專利名稱：：檢測和分離生物流體樣品中血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)同種型的方法和由此獲得的酶同種型的制作方法檢測和分離生物流體樣品中血清Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)同種型的方法和由此獲得的酶同種型本發(fā)明涉及檢測和分離血清Y_谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)同種型(isoform，同工酶)(sGGT)——其存在于生物流體如，例如血清或血漿的樣品中——的方法以及通過本發(fā)明的方法獲得的酶同種型。Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(EC2.3.2.2，也稱為Y-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶)是在血液(5)、大多數(shù)生物流體中以及大多數(shù)細(xì)胞類型的質(zhì)膜上發(fā)現(xiàn)的酶。一些組織，如腎皮質(zhì)、腦脈絡(luò)叢、膽管結(jié)構(gòu)(bilestructure)、泌乳乳腺尤其富含GGT(6)。大多數(shù)實體瘤(7)以及T_白血病細(xì)胞一一髓系和淋巴細(xì)胞(8)——也特別富含GGT。GGT是唯一的能夠催化谷胱甘肽(GSH)——哺乳動物細(xì)胞中最重要的抗氧化劑——水解的酶(9)。GGT位于細(xì)胞膜的外表面上的事實暗示其底物將主要是細(xì)胞外的GSH，并且本發(fā)明人獲得的實驗結(jié)果已經(jīng)為此提供了證據(jù)。雖然谷胱甘肽水解在腎臟腎小管細(xì)胞和其他通常含GGT的組織中回收GSH中具有生理功能，但是其在病理組織中通過產(chǎn)生活性氧種類、自由基和激發(fā)氧化事件而對細(xì)胞結(jié)構(gòu)具有有害結(jié)果(10)。而且，在腫瘤細(xì)胞中，高GGT活性的表達(dá)使得它們通過GSH的細(xì)胞外水解產(chǎn)物——其能夠與藥物反應(yīng)并鈍化藥物——的特別反應(yīng)性而對抗腫瘤的化療劑產(chǎn)生抵抗。迄今為止，GGT——其存在于血液循環(huán)中，稱為血清GGT(sGGT)——的生理功能還沒有得到很好的闡明，但是已知sGGT活性根據(jù)年齡、性別、生理狀況而不同，并且是這樣的病理狀況如肝膽病理狀況和酒精中毒的后果。由于這個原因，sGGT活性分析一般作為臨床化學(xué)中的測試應(yīng)用，這是由于sGGT水平被認(rèn)為是肝膽病理狀況和飲酒的標(biāo)記物。在許多患者中檢測到高(病理的)sGGT值，但是只在非常低百分比的病例中實際上診斷為腎病或確認(rèn)為酒精濫用。許多患者經(jīng)受長時間的昂貴的診斷程序(如，例如，實驗室檢查、超聲掃描、腎活檢等)，而沒有最終導(dǎo)致已有病狀的任何診斷。而且，近年來，不論腎病理的存在與否，sGGT作為發(fā)病率和早死率(prematuremortality)的最強預(yù)測因子之一產(chǎn)生。在過去10年中出版的著作實際上已經(jīng)表明到目前為止sGGT水平被認(rèn)為是非病理性的，雖然取決于參考范圍(sGGT5-50U/L)的高側(cè)(highside)(sGGT〉25U/L)，其與升高的心血管死亡率以及糖尿病的風(fēng)險相關(guān)(1，2，3)。甚至更近期地，已經(jīng)顯示回收后測定的sGGT水平是許多病理中不利進程——不僅是心血管病理進程而且是腫瘤、變性以及其它病理進程(4)——的最強的指示。清楚的是，盡管通過使用單獨的sGGT測定，其預(yù)測值的極寬范圍使其不可能預(yù)測將會影響患者的病理——更不用說其結(jié)果，也不可能指導(dǎo)隨后的診斷-治療方法，但是這種強的死亡率和發(fā)病率指示可能在臨床上非常有用。由于這個原因，血清GGT活性的測定被視為是靈敏且準(zhǔn)確的實驗室測試，但遺憾的是，不是特異的測試。實際上，即使已知sGGT水平的決定因素，但是關(guān)于這種酶的來源、性質(zhì)、功能以及后果卻知之甚少。包括在正向決定因素內(nèi)的是例如飲酒、用藥——包括口服避孕藥——年齡、疾病如糖尿病、高動脈壓和高膽固醇血癥，而包括在負(fù)向決定因素內(nèi)的是鍛煉、喝咖啡和肺換氣量(1)。許多研究已經(jīng)涉及不同GGT同工酶的研究(12)，試圖建立與具體的病理學(xué)和/或不同來源組織的關(guān)聯(lián)。實際上，由于已經(jīng)在人類中鑒別出能夠編碼活性GGT的單個基因(13)，所以使用術(shù)語"同工酶"來指不同的可檢測的GGT形式是不完全正確的；相反，使用一般術(shù)語"同種型"似乎更正確。很長時間已知，通過應(yīng)用各種方法，可能將來源于不同組織的GGT以及不同形式的血清GGT區(qū)別開，因為有可能在疾病的進程中顯示不同GGT形式的出現(xiàn)，或至少展示不同GGT形式的模式變化。為了檢測和分離GGT同種型，已經(jīng)應(yīng)用不同的技術(shù)，但是卻產(chǎn)生兩個重要的問題。第一個問題包括測定的低靈敏度，而第二個問題由極度的蛋白質(zhì)親脂性引起的，這在許多情況下使以實現(xiàn)末端親脂部分脫離從而允許在液體體系中分析蛋白質(zhì)為目的的GGT的蛋白水解消化變成必要。通過應(yīng)用凝膠過濾、瓊脂糖凝膠電泳、等電聚焦、凝集素親和或陰離子交換層析技術(shù)(其是考慮酶的蛋白水解消化并且不能在組織提取物和血漿上進行的程序)，已經(jīng)可能證明不同的組織產(chǎn)生相同的酶蛋白質(zhì)但是具有不同的糖基化并且因此具有不同的表面靜電電荷(14)。對于血清GGT，似乎用一些技術(shù)(例如陰離子交換)是均一的而用另外的技術(shù)(例如，瓊脂糖凝膠或醋酸纖維素電泳)是不均一的。歸功于Huseby(5、15)所做的研究，已經(jīng)對這種表面上的不一致進行了闡明只有腎來源的GGT存在于血液循環(huán)中，所以在使用涉及蛋白酶解的技術(shù)時在生物流體如血漿、血清或尿中可檢測的酶具有均一的表現(xiàn)，并且在靜電電荷的基礎(chǔ)上進行分離，而當(dāng)使用不涉及蛋白酶解的技術(shù)時，不同同種型的鑒定至少部分地取決于GGT與不同血漿脂蛋白結(jié)合的能力(16)。遺憾的是，這些技術(shù)的低靈敏度已經(jīng)使得不均勻性問題只在具有高GGT讀數(shù)的患者(如例如，受到膽汁淤積影響的對象)中被研究，因而，血清GGT與不同脂蛋白結(jié)合的機理、決定因素和精確的病理生理關(guān)聯(lián)性至今沒有被闡明，也不能真正地確定即使在血清酶促活性的正常水平下，是否只有存在的GGT是肝臟類型。目前，用動力學(xué)-酶促分析進行GGT化學(xué)-臨床測定(17)，所述動力學(xué)-酶促分析基于顯色底物(Y-谷氨酰基-4-硝基酰苯胺(nitroanilide)或Y_谷氨?；鵢3_羧基-4-硝基酰苯胺)的分解，以與樣品中GGT活性成比例的數(shù)量釋放著色產(chǎn)物(4-硝基苯胺)。已經(jīng)在商業(yè)上提議了使用裝置(BeckmanParagon)的GGT同種型的分析，其主要需要在醋酸纖維素支持物上進行血清蛋白電泳(類似于血清蛋白的正常電泳)以及借助于產(chǎn)生著色產(chǎn)物的底物檢測與血清蛋白共遷移的GGT條帶的存在，所述著色產(chǎn)物與條帶中GGT的量成比例(18)。以這種方式，獲得在其中不同的GGT條帶可檢測的圖，并且尤其是檢測與清蛋白共遷移的GGT條帶以及各種緊鄰血清脂蛋白共遷移的其他條帶。使用這樣的程序，不可能確定GGT是否與清蛋白和脂蛋白物理結(jié)合或其是否僅僅產(chǎn)生在支持物上以相同的速率遷移的條帶。近年來，不同GGT同種型的性質(zhì)問題引起了少量的興趣，因為它們不可能鑒定不同GGT的存在/不存在或絕對或相對強度與研究的疾病(唯一的例外是肝癌；19,20)之間的任何病理關(guān)聯(lián)。該不足主要由這樣的事實引起，所述事實是，迄今為止，GGT已經(jīng)被錯誤地認(rèn)為僅僅是肝膽損傷或酒精濫用的標(biāo)記物。由于這些原因，這樣的技術(shù)從未進入臨床應(yīng)用。最近，由于本發(fā)明人進行的研究，已經(jīng)證明1)GGT是一種心臟危險因子(21);2)在腦和脈絡(luò)膜以及心臟損傷中的動脈硬化斑塊(可引起如心臟病發(fā)作和中風(fēng)這一類的病理)內(nèi)發(fā)現(xiàn)GGT(10，22，23);3)在動脈硬化斑塊內(nèi)，GGT與氧化的脂蛋白沉積物復(fù)合(22);4)GGT本身能夠引起LDL脂蛋白的氧化(24)，并且該事件被認(rèn)為對于動脈硬化斑塊的形成和其不穩(wěn)定是至關(guān)重要的，其引起動脈硬化性疾病的最終結(jié)果，即心臟病發(fā)作和中風(fēng)。由于這些原因，GGT與引起動脈硬化的脂蛋白(例如LDL和脂蛋白(a))和防止動脈硬化的脂蛋白(例如，HDL)的結(jié)合以及所有組織和血清GGT同種型的詳細(xì)研究能夠在心血管疾病的預(yù)防、心血管和代謝藥物的開發(fā)以及其中增加的GGT水平或其同種型的修飾可以起重要作用的病理的診斷和鑒別診斷中達(dá)成實質(zhì)性的進展。然而，這樣的研究不能用目前可用的GGT分析技術(shù)來進行，原因在于包括蛋白酶解的所有程序(等電聚集、陰離子交換和親和層析等)導(dǎo)致GGT從不同的血漿載體中脫離。基于電泳的程序中的蛋白質(zhì)的差別性遷移是由于幾種因素(如電荷、質(zhì)量、體積等)的結(jié)合，因此，不可能通過這些技術(shù)來確定每一條帶的準(zhǔn)確性質(zhì)，這是由于每個單一條帶的形成是由幾種因素的共同作用決定的。雖然可以使用其中脂蛋白通過用聚陽離子的沉淀來分離的程序(例如，通過沉淀單一的脂蛋白類型并且分析與其沉淀的GGT的量)，但是這些技術(shù)沒有提供足夠的特異性，因為不同脂蛋白的沉淀不具有足夠的選擇性并且過多地受到溫度和PH條件的影響。脂蛋白分離可以通過密度梯度超離心技術(shù)實現(xiàn)，其中不同的脂蛋白類型由于它們不同的密度而以連續(xù)的或逐步的梯度通過離心血清或血漿樣品來分離。然而，這樣的程序包括使用在生物分析實驗室中不是非常常見的設(shè)備(超離心機)并且特別需要非常長的離心時間(大約數(shù)十小時)，這可能引起樣品的敗壞。因而，需要檢測血清GGT同種型的方法，所述方法足夠靈敏以允許檢測甚至在被認(rèn)為非病理(sGGT5-50U/L)值的范圍內(nèi)的酶。這樣的分析使區(qū)分和定量不同的血清GGT同種型或血清GGT同種型的不同模式成為可能，允許每一同種型或同種型模式和待研究的具體病理之間相關(guān)聯(lián)。這將在人類和經(jīng)濟成本方面產(chǎn)生改進的診斷能力以及顯著的節(jié)省。因此，本發(fā)明的一個目標(biāo)是提供檢測生物流體樣品中的血清Y_谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)同種型的方法，所述方法比現(xiàn)有技術(shù)中公開的方法更靈敏、準(zhǔn)確、簡單并且更具有成本效益。本發(fā)明的另一目標(biāo)是提供檢測生物流體樣品中的sGGT同種型的方法，所述方法允許鑒定和量化樣品中的各種sGGT同種型。本發(fā)明進一步的目標(biāo)是提供檢測生物流體樣品中的sGGT同種型的方法，所述方法允許基于單一的化學(xué)物理參數(shù)，即，分子量來鑒定同種型，從而允許量化與每一脂蛋白類型物理結(jié)合的GGT。這些和其它的目標(biāo)通過檢測生物流體樣品中的血清Y_谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)同種型的方法來實現(xiàn)，該方法包括下述步驟(a)借助于適合基于分子量分離血清蛋白的凝膠過濾HPLC柱，通過高效液相色譜(HPLC)分離存在于樣品中的血清蛋白，以實現(xiàn)將血清蛋白分離成不同的餾分(級分，組分，fraction)并且隨后將分別與每一餾分復(fù)合的不同sGGT同種型分離；(b)使在前面步驟中獲得的每一蛋白質(zhì)餾分與Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)底物進行柱后反應(yīng)，所述底物能夠形成在GGT的存在下在這樣的蛋白質(zhì)餾分中可檢測的產(chǎn)物；(c)測定在每一蛋白質(zhì)餾分中可檢測產(chǎn)物的存在或不存在，在給定蛋白質(zhì)餾分中可檢測產(chǎn)物的存在表示在所述蛋白質(zhì)餾分中復(fù)合的GGT同種型的存在。根據(jù)本發(fā)明的方法檢測sGGT同種型可以在包含GGT的生物流體，如例如血漿、血清、尿的任何樣品上進行，以及也可以在細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)菌培養(yǎng)物上清上進行。以非限制性實例形式給出的下述詳述是指所附的圖，其中圖1是本發(fā)明的方法和可以用于實施本發(fā)明方法的裝置的示意性代表圖；圖2示出了通過以不同的濃度將GGT注射到HPLC柱中獲得的GGT標(biāo)準(zhǔn)校準(zhǔn)曲線；圖3示出了從注射到圖l系統(tǒng)中的血漿樣品中獲得的兩個色譜圖。實線通過使用Y-Glu-AMC作為GTT反應(yīng)的底物獲得的在線熒光色譜圖(A激發(fā)=380nm，X發(fā)射=440nm);虛線在X=40Snm，通過使用Y-Glu-4-NA作為底物獲得的旁線(at-line)色譜圖；圖4示出了在表1中報道的條件下，通過將獲自對照對象(血液供體)的血漿樣品注射到圖1系統(tǒng)中獲得的GGT活性分布曲線；和圖5示出了血漿中和通過在不同密度下超離心獲得的各個的脂蛋白餾分中的GGT活性。參考圖l，本發(fā)明的方法可以通過使用高效液相色譜(HPLC)裝置進行，其基本上在每一分析實驗室中顯示了優(yōu)點。而且該方法考慮GGT酶與GGT底物的在線柱后反應(yīng)(post-columnreaction)，所述GGT底物被設(shè)計為產(chǎn)生可檢測產(chǎn)物，優(yōu)選著色的(發(fā)色團)或熒光化合物(可分別通過分光光度計和熒光計檢測)。液相色譜儀有利地是廣泛使用的、可自動化的、控制成本的儀器，其適合用于常規(guī)分析，也可以由不熟練的工人使用。液相色譜儀允許構(gòu)成混合物的單一成分的分離。圖1中的部分A代表通過在裝備有泵、注入閥和分離柱的高效液相色譜儀(HPLC)對待分析的生物流體樣品進行的色譜分離。注入的樣品通過分離柱，即，被設(shè)計為根據(jù)分子量分離GGT同種型的HPLC柱，以便從該柱獲得不同蛋白質(zhì)餾分的洗脫液，所述洗脫液由具體的分子量表征。圖1的部分B代表在適當(dāng)濃度的GGT催化的轉(zhuǎn)肽基反應(yīng)的受體的存在下，柱洗脫的餾分與GGT底物的混合，所述底物被指定為產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物，尤其是著色的(例如，Y_谷氨酰_4-硝基酰苯胺)或熒光(例如，Y_谷氨酰_7-酰氨基-4-甲基香豆素)化合物。在適合加速在線柱后酶促反應(yīng)的溫度下，例如，37t:的溫度下，各種柱洗脫餾分與GGT底物的混合在置于恒溫浴中的混合線圈(mixingcoil)中發(fā)生。包含在線柱后酶促反應(yīng)的底物的溶液從注射器泵(例如，臨床使用的裝備有罐或儲液器的常見的輸注器)遞送。最后，通過記錄流出所述混合線圈的流(流出物)的吸收或熒光來檢測著色的或熒光產(chǎn)物。根據(jù)峰面積(數(shù)量)和在柱中的保留時間(分子量)來確定存在于每一洗脫餾分中的GGT的活性(數(shù)量)和相關(guān)的酶同種型的分子大小。提供下述實施例僅僅是說明的目的，而不被認(rèn)為是對如在所附權(quán)利要求中所具體說明的本發(fā)明范圍的限制。原理同種型分離色譜技術(shù)，特別是高效液相色譜(HPLC)允許通過利用置于色譜柱內(nèi)的固定相和流動穿過同一柱的流動相之間的親和平衡來分離混合物的兩種或多種成分。該技術(shù)中的原理是與對固定相具有低親和力而對流動相具有高親和力的物質(zhì)相比，對固定相比對流動相具有更高親和力的物質(zhì)花費更長的時間流動穿過色譜柱。在HPLC技術(shù)中，待測試的樣品被注在色譜柱的頂部，并且由于施加高壓由流動相驅(qū)動通過固定相。為了實現(xiàn)非常有效的分離——這是HPLC的特征，加載顆粒的大小需要非常小。施加高壓是保持適當(dāng)?shù)南疵撍俾柿鲃铀仨毜?，并因此需要足夠的分析時間。檢測器，例如熒光計、分光光度計或電化學(xué)設(shè)備以及在餾分從柱洗脫時鑒定和/或量化所述餾分中物質(zhì)的計算器被設(shè)置在柱的底部。HPLC色譜允許鑒定和量化各種血槳GGT同種型。在本具體的情況下，GGT同種型——當(dāng)它們具有顯著不同的分子大小時——以不同的親和力保留在柱中并且因此它們顯示出不同的保留體積(VK)。凝膠過濾柱的使用使不同大小的分子由于這樣的事實而分離——固定相微孔材料含有不同大小的裂縫(孔)，因此較大的分子在固定相中移動的空間按比例更小。從而，以恒定的速率將緩沖溶液注入到柱中使得較大分子以按比例較高的速率移動，這些分子具有更有限體積來移動。相反，較小的分子，其能夠進入較大的孔和較小的孔——較大的分子不能進入較小的孔——更緩慢地移動通過柱。通過使用凝膠過濾柱并且方便地選擇材料的孔隙率，可能分離血漿脂蛋白，如例如由Usui等人(25)和0kazaki等人(26)描述的。最后，在GGT存在下以恒定速率在柱的下游注入能夠產(chǎn)生可檢測反應(yīng)的試劑允許評估在每一脂蛋白餾分中GGT的量，每一餾分通過不同的分子量以及因此通過在柱中的不同保留時間來表征。同種型的檢測總的GGT-催化的反應(yīng)可以被簡明地表示如下Y-Glu-底物+受體ccr,產(chǎn)物+Y-Glu-受體已知該反應(yīng)通過下述改良的乒乓(ping-pong)機制進行下去步驟(1):酶結(jié)合Y-谷氨酰基-供體底物并且釋放第一反應(yīng)產(chǎn)物Y-Glu-底物+GGT—Y-Glu-GGT+產(chǎn)物步驟(2):產(chǎn)生的Y-谷氨?；；?酶(Y-Glu-GGT)能夠與水(水解)或與受體底物(典型地，氨基酸或二肽，如例如甘氨酰甘氨酸)反應(yīng)，在第二反應(yīng)步驟(脫酰作用)中分別產(chǎn)生谷氨酸鹽或轉(zhuǎn)肽產(chǎn)物Y-Glu-GGT+甘氨酰甘氨酸一Y-Glu-甘氨酰甘氨酸+GGT除了根據(jù)單一的化學(xué)-物理參數(shù)分離同種型，本發(fā)明的另外的創(chuàng)新方面在于基于在線柱后酶促反應(yīng)對GGT同種型進行靈敏的選擇性的檢測，其中上述GGT和底物之間的反應(yīng)在色譜分離下游的混合線圈中進行。為了檢測GGT活性，使用Y-谷氨酰基-供體底物是必要的，所述Y-谷氨酰基-供體底物被選定為產(chǎn)生具有不同化學(xué)-物理特征并因此可通過適當(dāng)?shù)臋z測設(shè)備檢測的反應(yīng)產(chǎn)物。用于檢測GGT的合成底物(如Y_谷氨酰_7-酰氨基-4-甲基香豆素、Y_谷氨酰_4-甲氧基-萘酰胺、Y-谷氨酰-4-硝基酰苯胺、Y-谷氨酰-3-羧基4-硝基酰苯胺、Y_谷氨酰-3，5-二溴-4-羥基-酰苯胺)滿足這樣的要求。在本文下面給出的本發(fā)明的具體實施方式的實例中，使用了底物Y-谷氨酰-7_酰氨基_4-甲基香豆素(Y-Glu-AMC)，其是熒光分子，在GGT的反應(yīng)之后，按照下列轉(zhuǎn)肽反應(yīng)，產(chǎn)生產(chǎn)物7-氨基-4-甲基香豆素(AMC):<formula>formulaseeoriginaldocumentpage8</formula>產(chǎn)物AMC顯示出與起始底物Y-Glu-AMC不同的熒光激發(fā)/發(fā)射光譜(29)，并且可以通過使用熒光計在380nm的激發(fā)波長(A激發(fā)=380nm)和在440nm發(fā)射波長(Aem=440nm)下進行檢測。熒光檢測呈現(xiàn)靈敏的優(yōu)點，顯示對GGT酶的0.lmU的檢測限制。然而，根據(jù)選擇的底物的類型，與洗脫自色譜柱的不同蛋白質(zhì)餾分復(fù)合的GGT的活性可以通過使用其它商業(yè)上可用的檢測設(shè)備(uv-可見光分光光度計、電化學(xué)檢測器)來在本文描述的具體實施方式的實例中，在連續(xù)的流動下，含有源自輸注器(圖l，B部分)的供體底物Y-Glu-AMC的混合物與源自色譜柱(圖1，A部分)的洗脫物混合。供體底物與出自色譜柱的洗脫物反應(yīng)。由于熒光產(chǎn)物AMC只在GGT酶的存在下特異地形成，所以熒光信號只有具有GGT同種型的洗脫物時被看到。本方法允許血漿GGT同種型的保留體積(VK)以及因此分子量可視化。根據(jù)本實施方式，用于酶促在線柱后反應(yīng)的反應(yīng)混合物優(yōu)選地包含下述量的下述成分:-O.125MTris緩沖液，pH8.3;-180iiMy-Glu-AMC;存在于HPLC泵的儲存器中的色譜洗脫相優(yōu)選地包含下述量的下列成分-O.IM磷酸鹽緩沖液，pH7.4，含有0.2MNaCl和0.ImMEDTA;_5.4mM甘氨酰甘氨酸(GG，y-谷氨?；鶊F的受體)。通過與在線柱后衍生(derivitization)——使用底物Y-Glu-AMC——和熒光法檢測(A激發(fā)=380nm和A發(fā)射=440nm)偶聯(lián)的液相色譜，用于檢測GGT同種型的最佳操作條件示于下面的表I中表I<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>圖2示出了通過注射不同濃度的GGT獲得的GGT標(biāo)準(zhǔn)(牛腎GGT的商業(yè)制品，溶于O.1M磷酸鹽緩沖液，pH7.4)的校準(zhǔn)曲線。圖2中示出的校準(zhǔn)是在表I中報告的操作條件下使用FIA(流動注射分析，flowinjectionanalysis)技術(shù)完成的，其使用圖I中的系統(tǒng)但是沒有色譜柱。這種技術(shù)允許獲得與在分離柱存在下獲得的那些反應(yīng)類似的反應(yīng)(峰面積)，但是時間較短(大約4分鐘對大約50分鐘)并且可以有利地與商業(yè)標(biāo)準(zhǔn)一起使用，用于系統(tǒng)的校準(zhǔn)。得到的實驗點在三個數(shù)量級范圍內(nèi)的是線性的，動力學(xué)線性范圍為0.5-150mU/ml(對應(yīng)于O.05_15mU/ml)，靈敏度因數(shù)為3.806±0.116面積ml/(R2=0.952，N=8點)，并且檢出限制為0.5mU/ml(LODC=0.167mU/ml)。標(biāo)準(zhǔn)偏差是指N=相同實驗點的7次重復(fù)。實驗實施例柃測人血漿中的GGT同種型(1)血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品的制備通過將獲自IO個對象的血漿等份混合獲得血漿標(biāo)準(zhǔn)樣品。由此得到的庫(pool)被分成150L的等分試樣，其被儲存在-2(TC直到使用。(2)HPLC使用具有下列特件的色譜梓:Superose-610/300GL分子過濾柱(GEHealthcare)，其具有13yM的粒徑、30cm的長度和lcm直徑。0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4被用作洗脫液，其含有0.2MNaCl，O.lmMEDTA和5.4mM甘氨酰甘氨酸。使用100iiL(注射體積)的注射環(huán)。使用具有0.5mL/min流速的等度洗脫條件。(3)用于杵后衍牛反應(yīng)的混合物在0.005NNaOH中制備底物儲存溶液，3.6Mmy-Glu-AMC并儲存在+4°C。每日以0.25Tris緩沖液pH8.3制備用于柱后衍生反應(yīng)的混合物，180yMy-Glu-AMC。(4)樣品的Ml:在作為抗凝劑的EDTA的存在下，在Vacutest管中對來自待分析對象的外周全血(3ml)進行取樣。在4t:以1500Xg將血液離心10分鐘以除去顆粒物并獲得血漿。由此獲得的血漿用洗脫相以l:2稀釋注射到圖1的系統(tǒng)中。(5)分析禾g序通討毎日泮射用洗脫相以1:2稀釋的標(biāo)準(zhǔn)血清來校準(zhǔn)系統(tǒng)。稀釋的血清樣品被注射到圖i描述的系統(tǒng)的環(huán)中。圖3將通過使用熒光底物y-Glu-AMC和發(fā)色團底物y-谷氨酰基_4-硝基酰苯胺(y-Glu-NA)獲得的典型色譜圖疊加。在兩種情況下，在下述條件下進行色譜superose-610/300GL柱(GEHealthcare);注射環(huán)=100iiL;在含有O.2MNaC1、0.lmMEDTA和作為受體的5.4mM甘氨酰甘氨酸的0.1M磷酸鹽緩沖液pH7.4中的0.5ml/min等度洗脫。熒光底物的衍生流速=0.lmL/min。在前面的情況下，通過使用圖1的系統(tǒng)和熒光底物y-Glu-AMC檢測GGT洗脫曲線。在后面的情況下，以0.5ml餾分收集來自圖1中系統(tǒng)的色譜柱的洗脫物并且基于發(fā)色團底物y-Glu-NA的分解和與餾分中GGT活性成比例的著色產(chǎn)物(A=405nm)的釋放，用酶促動力學(xué)分析(30)檢測這些餾分中的每一個餾分的活性。在圖4中，通過注射來自不同對照對象的血漿樣品并且使用y-Glu-AMC作為檢測GGT活性的底物獲得的色譜圖以實例的方式示出。可以看到4個活性峰，對應(yīng)于在VK=11.6;14.8;18.9;21.7ml的不同GGT同種型，分別對應(yīng)于以大約2000、940、140和70Kda的分子量表征的餾分?；诜迕娣e和校準(zhǔn)曲線確定與每一峰有關(guān)的GGT濃度?？蛇x地，在整個色譜圖下的面積和在血漿樣品上測量的GGT的全部酶活性(考慮稀釋因素)之間的比例可以作為參考。由于與每一個GGT活性峰相關(guān)的分子量對應(yīng)于血漿中的脂蛋白類型的分子量，所以在密度梯度中對血漿樣品進行超離心以分離主要的脂蛋白類型(VLDL、LDL、HDL)。然后，由此得到的脂蛋白餾分被注射到圖1中演示的系統(tǒng)中，從而評價GGT含量。如在圖5中看到的，雖然總的血漿圖(a)顯示了由編號l-4表示的區(qū)域中的活性餾分，但是單獨注射純化的VLDL(b)沒有顯示峰，而富集LDL(c)和HDL(d)的血漿分別在區(qū)域l和2(c)和3(d)顯示出增加的峰。最后，耗盡脂蛋白的血漿在除了條帶4外的所有條帶中顯示出減少。因此，以不同密度超離心血漿使得三種sGGT同種型得以分離形式1和2(分子量分別為2000和940KDa)在d=1.063處漂浮；分子量為140KDa的形式3在d=1.21處漂浮。這種密度分別與LDL和HDL對應(yīng)，這因此證實了循環(huán)GGT與這些脂蛋白餾分相關(guān)。另一方面，sGGT形式4(70KDa)在任何脂蛋白餾分中都沒有發(fā)現(xiàn)，并且可能因此與血漿可溶的酶相對應(yīng)，如由分子量所同樣暗示的。文獻(xiàn)參考資料1.Wa皿ametheeG，EbrahimS，ShaperAG.Gamma—glutamyltransferase-determinantsandas_sociationwithmortalityfromischaemicheartdiseaseandallcauses.AmJEpidemiol.1995;142:699-708.2.Ruttma皿E.，BrantLJ.，ConcinH.，DiemG，RappK.，UlmerH.Y—Glutamyltransferaseasariskfactorforcardiovasculardiseasemortality.Aninvestigationinacohortof163，944Austrianadults.Circulation.2005;112:2130-7.3丄eeDS，EvansJC，RobinsSJ，WilsonPW，AlbanoI，F(xiàn)oxCS，WangTJ，BenjaminEJ，D'AgostinoRB，VasanRS.Gammaglutamyltransferaseandmetabolicsyndrome,cardiovascu—lardisease,andmortalityrisk:theFraminghamHeartStudy.ArteriosclerThrombVaseBiol.2007;27:127_33.4.Kazemi-ShiraziL，EndlerG，WinklerS，SchickbauerT，Wagner0，MarsikC.GammaGlu—tamyltranspeptidaseandLong—TermSurvival:IsItJusttheLiverClinChem2007;53:940-946.5.HusebyNE，Ingebretsen0C.Thelevelofgamma—glutamyltransferaseinserum，effectofcarbohydrateheterogeneityonclearancerate.ScandJClinLabInvestSuppl.1993;215:93—100.6.HaniganMH，F(xiàn)riersonHFJr，Imm皿ohistochemicaldetectionofgamma—glutamyltranspep—tidaseinnormalhumantissue.JHistochemCytochem.1996;44:1101_8.7.HaniganMH，F(xiàn)riersonHFJr，SwansonPE，DeYoungBR.Alteredexpressionofgamma—glutamyltranspeptidaseinhumantumors.HumPathol1996;30:300_5.8.KhalafMR，HayhoeFG.CytochemistryofY—glutamyltransferaseinhaemiccellsandmalig—nancies.HistochemJ.1987;19:385—95.9.MeisterA.Glutathionemetabolism.MethodsEnzymol.1995;251:3_7.10.DominiciS，PaolicchiA，LorenziniE，MaellaroE，ComportiM，PieriL，MinottiG，Pom-pellaA.Gamma—glutamyltransferase—dependentprooxidantreactions:afactorinmultipleproc—esses.Biofactors.2003;17:187_98.11.PompellaA，DeTataV，PaolicchiA，ZuninoF.Expressionofgamma—glutamyltransferaseincancercellsanditssignificanceindrugresistance.BiochemPharmacol.2006;71:231_8.12.NemesanszkyE，LottJA.Gamma—glutamyltransferaseanditsisoenzymes:progressandproblems.ClinChem.1985;31:797—803.13.CourtayC，HeisterkampN，SiestG，GroffenJ".ExpressionofmultipleY—glutamyltransferasegenesinman.BiochemJ.1994;297:503—8.14.EvjenG，HusebyNE.Characterizationofthecarbohydratemoietyofhumangamma—glutamyltransferasesusinglectin_blottingandglycosidasetreatment.ClinChimActa.1992;209:27_34.15.HusebyNE.Separationandcharacterizationofhumangamma—glutamyltransferases.ClinChimActa.1981;111:39—45.16.HusebyNE.Multipleformsofserumgamma—glutamyltransferase.Associationoftheen_zymewithlipoproteins.ClinChimActa.1982;124:103-12.17.SzaszG.Akineticphotometricmethodforserumgamma—glutamyltranspeptidase.ClinChem.1969;15:124-36.18.KokPJMJ，SeidelB，HoltkampHC，HuismanJ.Anewprocedureforthevisualizationofmultipleformsofgamma-glutamyltransferase(GGT).ClinChimActa.1978;90，209-216.19.CastaldoG，IntrieriM，CastellanoL，deSioI，DelVecchioBlancoC，SacchettiL，SalvatoreF.Serumgamma—glutamyltransferaseisoformcomplexedtoLDLinthediagnosisofsmallhe—patocellularcarcinoma.ClinChem.1999;45:1100_2.20.PompiliM，AddoloratoG，PignataroG，RossiC，ZuppiC，CovinoM，GriecoA，GasbairiniG，RapacciniGLEvaluationofthealbumin_gamma_glutamyltransferaseisoenzymeasadiag—nosticmarkerofhepatocellularcarcinoma—complicatinglivercirrhosis.JGastroenterolHepatol.2003;18:288_95.21.EmdinM，PassinoC，MichelassiC，TittaF，L/AbbateA，DonatoL，PompellaA，PaolicchiA.Prognosticvalueofserumgamma—glutamyltransferaseactivityaftermyocardialinfarction.EurHeartJ.2001;22:1802-7.22.EmdinM，PassinoC，DonatoL，PaolicchiA，PompellaA.Serumgamma—glutamyltransferaseasariskfactorofischemicstrokemightbeindependentofalcoholcon—sumption.Stroke.2002;33:1163-4.23.PaolicchiA，EmdinM，GhliozeniE，CianciaE，PassinoC，PopoffG，PompellaA.Humanatheroscleroticplaquescontaingamma—glutamyltranspeptidaseenzymeactivity.Circulation.2004;109:1440.24.PaolicchiA，MinottiG，TonarelliP，TongianiR，DeCesareD，MezzettiA，DominiciS，ComportiM，PompellaA.Gamma—glutamyltranspeptidase—dependentironreductionandLDLoxidation__apotentialmechanisminatherosclerosis.JInvestigMed.1999;47:151_60.25.UsuiS，HaraY，HosakiS，0kazakiM.Anewon—linedualenzymaticmethodforsimulta—neousquantificationofcholesterolandtriglyceridesinlipoproteinsbyHPLC.JLipidRes.2002;43:805_14.26.0kazakiM，UsuiS，IshigamiM，SakaiN，NakamuraT，MatsuzawaY，YamashitaS.Identi_ficationofuniquelipoproteinsubclassesforvisceralobesitybycomponentanalysisofcholes—terolprofileinhigh—performanceliquidchromatography.ArteriosclerThrombVaseBiol.2005;25:578-84.27.AllisonRD.Y-Glutamyltransp印tidase:kineticsandmechanism.MethodsEnzymol.1985;113:419—437.28.TaniguchiN，IkedaY.Y—Glutamyltranspeptidase:catalyticmechanismandgeneexpression.AdvEnzymolRelatAreasMolBiol.1998;72:239-278.29.SmithGD，Ding幾，PetersTJ.Asensitivefluorimetricassayfory—Glutamyltransferase.AnalyticalBiochemistry.1979;100:136—139.30.HusebyNE，StrommeJH.PracticalpointsregardingroutinedeterminationdeterminationofY-glutamyltransferase(Y_GT)inserumwithakineticmethodat37。C.ScandJClinLabInvest.1974^34:357_63.權(quán)利要求一種檢測生物流體樣品中的血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)同種型的方法，其包括下述步驟(a)借助于適合基于分子量分離血清蛋白的HPLC柱，通過高效液相色譜(HPLC)分離存在于所述樣品中的血清蛋白，以實現(xiàn)將血清蛋白分離成不同的餾分并且隨后將分別與每一餾分結(jié)合的不同血清γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)同種型分離；(b)使在前面步驟中獲得的每一蛋白質(zhì)餾分與γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)底物進行柱后反應(yīng)，所述γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶底物能夠在這樣的蛋白質(zhì)餾分中在GGT的存在下形成可檢測的產(chǎn)物；(c)測定在每一蛋白質(zhì)餾分中可檢測產(chǎn)物的存在或不存在，在給定蛋白質(zhì)餾分中可檢測產(chǎn)物的存在表示在所述蛋白質(zhì)餾分中結(jié)合的GGT同種型的存在。2.根據(jù)權(quán)利要求l所述的方法，其中所述分離步驟用凝膠過濾HPLC柱進行。3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其中在步驟(b)的反應(yīng)中在GGT的存在下形成的所述可檢測產(chǎn)物是發(fā)色團或熒光化合物。4.根據(jù)權(quán)利要求l-3中任一項所述的方法，其中所述步驟(b)的反應(yīng)在y-谷氨酰基團的受體的存在下進行。5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中所述y-谷氨?；鶊F的受體是甘氨酰甘氨酸。6.根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一項所述的方法，其中能夠在GGT的存在下形成可檢測產(chǎn)物的所述GGT底物選自y-谷氨?；?7-酰氨基-4-甲基香豆素、y_谷氨?；鵢4-甲氧基_萘酰胺、y_谷氨?；鵢4-硝基酰苯胺、y_谷氨酰基_3-羧基-4-硝基酰苯胺、y-谷氨?；?3，5-二溴-4-羥基-酰苯胺。7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中能夠在GGT的存在下形成可檢測產(chǎn)物的所述GGT底物是y_谷氨?；鵢7-酰氨基_4-甲基香豆素并且所述可檢測產(chǎn)物是7-氨基-4-甲基香豆素。8.根據(jù)權(quán)利要求1-7中任一項所述的方法，其中所述測定步驟(c)包括測定每一蛋白質(zhì)餾分中GGT的存在和定量GGT活性。9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，包括下述步驟(a)借助于適合基于分子量(或分子大小)分離血清蛋白的HPLC柱，通過高效液相色譜(HPLC)分離存在于所述樣品中的血清蛋白，以實現(xiàn)將血清蛋白分離成不同的餾分并且隨后將分別與每一餾分結(jié)合的不同血清y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)同種型分離；(b)使在前面步驟中獲得的每一蛋白質(zhì)餾分與底物y-谷氨?；?7-酰氨基-4-甲基香豆素進行柱后反應(yīng)，所述底物能夠在這樣的蛋白質(zhì)餾分中在GGT的存在下形成熒光產(chǎn)物7_氨基_4-甲基香豆素；(c)應(yīng)用380nm的激發(fā)波長和440nm的發(fā)射波長，通過熒光測定，測定并定量每一蛋白質(zhì)餾分中的所述產(chǎn)物7-酰氨基-4-甲基香豆素。10.根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項所述的方法，其中所述生物流體選自血漿、血清、尿、細(xì)胞培養(yǎng)物和細(xì)菌培養(yǎng)物上清。11.根據(jù)權(quán)利要求1-10中任一項所述的方法，進一步包括步驟(d):分離步驟(c)中測定的所述血清y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(sGGT)同種型。12.酶同種型，其具有y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)活性并具有大約2000KDa的分子量。13.酶同種型，其具有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)活性并具有大約940KDa的分子量。14.酶同種型，其具有Y-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶(GGT)活性并具有大約140KDa的分子量。15.根據(jù)權(quán)利要求12至14的任一項所述的酶同種型，其可由根據(jù)權(quán)利要求11所述的方法獲得。全文摘要描述了檢測生物流體如血漿或血清的樣品中γ-谷氨酰轉(zhuǎn)移酶同種型(GGT，EC2.3.2.2)的方法。所述方法包括基于分子大小的樣品蛋白質(zhì)的HPLC分離步驟和第二步驟，所述第二步驟用于通過與能夠產(chǎn)生可檢測終產(chǎn)物的GGT酶底物進行柱后反應(yīng)，優(yōu)選地通過分光光度或熒光方法來檢測GGT同種型。GGT同種型可以通過超離心進行分離，從而獲得三種酶同種型，它們分別以大約2000、940和140KDa的分子量表征。文檔編號C12Q1/48GK101730747SQ200880021630公開日2010年6月9日申請日期2008年6月24日優(yōu)先權(quán)日2007年6月25日發(fā)明者A·保利基,A·蓬佩拉,E·布拉馬尼,M·埃姆金,M·弗蘭奇尼,R·巴爾薩奇申請人:比薩大學(xué)