè)啟動(dòng)子以相反方向排列，側(cè)接至少一個(gè)適合插入病毒基因組RNA區(qū)段的克隆位點(diǎn)(即限制性內(nèi)切酶識(shí)別序列)，優(yōu)選獨(dú)特的克隆位點(diǎn)?；蛘?，可使用"雙義"載體，其中(+)鏈mRNA和(-)病毒RNA(例如，cRNA)從該載體的同一條鏈上轉(zhuǎn)錄。表達(dá)載體待表達(dá)的流感病毒基因組區(qū)段操作性連接于合適的轉(zhuǎn)錄控制序列(啟動(dòng)子)以介導(dǎo)mRNA合成。各種啟動(dòng)子都適用于表達(dá)載體中以調(diào)控流感病毒基因組區(qū)段的轉(zhuǎn)錄。在某些實(shí)施方式中，例如載體是質(zhì)粒pAD3000時(shí)，所用的啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)DNA依賴性RNA聚合酶II(PolII)啟動(dòng)子。如果需要，例如為了調(diào)控條件性表達(dá)，也可以用其他的啟動(dòng)子替換以誘導(dǎo)RNA在特定的條件下轉(zhuǎn)錄，或者在特定的組織或細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄。許多病毒和哺乳動(dòng)物，如人的啟動(dòng)子都可以使用，或者可根據(jù)特定的用途來(lái)分離。例如，從動(dòng)物和人病毒的基因組獲得的其它啟動(dòng)子包括腺病毒(如腺病毒2)、乳頭狀瘤病毒、乙型肝炎病毒、多瘤病毒和猿病毒40(SV40)的啟動(dòng)子以及各種逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子。哺乳動(dòng)物啟動(dòng)子包括肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子、免疫球蛋白啟動(dòng)子、熱激啟動(dòng)子等。另外，噬菌體啟動(dòng)子也可與同源的RNA聚合酶聯(lián)用，如T7啟動(dòng)子。任選通過(guò)包含增強(qiáng)子序列來(lái)增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。增強(qiáng)子一般較短，約10-500bp，是一種順式作用DNA元件，可與啟動(dòng)子一起增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄。已從哺乳動(dòng)物基因(血紅蛋白、彈性蛋白酶、白蛋白、甲胎蛋白和胰島素)和真核細(xì)胞病毒中分離了許多增強(qiáng)子序列。增強(qiáng)子可連接到載體中異源編碼序列的5'或3'位置，但是一般都插入到啟動(dòng)子的5'位。通常，選擇啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)序列(如果需要的話)來(lái)優(yōu)化異源DNA在其所引入的宿主細(xì)胞類型中的表達(dá)(Scharf等，(1994)"熱應(yīng)激啟云力子禾口轉(zhuǎn)錄因子"(Heatstresspromotersandtranscriptionfactors)ResultsProblCellDiffer20:125-62;Kriegler等，(1990)"增強(qiáng)子、啟動(dòng)子和剪接位點(diǎn)的裝配以控制轉(zhuǎn)移基因的表達(dá)"(Assemblyofenhancers,promoters,andsplicesignalstocontrolexpressionoftransferredgenes)MethodsinEnzymol185:512-27)。擴(kuò)增子還任選含有核糖體結(jié)合位點(diǎn)或內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)(IRES)以便于開始翻譯。本發(fā)明的載體還可包含轉(zhuǎn)錄終止以及穩(wěn)定mRNA所需的序列，如多聚腺苷酸位點(diǎn)或終止子序列。這種序列通常置于真核或病毒DNA或cDNA的5'非翻譯區(qū)，有時(shí)也置于3'非翻譯區(qū)。在一個(gè)實(shí)施方式中，例如涉及質(zhì)粒pAD3000的實(shí)施方式中，SV40多聚腺苷酸序列提供多聚腺苷酸信號(hào)。此外，如上所述，表達(dá)載體任選包含一個(gè)或多個(gè)可選擇的標(biāo)記基因以提供篩選轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞所需的表型性狀，除了前面所列基因外，標(biāo)記物如二氫葉酸還原酶或新霉素耐藥性都適于選擇真核細(xì)胞培養(yǎng)物。含上述合適DNA序列以及合適啟動(dòng)子或控制序列的載體可用于轉(zhuǎn)化允許蛋白表達(dá)的宿主細(xì)胞。其它表達(dá)元件編碼流感病毒蛋白的基因組區(qū)段可包括該區(qū)段表達(dá)所需的任何額外的序列。例如，可以包含特異性的起始信號(hào)以幫助有效翻譯異源編碼序列。這些信號(hào)包括，例如ATG起始密碼子及毗鄰序列。為了確保翻譯該基因組區(qū)段編碼的整個(gè)蛋白質(zhì)，起始密碼子插入相對(duì)于病毒蛋白的正確讀框內(nèi)。外源性轉(zhuǎn)錄元件和起始密碼子可以是各種來(lái)源，可以是天然的，也可以是合成的?？梢酝ㄟ^(guò)納入適于所用細(xì)胞系統(tǒng)的增強(qiáng)子來(lái)提高表達(dá)效率。編碼附加表達(dá)元件如信號(hào)序列、分泌或定位序列等額外的多核苷酸序列可以摻入載體，通常與感興趣的多核苷酸序列同框，從而，例如使多肽表達(dá)靶向所需的細(xì)胞隔室、膜或細(xì)胞器，或者分泌到細(xì)胞培養(yǎng)基中。這些序列是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，包括分泌前導(dǎo)肽、細(xì)胞器靶向性序列(如細(xì)胞核定位序列、ER滯留信號(hào)、線粒體轉(zhuǎn)運(yùn)序列)、膜定位/錨定序列(如停止運(yùn)送序列、GPI錨定序列)等。內(nèi)部基因組區(qū)段B型流感病毒株的內(nèi)部基因組區(qū)段可以是一種或多種主供體B型流感病毒的內(nèi)部基因組區(qū)段?？梢愿鶕?jù)疫苗給藥相關(guān)的所需特性選擇所述一種或多種主(供體)B型流感病毒。例如，可根據(jù)減毒表型、冷適應(yīng)性和/或溫度敏感性選擇主供體B型流感病毒株。就此而言，caB/A皿Arbor/1/66或摻入表17所列一種或多種氨基酸取代的人工改造的B型流感病毒株可以是主供體B型流感病毒株。這些氨基酸取代可以包括位于以下一處或多處的取代:PB2630;PA431;PA柳;NP55;NP"4;NP"。;NP509;M1159和Ml皿。所述氨基酸取代可以包括以下一個(gè)或多個(gè)PB263°(S630R);PA431(V431M);PA柳(Y497H);NP55(T55A);NP114(V114A);NP410(P410H);NP509(A509T);M1159(H159Q)和Ml183(M183V)。氨基酸取代可以包括位于以下全部位置的取代:PB263。;PA431;PA柳;NP55;NP"4;NP"。;NP509;M1咖和Ml皿。取代可以是以下全部PB263。(S630R);PA431(V431M);PA柳(Y497H);NP55(T55A);NP114(V114A);NP41。(P410H);NP509(A509T);M1159(H159Q)和Ml183(M183V)?？蓪⒁环N或多種主供體B型流感病毒株(即，PB1、PB2、PA、NP、NB、Ml、BM2、NS1和NS2)的6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段與在抗原性上理想的毒株，例如預(yù)期會(huì)導(dǎo)致明顯的局部或整體流感感染的毒株的血凝素和神經(jīng)氨酸酶區(qū)段聯(lián)合轉(zhuǎn)染入合適的宿主細(xì)胞。重配病毒在有效回收的合適溫度，例如等于或小于35t:，如約30°C-35t:、如約32°C-35t:、如約32°C_34"，或約3(TC、或約3rC、或約32"、、或約33"、或約34"或約35"下，在細(xì)胞培養(yǎng)物中復(fù)制后，回收重配病毒?；厥盏牟《究稍诤唠u蛋中復(fù)制?；厥盏牟《究梢栽谂囵B(yǎng)的細(xì)胞中復(fù)制。可利用變性劑，例如甲醛或e-丙內(nèi)酯滅活在含胚雞蛋或培養(yǎng)細(xì)胞中復(fù)制的回收病毒。屬性改變的B型流感病毒本發(fā)明方法還包括引入突變從而在HA位置141處形成氨基酸取代。與HA未取代的流感病毒相比，該突變可增強(qiáng)B型流感病毒在含胚雞蛋中復(fù)制的能力。HA位置141處的取代還允許流感病毒保留HA氨基酸殘基196/197處的糖基化。HA位置141處的取代還不會(huì)明顯改變HA的抗原性。HA位置141處的取代可以是取代精氨酸、組氨酸或半胱氨酸。與未修飾的流感病毒相比，在HA中引入氨基酸取代可將B型流感病毒在雞蛋中復(fù)制的能力增強(qiáng)至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%、或至少300%、或至少400%、或至少500%。在雞蛋中復(fù)制能力增強(qiáng)的病毒的滴度可以是至少5.01og10PFU/ml、至少6.01og10PFU/ml、至少6.51og10PFU/ml、至少7.01og10PFU/ml、至少7.251ogi。PFU/ml、至少7.51og1(lPFU/ml、至少7.751og1(lPFU/ml、至少8.01ogl。PFU/ml、至少8.251ogi。PFU/ml、至少8.51ogi。PFU/ml、至少8.751ogi。PFU/ml、至少9.01og1(lPFU/ml或至少9.51ogl。PFU/ml。與未修飾的流感病毒相比，在雞蛋中復(fù)制能力增強(qiáng)的B型流感病毒還保留了氨基酸殘基位置196/197處的HA糖基化。與未修飾的病毒相比，引入氨基酸取代還不會(huì)明顯改變?nèi)〈牧鞲胁《镜目乖?。取代的流感病毒的抗原性與未修飾病毒的差別小于5%、10%、20%、25%、30%、40%或50%。測(cè)定病毒抗原性的方法是本領(lǐng)域熟知的。引入導(dǎo)致HA殘基位置141處發(fā)生氨基酸取代的突變可調(diào)節(jié)HA的受體結(jié)合活性。HA的受體結(jié)合活性包括但不限于HA與存在于細(xì)胞表面糖蛋白或糖脂上的唾液酸殘基(例如，2，6-連接的唾液酸-半乳糖基部分[Siaa(2，6)Gal]和2，3_連接的唾液酸-半乳糖基部分[Siaa(2，3)Gal])結(jié)合。檢驗(yàn)HA結(jié)合的方法是本領(lǐng)域熟知的。引入導(dǎo)致HA殘基1419處發(fā)生氨基酸取代的突變可增強(qiáng)HA與[Siaa(2，3)Gal]部分結(jié)合。在本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的(例如)血細(xì)胞凝集試驗(yàn)(hemaagglutinationassay)中，與[Siaa(2，3)Gal]部分的結(jié)合增強(qiáng)至少10%、或至少20%、或至少30%、或至少40%、或至少50%、或至少60%、或至少70%、或至少80%、或至少90%、或至少100%、或至少200%。B型流感病毒變體還可具有以下一種或多種屬性，包括減毒、冷適應(yīng)、溫度敏感或它們的任何組合。B型流感病毒變體可以因摻入了主供體B型流感病毒，例如流感B/AnnArbor/1/66的內(nèi)部基因組區(qū)段而具有這些屬性中的一種或多種。所述B型流感病毒變體可以是包含在141位具有甘氨酸殘基的HA多肽的任何B型流感病毒。所述B型流感病毒HA多肽可以是以下流感病毒株的HA多肽B/Victoria/2/87、B/HongKong/330/01、B/Brisbane/32/02、B/Malaysia/2506/04、B/Hawaii/13/04、B/0hio/1/05、B/Yamagata/16/88、B/Yamanashi/166/98、B/Joharmesburg/5/99、B/Vicotria/504/00、B/Shanghai/361/02、B/Jilin/20/03或B/Florida/7/04。細(xì)胞培養(yǎng)在本發(fā)明包括的一些方法中，將多個(gè)載體引入宿主細(xì)胞。這些宿主細(xì)胞包括，例如Vero細(xì)胞、Per.C6細(xì)胞、BHK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、293細(xì)胞和COS細(xì)胞，包括293T細(xì)胞、C0S7細(xì)胞?；蛘?，可采用包括以上細(xì)胞系中兩種，例如MDCK細(xì)胞和293T或COS細(xì)胞的聯(lián)合培養(yǎng)，例如比例為1:1?？稍谶m合維持中性緩沖pH(例如，pH介于7.0-7.2之間)的受控濕度和(A濃度下，將細(xì)胞維持在合適的商品化培養(yǎng)基中，例如補(bǔ)加了血清(如，10%胎牛血清)的Dulbecco改進(jìn)的Eagle培養(yǎng)基，或維持在無(wú)血清培養(yǎng)基中。培養(yǎng)基任選含有抗生素(例如，青霉素、鏈霉素等)以防止細(xì)菌生長(zhǎng)，和/或額外的營(yíng)養(yǎng)物，例如L-谷氨酰胺、丙酮酸鈉、非必需氨基酸，額外的添加劑以促進(jìn)生長(zhǎng)特征，例如胰蛋白酶、P-巰基乙醇等。培養(yǎng)哺乳動(dòng)物細(xì)胞的方法已廣為報(bào)道，本領(lǐng)域技術(shù)人員知道這些方法。通用方法見，例如Freshney(1983)《動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)基本技術(shù)手冊(cè)》(CultureofAnimalCells:Ma麗lofBasicTechnique)，ARL公司(AlanR.Liss)，紐約；Paul(1975)《細(xì)胞與組織培養(yǎng)》(CellandTissueCulture)，第5版，利文斯頓公司(Livingston)，愛丁堡；Adams(1980)《生物化學(xué)家用于細(xì)胞培養(yǎng)的生物化學(xué)和分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室技術(shù)》(XaboratoryTechniquesinBiochemistryandMolecularBiology_CellCultureforBiochemists)，Work和Burdon(編)Elsevier，阿姆斯特丹。體外生產(chǎn)流感病毒的特別感興趣的組織培養(yǎng)方法的細(xì)節(jié)見，例如Merten等，(1996)"在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生用于疫苗制備的流感病毒，，(Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepr印aration).刊于Cohen和Shafferman(編)《疫苗設(shè)計(jì)和生產(chǎn)的新方案》(NovelStrategiesinDesignandProductionofVaccines)，其通過(guò)弓l用全文纟內(nèi)入本文。此夕卜，通過(guò)常規(guī)實(shí)驗(yàn)不難確定適用于本發(fā)明的這些方法的改變形式。可在含血清或無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)生產(chǎn)B型流感病毒的細(xì)胞。在一些情況中，例如為制備純化的病毒，在無(wú)血清條件下培養(yǎng)宿主細(xì)胞是理想的?？梢匀魏我?guī)模培養(yǎng)細(xì)胞。細(xì)胞可采用小規(guī)模，例如25ml以下培養(yǎng)基，在培養(yǎng)管或培養(yǎng)瓶或大培養(yǎng)瓶中振蕩培養(yǎng)，在轉(zhuǎn)瓶中，或在培養(yǎng)瓶、瓶或反應(yīng)器中的微載體珠(如DEAE-Dextran微載體珠，如多姆賽爾公司(Dormacell)、PL公司(Pfeifer&Langen);超級(jí)珠(Superbead)，F(xiàn)L公司(FlowLaboratories);苯乙烯共聚物-三-甲胺珠，如喜力公司(Hillex)，索赫爾公司(Solohill)，AA公司(AnnArbor))上培養(yǎng)。微載體珠是一種小球(直徑為100-200微米)，為單位體積細(xì)胞培養(yǎng)液中的粘附細(xì)胞生長(zhǎng)提供大的表面積。例如，l升培養(yǎng)基可包含2千萬(wàn)以上的微載體珠，提供超過(guò)8000mi^的生長(zhǎng)表面。對(duì)于病毒的商品化生產(chǎn)，如疫苗生產(chǎn)，在生物反應(yīng)器或發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)細(xì)胞是理想的。可用的生物反應(yīng)器的體積可自l升以下到IOO升以上，如明尼蘇達(dá)州明內(nèi)通卡的奧斯莫尼克公司(Osmonics，Minnetonka，MN)的Cyto3生物反應(yīng)器;新澤西州埃迪遜NBS公司(NewBrunswickScientific,Edison，N.J.)的NBS生物反應(yīng)器；德國(guó)梅爾蘇根BBBI公司(B.Bra皿Biotechlnternational，B.Bra皿Biotech,Mels皿gen，Germany)的實(shí)驗(yàn)室禾口商品化規(guī)模的生物反應(yīng)器。不論培養(yǎng)體積的大小，培養(yǎng)可維持在小于或等于35t:、小于或等于34t:、小于或等于33t:、小于或等于32t:、小于或等于3rC、或小于或等于3(TC的溫度下?？蓪⒓?xì)胞培養(yǎng)約30°C-35。C、約32。C-35。C、約32。C-約34。C、或約32。C-33。C的溫度下。將載體引入宿主細(xì)胞可按照本領(lǐng)域熟知的方法將包含對(duì)應(yīng)于流感病毒基因組區(qū)段的核苷酸序列的載體引入(如轉(zhuǎn)染)宿主細(xì)胞，這些方法包括，例如鈣磷酸鹽共沉淀法、電穿孔、微注射、脂質(zhì)轉(zhuǎn)染和利用多胺轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染。例如，可按照廠家的使用說(shuō)明書，利用多胺轉(zhuǎn)染試劑TransIT-LTl(麥樂斯公司(Mirus))將載體如質(zhì)粒引入宿主細(xì)胞，如COS細(xì)胞、293T細(xì)胞或者COS或293T細(xì)胞與MDCK細(xì)胞的組合?？捎迷?60y1培養(yǎng)基中稀釋的約2y1TransIT-LTl將約1yg的各載體引入宿主細(xì)胞群，總體積為200yl。DNA:轉(zhuǎn)染試劑混合物在室溫下溫育45分鐘，然后加入800ii1培養(yǎng)基。將轉(zhuǎn)染混合物加入宿主細(xì)胞，如上所述培養(yǎng)?；蛘撸部刹捎秒姶┛讓瑢?duì)應(yīng)于流感病毒基因組區(qū)段的核苷酸序列的載體引入宿主細(xì)胞。例如，可根據(jù)以下流程，采用電穿孔將包含對(duì)應(yīng)于B型流感病毒基因組區(qū)段的核苷酸序列的質(zhì)粒載體引入Vero細(xì)胞。將在添加了10%胎牛血清(FBS)的改進(jìn)Eagle培養(yǎng)基(MEM)中培養(yǎng)的5Xl(f個(gè)Vero細(xì)胞重懸于0.4mlOptiMEM中，置于電穿孔杯內(nèi)。將體積最多為25iU的20微克DNA加入到含細(xì)胞的杯中，然后輕叩以輕柔地混合。按照廠家的使用說(shuō)明書(例如，連接有加強(qiáng)型電容增量器的BR基因脈沖儀II(BioRadGenePulserIIwithCapacitanceExtenderPlusconnected))進(jìn)行電穿孑L300伏、950微法，時(shí)間常數(shù)為28-33毫秒。通過(guò)溫和敲打再混合細(xì)胞，電穿孔后約1-2分鐘將0.7ml含10%FBS的MEM直接加入小杯內(nèi)。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到標(biāo)準(zhǔn)6孔組織培養(yǎng)板的2個(gè)孔內(nèi)，孔內(nèi)含2mlMEM+10%FBS或無(wú)血清的OPTI-MEM。洗滌小杯以回收任何剩余的細(xì)胞，洗滌懸液分成兩孔。終體積約為3.5ml。然后在適合病毒生長(zhǎng)的條件下溫育細(xì)胞?；厥詹《究蓮囊岩攵鄠€(gè)載體的細(xì)胞的培養(yǎng)液中回收病毒。先得到粗制的培養(yǎng)液并進(jìn)行澄清，再濃縮澄清的培養(yǎng)液中的流感病毒。常用的濃縮方法包括過(guò)濾、超濾、硫酸鋇吸附和洗脫以及離心。例如，首先可在例如1000-2000Xg離心足夠時(shí)間，如10到30分鐘來(lái)澄清受感染培養(yǎng)物的粗制培養(yǎng)液以去除細(xì)胞碎片和其它大顆粒物質(zhì)?；蛘?，培養(yǎng)液可經(jīng)0.8iim的醋酸纖維素濾器過(guò)濾以除去完整的細(xì)胞和其它大顆粒物質(zhì)。然后任選離心澄清的培養(yǎng)液上清以沉淀流感病毒，如以15，OOOXg離心約3-5小時(shí)。將病毒團(tuán)重懸浮在合適的緩沖液中，如STE(O.01MTris-HCl;0.15MNaCl;0.0001MEDTA)或pH7.4的磷酸緩沖鹽水(PBS)中后，利用蔗糖(60%-12%)或酒石酸鉀(50%-10%)密度梯度離心濃縮病毒。持續(xù)或分步離心都合適，如12%_60%的蔗糖梯度，4步，每步12%。梯度離心時(shí)要有足夠的轉(zhuǎn)速和時(shí)間以使病毒濃縮成可見的條帶以供回收?；蛘?，對(duì)于大規(guī)模商品化應(yīng)用，可利用持續(xù)模式操作的區(qū)帶離心機(jī)從密度梯度淘選病毒。以下文獻(xiàn)提供了足以指導(dǎo)技術(shù)人員從組織培養(yǎng)物中制備流感病毒的其它細(xì)節(jié)例如，F(xiàn)urminger，"疫苗制備"(VaccineProduction)，刊于Nicholson等(編)，《流感病毒教科書》(TextbookofInfluenza)，第324-332頁(yè);Merten等，(1996)"在細(xì)胞培養(yǎng)物中制備流感病毒用于疫苗的制備"(Productionofinfluenzavirusincellculturesforvaccinepreparation)，干lj于Cohen禾口Shafferman(編)，《疫苗設(shè)計(jì)禾口制備的新方案》(NovelStrategiesinDesignandProductionofVaccines),141-151頁(yè)；以及美國(guó)專利5，690，937號(hào)。如果需要，回收的病毒還可以在有作為穩(wěn)定劑的蔗糖_磷酸鹽_谷氨酸鹽(SPG)存在下保存于-80°C。預(yù)防件給予疫苗的方法和飽合物本發(fā)明的重組和重配病毒可以用合適的運(yùn)載體或賦形劑預(yù)防性給予以剌激一種或多種流感病毒株的特異性免疫反應(yīng)。所述運(yùn)載體或賦形劑可以是藥學(xué)上可接受的運(yùn)載體或賦形齊U，如無(wú)菌水、水性鹽溶液、水性緩沖鹽溶液、水性葡萄糖溶液、水性甘油溶液、乙醇、未感染雞蛋的尿囊液(即正常的尿囊液"NAF")或它們的組合?？砂凑毡绢I(lǐng)域已知的方法制備確保無(wú)菌、pH、等滲性和穩(wěn)定性的這種溶液。運(yùn)載體或賦形劑的選擇通常應(yīng)盡可能降低變態(tài)反應(yīng)或其它不良反應(yīng)，并且適合特定的給藥途徑，如皮下、肌肉、鼻內(nèi)等。本發(fā)明的流感病毒的給予量通常足以剌激一種或多種流感病毒株的特異性免疫反應(yīng)。本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知激發(fā)抵御一種或多種流感病毒株的保護(hù)性免疫反應(yīng)的劑量和方法。例如，滅活的流感病毒的給藥劑量約為l-1000HID5。(人感染劑量)，即每個(gè)劑量給予約105_108pfu(噬斑形成單位)。或者，約10-50yg，如約15iigHA不添加佐劑給予，而更低的劑量要用佐劑給予。一般可在該范圍內(nèi)根據(jù)年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、給藥時(shí)間以及其它臨床因素調(diào)整劑量。預(yù)防性疫苗制劑可以用針頭和注射器，或者無(wú)針注射裝置通過(guò)例如皮下或肌肉注射而全身性給予。或者，疫苗制劑還可通過(guò)滴劑、大顆粒氣溶膠(大于約10微米)鼻內(nèi)給予，或者可噴入上呼吸道。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，可利用減毒的活病毒疫苗，例如減毒的、冷適應(yīng)的和/或溫度敏感的重組或重配流感病毒。雖然優(yōu)選利用單劑量來(lái)剌激保護(hù)性免疫反應(yīng)，但是通過(guò)相同或不同給藥途徑給予額外劑量也可以實(shí)現(xiàn)所需的保護(hù)效果。或者，可用流感病毒離體或體內(nèi)靶向樹突狀細(xì)胞來(lái)剌激免疫反應(yīng)。例如，可使增殖的樹突狀細(xì)胞以足夠的用量和足夠的時(shí)間與病毒接觸以使樹突狀細(xì)胞捕獲流感病毒抗原。然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)靜脈內(nèi)移植方法將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到經(jīng)免疫的對(duì)象體內(nèi)。預(yù)防性或治療性治療流感的制劑中可存在一種或多種B型流感病毒。一種制劑可包含一種B型流感病毒。一種制劑可包含一種B型流感病毒和一種A型流感病毒。一種制劑可包含一種B型流感病毒和兩種A型流感病毒。一種制劑中可包含兩種B型流感病毒和兩種A型流感病毒。一種制劑中可包含兩種B型流感病毒。制劑中的至少一種B型流感病毒可在氨基酸殘基141處包含精氨酸。保護(hù)性給予流感病毒或其亞單位的制劑還可以包含一種或多種佐劑以增強(qiáng)針對(duì)流感病毒抗原的免疫反應(yīng)。合適的佐劑包括皂甙、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普朗尼克多元醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、桿菌卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌(Corynebacteri咖par權(quán))以及合成的佐劑QS-21禾口MF59。預(yù)防性給予流感病毒的制劑可以與一種或多種免疫剌激分子聯(lián)用。免疫剌激分子包括具有免疫剌激、免疫增強(qiáng)和促炎活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，例如，白介素(如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-12、IL-13);生長(zhǎng)因子(如粒細(xì)胞_巨噬細(xì)胞(GM)-集落剌激因子(CSF));和其它免疫剌激分子，如巨噬細(xì)胞炎癥因子、Flt3配體、B7.1、B7.2等。免疫剌激分子可以和流感病毒在同一種制劑內(nèi)給予，也可以分別給予。可以給予蛋白質(zhì)或編碼蛋白質(zhì)的表達(dá)載體以產(chǎn)生免疫剌激效應(yīng)。在另一個(gè)實(shí)施方式中，可以聯(lián)用上述合適的藥物運(yùn)載體或賦形劑與包含對(duì)應(yīng)于流感病毒基因組區(qū)段的核苷酸序列的本發(fā)明載體將異源核酸引入宿主生物或宿主細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物細(xì)胞，如來(lái)源于人對(duì)象的細(xì)胞?？蓪愒春怂岵迦牖蚧蚧騾^(qū)段的非必需區(qū)。異源多核苷酸序列可編碼多肽或肽，或者RNA，如反義RNA或核酶。然后通過(guò)制備摻入了異源核酸的重組病毒而將該異源核酸引入宿主或宿主細(xì)胞，如上所述給予病毒?；蛘?，可通過(guò)將載體共轉(zhuǎn)染入感染了流感病毒的細(xì)胞而將包含異源核酸的本發(fā)明載體引入宿主細(xì)胞并在其中表達(dá)。然后任選將細(xì)胞回輸或遞送給該對(duì)象，一般是遞送到獲得細(xì)胞的部位。在一些應(yīng)用中，可采用已有的細(xì)胞轉(zhuǎn)移或移植方法將這些細(xì)胞移植到感興趣的組織、器官或系統(tǒng)部位(如上所述)上。例如，可采用標(biāo)準(zhǔn)遞送或輸注技術(shù)將造血細(xì)胞系的干細(xì)胞，如骨髓、臍帶血或外周血來(lái)源的造血干細(xì)胞遞送至對(duì)象。或者，可將含異源核酸的病毒遞送至對(duì)象體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)。這種方法可包括將載體顆粒給予靶細(xì)胞群(例如，血細(xì)胞、皮膚細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)(包括腦)細(xì)胞、腎細(xì)胞、子宮細(xì)胞、肌肉細(xì)胞、腸細(xì)胞、宮頸細(xì)胞、陰道細(xì)胞、前列腺細(xì)胞等；以及源自各種細(xì)胞、組織、器官的腫瘤細(xì)胞)?？赏ㄟ^(guò)例如靜脈給予病毒顆粒，也可以通過(guò)各種方法，包括注射(利用針頭或注射器)、無(wú)針疫苗遞送、局部給藥或推入組織、器官或皮膚部位而病毒顆粒直接遞送到一個(gè)或多個(gè)感興趣的部位。例如，病毒載體顆粒可通過(guò)吸入、口服、靜脈內(nèi)、皮下、真皮下、真皮內(nèi)、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)、氣管內(nèi)、經(jīng)陰道或直腸給藥，或者在例如手術(shù)過(guò)程中將病毒顆粒置于身體的腔隙或其它部位而遞送。本發(fā)明的方法和病毒可用于治療性或預(yù)防性治療多種疾病，包括遺傳性和獲得性疾病，例如作為病毒、細(xì)菌等所致疾病的疫苗。試劑盒為了便于使用本發(fā)明的載體和流感病毒，可為實(shí)驗(yàn)或治療目的而將任何這些載體和病毒，以及用于包裝和感染的其它組分，例如緩沖液、細(xì)胞、培養(yǎng)基包裝成試劑盒的形式。除上述組分外，試劑盒可包含其它材料，例如實(shí)施本發(fā)明方法的使用說(shuō)明書、包裝材料和容器。病毒核酸和g白質(zhì)的操作就本發(fā)明而言，可根據(jù)已知的分子生物學(xué)技術(shù)操作流感病毒核酸和/或蛋白質(zhì)。許多這種方法，包括擴(kuò)增、克隆、誘變、轉(zhuǎn)化等的詳細(xì)方案描述于以下文獻(xiàn)Ausubel等，《最新分子生物學(xué)技術(shù)》(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(2000年增補(bǔ))，約翰威利父子公司(JohnWiley&Sons)，紐約(〃Ausubel");Sambrook等，《分子克隆-實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)》(MolecularCloning-ALaboratoryManual)(第二版)，1-3巻，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，冷13泉港，紐約，1989("Sambrook");以及Berger和Kimmel《分子克隆技術(shù)指導(dǎo)，酶學(xué)方法》(GuidetoMolecularCloningTechniques,MethodsinEnzymology)，152巻，學(xué)術(shù)出片反社(AcademicPress,Inc.)，圣迭戈，加利福尼亞州(〃Berger")。除了上述文獻(xiàn)外，其它可用于擴(kuò)增本發(fā)明的cDNA探針的體外擴(kuò)增技術(shù)方案，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)、連接酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(LCR)、QP-復(fù)制酶擴(kuò)增以及其它RNA聚合酶介導(dǎo)的技術(shù)(如NASBA)可見Mullis等，(1987)美國(guó)專利4，683，202號(hào)；《PCR方案-方法和應(yīng)用指導(dǎo)》(PCRProtocolsAGuidetoMethodsandApplications)(Innis等編)，學(xué)術(shù)出版社，圣迭戈，加利福尼亞州(1990)(〃Innis");Arnheim和Levinson(1990)C&EN36;TheJournalO皿HResearch(1991)3:81;Kwoh等，(1989)ProcNatlAcadSciUSA86,1173;Guatelli等，(1990)ProcNatlAcadSciUSA87:1874;Lomell等，(1989)JClinChem35:1826山Emdegren等，(1988)Science241:1077;V肌B進(jìn)t(1990)Biotechnology8:291;Wu和Wallace(1989)Gene4:560;Barringer等，(1990)Gene89:117以及Sooknanan和Malek，(1995)Biotechnology13:563。可用于克隆本發(fā)明核酸的其它方法包括Wallace等的美國(guó)專利第5，426，039號(hào)。通過(guò)PCR擴(kuò)增大核酸的改進(jìn)方法總結(jié)于Cheng等，(1994)Nature369:684及其參考文獻(xiàn)?？衫酶鞣N固相技術(shù)合成某些本發(fā)明的多核苷酸，例如寡核苷酸，包括基于單核苷酸_和/或三核苷酸_的亞磷酰胺耦合化學(xué)方法。例如，可通過(guò)將活化的單體和/或三聚體順序添加到延伸的多核苷酸鏈上來(lái)合成核酸序列。參見Caruthers，M.H.等，(1992)MethEnz，ol211:3。除了合成所需序列外，還可以從各種商業(yè)來(lái)源定制基本上任何核酸序列，如MCRC公司(MidlandCertifiedReagentCompany,mcrc@oligos.com)，GAGC公司(TheGreatAmericanGeneCompany,www.genco.com)，EG公司(ExpressGen，Inc.，www.expressgen.com)，0T公司(OperonTechnologies,Inc.，www.operon.com)禾口許多其它公司。此外，可通過(guò)例如定點(diǎn)誘變來(lái)取代病毒多肽上指定的氨基酸。例如，可通過(guò)將特異性突變引入編碼病毒多肽的病毒核酸片段來(lái)制備含有在功能上與表型特征，如減毒表型、冷適應(yīng)、溫度敏感性相關(guān)的氨基酸取代的病毒多肽。定點(diǎn)誘變的方法是本領(lǐng)域熟知的，參見例如Ausubel、Sambrook和Berger，同上。執(zhí)行定點(diǎn)誘變的許多試劑盒可商品化購(gòu)得，如拉霍亞斯特拉塔基因公司的卡梅隆定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?ChameleonSiteDirectedMutagenesisKit，Stratagene，LaJolla)，可按照廠家的使用說(shuō)明書將表6或表17中所述的一個(gè)或多個(gè)氨基酸取代分別引入編碼A或B型流感病毒多肽的基因組區(qū)段。具體實(shí)施例方式1.—種制備在雞蛋中復(fù)制增強(qiáng)的HA糖基化B型流感病毒的方法，包括(a)將導(dǎo)致HA位置141處的氨基酸取代為精氨酸的突變引入B型流感病毒基因組；和(b)在產(chǎn)生B型流感病毒的條件下復(fù)制該突變的流感病毒基因組。2.如實(shí)施方式2的方法，其中通過(guò)定點(diǎn)誘變實(shí)施引入步驟。3.—種制備在雞蛋中復(fù)制增強(qiáng)的HA糖基化B型流感病毒的方法，包括(a)將多個(gè)載體引入一群宿主細(xì)胞，所述載體包含對(duì)應(yīng)于以下的核苷酸序列(i)第一B型流感病毒株的至少6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段；禾口(ii)至少第二B型流感病毒株的編碼HA和NA多肽的一個(gè)或多個(gè)基因組區(qū)段，其中所述HA多肽在氨基酸殘基141處包含精氨酸；(b)在不超過(guò)35t:的溫度下培養(yǎng)該群宿主細(xì)胞；禾口(c)回收流感病毒。4.如實(shí)施方式3的方法，還包括在步驟(i)之前在所述多個(gè)載體的一個(gè)載體中引入突變；其中該一個(gè)載體包含對(duì)應(yīng)于編碼HA的基因組區(qū)段的核苷酸序列，禾口其中該突變導(dǎo)致氨基酸殘基141處為精氨酸。5.如實(shí)施方式3或4的方法，其中所述第一B型流感病毒具有以下屬性之一溫度敏感性、減毒或冷適應(yīng)性。6.如實(shí)施方式3-5中任一項(xiàng)的方法，其中，所述第一B型流感病毒包含以下氨基酸殘基PB2630(630R);PA431(431M);PA497(497H);NP55(55A);NP114(114A);NP410(410H);NP510(510T);M1159(159Q)和M1183(183V)。7.如實(shí)施方式6的方法，還包括以下步驟在所述多個(gè)載體的載體中引入突變；其中所述載體包含對(duì)應(yīng)于所述第一B型流感病毒株的6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段的核苷酸序列，和其中該突變導(dǎo)致存在以下氨基酸殘基PB2630(630R);PA431(431M);PA497(497H);NP55(55A);NP114(114A);NP410(410H);NP510(510T);M1159(159Q)禾口M1183(183V)。8.如實(shí)施方式3-7中任一項(xiàng)的方法，其中所述第一B型流感病毒是病毒株B/AnnArbor/1/66。9.如實(shí)施方式3-8中任一項(xiàng)的方法，其中所述細(xì)胞是以下一種Vero細(xì)胞、Per.C6細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PCK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、293細(xì)胞或COS細(xì)胞。10.如實(shí)施方式3-9中任一項(xiàng)的方法，其中所述載體是質(zhì)粒。11.如實(shí)施方式3-10中任一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)載體包含8質(zhì)粒組，其中該8質(zhì)粒各自包含對(duì)應(yīng)于所述第一或第二B型流感病毒株的不同基因組區(qū)段的核苷酸序列。12.如實(shí)施方式3-11中任苷酸序列。13.如實(shí)施方式3-12中任14.如實(shí)施方式3-13中任述引入步驟。15.如實(shí)施方式3-14中任16.如實(shí)施方式3-15中任17.如實(shí)施方式3-16中任其中利用雞蛋復(fù)制的流感病毒保留HA氨基酸殘基位置196/197糖基化位點(diǎn)；禾口其中所述流感病毒用雞蛋復(fù)制到至少7.OloglOPFU/ml的峰值滴度。18.通過(guò)實(shí)施方式1-17中任一項(xiàng)的方法制備的B型流感病毒。一項(xiàng)的方法，其中所述多個(gè)載體中各質(zhì)粒包含所有的核一項(xiàng)的方法，其中該方法不包括利用輔助病毒。一項(xiàng)的方法，其中通過(guò)脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔實(shí)施所一項(xiàng)的方法，其中所述溫度介于30-35t:之間。一項(xiàng)的方法，其中所述溫度介于32-35t:之間。一項(xiàng)的方法，還包括利用雞蛋復(fù)制回收的流感病毒；19.—種免疫原性組合物，其包含實(shí)施方式18的B型流感病毒。20.—種疫苗，其包含實(shí)施方式19的B型流感病毒。21.如實(shí)施方式20的疫苗，其適合于鼻內(nèi)給藥。22.如實(shí)施方式3-17中任一項(xiàng)的方法，還包括殺傷所述回收的病毒。23.如實(shí)施方式1或2所述的方法，還包括a)回收流感病毒；禾口b)殺傷回收的病毒。24.—種減毒的活B型流感病毒疫苗，其包含通過(guò)實(shí)施方式1-17中任一項(xiàng)的方法制備的病毒。24.—種治療對(duì)象的病毒感染的方法，包括給予該對(duì)象通過(guò)實(shí)施方式1-17中任一項(xiàng)的方法制備的病毒，其給予量足以產(chǎn)生抵御該病毒感染的免疫反應(yīng)。實(shí)施例實(shí)施例1:構(gòu)建pAD3000修飾質(zhì)粒pHW2000(Hoffmann等(2000)"從8個(gè)質(zhì)粒產(chǎn)生A型流感病毒的DNA轉(zhuǎn)染系統(tǒng)"(ADNAtransfectionsystemforgenerationofinfluenzaAvirusfromeightplasmids)ProcNatlAcadSciUSA97:6108-6113)，用猿病毒40(SV40)來(lái)源的多聚腺苷酸信號(hào)序列替代牛生長(zhǎng)激素(BGH)多聚腺苷酸信號(hào)。利用下列寡核苷酸，以T叫MasterMix(快而精公司(Qiagen))擴(kuò)增SV40來(lái)源的序列，方向指定為5'到3，polyA.1:AACAATTGAGATCTCGGTCACCTCAGACATGATAAGATACATTGATGAGT(SEQIDN0:1);polyA.2:TATAACTGCAGACTAGTGATATCCTTGTTTATTGCAGCTTATAATGGTTA(SEQIDNO:2)。質(zhì)粒pSV2His用作模板。按照廠家的使用說(shuō)明書，用英杰公司(Invitrogen)的TopoTA克隆載體擴(kuò)增與預(yù)期的175bp產(chǎn)物一致的片段并克隆入pcDNA3.1。用EcoRV和BstEII將含有SV40多聚腺苷酸信號(hào)的所需138bp片段從所得到的質(zhì)粒上切下，瓊脂糖凝膠電泳分離，然后利用常規(guī)技術(shù)(參見，例如Ausubel、Berger、Sambrook)克隆到pHW2000的獨(dú)特PvuII和BstEII位點(diǎn)之間。所得質(zhì)粒，pAD3000(圖1)經(jīng)測(cè)序發(fā)現(xiàn)含有方向正確的SV40多聚腺苷酸位點(diǎn)。pAD3000的核苷酸295-423分別對(duì)應(yīng)于SV40毒株777(AF332562)的核苷酸2466-2594。實(shí)施例2:制備MDV-B的8質(zhì)粒系統(tǒng)利用加利福尼亞州瓦倫西亞快而精公司的Rneasy試劑盒(RNeasyKit,Qiagen，Valencia,CA)從受感染含胚雞蛋的100尿囊液中提取流感B/AnnArbor/1/66(ca/MasterAnnArbor/1/66PIAviron10/2/97)的冷適應(yīng)變體的病毒RNA，該病毒株是示例性的B型流感病毒主供體病毒株(MDV-B)，將該RNA洗入40H20中。利用加利福尼亞州瓦倫西亞快而精公司的RT-PCR試劑盒進(jìn)行基因組區(qū)段的RT-PCR，每次反應(yīng)使用1yl提取的RNA。RT-反應(yīng)在5(TC進(jìn)行50分鐘，然后在94。C進(jìn)行15分鐘。PCR進(jìn)行25輪94。C進(jìn)行1分鐘，54t:進(jìn)行1分鐘，和72t:進(jìn)行3分鐘。利用含BsmBI位點(diǎn)的區(qū)段特異性引物擴(kuò)增P-基因，從而產(chǎn)生兩個(gè)片段(表l)。表1.擴(kuò)增流感caB/AnnArbor/1/66的8個(gè)vRNA的RT-PCR引物正向引物反向引物PB1Bm-PBlb-1:(SEQIDNO:14)1ATATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCCTTTAAGATGPB1Bm-PBlb-1220:(SEQIDNO:16)1BJTATTCGTCTCGGCATCTTTGTCGCCTGGGATGATGATGPB2Bm-PB2b-l:(SEQIDNO:18)[2A]TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGAGCGTTTTCAAGATGPB2Bm-PB2b-1142:(SEQIDNO:20)[2B]TATTCGTCTCATGAGAATGGAAAAACTACTAATAAATTCAGCPABm-Pab陽(yáng)l:(SEQIDNO:22)[3A]TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCGGTGCGTTTGAPABm-Pab-1283:(SEQIDNO:24)[3B]TATTCGTCTCTCCTGGATCTACCAGAAATAGGGCCAGACHAMDV-B5'BsmBI-HA:(SEQIDNO:26)TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATTTTCTAATATCNPBa-NPb-1:(SEQIDNO:28)TATTGGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTNAMDV-B5'BsmBI隱NA:(SEQIDNO:30)TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCATCTTCTCAAAACMMDV-BS'BsmBI-M:(SEQIDNO:32)TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACGCACTTTCTTAAAATGNSMDV-B5'BsmBI-NS:(SEQIDNO:34)TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGGATTTGTTTAGTCBm-PBlb-1200R:(SEQIDNO:15)TATTCGTCTCGATGCCGTTCCTTCTTCATTGAAGAATGGBm-PBlb-2369R:(SEQIDNO:17)ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGAGCCTTBm-PB2b-1145R:(SEQIDNO:19)TATTCGTCTCTCTCATTTTGCTCTTTTTTAATATTCCCCBm-PB2b-2396R:(SEQIDNO:21)ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGAGCATTBm-PAb-1261R:(SEQIDNO:23)TATTCGTCTCCCAGGGCCCTTTTACTTGTCAGAGTGCBm-PAb-2308R:(SEQIDNO:25)ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACACGTGCATTMDV-B3'BsmBI-HA:(SEQIDNO:27)ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCBa-NPb-1842R:(SEQIDNO:29)ATATGGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTMDV-B3'BsmBI-NA:(SEQIDNO:31)ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTTTCAGMDV-B3'BsmBI-M:(SEQIDNO:33)ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACGCACTTTTTCCAGMDV-B3'BsmBI-NS:(SEQIDNO:35)ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGGATTTTTAT這些流感序列的互補(bǔ)序列以黑體顯示。5'-端具有限制性核酸內(nèi)切酶BsmBI(Bm)或BsaI(Ba)的識(shí)別序列?？私蒂|(zhì)粒分離PCR片段，用BsmBI(或?qū)τ贜P用Bsal)消化，插入上述pAD3000(pHW2000的衍生物，其能轉(zhuǎn)錄負(fù)有義vRNA和正mRNA)的BsmBI位點(diǎn)。2_4個(gè)所得質(zhì)粒各自測(cè)序并根據(jù)對(duì)RT-PCR片段直接測(cè)序與MDV-B的共有序列比較。通過(guò)克隆質(zhì)粒或者利用加利福尼亞州拉霍亞斯特拉塔基因公司的快速改變?cè)噭┖?Quikchangekit)"修復(fù)"具有導(dǎo)致氨基酸與共有序列不同的核苷酸取代的質(zhì)粒。得到的B/A皿Arbor/1/66質(zhì)粒指定為pAB121_PBl、pAB122-PB2、pAB123-PA、pAB124_HA、pAB125_NP、pAB126_NA、pAB127-M和pAB128-NS。利用該雙向轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，在胞內(nèi)產(chǎn)生所有病毒RNA和蛋白質(zhì)，從而產(chǎn)生感染性B型流感病毒(圖2)。應(yīng)注意，與共有序列相比，pAB121-PBl和pAB124-HA具有2個(gè)，pAB128-NS具有1個(gè)沉默核苷酸取代(表2)。這些核苷酸改變不導(dǎo)致氨基酸改變，預(yù)計(jì)不會(huì)影響病毒生長(zhǎng)和拯救。保留這些沉默取代從而有利于重組病毒的基因分型。表2.表示B/ANNARBOR/1/66(MDV-B)的8個(gè)區(qū)段的質(zhì)粒組區(qū)段質(zhì)粒核苷酸蛋白質(zhì)PB1PAB121-PB1A924>G924;C1701>T1701沉默PB2PAB122-PB2共有PAPAB123-PA共有HAPAB124-HAT150〉C150;T153>C153沉默NPPAB125-NP共有NAPAB126-NA共有MPAB127-M共有NSPAB128國(guó)NSA416〉G416NS1:沉默為構(gòu)建在PA、NP和Ml基因中具有核苷酸取代的質(zhì)粒，質(zhì)粒pAB123-PA、pAB125-NP、pAB127-M用作模板。利用加利福尼亞州拉霍亞斯特拉塔基因公司的快速改變?cè)噭┖懈淖兒塑账帷；蛘?，利用含有所需突變的引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增兩個(gè)片段，用BsmBI消化并采用三片段連接反應(yīng)插入pAD3000-BsmBI。測(cè)序產(chǎn)生的質(zhì)粒以確保cDNA不含不需要的突變。利用羅丹明或d羅丹明染料-終止子循環(huán)測(cè)序簡(jiǎn)易反應(yīng)試劑盒(RhodamineordRhodaminedye—terminatorcyclesequencingreadyreactionkit)與力口利福尼亞州福斯特城PEAB公司(Perkin-ElmerAppliedBiosystems，Inc，F(xiàn)osterCity，CA)的AmpliT叫⑧DNA聚合酶FS測(cè)定模板DNA的序列。通過(guò)電泳分離樣品，用373型PE/ABI、373型Stretch或377型DNA測(cè)序儀分析。在另一實(shí)驗(yàn)中，如以上MDV-B毒株所述，擴(kuò)增流感B/Yamanshi/166/98的病毒RNA并克隆入pAD3000，例外之處是擴(kuò)增進(jìn)行25輪94t:進(jìn)行30秒，54。C進(jìn)行30秒和72。C進(jìn)行3分鐘。利用相同引物擴(kuò)增B/Yamanashi/166/98毒株區(qū)段，分別換用以下引物來(lái)擴(kuò)增NP和NA區(qū)段MDV-B5'BsmBI-NP:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCACAGCATTTTCTTGTG(SEQIDN0:36)和MDV-B3'BsmBI-NP:ATATCGTCTCGTATTAGTAGAAACAACAGCATTTTTTAC(SEQIDNO:37)以及Bm-NAb-l:TATTCGTCTCAGGGAGCAGAAGCAGAGCA(SEQIDNO:38)禾PBm-NAb—1557R:ATATCGTCTCGTATTAGTAGTAACAAGAGCATTTT(SEQIDNO:39)。B/Yamanashi/166/98質(zhì)粒指定為pAB251-PBl、pAB252-PB2、pAB253-PA、pAB254-HA、pAB255-NP、pAB256-NA、pAB257-M和pAB258-NS。在PA中鑒定到有利于重組和重配B/Yamanashi/166/98病毒的基因分型的3處沉默核苷酸差異。實(shí)施例3:制備感染性重組B型流感病毒和重配流感病毒通過(guò)共同培養(yǎng)293T或C0S-7細(xì)胞(具有高感染效率和poll活性的靈長(zhǎng)類細(xì)胞)與MDCK細(xì)胞(允許流感病毒生長(zhǎng))來(lái)制備感染性重組B流感病毒。293T細(xì)胞維持在含5XFBS的Opti-MEMI-AB培養(yǎng)基中，C0S-7細(xì)胞維持在含10%FBS的DMEMI-AB培養(yǎng)基中。MDCK細(xì)胞維持在加入了抗生素和抗真菌劑的lxMEM，10%FBS中。用病毒基因組載體轉(zhuǎn)染前，先用5mlPBS或不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞一次。將10ml胰蛋白酶-EDTA加到75cm2培養(yǎng)瓶的匯合細(xì)胞上(MDCK細(xì)胞溫育20-45分鐘，293T細(xì)胞溫育1分鐘)。離心細(xì)胞，重懸在10mlOptiMEMI-AB中。然后每種細(xì)胞取lml稀釋到18mlOptiMEMI-AB中，混勻。隨后將細(xì)胞等份加入6孔板，每孔3ml。6-24小時(shí)后，每種質(zhì)粒取1Pg加到含OptiMEMI-AB的181.5ml離心管(Eppendorftube)中(xii1質(zhì)粒+xii1OptiMEMI_AB+xii1TransIT-LTl=200ill);每微克質(zhì)粒DNA用2iUTransIT-LTl?；旌衔镌谑覝叵聹赜?5分鐘。然后加入800illOptiMEMI-AB。除去細(xì)胞培養(yǎng)基，將轉(zhuǎn)染混合物加入細(xì)胞(t=0)，33。C溫育6-15小時(shí)。從細(xì)胞中緩慢除去轉(zhuǎn)染混合物，加入lmlOptiMEMI-AB，細(xì)胞在33t:溫育24小時(shí)。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，將1ml含有1iig/mlTPCK-胰蛋白酶的OptiMEMI-AB加入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后96小時(shí)，將lml含有1iig/mlTPCK-胰蛋白酶的OptiMEMI-AB加入細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后4天和7天之間，取出lml細(xì)胞培養(yǎng)上清液，通過(guò)HA或噬斑試驗(yàn)監(jiān)測(cè)。簡(jiǎn)言之，將lml上清液等份加入離心管，5000rpm離心5分鐘。將900上清液轉(zhuǎn)移至新管中，進(jìn)行連續(xù)稀釋，以500ii1/孔加入MDCK細(xì)胞(例如，在12孔板中)。上清液與細(xì)胞溫育1小時(shí)后除去并替換以含有1yg/mlTPCK-胰蛋白酶的感染培養(yǎng)基(lxMEM)。然后進(jìn)行HA試驗(yàn)或噬斑試驗(yàn)。例如，對(duì)于噬斑試驗(yàn)，用在33t:與0.8X瓊脂糖疊加物溫育3天的MDCK細(xì)胞滴定上清液。對(duì)于感染雞蛋，轉(zhuǎn)染后6或7周收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，33t:，將Opti-MEMI配制的100ii1病毒稀釋液注射入11日齡的含胚雞蛋。接種3天后通過(guò)MDCK細(xì)胞的TCID5。試驗(yàn)測(cè)定滴度。為產(chǎn)生MDV-B，用1iig的各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染共同培養(yǎng)的293T-MDCK或COS-7-MDCK細(xì)胞。在轉(zhuǎn)染后5-7天檢測(cè)時(shí)，共同培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞顯示細(xì)胞病變效應(yīng)(CPF)，表明從克隆的cDNA產(chǎn)生了感染性MDV-B病毒。在用7個(gè)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中未觀察到CPE(表3)。為測(cè)定DNA轉(zhuǎn)染體系產(chǎn)生病毒的效率，轉(zhuǎn)染7天后用MDCK細(xì)胞滴定細(xì)胞的上清液，通過(guò)噬斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。共同培養(yǎng)293T-MDCK的上清液的病毒滴度是5.0xl06pfu/ml，在C0S7-MDCK細(xì)胞中是7.6xl06pfu/ml。表3.從8個(gè)質(zhì)粒產(chǎn)生感染性B型流感病毒<table>tableseeoriginaldocumentpage19</column></row><table>用7或8個(gè)質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染共同培養(yǎng)的293T-MDCK(1，2)或共同培養(yǎng)的C0S7-MDCK細(xì)胞(3，4)。轉(zhuǎn)染7天后監(jiān)測(cè)共同培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞中的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)。轉(zhuǎn)染7天后，用MDCK滴定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液。pfu/ml的數(shù)據(jù)表示多次(例如，3次或4次)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的平均值。利用B/Yamanashi/166/98質(zhì)粒載體在轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中獲得可比較的結(jié)果。這些結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染體系能從8個(gè)質(zhì)?？稍佻F(xiàn)地從頭產(chǎn)生B型流感病毒。重組B型流感病毒的基因分型用MDCK細(xì)胞作后續(xù)傳代后，對(duì)感染細(xì)胞的上清液采用RT-PCR來(lái)證實(shí)所產(chǎn)生病毒的真實(shí)性。用所有8個(gè)區(qū)段的區(qū)段特異性引物(表l)進(jìn)行RT-PCR。如圖3A所示，所有區(qū)段均產(chǎn)生PCR產(chǎn)物。直接測(cè)序PBl、HA和NS區(qū)段的PCR產(chǎn)物揭示分析的4個(gè)核苷酸與質(zhì)粒pAB121-PBl、pAB124-HA和pAB128_NS中發(fā)現(xiàn)的相同。這些結(jié)果證實(shí)所產(chǎn)生的病毒是由所設(shè)計(jì)的質(zhì)粒產(chǎn)生的，并排除了(除了陰性對(duì)照外)任何可能的親代病毒的實(shí)驗(yàn)室污染(圖3B)。類似地，用B/Yamanashi/166/98質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染后，回收病毒，擴(kuò)增包含PA區(qū)段的核苷酸1280-1290的區(qū)域。測(cè)序證實(shí)回收的病毒對(duì)應(yīng)于質(zhì)粒來(lái)源的重組B/Yamanashi/166/98(圖3C和D)。rMDV-B的表型分型MDV-B病毒顯示兩種特征性表型溫度敏感性(ts)和冷適應(yīng)性(ca)。與33。C相比37t:時(shí)病毒滴度差異為21og(或更高)被定義為ts，與33t:相比25t:時(shí)病毒滴度差異小于21og被定義為ca。用親代病毒MDV-B和質(zhì)粒來(lái)源的轉(zhuǎn)染病毒感染原代雞腎(PCK)細(xì)胞以測(cè)定三種溫度下的病毒生長(zhǎng)。用6孔板中匯合的MDCK細(xì)胞(ECACC)進(jìn)行噬斑試驗(yàn)。病毒稀釋液在33。C溫育30-60分鐘。在細(xì)胞上覆蓋0.8%瓊脂糖疊加物。在33t:或37t:溫育感染的細(xì)胞。感染3天后，用0.1%結(jié)晶紫溶液染色細(xì)胞并測(cè)定噬斑數(shù)目。在25、33和37t:，通過(guò)病毒樣品的TCID5。滴定進(jìn)行ca-ts表型試驗(yàn)。該試驗(yàn)形式通過(guò)不同溫度下(25t:、33t:和37°C)，在96-孔細(xì)胞培養(yǎng)板中檢測(cè)流感病毒對(duì)原代雞腎細(xì)胞單層的細(xì)胞病變效應(yīng)(CPE)來(lái)檢測(cè)TCIDs。滴度。該試驗(yàn)不依賴于隨溫度和病毒株而變的噬斑形態(tài)；而是只依賴于流感病毒復(fù)制和導(dǎo)致CPE的能力。將通過(guò)胰蛋白酶處理原代組織制備的原代雞腎(PCK)細(xì)胞懸液懸浮在含有5%FCS的MEM(Earl)培養(yǎng)基中。將PCK細(xì)胞接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)48小時(shí)，以制備匯合度>90%的單層。48小時(shí)后，用含5mML-谷氨酰胺、抗生素、非必需氨基酸的無(wú)血清MEM培養(yǎng)基(稱為表型分析培養(yǎng)基(PAM))洗滌PCK細(xì)胞單層1小時(shí)。在含PAM的96孔板制備病毒樣品的10倍連續(xù)稀釋液。然后將稀釋的病毒樣品涂布到96孔板中經(jīng)洗滌的PCK單層上。在病毒樣品的每個(gè)稀釋度，用稀釋的病毒感染六復(fù)孔。每份樣品包括六復(fù)孔的未感染細(xì)胞作為細(xì)胞對(duì)照。各病毒樣品取2-4復(fù)孔滴定。各試驗(yàn)包括在25t:、33t:和37t:預(yù)先測(cè)定滴度的表型對(duì)照病毒。為測(cè)定病毒樣品的ts表型，33t:和37°C，在5%C02細(xì)胞培養(yǎng)孵育箱中溫育諸平板6天。對(duì)于ca-表型表征，25t:溫育諸平板10天。通過(guò)Karber方法計(jì)算病毒滴度，用Logl。TCID5。滴度平均值(n=4)/ml±標(biāo)準(zhǔn)差表示。圖1-3中所示的病毒滴度的標(biāo)準(zhǔn)差在0.1到0.3之間。33t:和37t:的病毒滴度差異用于測(cè)定ts表型，25t:和33t:的病毒滴度差異用于測(cè)定ca表型。源自質(zhì)粒的MDV-B(recMDV-B)病毒如預(yù)期的那樣在細(xì)胞培養(yǎng)物中表現(xiàn)出兩種特征性表型，ca和ts。ca表型在25t:有效復(fù)制，用PCK細(xì)胞檢驗(yàn)時(shí)病毒例如在25。C和33°C之間的滴度差異小于或等于21ogl0。親代MDV-B和recMDV-B均表現(xiàn)出ca;25。C和33。C之間的差異分別為0.3和0.41ogl0(表4)。還通過(guò)觀察兩種不同溫度下PCK細(xì)胞的滴度檢測(cè)了ts表型；然而，對(duì)于該表型，37t:的滴度應(yīng)比33t:的滴度小21ogl0或更多。對(duì)于親代MDV-B和recMDV-B，33。C和37。C之間的差異分別是3.4和3.71ogl0(表4)。因此，源自重組質(zhì)粒的MDV-B病毒表現(xiàn)出ca和ts兩種表型。33"，重組病毒的滴度為7.01ogi。TCID5。/ml，37t:時(shí)的為3.3TCID5。/ml，25°C時(shí)為8.81ogi。TCIDs。/ml(表4)。因此，用8個(gè)流感MDV-B基因組區(qū)段質(zhì)粒轉(zhuǎn)染得到的重組病毒同時(shí)具有ca和ts表型。表4.從質(zhì)粒產(chǎn)生的MDV-B和rMDV-B的表型分析溫度(。c)表型Logl0TCID50/ml(平均值+SD)caB/AnnArbor/01/66(MDV-B)8.8+0.38.5+0.05~~5.1+0.1RecMDV-B7.4+0.37.0+0.133.3+0.12ca,tsRec53-MDV-B5.9+0.15.7+0.05.3+0.1ca，非-ts用親代病毒MDV-B和質(zhì)粒來(lái)源的重組病毒(recMDV-B)感染原代雞腎細(xì)胞。測(cè)定3種不同溫度下的病毒滴度。實(shí)施例7:重配B/Yamanashi/166/98病毒的產(chǎn)生擴(kuò)增代表B型流感病毒主要譜系的幾種不同毒株的HA和NA區(qū)段并克隆入pAD3000，基本上如上所述。優(yōu)化引物以同時(shí)RT-PCR擴(kuò)增HA和NA區(qū)段。比較代表區(qū)段4(HA)和區(qū)段6(NB/NA)的非編碼區(qū)的vRNA末端區(qū)域顯示B型流感病毒的HA和NA基因之間5'末端的20核苷酸和3'末端的15個(gè)核苷酸是一致的。合成RT-PCR所用的引物對(duì)(斜體序列是B型流感病毒特異性的)Bm-NAb-l:TATTCGTCTCAGGGjGC力a4」GC^CL4(SEQIDNO:38);Bm-NAb—1557R:ATATCGTCTCGTATT^Gr^GTA4C/14GJGC4Tr7T(SEQIDN0:39)，并用于同時(shí)擴(kuò)增各種B型流感病毒株的HA和NA基因(圖6)。分離B/Victoria/504/2000、B/Hawaii/10/2001和B/HongKong/330/2001的HA和NAPCR區(qū)段，用BsmBI消化，插入pAD3000。這些結(jié)果表明這些引物適用于有效擴(kuò)增含有幾種不同野生型病毒來(lái)源的B型流感病毒HA和NA基因的質(zhì)粒，所述野生型病毒代表了B型流感病毒的主要譜系。RT-PCR產(chǎn)物用于測(cè)序和/或克隆入表達(dá)質(zhì)粒。為了證明利用B/Yamanashi/166/98(—種B/Yamagata/16/88樣病毒)能有效表達(dá)各種B型流感病毒譜系來(lái)源的抗原，制備含B/Yamanashi/166/98的PB1、PB2、PA、NP、M、NS和代表Victoria及Yamagata譜系的HA和NA的重配病毒(6+2重配病毒)。按照上述方法，用代表B/Yamanashi/166/98的6個(gè)質(zhì)粒和含有B/Victoria/2/87譜系的兩個(gè)病毒株(B/HongKong/330/2001和B/Hawaii/10/2001)，以及B/Yamagata/16/88譜系的一個(gè)病毒株(B/Victoria/504/2000)的HA和NA區(qū)段的cDNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染瞬時(shí)共培養(yǎng)的C0S7-MDCK細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后6到7天，用新鮮MDCK細(xì)胞滴定上清液。所有6+2重配病毒的滴度在4-9X106pfu/ml之間(表5)。這些數(shù)據(jù)證明B/Yamanashi/166/98的6個(gè)內(nèi)部基因能與兩種B型流感病譜系的HA和NA基因區(qū)段有效形成感染性病毒。轉(zhuǎn)染后6或7天，滴定共培養(yǎng)C0S7-MDCK細(xì)胞的上清液，利用MDCK細(xì)胞通過(guò)噬斑試驗(yàn)測(cè)定病毒滴度。表5:用于產(chǎn)生B/Yamanashi/166/98和6+2重配病毒的質(zhì)粒組區(qū)段1—pAB251-PBlpAB251-PBlpAB251-PBlpAB251-PBl2pAB252-PBpAB252-PB2pAB252-PB2pAB252-PB2pAB252-PB23pAB253-PApAB253-PApAB253-PApAB253-PApAB253-PA4pAB254-HApAB254-HApAB281-HApAB285-HApAB287-HA5pAB255-NPpAB255-NPpAB255-NPpAB255-NPpAB255-NP6pAB256-NApAB256-NApAB291-NApAB295-NApAB297-NA7pAB257-MpAB257-MpAB257-MpAB257-MpAB257-M8pAB258-NApAB258-NApAB258-NApAB258-NApAB258-NA重組病毒86+26+26+2B/Yamanashi/B/Victoria/504/B/Hawaii/10/200B/Hong166/9820001Kong/330/200pfu/m04x1069x10b6x10。7x10b野生型B/Yamanashi/166/98在雞蛋內(nèi)復(fù)制可得到較高滴度。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定這種特性是否是該病毒的6個(gè)"內(nèi)部"基因的固有表型。為了評(píng)價(jià)這種特性，將在雞蛋內(nèi)只能中等程度復(fù)制的野生型B/Victoria/504/2000的產(chǎn)量與表達(dá)B/Victoria/504/2000HA和NA的6+2重配病毒的產(chǎn)量作比較。除了野生型和重組的B/Yamanashi/166/98外，這些病毒各自以100或1000pfu接種到3或4個(gè)含胚雞蛋內(nèi)。感染后3天，從雞蛋收集尿囊液，用MDCK細(xì)胞測(cè)定TCIDs。滴度。6+2重配病毒在尿囊液中的產(chǎn)量類似于野生型和重組B/Yamanashi/166/98病毒株(圖7)。B/Victoria/504/2000和6+2重組病毒的滴度差異約為1.61og10TCID50(0.7-2.51og10TCID50/ml，95%CI)。通過(guò)3個(gè)不同的實(shí)驗(yàn)證明B/Victoria/504/2000和6+2重組病毒之間有差異(P<0.001)。這些結(jié)果證明B/Yamanashi/166/98的雞蛋生長(zhǎng)特性可賦予在雞蛋內(nèi)很難復(fù)制的病毒株正常表達(dá)的HA和NA。實(shí)施例8:caB/AnnArbor〃1/66減毒的分子基礎(chǔ)MDV-B病毒(caB/AnnArbor/1/66)在人體內(nèi)是減毒的，在雪貂中顯示減毒表型，在細(xì)胞培養(yǎng)物中顯示冷適應(yīng)表型和溫度敏感表型。利用BLAST搜索算法比較MDV-B內(nèi)部基因的推導(dǎo)氨基酸序列與LosAlamos流感病毒數(shù)據(jù)庫(kù)(萬(wàn)維網(wǎng)址flu.lanl.gov)的序列。鑒定出任何其他病毒株中不存在的8個(gè)MDV-B獨(dú)有的氨基酸(表6)。編碼PB1、BM2、NS1和NS2的基因組區(qū)段顯示沒有獨(dú)特取代的殘基。PA和M1蛋白各有2個(gè)，NP蛋白有4個(gè)獨(dú)特取代的氨基酸(表6)。在PB2的位置630處發(fā)現(xiàn)一個(gè)取代的氨基酸(另一病毒株B/Harbin/7/94(AF170572)在630位置處也有精氨酸殘基)。這些結(jié)果提示基因區(qū)段PB2、PA、NP和Ml可能參與MDV-B的減毒表型。采用與上述MDV-A相似的方式，可利用8質(zhì)粒系統(tǒng)產(chǎn)生重組和重配病毒(單和/或雙，S卩，7:1;6:2重配病毒)，以不依賴于輔助病毒的方式將相關(guān)的質(zhì)粒按照上述MDV-A相似的方式簡(jiǎn)單地共轉(zhuǎn)染入培養(yǎng)的細(xì)胞。例如，可聯(lián)用B/Lee/40的6個(gè)內(nèi)部基因與MDV-B來(lái)源的HA和NA區(qū)段來(lái)產(chǎn)生6+2重配病毒。表6:B/AnnArbor/1/66的獨(dú)特取代的氨基酸22<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>8種caB/AnnArbor蛋白的推算出的氨基酸序列用于BLAST檢索。顯示了MDV-B和比對(duì)序列之間不相同的氨基酸位置。密碼子中有下劃線的核苷酸代表取代位置。為了確定這8個(gè)獨(dú)特的氨基酸差異是否影響特征性MDV-B表型，構(gòu)建一重組病毒，其中所有8個(gè)核苷酸位置編碼反映野生型流感病毒遺傳互補(bǔ)情況的氨基酸。構(gòu)建了一組質(zhì)粒，其中PA、NP和Ml基因的8個(gè)殘基通過(guò)定點(diǎn)誘變加以改變以反映野生型氨基酸(如表6所示)。具有所有8個(gè)改變的重組病毒稱為rec53-MDV-B，其是通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染共培養(yǎng)的C0S7-MDCK細(xì)胞而獲得。共培養(yǎng)MDCK細(xì)胞并在33。C生長(zhǎng)確保轉(zhuǎn)染后6_7天的上清液中含有高病毒滴度。滴定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，通過(guò)噬斑試驗(yàn)利用MDCK細(xì)胞和PCK細(xì)胞測(cè)定33t:和37t:的滴度。如圖8所示，在兩個(gè)不同的獨(dú)立實(shí)驗(yàn)中，recMDV-B在MDCK細(xì)胞和PCK細(xì)胞內(nèi)都能表達(dá)ts-表型。設(shè)計(jì)的三基因重配病毒rec53-MDV-B含有表現(xiàn)出非_ts_表型的所有8個(gè)氨基酸改變，33t:和37t:，PCK細(xì)胞內(nèi)的滴度差異只有0.71og1Q。該滴度低于ts定義所要求的21ogl。的差異，也顯著低于recMDV-B所觀察到的約31ogl。的差異。這些結(jié)果說(shuō)明PA、NP和Ml蛋白內(nèi)的8個(gè)氨基酸改變足以產(chǎn)生具有同源和異源糖蛋白的非_偽、野生型樣病毒。隨后測(cè)定了各基因區(qū)段對(duì)ts表型的作用。通過(guò)DNA共轉(zhuǎn)染技術(shù)產(chǎn)生了含有PA、NP或M基因區(qū)段與野生型氨基酸互補(bǔ)(區(qū)段)的質(zhì)粒來(lái)源的重組病毒。37t:，所有單基因重組病毒顯示在MDCK細(xì)胞和PCK細(xì)胞內(nèi)生長(zhǎng)受限制(圖9)，提示單個(gè)基因區(qū)段的改變不能逆轉(zhuǎn)ts表型。此外，攜帶NP和M或PA和M基因區(qū)段的重組病毒也保留了ts-表型。相反，含有PA和NP基因區(qū)段的重組病毒在37t:和33t:時(shí)的滴度差異為2.01og1Q或更低，與rec53-MDV-B相似。這些結(jié)果說(shuō)明NP和PA基因是影響ts-表型的主要基因。為測(cè)定NP蛋白的所有4個(gè)氨基酸和PA蛋白的2個(gè)氨基酸是否影響非_ts表型，制備了具有改變的NP和PA基因改變的三基因和雙基因重組病毒(圖IO)。NP蛋白中的兩個(gè)氨基酸取代，A114—V114和H410—P410產(chǎn)生非-ts表型。在核蛋白中具有單取代，H410—P410的病毒在MDCK和PCK細(xì)胞中顯示非-ts表型。另一方面，單取代A55—T55顯示ts-表型，與位置509處的單取代一樣。這些結(jié)果說(shuō)明NP的氨基酸殘基V114和P410參與37t:的有效生長(zhǎng)(圖IIA)。采用類型的方案剖析PA基因中兩個(gè)氨基酸的作用。構(gòu)建一組重組病毒，各包含具有4個(gè)野生型共有氨基酸的NP基因區(qū)段和只有兩個(gè)共有野生型氨基酸之一的PA基因。H497—Y497的取代維持ts(圖11B)，證明該基因座對(duì)表型的表達(dá)無(wú)甚影響。相反，用V431取代M431導(dǎo)致ts表型逆轉(zhuǎn)。這些結(jié)果顯示NP中的氨基酸A114和H410以及PA中的M431是MDV-B的溫度敏感性的主要決定因素。根據(jù)以前的證據(jù)，ts-表型和減毒表型高度相關(guān)。現(xiàn)已證實(shí)在受感染雪貂的肺組織內(nèi)檢測(cè)不到caB/AnnArbor/1/66病毒，而鼻內(nèi)感染后在肺組織內(nèi)可檢測(cè)到非減毒的B型流感病毒。為確定ts和att表型是否基于相同的突變，進(jìn)行了以下研究。轉(zhuǎn)染后獲得的重組病毒在含胚雞蛋內(nèi)傳代以產(chǎn)生病毒原種。9周齡的雪貂鼻內(nèi)接種病毒，每個(gè)鼻孔0.5ml，滴度為5.5、6.0或7.01Ogl。pfu/ml。感染3天后處死雪貂，如以前所述檢測(cè)它們的肺和鼻甲。雪貂(每組4只)鼻內(nèi)感染recMDV-B或rec53-MDV-B。感染病毒后3天收集鼻甲和肺組織，檢測(cè)病毒的存在。用7.01ogi。pfurecMDV-B感染的雪貂肺組織內(nèi)檢測(cè)不到病毒。用7.01ogl。pfurec53-MDV-B感染的4只動(dòng)物中有3只可在肺組織內(nèi)檢測(cè)到病毒(該組中的一只動(dòng)物的原因不清)。感染低劑量(5.51ogl。pfu)rec53-MDV-B的4只雪貂中有2只在肺組織內(nèi)分離出了病毒。因此，PA、NP和M1蛋白的8個(gè)獨(dú)特氨基酸的改變足以使att表型轉(zhuǎn)變成非-att表型。由于細(xì)胞培養(yǎng)的數(shù)據(jù)顯示PA和NP對(duì)ts-表型起主要作用，因此在第二個(gè)實(shí)驗(yàn)中用61ogpfu的rec53-MDV-B(PA、NP、M)、rec62-MDV-B(PA)、NPrec71-MDV-B(NP)感染雪貂。用rec53-MDV-B感染的4只動(dòng)物中有2只在肺內(nèi)檢測(cè)到病毒。感染單和雙重配病毒的雪貂在肺組織內(nèi)未檢測(cè)到病毒。因此，除了PA和NP蛋白的氨基酸外，Ml蛋白對(duì)于att表型也很重要。具有野生型PA和NP的病毒在雪貂肺內(nèi)不能復(fù)制，說(shuō)明參與減毒的突變亞組也參與ts表型。因此，B/AnnArbor/1/66的ts和att表型最多由3個(gè)基因決定。將PA、NP和Ml蛋白的8個(gè)氨基酸轉(zhuǎn)變成野生型殘基可使重組病毒在37°C具有復(fù)制能力。同樣，含有MDV-B的6個(gè)內(nèi)部基因和B/HongKong/330/01的HA和NA區(qū)段的6+2重組病毒顯示ts-表型，而三基因重組病毒是非-ts的。我們利用MDV-B骨架的結(jié)果表明6個(gè)氨基酸足以將ts/att表型轉(zhuǎn)變成非_ta/非-att表型。因此，我們感興趣的是確定引入那六個(gè)"減毒"殘基是否能將這些生物學(xué)特性傳遞給異源野生型、非減毒B型流感病毒，例如B/Yamanashi/166/98。制備了重組重配B/Yamanashi/166/98(recYam)(7)和重組病毒(rec6-Yam):含6個(gè)氨基酸改變PA(V431—M431、H497—Y497)，NP(V114—A114、P410—H410)和M1(H159—Q159、M183—V183)。與33。C相比RecYam在37°C的滴度降低0.171ogl0，而rec6Yam明顯是ts的，37。C和33°C間病毒滴度的差異是4.61ogl0。病毒如典型野生型B型流感病毒所預(yù)計(jì)的那樣從感染recYam的雪貂有效回收。當(dāng)將rec6Yam接種入雪貂時(shí)，在肺組織中未檢測(cè)到病毒(表7)。因此，轉(zhuǎn)移MDV-B的ts/att基因座足以將ts_和att-表型傳遞給不同的病毒(divergentvirus)。表7:在雪貂中的減毒研究<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>a利用具有不同于野生型的氨基酸的含MDV-B骨架的重組病毒鼻內(nèi)感染雪貂。RecYam是重組B/Yamanashi/166/98，Rec6Yam表示在NP、PA和Ml中具有6個(gè)"MDV-B-減毒"氨基酸改變、含有B/Yamanashi骨架的病毒。b感染后3天，測(cè)定鼻甲和肺組織的病毒滴度，顯示了4只受感染雪貂的平均滴度。。<1.5表明未檢測(cè)到病毒。因此，具有一個(gè)或多個(gè)這些氨基酸取代的B型流感病毒的人工改造變體表現(xiàn)出ts和att表型，其適用于例如作為主供體病毒株來(lái)生產(chǎn)減毒活流感病毒疫苗。實(shí)施例9:測(cè)定控制B/ANNARBOR/1/66流感病毒的冷適應(yīng)表型的基因座冷適應(yīng)的(ca)B/AnnArbor/1/66是減毒活B型流感病毒Flumist⑧疫苗的主供體病毒(MDV-B)。將攜帶源自caB/AnnArbor/1/66的6個(gè)內(nèi)部基因和流行野生型毒株的HA及NA表面糖蛋白的6:2B型流感病毒疫苗表征為冷適應(yīng)(ca)、溫度敏感性(ts)和減毒(att)表型。序列分析顯示MDV-B在PB2、PA、NP和Ml蛋白中含有野生型B型流感病毒株中不存在的9個(gè)氨基酸。我們確定PA(M431V)和NP(A114V，H410P)中的3個(gè)氨基酸決定ts表型，除了這3個(gè)ts基因座外，Ml(Q159H，V183M)中的兩個(gè)氨基酸賦予att表型。為理解ca表型的分子基礎(chǔ)，采用基于質(zhì)粒的逆轉(zhuǎn)遺傳體系評(píng)估這9個(gè)MDV-B特異性氨基酸對(duì)ca表型的作用。25t:和33t:下重組MDV-B在雞胚腎(CEK)細(xì)胞中有效復(fù)制。相反，含有9個(gè)野生型氨基酸的重組野生型B/A皿Arbor/1/66在25。C下不能有效復(fù)制。確定總共有5個(gè)野生型氨基酸是完全逆轉(zhuǎn)MDV-Bca表型所需的一個(gè)在PB2中(R630S)、一個(gè)在PA中(M431V)、3個(gè)在NP中(A114V、H410P、T509A)。此外，用野生型氨基酸替代MDV-B或6:2疫苗毒株的M1蛋白中的兩個(gè)氨基酸(Q159H，V183M)顯著增強(qiáng)病毒在33°C(但不是25°C)在CEK細(xì)胞中的復(fù)制；V183M改變對(duì)該變化影響較大。實(shí)施例10:通過(guò)Vero細(xì)胞的電穿孔從8個(gè)質(zhì)粒拯救流感病毒還可采用電穿孔從Vero細(xì)胞拯救重組流感病毒。這些方法適合于產(chǎn)生A型流感病毒和B型流感病毒株，還能從無(wú)血清條件下生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞中回收，例如冷適應(yīng)的、溫度敏感性、減毒病毒，從而有利于制備適合在例如鼻內(nèi)疫苗制劑中給予的減毒活疫苗。除了其廣泛適用于各種病毒株外，電穿孔技術(shù)除了細(xì)胞底物的生長(zhǎng)培養(yǎng)基外無(wú)需額外的試劑，因此有害污染物的可能性較低。具體地說(shuō)，該方法利用適應(yīng)在無(wú)血清條件下生長(zhǎng)的Vero細(xì)胞，例如無(wú)病原體并適于疫苗生產(chǎn)的Vero細(xì)胞分離物而有效產(chǎn)生重組和重配病毒。該特征使電穿孔技術(shù)成為將DNA導(dǎo)入細(xì)胞底物內(nèi)的適宜商業(yè)方法。將電穿孔技術(shù)與將DNA引入Vero細(xì)胞的各種方法，包括利用大量脂質(zhì)試劑轉(zhuǎn)染、磷酸鈣沉淀和細(xì)胞微注射法進(jìn)行比較。雖然利用脂質(zhì)試劑拯救A型流感病毒獲得一定成功，但只有電穿孔顯示能從Vero細(xì)胞中拯救B型流感病毒和A型流感病毒。電穿孔前的一天，分離90_100%匯合的Vero細(xì)胞，以每個(gè)T225培養(yǎng)瓶9xl06個(gè)細(xì)胞的密度接種在補(bǔ)加了青霉素/鏈霉素、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸和10%FBS的MEM中(MEM，10%FBS)。第二天，胰蛋白酶處理細(xì)胞并重懸到每個(gè)T225培養(yǎng)瓶50ml的磷酸緩沖鹽水(PBS)中。然后使細(xì)胞沉淀并重懸到每個(gè)T225培養(yǎng)瓶0.5ml的OptiMEMI中。可任選利用定制的不含人或動(dòng)物來(lái)源組分的OptiMEM培養(yǎng)基。測(cè)定細(xì)胞密度，例如用血球計(jì)數(shù)器計(jì)數(shù)l:40稀釋液后，將5xl0e個(gè)細(xì)胞加入0.4cm電穿孔杯，終體積為400ii1OptiMEMI。然后將20iigDNA加入含細(xì)胞的杯中，所述DNA由摻入MDV-A或MDV-B基因組的8個(gè)質(zhì)粒的等摩爾混合物構(gòu)成，其體積不超過(guò)25iU。通過(guò)扣擊輕柔混合細(xì)胞，用連接有增強(qiáng)型電容增量器的BR基因脈沖儀II進(jìn)行電穿孔，300伏、950微法。時(shí)間常數(shù)為28-33毫秒。通過(guò)敲打輕柔混合杯的內(nèi)含物，電穿孔后約1-2分鐘用lml移液管加入0.7ml含10%FBS的MEM。然后用移液管上下吹打數(shù)次再次輕柔混合細(xì)胞，隨后分到6孔平皿的2個(gè)孔內(nèi)，每孔含2mlMEM、腦FBS。然后用lmlMEM，10%FBS洗滌小杯，分到兩孔中，終體積約為3.5ml/孔。在其它實(shí)驗(yàn)中，如上所述對(duì)適于無(wú)血清生長(zhǎng)條件，例如加利福尼亞州卡爾斯巴德英杰公司(Invitrogen，Carlsbad，CA)的OptiPro(SFM)的Vero細(xì)胞進(jìn)行電穿孔，除了在OptiMEMI中電穿孔后，用OptiPro(SFM)稀釋細(xì)胞，隨后培養(yǎng)細(xì)胞以供拯救病毒。然后將經(jīng)電穿孔的細(xì)胞在適于復(fù)制和回收所引入病毒的條件，S卩，對(duì)于冷適應(yīng)主供體病毒株在33t:下生長(zhǎng)。第二天(例如，電穿孔后約19小時(shí))，除去培養(yǎng)基，用OptiMEMI或OptiPro(SFM)洗滌細(xì)胞，每孔3ml。將含青霉素/鏈霉素的OptiMEMI或OptiPro(SFM)加入各孔，每孔lml，每日通過(guò)替換培養(yǎng)基來(lái)收集上清液。將上清液于-S(TC保存在SPG中。通常在電穿孔后2-3天觀察到峰值病毒產(chǎn)量。表8:利用不同細(xì)胞類型、采用不同轉(zhuǎn)染方法的8質(zhì)粒拯救MDV病毒株的結(jié)果底物方法M試數(shù)量結(jié)果t^(的接染性病萄實(shí)施例11:B型流感病毒在雞蛋中生長(zhǎng)導(dǎo)致HA196/197糖基化位點(diǎn)喪失大多數(shù)B型流感病毒臨床分離物含有潛在的HAN-連接的糖基化位點(diǎn)。對(duì)于B/Yamagata毒株，該HAN_連接糖基化位點(diǎn)存在于氨基酸殘基196-199附近，對(duì)于B/Victoria毒株存在于氨基酸殘基197-199附近。最近流行的B/Victoria毒株，例如B/Malaysia/2506/04和B/0hio/l/05，以及最近流行的B/Yamagata毒株，例如B/Florida/7/04含有該潛在的HAN_連接糖基化位點(diǎn)。為確定雞蛋傳代后這些毒株的HA糖基化位點(diǎn)是否保留，在雞蛋中培養(yǎng)各毒株，進(jìn)行核苷酸測(cè)序以確定所編碼的HA多肽的氨基酸序列。用于該項(xiàng)研究的所述病毒獲自佐治亞州亞特蘭大的疾病控制和預(yù)防中心(CDC)。利用該病毒接種獲自北康涅狄格州富蘭克林查爾斯河公司(CharlesRiverSPAFAS，F(xiàn)ranklin,CT，North)的含胚雞蛋，其在病毒接種前已受精10-ll天。接種的雞蛋在33t:溫育。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增接種雞蛋中病毒的HA病毒RNA，然后測(cè)序。雞蛋傳代后，B型流感病毒B/0hio/l/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04的HA多肽的氨基酸序列在N-連接的糖基化位點(diǎn)處均發(fā)生改變。B/Ohio/1/05的糖基化位點(diǎn)處的序列從NET改變成SET。B/Malaysia/2506/04的糖基化位點(diǎn)處的序列從NET改變成NEA或SET。B/Florida/7/04的糖基化位點(diǎn)處的序列從NKT改變成NKP、DKT或IKT。參見下表9。表9:在雞蛋中傳代前后的流感BHA196/197糖基化位點(diǎn)序列COS-畫CKCOS-腳CKMRC-5MRC-5MRC-5WI-38WI-38WI-38LF翻LF1043VeroVeroVe,DCKVero(ft港)Vero(無(wú)ft港)Vero(ft滑)Vero(無(wú)ft港)MDV-B32532254MDV.fl33陽(yáng)性(3/3)陽(yáng)性(3/3)oo孔孔&oo孔孔孔孔OPOP宇D穿&OPOP2穿穿穿穿54性性性性性性性性性性性性性ErTTTT「1111-1…111=一=1l-l…l曙l:一:-:陽(yáng)病毒氨基酸196-198(197-199)1化床分離物*雞蛋分離物cDNA克隆B/Ohio/1/05NETSETSETB/Malaysia/2506/04NETXaEXNEASETNKPB/Florida/7/04NKTXKXDKTIKT*CDC的M.Shaw博士提供臨床分離物的HA序列.1表示混合序列。檢測(cè)了B型流感病毒的各種其它毒株的HA糖基化位點(diǎn)處的氨基酸序列。參見圖12，其提供了用雞蛋傳代后6種B/Victoria毒株和8種B/Yamagata毒株的部分HA氨基酸序列。潛在的N-連接糖基化位點(diǎn)(N-X-T/S)在圖中以下劃線標(biāo)出。應(yīng)該注意，雞蛋傳代后，所檢測(cè)的14種B型流感病毒株無(wú)一保留它們潛在的N-X-T/SN-連接糖基化位點(diǎn)。實(shí)施例12:HA196/197糖基化位點(diǎn)喪失降低了B型流感病毒的抗原性隨后檢測(cè)了HA196-197糖基化位點(diǎn)對(duì)B型流感病毒株B/0hio/l/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04的抗原性的影響。為比較糖基化與非糖基化病毒的抗原性，采用反向遺傳學(xué)技術(shù)制備對(duì)應(yīng)于B型流感病毒株B/0hio/l/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04中每一種的一對(duì)病毒(見實(shí)施例3)。每對(duì)的兩個(gè)成員是相同的，除了第一成員含有的HA多肽具有野生型氨基酸序列，S卩，含有從CDC獲得的毒株中存在的N-連接糖基化位點(diǎn)的HA氨基酸序列，第二成員含有缺乏N-連接糖基化位點(diǎn)的HA多肽，即，從雞蛋傳代后病毒獲得的HA氨基酸序列。反向遺傳學(xué)技術(shù)中使用的6種質(zhì)粒提供了對(duì)應(yīng)于caB/AnnArbor/1/66(MDV-B)的內(nèi)部基因組區(qū)段的核苷酸序列。第七質(zhì)粒提供對(duì)應(yīng)于編碼各野生型病毒的野生型NA多肽的基因組區(qū)段的核苷酸序列，例如利用B/Ohio/1/05毒株的野生型NA多核苷酸序列制備B/Ohio/1/05病毒對(duì)的各成員。第八質(zhì)粒提供對(duì)應(yīng)于編碼HA多肽的基因組區(qū)段的核苷酸序列。所述HA多肽可以是野生型的或雞蛋傳代的HA，取決于該流感病毒是該病毒對(duì)的第一成員還是第二成員。通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增野生型病毒的NA或HAvRNA并將擴(kuò)增的cDNA克隆在pAD3000的兩個(gè)BsmBI位點(diǎn)之間，從而獲得野生型病毒的NA和HA多核苷酸序列。利用加利福尼亞州拉霍亞斯特拉塔基因公司的QuikChange⑧定點(diǎn)誘變?cè)噭┖卸c(diǎn)誘變含野生型HA區(qū)段的質(zhì)粒來(lái)制備含有對(duì)應(yīng)于編碼雞蛋傳代HA多肽的基因組區(qū)段的核苷酸序列的質(zhì)粒。將質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入共培養(yǎng)的MDCK和293細(xì)胞。所有拯救的病毒在MDCK細(xì)胞中有效復(fù)制，滴度為6-71ogl。PFU/mL。轉(zhuǎn)染后7天，收集轉(zhuǎn)染細(xì)胞的上清液，通過(guò)噬斑試驗(yàn)滴定?；厥詹《镜男蛄蟹治鲎C實(shí)保留了野生型或雞蛋傳代的HA氨基酸序列，與在轉(zhuǎn)染期間用于制備病毒的HA質(zhì)粒一致。利用感染后雪貂血清，通過(guò)HAI試驗(yàn)檢測(cè)各病毒對(duì)的抗原性。鼻內(nèi)接種6-71og^FU病毒后21天，從雪貂收集血清。通過(guò)血凝素-抑制(HAI)試驗(yàn)評(píng)估雪貂血清中抵御各種病毒的抗體水平。通過(guò)在V形底96-孔微量滴定板中加入25L連續(xù)稀釋的血清樣品與4HA單位的流感病毒(25iiL體積)進(jìn)行HAI試驗(yàn)。溫育30分鐘后，加入50y10.5%火雞紅細(xì)胞來(lái)檢測(cè)血細(xì)胞凝集作用。HAI滴度表示為抑制病毒血小板凝集作用的最高血清稀釋度。表10提供了成對(duì)野生型(HA糖基化+)/雞蛋-傳代(HA糖基化—)病毒的抗原性。表10:雪貂中HA196/197糖基化位點(diǎn)變體的抗原性氨基酸病毒196-198感染后雪貂血清HAI滴度的幾何平均值(197-闊糖基化(G-)非-糖基化(G+)B/Ohio/1/05SET(G-)101.616.0NET(G+)64.064.0B/Malaysia/2506/04NEA(G曙)64.032.0NET(G+)25.450.8B/Florida/7/04DKT(G-)161.328.5NKT(G+)35.980.6用HA糖基化病毒產(chǎn)生的血清對(duì)HA糖基化病毒的HAI滴度高于所配對(duì)的HA非糖基化病毒，用HA非糖基化病毒產(chǎn)生的血清對(duì)所配對(duì)的HA非糖基化病毒的HAI滴度較高。各對(duì)HA糖基化/HA非糖基化病毒在HAI試驗(yàn)中的抗原性差異為1.5-4.5倍不等。該差異表明196/197糖基化位點(diǎn)影響病毒抗原性。實(shí)施例13:具有HA196/197糖基化位點(diǎn)的B型流感病毒不能在雞蛋中復(fù)制為確定實(shí)施例12的成對(duì)流感病毒株的各成員是否能在雞蛋中復(fù)制，病毒以102PFU/雞蛋或104-105PFU/雞蛋接種含胚雞蛋，33t:溫育3天。然后通過(guò)噬斑試驗(yàn)測(cè)定MDCK細(xì)胞中的病毒峰值滴度。成對(duì)病毒在雞蛋中的復(fù)制情況(病毒滴度)和各病毒在HA氨基酸殘基196-199處的序列見表11。表ll.成對(duì)HA196/197糖基化變體在雞蛋中的復(fù)制病毒氨基酸病毒滴度雞蛋中生長(zhǎng)后的196-198(log10PFU/ml)氨基酸(197-199)196-199(197-200)SET(G-)8.7aSETQB/Ohio/1/05NET(G+)2.1a滯"8.86SETQNEA(G-)8.7。NEAQB/M勿sia/2506/04NET(G+)1.7"M)7.36旦ETQ__FJE股DKT(G-)^DKTQB/Florida/7/04NKT(G+)3.0"NKTQ6.76NK:Qa'b用所示6:2重配病毒以102PFU/雞蛋(a)或104_105PFU/雞蛋(b)接種雞蛋。l則定從雞蛋中回收病毒的HA序列，氨基酸序列改變以下劃線標(biāo)出。29dND:未測(cè)定。對(duì)于各病毒對(duì)，缺乏糖基化位點(diǎn)的病毒成員在雞蛋中生長(zhǎng)良好，生長(zhǎng)至滴度高于8.01ogl。PFU/mL。然而，具有糖基化位點(diǎn)(NXT)的病毒成員在接種102PFU病毒的雞蛋中復(fù)制不佳。參見表ll，其表明HA糖基化病毒B/0hio/1/05、B/Malaysia/2506/04和B/Florida/7/04分別只生長(zhǎng)至病毒滴度為2.llog1(1PFU/mL、1.71og1(1PFU/mL和3.01og1(1PFU/mL。當(dāng)用更大量的病毒(10Ll()SpFU/雞蛋)接種雞蛋時(shí)，可以檢測(cè)到HA糖基化病毒成員的復(fù)制。這些復(fù)制病毒的序列分析顯示在196/197糖基化位點(diǎn)處引入了氨基酸取代。參見表ll，其表明B/Ohio/1/05的野生型糖基化序列從NET改變至SET,B/Malaysia/2506/04的野生型糖基化序列從NET改變至SET或NEN，B/Florida/7/04的野生型糖基化序列從NKT改變至NKI或者脯氨酸取代緊鄰NXT糖基化序列C-末端的谷氨酰胺。以前的研究(Bause，BiochemJ.209(1983):331-336;Gavel和VonHeijne，ProteinEng.3(1990):433-442)顯示毗鄰HANXT糖基化位點(diǎn)C-末端的脯氨酸阻止N-連接的糖基化。因此，看來(lái)HA196/197處缺乏糖基化是B型流感病毒在雞蛋中良好復(fù)制所需。實(shí)施例14:鑒定能在雞蛋中復(fù)制的HA糖基化3型流感病毒株為確定含有196/197糖基化位點(diǎn)的任何B型流感病毒株是否能在雞蛋中復(fù)制，用各種野生型B型流感病毒株接種雞蛋。然后測(cè)定復(fù)制病毒的HA序列。大多數(shù)能在雞蛋中復(fù)制的B型流感病毒在殘基197-199(或196-198)處不含NXT糖基化位點(diǎn)。即使雞蛋傳代的病毒含有NXT糖基化位點(diǎn)，它們也正在喪失過(guò)程中；NXT序列是HA蛋白的殘基197-199/196-198處的序列群之一。兩種病毒株-B/Jilin/20/03(B/JL)和B/Jiangsu/10/03(B/JS)-鑒定為在雞蛋傳代后具有NXT糖基化序列，NKT。B/幾在緊鄰196-198糖基化位點(diǎn)C_末端的位置199處具有脯氨酸。如上所述，緊鄰糖基化位點(diǎn)殘基C-末端的脯氨酸可能干擾并阻止196/197糖基化。為更仔細(xì)檢測(cè)B/幾和B/JS在雞蛋中的復(fù)制情況，通過(guò)實(shí)施例12所述的反向遺傳學(xué)技術(shù)制備B/幾、B/JS各自的以及相關(guān)B型流感病毒株B/Shanghai/361/02(B/SH)的缺乏和含有NXT糖基化位點(diǎn)序列的成對(duì)B型流感病毒株。然后測(cè)定這些成對(duì)病毒在MDCK細(xì)胞和雞蛋中的復(fù)制情況。參見表12。表12.B/Jiangsu/10/03在雞蛋中保留了196-197糖基化位點(diǎn)病毒a氨基酸196-199病毒滴度(logi0PFU/ml)MDCK雞蛋在雞蛋中生長(zhǎng)后的-氨基酸196-199eB/JS/10/03DKTQ(G-)NKTQ(G+)6.57.47.3fl8.4"DKTQNKTQB/SH/361/02DKTQ(G-)NKTQ(G+)7.36.98.7"3.9"6.2ADKTQNKTQSKTQ&KTQB/JL/20/03NKTP(G-)6.47.6"NKTPNKTQ(G+)7.53.0"6.8*NK丁qNK§Qa'b用所示病毒以0.004的moi感染MDCK細(xì)胞，用在MDCK細(xì)胞中擴(kuò)增的所示6:2重配病毒以102PFU/雞蛋C)或104-105PFU/雞蛋(b)接種雞蛋并在33"溫育3天，所述病毒具有(G+)或不具有(G-)196/197HA糖基化位點(diǎn)。通過(guò)噬斑試驗(yàn)測(cè)定MDCK細(xì)胞內(nèi)的病毒峰值滴度。1則定從雞蛋中回收病毒的HA序列，氨基酸序列改變以下劃線標(biāo)出。所有3對(duì)病毒在MDCK細(xì)胞中復(fù)制良好，滴度范圍是6.4-7.51ogl。PFU/mL。然而，不是所有病毒在雞蛋中良好復(fù)制。以1(^lc^。PFU接種雞蛋的HA196/197糖基化(糖基化序列NKTQ)B/SH或B/幾病毒復(fù)制不佳。將B/SH或B/幾HA的接種劑量提高至104_105logl。PFU則可檢測(cè)到病毒復(fù)制。測(cè)序這些復(fù)制病毒顯示糖基化位點(diǎn)喪失(B/SH中從NKT改變?yōu)镾KT或DKT，B/幾中從NKT改變?yōu)镹KS)。與B/SH和B/幾病毒不同，有或沒有糖基化位點(diǎn)的B/JS病毒均能在雞蛋中良好復(fù)制，滴度分別為7.3和8.41ogl。PFU。HA特異性抗體的蛋白質(zhì)印跡證實(shí)在MDCK細(xì)胞和雞蛋中生長(zhǎng)的各病毒的糖基化狀態(tài)。通過(guò)將MDCK細(xì)胞培養(yǎng)上清液或尿囊液的病毒與2x蛋白質(zhì)裂解緩沖液(英杰公司)混合，用10%SDS-PAGE凝膠電泳來(lái)進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。將在凝膠上電泳的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，利用雞抗B型流感病毒株抗血清進(jìn)行蛋白質(zhì)印跡。與HRP偶聯(lián)的抗-雞抗體溫育后，利用GHBS公司(GEHealthcareBio-Sciences)的化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白質(zhì)-抗體復(fù)合物。蛋白質(zhì)印跡分析顯示當(dāng)利用MDCK細(xì)胞復(fù)制時(shí)，HA糖基化+病毒保留其糖基化位點(diǎn)，因此在凝膠上遷移慢于所配對(duì)的HA糖基化—病毒。參見，例如圖13a的泳道l和2，其顯示與糖基化+HA(泳道1)病毒的HA抗血清交叉反應(yīng)的條帶遷移慢于具有糖基化—HA病毒的泳道條帶(泳道2)。B/SH(圖13a，泳道3和4)和B/幾(圖13a，泳道5和6)病毒獲得相似的結(jié)果。當(dāng)用雞蛋復(fù)制時(shí)，只有一種病毒，即B/JS病毒保留了遷移模式，其中糖基化+HA病毒的條帶(圖13b，泳道3)遷移慢于糖基化—HA病毒的條帶(圖13b，泳道4)。該模式提示B/JS病毒是所測(cè)試的唯一能用雞蛋復(fù)制并保留HA糖基化位點(diǎn)的病毒。實(shí)施例15:HA氨基酸殘基位置141處的精氨酸穩(wěn)定196-197糖基化位點(diǎn)表12顯示，雖然B/JS和B/幾流感病毒株在氨基酸殘基196-199處具有氨基酸序列NKTQ，但只有B/JS能在雞蛋中良好復(fù)制并保留NKTQ糖基化位點(diǎn)。B/JS和B/幾病毒的HA氨基酸序列的比較鑒定了3個(gè)不同的氨基酸殘基。在這3個(gè)殘基中，141R和237E是B/JS獨(dú)有的(相對(duì)于其它B型流感病毒)。大多數(shù)B型流感病毒株在氨基酸殘基位置141和237處含有甘氨酸。為檢驗(yàn)141R和/或237E氨基酸殘基中的一個(gè)或兩個(gè)是否對(duì)穩(wěn)定B/JSHA196糖基化位點(diǎn)有作用，誘變B/JSHA將141R和/或237E改變成甘氨酸。然后測(cè)定各種B/JS病毒在雞蛋中的復(fù)制情況。如表13所示，當(dāng)B/JSHA殘基141從R改變成G時(shí)，以102PFU劑量接種的該病毒不能在雞蛋中復(fù)制。將接種劑量提高至1(^-10SpFU使得該病毒能在雞蛋中復(fù)制。測(cè)序具有HA141G殘基的復(fù)制B/JS病毒以確定196/197糖基化位點(diǎn)是否保留。測(cè)序顯示NKT糖基化位點(diǎn)喪失，而換以DKT或NKTP。該發(fā)現(xiàn)表明B/JS的HA141精氨酸殘基可能穩(wěn)定197/197HA糖基化位點(diǎn)。用甘氨酸取代B/JSHA氨基酸殘基237處的谷氨酰胺不影響其在雞蛋中的生長(zhǎng)。數(shù)據(jù)未顯示。表13:HA141R穩(wěn)定雞蛋傳代期間的196/197糖基化位點(diǎn)所示位置的氨基病毒滴度雞蛋中生長(zhǎng)后的氨病毒酸(logl0PFU/ml)基酸196-199141196-198(197-199)MDCK雞蛋(197-200)cB/JS/10/03RNKT7.48.4"NKTQGNKT7.02.4"8VNKTQ2KTQNKTPB/SH/361/02RNKT7.68.0aNKTQB/Ohio/1/05RNET7.67.9aNETQa'b用所示病毒以0.004的moi感染MDCK細(xì)胞，用在MDCK細(xì)胞中擴(kuò)增的所示6:2重配病毒以102PFU/雞蛋C)或104-105PFU/雞蛋(b)接種雞蛋并在33"溫育3天，所述病毒具有(G+)或不具有(G-)196/197HA糖基化位點(diǎn)。通過(guò)噬斑試驗(yàn)測(cè)定MDCK細(xì)胞內(nèi)的病毒峰值滴度。1則定從雞蛋中回收病毒的HA序列，氨基酸序列改變以下劃線標(biāo)出。為進(jìn)一步證實(shí)HA殘基141R足以在雞蛋復(fù)制期間穩(wěn)定流感BHA196/197糖基化位點(diǎn)，用精氨酸取代B/SH和B/Ohio/1/05的HA141處的甘氨酸而引入氨基酸取代。如表13所示，在HA位置141處具有甘氨酸到精氨酸取代的B/SH和B/Ohio/1/05病毒能在雞蛋中有效復(fù)制，滴度約為8.01ogl。PFU/mL。具有HA141R取代的B/SH和B/Ohio/1/05病毒在雞蛋復(fù)制期間還保留了HA糖基化。參見圖14，其提供的蛋白質(zhì)印跡證實(shí)雞蛋傳代的具有HA141R殘基的B/SH(泳道2)、B/Ohio(泳道4)和B/JS(泳道6)病毒的HA糖基化。這些數(shù)據(jù)表明HA殘基141影響雞蛋生長(zhǎng)的B型流感病毒的HA196/197糖基化位點(diǎn)的用途。實(shí)施例16:B型流感病毒殘基141處的精氨酸不影響病毒的抗原性檢驗(yàn)了取代HA氨基酸位置141處精氨酸殘基對(duì)B型流感病毒株的抗原性的影響。為測(cè)定141R殘基是否影響病毒抗原性，用不同的糖基化和非糖基化病毒制備雪貂血清。檢驗(yàn)雪貂血清對(duì)在141和196/197殘基中含有不同修飾的病毒的反應(yīng)性。利用7.01o&。PFU雞蛋來(lái)源的病毒，通過(guò)鼻內(nèi)接種雪貂來(lái)制備雪貂血清，所述病毒分別在141和196/197位點(diǎn)處含有遺傳簽名GD(非糖基化)或RN(糖基化)。21天后收集雪貂的感染后血清以供在HAI試驗(yàn)中檢驗(yàn)抗原性。分別制備在HA氨基酸位置141和196/197處各含遺傳簽名GD、RN或GN的B/SH/361/02、B/0hio/l/05和B/JS/10/03病毒來(lái)檢驗(yàn)針對(duì)雪貂血清的抗原性。從感染的MDCK細(xì)胞制備這些病毒；含G141和196/197N殘基的流感病毒不能在雞蛋中生長(zhǎng)。在HAI試驗(yàn)中，用非糖基化(GD)B/SH/361/02產(chǎn)生的雪貂血清與非糖基化B/SH/361/02病毒反應(yīng)良好，但不與糖基化B/SH/361/02病毒反應(yīng)；非糖基化病毒的感染后雪貂血清的HAI滴度是糖基化病毒的4倍。類似地，用糖基化(RN)B/SH/361/02病毒產(chǎn)生的雪貂血清與糖基化B/SH/361/02病毒反應(yīng)良好，但不與非糖基化B/SH/361/02病毒反應(yīng)。非糖基化病毒的感染后雪貂血清的HAI滴度的差異仍是4倍。這4倍的差異表明非糖基化和糖基化病毒之間的抗原性差異，實(shí)施例12，表10也有討論。在HAI試驗(yàn)中，用糖基化(RN)B/SH/361/02產(chǎn)生的雪貂血清類似地與RN和GN糖基化病毒反應(yīng)；對(duì)RN糖基化病毒的滴度是GN糖基化病毒的2倍。反應(yīng)活性中的這種微小的差異表明位置141處的氨基酸殘基從甘氨酸改變成精氨酸對(duì)B/SH/361/02抗原性沒有顯著影響。當(dāng)利用B型流感病毒株B/Ohio/1/05和B/JS/10/03進(jìn)行相同的一組HAI試驗(yàn)時(shí)獲得相似結(jié)果。參見表14。表14:氨基酸殘基141對(duì)B型流感病毒株的抗原性沒有影響感染后雪貂血清的幾何以下位置處的氨基酸平均HAI滴度_病毒141196/197GDRNB/SH/361/02GD(G-)203.240.3RN(G+)40.3161.3GN(G+)40.380.6B/Ohio/1/05GS(G-)101.632.0RN(G+)32.0161.3GN(G+)25.480.6B/JS/10/03GD(G-)256.016.0RN(G+)32.0卯.5GN(G+)128.0128.0利用雞紅細(xì)胞檢驗(yàn)雪貂血清對(duì)MDCK來(lái)源病毒的HAI滴度。從3份雪貂感染后血清計(jì)算幾何平均HAI滴度。相似HAI滴度以下劃線標(biāo)出。實(shí)施例17:HA196/197處糖基化影響與a_2，3連接唾液酸的結(jié)合由于HA196/197位點(diǎn)糖基化的B型流感病毒在MDCK細(xì)胞中生長(zhǎng)良好，但在雞蛋中不生長(zhǎng)，HA196/197處糖基化可能影響病毒受體結(jié)合特異性。Sia(a-2，3)Gal和Sia(a-2，6)Gal是在不同宿主細(xì)胞中差異分布的兩種主要受體部分。MDCK細(xì)胞同時(shí)表達(dá)Sia(a-2，3)Gal和Sia(a-2，6)Gal部分。雞胚絨毛膜尿囊膜細(xì)胞只表達(dá)Sia(a-2，3)Gal部分?？赏ㄟ^(guò)血細(xì)胞凝集試驗(yàn)，利用差異性表達(dá)Sia(a-2，3)和Sia(a-2，6)Gal部分的不同動(dòng)物的紅細(xì)胞(RBC)檢測(cè)病毒受體結(jié)合特異性。馬RBC主要表達(dá)Sia(a-2，3)Gal受體，而豚鼠RBC主要表達(dá)Sia(a-2，6)Gal受體。火雞和雞RBC大量表達(dá)Sia(a-2，3)和Sia(a-2，6)Gal部分(Ito等，Virol.156(1997):493-499)。利用馬RBC(hRBC)、豚鼠RBC(gpRBC)和火雞RBC(tRBC)檢驗(yàn)雞蛋來(lái)源的糖基化+(RN)或糖基化—(GS、RS、GD或RD)的B/Ohio/1/05和B/Jiangsu/10/03病毒的HA滴度。無(wú)論B型流感病毒的糖基化狀態(tài)，它們均類似地與表達(dá)Sia(a_2，6)Gal部分的gpRBC和tRBC良好結(jié)合。相反，糖基化+(RN)病毒與只表達(dá)Sia(a-2，3)部分的hRBC結(jié)合不佳或者結(jié)合水平檢測(cè)不到，提示HA196/197處糖基化抑制病毒與Sia(a-2，3)Gal受體結(jié)合。參見表15。表15:HA196/197糖基化抑制HA結(jié)合具有a_2，3連接唾液酸的受體33利用所示紅細(xì)胞的血細(xì)胞凝集以下位置的氨基酸病毒滴度(HA)滴度病毒141196/197(logIQPFU/ml)hRJBCgp匿tRBCB/Ohio/1/05GS(G誦)8.9128128128RS(G-)9.351264128RN(G+)8.1<26464B/JS/10/03GD(G-)8.91024128256RD(G-)7.6643232RN(G+)8.64128256糖基化的病毒不能結(jié)合表達(dá)Sia(a-2，3)部分的細(xì)胞，例如含胚雞蛋的尿囊細(xì)胞，使得B型流感疫苗毒株難以在雞蛋中生長(zhǎng)。糖基化位點(diǎn)喪失使得B型流感病毒株能在雞蛋中生長(zhǎng)，但改變了毒株的抗原性。如果能保留B型流感病毒的HA196/197糖基化位點(diǎn)，同時(shí)維持在雞蛋中生長(zhǎng)和病毒的抗原性將有助于疫苗生產(chǎn)。在B型流感病毒株的HA氨基酸位置141處引入精氨酸是實(shí)現(xiàn)該目的的手段。雖然出于清晰和理解的目的詳細(xì)描述了本發(fā)明，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)知道通過(guò)閱讀本文可在形式和細(xì)節(jié)中作出各種改變而不脫離本發(fā)明的真正范圍。例如，可以各種組合使用上述所有技術(shù)和設(shè)備。如同各份出版物、專利、專利申請(qǐng)或其它文件單獨(dú)表明出于所有目的通過(guò)引用納入本文的程度一樣，本申請(qǐng)的引用的所有出版物、專利、專利申請(qǐng)或其它文件出于所有目的通過(guò)引用全文納入本文。具體地說(shuō)，以下專利申請(qǐng)通過(guò)引用全文納入本文2007年6月18日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?0/944，600。權(quán)利要求一種制備在雞蛋中復(fù)制增強(qiáng)的HA糖基化的B型流感病毒的方法，該方法包括(a)將導(dǎo)致HA位置141處的氨基酸取代為精氨酸的突變引入B型流感病毒基因組；和(b)在產(chǎn)生B型流感病毒的條件下復(fù)制該突變的流感病毒基因組。2.如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，通過(guò)定點(diǎn)誘變實(shí)施所述引入步驟。3.—種制備在雞蛋中復(fù)制增強(qiáng)的HA糖基化的B型流感病毒的方法，該方法包括(a)將多個(gè)載體引入一群宿主細(xì)胞，所述載體包含對(duì)應(yīng)于以下的核苷酸序列(i)第一B型流感病毒株的至少6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段；禾口(ii)至少第二B型流感病毒株的編碼HA和NA多肽的一個(gè)或多個(gè)基因組區(qū)段，其中所述HA多肽在氨基酸殘基141處包含精氨酸；(b)在不超過(guò)35t:的溫度下培養(yǎng)該群宿主細(xì)胞；禾口(c)回收流感病毒。4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，還包括在步驟(i)之前在所述多個(gè)載體的一個(gè)載體中引入突變；其中所述一個(gè)載體包含對(duì)應(yīng)于編碼HA的基因組區(qū)段的核苷酸序列，禾口其中所述突變導(dǎo)致氨基酸殘基141處為精氨酸。5.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第一B型流感病毒具有以下屬性之一溫度敏感性、減毒或冷適應(yīng)性。6.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第一B型流感病毒包含以下氨基酸殘基PB263°(630R);PA431(431M);PA497(497H);NP55(55A);NP114(114A);NP"。(410H);NP510(510T);M1159(159Q)和Ml183(183V)。7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，還包括以下步驟；在所述多個(gè)載體的載體中引入突變；所述載體包含對(duì)應(yīng)于所述第一B型流感病毒株的6個(gè)內(nèi)部基因組區(qū)段的核苷酸序列，和所述突變導(dǎo)致存在以下氨基酸殘基PB263°(630R);PA431(431M);PA497(497H);NP55(55A);NP"4(114A);NP"。(410H);NP510(510T);M1159(159Q)和Ml183(183V)。8.如權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述第一B型流感病毒是病毒株B/AnnArbor/1/66。9.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述細(xì)胞是Vero細(xì)胞、Per.C6細(xì)胞、BHK細(xì)胞、PCK細(xì)胞、MDCK細(xì)胞、MDBK細(xì)胞、293細(xì)胞或COS細(xì)胞中的一種。10.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述載體是質(zhì)粒。11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)載體包含8質(zhì)粒組，其中所述8質(zhì)粒中各自包含對(duì)應(yīng)于所述第一或第二B型流感病毒株的不同基因組區(qū)段的核苷酸序列。12.如權(quán)利要求IO所述的方法，其特征在于，所述多個(gè)載體中各質(zhì)粒包含所有的核苷酸序列。13.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述方法不包括利用輔助病毒。14.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，通過(guò)脂質(zhì)介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染或電穿孔實(shí)施所述引入步驟。15.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述溫度介于30-35t:之間。16.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述溫度介于32-35t:之間。17.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，還包括用雞蛋復(fù)制回收的流感病毒；其中用雞蛋復(fù)制的流感病毒保留HA氨基酸殘基位置196/197糖基化位點(diǎn)；禾口其中所述流感病毒用雞蛋復(fù)制到至少7.OloglOPFU/ml的峰值滴度。18.通過(guò)權(quán)利要求3或7所述方法制備的B型流感病毒。19.一種免疫原性組合物，其包含權(quán)利要求18所述的B型流感病毒。20.—種疫苗，其包含權(quán)利要求19所述的B型流感病毒。21.如權(quán)利要求20所述的疫苗，其特征在于，所述疫苗適合于鼻內(nèi)給藥。22.如權(quán)利要求3或17所述的方法，其特征在于，還包括殺傷所述回收的病毒。23.—種減毒的活B型流感病毒疫苗，其包含通過(guò)權(quán)利要求3或8所述方法制備的病毒。24.—種治療對(duì)象病毒感染的方法，包括給予所述對(duì)象通過(guò)權(quán)利要求3或8所述方法制備的病毒，其給予量有效產(chǎn)生抵御所述病毒感染的免疫反應(yīng)。全文摘要本發(fā)明包括在細(xì)胞培養(yǎng)物中產(chǎn)生B型流感病毒的方法。B型流感病毒可具有所需特征，例如在雞蛋中復(fù)制增強(qiáng)，可用在例如疫苗和防止B型流感病毒感染的治療方法中。文檔編號(hào)C12N7/02GK101715487SQ200880020720公開日2010年5月26日申請(qǐng)日期2008年6月18日優(yōu)先權(quán)日2007年6月18日發(fā)明者H·金,陳忠英申請(qǐng)人:米迪繆尼有限公司