專利名稱：多核苷酸及其編碼的多肽和用于在表達(dá)所述多核苷酸、多肽的植物中用所述多核苷酸、多 ...的制作方法
多核苷酸及其編碼的多肽和用于在表達(dá)所述多核苷酸、多 肽的植物中用所述多核苷酸、多肽提高非生物脅迫耐受性 和/或生物量和/或產(chǎn)量的方法
發(fā)明領(lǐng)域和背景
本發(fā)明在其某些實(shí)施方案中涉及分離的多肽和多核苷酸，更特別涉及但并非僅涉 及用于用所述多肽和多核苷酸提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性、植物生長(zhǎng)、生物量、活力和 /或產(chǎn)量的方法。
非生物脅迫(ABS ；也稱為“環(huán)境脅迫”)條件例如咸度、干旱、洪澇、亞適溫和有毒 化學(xué)污染，對(duì)農(nóng)作物產(chǎn)生相當(dāng)大的損害。大部分植物進(jìn)化出保護(hù)自身應(yīng)對(duì)這些條件的策略。 然而，如果脅迫條件的嚴(yán)重程度和持續(xù)時(shí)間太過(guò)，則對(duì)植物發(fā)育、生長(zhǎng)和產(chǎn)量的影響是深遠(yuǎn) 的。此外，大部分農(nóng)作物極易受ABS影響，因此對(duì)于商業(yè)農(nóng)作物產(chǎn)量而言，最佳生長(zhǎng)條件成 為必要。持續(xù)暴露在脅迫之中引起植物代謝的嚴(yán)重改變，這種改變最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡并因 此減產(chǎn)。因此，盡管進(jìn)行了廣泛的研究并采取了強(qiáng)烈的保護(hù)農(nóng)作物的措施，由于非生物脅迫 條件而引起的損失仍以每年數(shù)十億美元計(jì)。
干旱是一種漸進(jìn)現(xiàn)象，其涉及反常的干旱天氣時(shí)期，此期持續(xù)之長(zhǎng)足以產(chǎn)生嚴(yán)重 的水失衡，例如農(nóng)作物損壞及水供應(yīng)短缺。在嚴(yán)重情況下，干旱可持續(xù)多年，對(duì)農(nóng)業(yè)和水供 應(yīng)產(chǎn)生毀滅性影響。由于急劇增長(zhǎng)的人口和長(zhǎng)期缺乏可用淡水，干旱不僅是農(nóng)業(yè)上與氣候 有關(guān)的頭等問(wèn)題，而且一直也列為主要自然災(zāi)害之一，其不僅引起經(jīng)濟(jì)損失(例如1988年 的美國(guó)干旱損失超過(guò)四百億美元)，而且還引起人的生命喪失，例如1984-1985非洲之角的 干旱引起的饑荒餓死了 750，000人。此外，干旱與對(duì)各種疾病的易感性增加有關(guān)。
對(duì)于大部分農(nóng)作物來(lái)說(shuō)，世界上的陸地都太干旱了。另外，過(guò)度使用可用水導(dǎo)致增 加喪失農(nóng)業(yè)上可用的陸地(沙漠化)，土壤中鹽積聚增長(zhǎng)增加了土壤中可用水的丟失。
咸度，即高鹽水平，影響五分之一公頃澆灌土地。這種情形預(yù)期只能更糟，將進(jìn)一 步降低可耕地的可用性和農(nóng)作物生產(chǎn)，因?yàn)榕旁谇拔宸N的糧食作物(即小麥、玉米、水稻、 馬鈴薯和大豆)沒(méi)有一種能耐受過(guò)量的鹽。鹽對(duì)植物的有害影響起因于導(dǎo)致滲壓脅迫(與 干旱脅迫相似)的缺水和過(guò)量鈉離子對(duì)關(guān)鍵生化過(guò)程的影響二者。和冰凍及干旱的情況一 樣，高鹽也導(dǎo)致水分虧缺；高鹽的存在使得植物根難于從其環(huán)境中吸取水分。因此，土壤咸 度是決定植物能否茁壯成長(zhǎng)的更為重要的變量之一。在世界的很多地方，相當(dāng)大的陸地面 積由于天然的土壤高鹽而不能耕種。因此，用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的土壤的鹽化在主要依賴農(nóng)業(yè)的 地區(qū)是顯著且越來(lái)越嚴(yán)重的問(wèn)題，這一情況由于過(guò)度耕種、施肥過(guò)多及通常因氣候變化和 日益增加的人口需求而引起的缺水而更加惡化。在植物生活周期的早期耐受鹽尤其重要， 因?yàn)橥寥辣砻娴恼舭l(fā)引起水向上移動(dòng)并在種植種子的上部土壤層積聚鹽。另一方面，發(fā)芽 通常發(fā)生在高于全體土壤層中平均鹽水平的鹽濃度下。
很多農(nóng)作物的發(fā)芽對(duì)溫度敏感。在熱條件下可提高發(fā)芽的基因可用于在季節(jié)晚期 或在熱帶氣候種植的植物。另外，當(dāng)蒸騰作用不足以應(yīng)對(duì)熱脅迫時(shí)，暴露于過(guò)度熱量中的幼 苗及成熟植株可能經(jīng)歷熱休克，這可在多種器官中出現(xiàn)，包括葉和尤其是果實(shí)。熱還損傷 包括細(xì)胞器和細(xì)胞骨架在內(nèi)的細(xì)胞結(jié)構(gòu)，并削弱膜的功能。熱休克可引起總蛋白質(zhì)合成降低，其伴隨熱休克蛋白例如伴侶蛋白(chaperone)的表達(dá)，這些蛋白參與熱變性蛋白的再折疊。
熱脅迫通常伴隨低可用水條件。熱本身被認(rèn)為是與水分虧缺條件互相影響的脅 迫，并增加水分虧缺條件引起的有害作用。水蒸發(fā)需求隨日間溫度增加表現(xiàn)出接近指數(shù)增 加，并可導(dǎo)致蒸騰率高及植物水勢(shì)低。高溫對(duì)花粉的損傷幾乎總是與干旱脅迫一起發(fā)生，很 少在水條件良好的情況下發(fā)生。混合脅迫可以新的方式改變植物代謝；因此，理解不同脅迫 間的相互作用對(duì)于開發(fā)通過(guò)遺傳操作提高脅迫耐受性的策略很重要。
過(guò)分寒冷的條件(例如低溫但在凍結(jié)溫度之上)影響熱帶來(lái)源的農(nóng)作物，例如大 豆、水稻、玉米和棉花。典型的低溫冷害包括萎蔫、壞死、黃萎或離子從細(xì)胞膜滲漏。寒冷敏 感性的基礎(chǔ)機(jī)制尚未完全理解，但很可能涉及膜飽和水平及其它生理缺陷。例如，光合作用 的光抑制(由于高光強(qiáng)導(dǎo)致的光合作用中斷)通常在涼寒的夏末/秋天的夜晚之后的清澈 空氣條件下發(fā)生。另外，寒冷可通過(guò)延遲玉米成熟而導(dǎo)致產(chǎn)量損失及產(chǎn)物質(zhì)量低劣。
水分虧缺是很多植物脅迫的常見組成部分。當(dāng)整個(gè)植物的蒸騰率超過(guò)水?dāng)z入時(shí)， 在植物細(xì)胞中發(fā)生水分虧缺。除干旱外，還有其它脅迫(例如咸度和低溫)使得細(xì)胞脫水。
鹽脅迫和干旱脅迫的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)由離子及滲透穩(wěn)態(tài)信號(hào)傳導(dǎo)途徑組成。鹽脅迫的離 子方面經(jīng)由SOS途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，在該途徑中鈣應(yīng)答性S0S3-S0S2蛋白激酶復(fù)合物控制離子 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白例如SOSl的表達(dá)及活性。鹽脅迫的滲透組分涉及與干旱和/或冷脅迫應(yīng)答重疊 的復(fù)雜的植物反應(yīng)。
干旱、寒冷和鹽脅迫應(yīng)答的常見方面[綜述于Xiong和aiu(2002)Plant Cell Environ. 25 :131-139]包括(a)在信號(hào)傳導(dǎo)事件早期細(xì)胞質(zhì)鈣水平瞬時(shí)變化[Knight,(2000)Int.Rev. Cytol. 195 :269-324 ；Sanders 等(1999)Plant Cell 11 :691-706] ； (b)經(jīng) 由促分裂原活化的和/或鈣依賴性蛋白激酶(CDPK)及蛋白磷酸酶的信號(hào)轉(zhuǎn)換[Merlot等(2001)PlantJ. 25 :295-303 ;Tahtiharju 和 PalvaQ001)Plant J. 26 :461-470] ； (c)因響 應(yīng)脅迫而提高的脫落酸水平觸發(fā)了一個(gè)亞組的應(yīng)答；(d)作為信號(hào)分子的肌醇磷酸(至少 對(duì)于一個(gè)亞組的脅迫應(yīng)答性轉(zhuǎn)錄變化而言[Xiong等(2001)Genes Dev. 15 :1971-1984]； (e)磷脂酶活化，進(jìn)而產(chǎn)生一批不同的第二信使分子，其中某些信使分子可能調(diào)控脅迫應(yīng)答 性激酶的活性[例如磷脂酶D ;Frank等O000)Plant Cell 12 :111-124] ； (f)誘導(dǎo)胚胎發(fā) 育晚期豐富蛋白(LEA)型基因，所述基因包括CRT/DRE應(yīng)答性C0R/RD基因；(g)抗氧化劑 及相容的滲壓劑(osmolyte)(例如脯氨酸和可溶性糖)的水平提高[Hasegawa等Q000) Annu. Rev. Plant Mol. Plant Physiol. 51 :463-499)]；和 Qi)積聚活性氧物質(zhì)，例如超氧化 物、過(guò)氧化氫和羥基自由基。
滲壓脅迫以多個(gè)步驟調(diào)節(jié)脫落酸生物合成。ABA依賴性及非ABA依賴性的滲壓脅 迫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)首先都改變組成型表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，這導(dǎo)致早期應(yīng)答轉(zhuǎn)錄激活蛋白表達(dá)，然后 所述激活蛋白激活下游脅迫耐受性效應(yīng)基因。
提高對(duì)寒冷或鹽脅迫的耐受性的幾種基因還可改進(jìn)干旱脅迫保護(hù)，這些基因包括 例如轉(zhuǎn)錄因子 AtCBF/DREBl、0sCDPK7 (Saijo 等 2000，Plant J. 23 :319-327)或 AVPl (液泡 焦磷酸酶-質(zhì)子泵，Gaxiola 等 2001，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 98 :11444-11449)。
開發(fā)耐受脅迫的植物是有可能解決或調(diào)停至少某些這類問(wèn)題的策略。然而，用于 開發(fā)對(duì)ABS表現(xiàn)耐受性的植物新品系的傳統(tǒng)的植物育種策略效率相對(duì)低，因?yàn)樗鼈內(nèi)唛L(zhǎng)耗時(shí)且不能預(yù)測(cè)結(jié)果。此外，用于脅迫耐受性的種質(zhì)資源有限以及遠(yuǎn)緣植物種間雜交中的不 相容性是在常規(guī)育種中遇到的重要的問(wèn)題。另外，導(dǎo)致ABS耐受性的細(xì)胞過(guò)程本質(zhì)上很復(fù) 雜，涉及多種細(xì)胞適應(yīng)機(jī)制和眾多代謝途徑。
本領(lǐng)域業(yè)已闡述目標(biāo)為賦予轉(zhuǎn)基因作物非生物脅迫耐受性的遺傳工程的成 就。Apse 禾口 Blumwald(Curr Opin Biotechnol. 13 146-150，2002)、Quesada 等(Plant Physiol. 130 :951-963,2002)、Holmstr6m等(Nature 379 :683-684,1996)、Xu 等(Plant Physiol 110 :249-257,1996), Pilon-Smits 和 Ebskamp(Plant Physiol 107:125-130， 1995)和Tarczynski等(Science 259 =508-510,1993)的研究皆嘗試產(chǎn)生脅迫耐受性植 物。
另外，一些美國(guó)專利和專利申請(qǐng)也闡述與脅迫耐受性有關(guān)的多核苷酸及其在產(chǎn) 生脅迫耐受植物中的應(yīng)用。美國(guó)專利第5，四6，462號(hào)和第5，356，816號(hào)闡述了用擬南芥 (Arabidopsis thaliana)中編碼涉及冷適應(yīng)的蛋白質(zhì)的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物，以提高耐寒性。
美國(guó)專利第6，670，528號(hào)闡述了用編碼結(jié)合脅迫應(yīng)答元件的多肽的多核苷酸轉(zhuǎn) 化植物，以提高非生物脅迫耐受性。
美國(guó)專利第6，720，477號(hào)闡述了用編碼能夠提高轉(zhuǎn)化植物非生物脅迫耐受性的 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)脅迫相關(guān)蛋白的多核苷酸轉(zhuǎn)化植物。
美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)09/938842和10/3422M闡述了非生物脅迫相關(guān)基因及其用于賦 予植物對(duì)非生物脅迫的耐受性的應(yīng)用。
美國(guó)申請(qǐng)順序號(hào)10/231035闡述了在植物中過(guò)表達(dá)鉬輔因子硫化酶，以提高非生 物脅迫耐受性。
Evogene Ltd.的W02004/104162教導(dǎo)了多核苷酸序列及應(yīng)用所述多核苷酸序列 提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或提高植物的生物量的方法。
Evogene Ltd.的W02007/020638教導(dǎo)了多核苷酸序列及應(yīng)用所述多核苷酸序列 提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/或提高植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量的方法。
Evogene Ltd.的W02007/049275教導(dǎo)了用于提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性和/ 或用于提高植物的生物量、活力和/或產(chǎn)量的分離的多肽、編碼所述多肽的多核苷酸。
另外的背景技術(shù)包括美國(guó)專利申請(qǐng)第20060183137A1 Al號(hào)和第20030056M9A1 號(hào)。
發(fā)明_既述
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性的方法，所述方法 包括在植物內(nèi)表達(dá)外源多核苷酸，藉此提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性，其中所述外源多 核苷酸編碼包含與選自以下的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO 201、207、212、202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性的方法，所述方法 包括在植物內(nèi)表達(dá)外源多核苷酸，藉此提高植物對(duì)非生物脅迫的耐受性，其中所述外源多 核苷酸編碼包含選自以下氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :201、207、212、202-206、208-211、 213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供提高植物的生物量、生長(zhǎng)率、活力和/或產(chǎn)量的方法，所述方法包括在植物內(nèi)表達(dá)外源多核苷酸，藉此提高植物的生物量、生長(zhǎng)率、活力和/ 或產(chǎn)量，其中所述外源多核苷酸編碼包含與選自以下的氨基酸序列至少90%同源的氨基 酸序列的多肽:SEQ ID NO :201、207、212、202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供提高植物的生物量、生長(zhǎng)率、活力和/或產(chǎn)量的方 法，所述方法包括在植物內(nèi)表達(dá)外源多核苷酸，藉此提高植物的生物量、生長(zhǎng)率、活力和/ 或產(chǎn)量，其中所述外源多核苷酸編碼包含選自以下的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :201, 207、212、202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含與選自以下的 核酸序列至少有 90% 同一性的核酸序列=SEQ IDNO :1530、1561、1532、1531、1562、1533、 1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、1539、1550、1558、1565、1541、1667、1542、 1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392-960 和 1656-1659。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含選自以下的核 酸序列=SEQ ID NO :1530、1561、1532、1531、1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、 1543、1668、1539、1550、1558、1565、1541、1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、 392-960 和 1656-1659。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供核酸構(gòu)建體，所述核酸構(gòu)建體包含所述分離的多核 苷酸和用于指導(dǎo)所述核酸序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供分離的多肽，所述多肽包含與選自以下的氨基酸 序列至少 90% 同源的氨基酸序列=SEQ ID NO :201、207、212、202-206、208-211、213-391、 1655,961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供分離的多肽，所述多肽包含選自以下的氨基酸序 列=SEQ ID NO :201、207、212、202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含外源多肽，所述外源 多肽包含與選自以下的氨基酸序列至少90%同源的氨基酸序列SEQ ID NO :201,207,212, 202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含外源多肽，所述多肽 包含選自以下的氨基酸序列:SEQ ID NO :201、207、212、202-206、208-211、213-391、1655、 961-1529 和 1660-1663。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含外源多核苷酸，所述 外源多核苷酸包含與選自以下的核酸序列至少90%同源的核酸序列SEQ ID NO =1530, 1561、1532、1531、1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、 1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、1539、1550、1558、1565、1541、1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392_960和 1656-1659。
本發(fā)明某些實(shí)施方案方面提供植物細(xì)胞，所述植物細(xì)胞包含外源多核苷酸，所述 多核苷酸包含選自以下的核酸序列:SEQ ID NO :1530、1561、1532、1531、1562、1533、1538、 1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、1539、1550、1558、1565、1541、1667、1542、1544、 1537、1551、1545、1-200、1653、392-960 和 1656-1659。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述核酸序列選自SEQ ID NO :1530,1561,1532, 1531、1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、1552、1553、 1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、1539、1550、1558、1565、 1541、1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392_960 和 1656-1659。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述多核苷酸選自SEQ ID NO :1530,1561,1532, 1531、1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、1552、1553、 1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、1539、1550、1558、1565、 1541、1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392_960 和 1656-1659。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述氨基酸序列選自SEQ ID NO :201、207、212、 202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述多肽選自SEQ ID NO :201、207、212、202_206、 208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述植物細(xì)胞形成植物的部分。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述非生物脅迫選自咸度、干旱、脫水、低溫、高溫、重 金屬毒性、缺氧(anaerobiosis)、營(yíng)養(yǎng)缺乏、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、大氣污染和UV輻射。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述方法進(jìn)一步包括培養(yǎng)在非生物脅迫下表達(dá)外源多 核苷酸的植物。
除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和/或科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域 普通技術(shù)人員通常理解的一樣的含義。盡管在實(shí)施或試驗(yàn)本發(fā)明實(shí)施方案中可使用與本文 所述相似或等同的方法及材料，但下面闡述例示性方法和/或材料。在有沖突的情況下，將 以本專利說(shuō)明書(包括定義)為準(zhǔn)。另外，所述材料、方法和實(shí)施例僅為闡明性的，并非必 定為限制性的。
附圖簡(jiǎn)述
本文通過(guò)舉例并參考附圖闡述了本發(fā)明的某些實(shí)施方案?，F(xiàn)在特別詳細(xì)地提及附 圖，要強(qiáng)調(diào)的是所示細(xì)節(jié)僅作為實(shí)例，用于說(shuō)明性地論述本發(fā)明的實(shí)施方案。在該方面，說(shuō) 明書并結(jié)合附圖使得本領(lǐng)域技術(shù)人員明白本發(fā)明實(shí)施方案可如何實(shí)施。
在附圖中


圖1示意性闡明用于表達(dá)本發(fā)明分離的多核苷酸序列的pGI 二元質(zhì)粒。RB-T-DNA 的右邊界；LB-T-DNA的左邊界；H-HindIII限制酶；X-XbaI限制酶；B-BamHI限制酶；S_&ill 限制酶；Sm-SmaI限制酶；R-I-EcoRI限制酶；Sc-SacI/SstI/Ecll36II ；(數(shù)字)_堿基對(duì)長(zhǎng) 度；N0S ρΓο =胭脂氨酸合酶啟動(dòng)子；NPT-II =新霉素(neomycin)磷酸轉(zhuǎn)移酶基因；NOS ter=胭脂氨酸合酶終止子；Poly-A信號(hào)(聚腺苷酸化信號(hào))；⑶Sintron-GUS報(bào)告基因 (編碼序列和內(nèi)含子)。將本發(fā)明分離的多核苷酸序列克隆到載體，同時(shí)取代GUSintron報(bào) 告基因。
圖加-b為描述顯現(xiàn)在透明的瓊脂板中生長(zhǎng)的植物根發(fā)育的圖像。不同的轉(zhuǎn)基因 在透明瓊脂板中生長(zhǎng)17天，在第7天開始每2天給瓊脂板照相。圖2a-在瓊脂板上12天 后所攝的植物照片圖像。圖2b-根分析圖象，其中所測(cè)量的根長(zhǎng)由紅色箭頭表示。
發(fā)明詳述
本發(fā)明在其某些實(shí)施方案中涉及分離的多肽和編碼所述多肽的多核苷酸，更特別 涉及但并非僅涉及用所述多肽和多核苷酸提高對(duì)非生物脅迫的耐受性、植物的生長(zhǎng)率、產(chǎn) 量、生物量和/或活力的方法。
在詳細(xì)闡明至少一個(gè)本發(fā)明實(shí)施方案之前，應(yīng)該理解，本發(fā)明在其應(yīng)用方面不一 定限制在以下說(shuō)明所提出的或通過(guò)實(shí)施例所例證的詳細(xì)資料。本發(fā)明可以是其它實(shí)施方 案，或可以通過(guò)多種方式來(lái)實(shí)行或?qū)嵤?br> 在實(shí)施本發(fā)明時(shí)，本發(fā)明人業(yè)已鑒定了新的多肽及多核苷酸，它們可用于提高對(duì) 非生物脅迫的耐受性并改進(jìn)植物的生長(zhǎng)率、生物量、產(chǎn)量和/或活力。
因此，如以下實(shí)施例部分所示，本發(fā)明人采用生物信息學(xué)方法并鑒定了可提高對(duì) 非生物脅迫的耐受性及改進(jìn)生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和活力的多核苷酸及多肽(對(duì)于多核苷酸 為 SEQ ID NO 1-200 及 1653 ；對(duì)于多肽為 SEQ ID NO =201-391 及 1655 ；實(shí)施例 1 表 1)，所 述生物信息學(xué)方法聯(lián)合來(lái)自擬南芥、水稻和其它公開獲得的植物基因組數(shù)據(jù)庫(kù)、表達(dá)序列 標(biāo)簽(EST)、蛋白質(zhì)和途徑數(shù)據(jù)庫(kù)及具有數(shù)字表達(dá)譜(digitalexpression profile)( “電 子RNA印跡”)的QTL信息的序列聚類(clustering)及拼接(assembly)。通過(guò)比對(duì)直向 同源物序列和數(shù)字表達(dá)譜，鑒定了來(lái)自單子葉物種的推定的ABST直向同源物(對(duì)多核苷 酸為 SEQ IDNO :392-960、1656-1659 ；對(duì)多肽為 SEQ ID NO :961_1529、1660-1663 ；實(shí)施例 1表2)。如以下實(shí)施例部分中表3及表4進(jìn)一步闡述，克隆了代表性的多核苷酸(多核苷 酸SEQ ID NO :1530、1538、1532、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1561、1564、1534、1536、 1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543 和 1668)。制備了具 有優(yōu)化核酸序列的另外的多核苷酸(多核苷酸SEQ ID N0:1531、1539、1533、1550、1558、 1562、1565、1541、1667、1542、1544、1537、1551 和 1545)。如以下實(shí)施例部分中的進(jìn)一步闡 述，產(chǎn)生了外源表達(dá)所述已克隆的和/或優(yōu)化的本發(fā)明多核苷酸的轉(zhuǎn)基因植物。如表5-76 所述，當(dāng)這些植物在滲壓脅迫(在25% PEG存在下)、氮缺乏(在0. 75mM氮存在下)或常 規(guī)條件下生長(zhǎng)時(shí)，表現(xiàn)出幼苗重量、根覆蓋、根長(zhǎng)和相對(duì)生長(zhǎng)率的增加。另外，如表77-188 所示，當(dāng)外源性表達(dá)本發(fā)明多核苷酸的植物在咸度脅迫或正常條件下生長(zhǎng)時(shí)，表現(xiàn)出葉叢 面積(rosette area)、葉叢直徑(rosette diameter)、葉平均面積、以上所述的相對(duì)生長(zhǎng) 率、植物生物量、植物種子產(chǎn)量、種子千粒重和收獲指數(shù)的增加。總之，這些結(jié)果提示本發(fā)明 新的多核苷酸及多肽用于提高非生物脅迫的耐受性及增加植物的生長(zhǎng)率、生物量、活力和/ 或產(chǎn)量的用途。
因此，本發(fā)明一方面提供提高非生物脅迫耐受性、植物的生長(zhǎng)率、生物量、產(chǎn)量和/ 或活力的方法。所述方法通過(guò)在植物內(nèi)表達(dá)外源多核苷酸來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述外源多核苷酸編碼 包含與選自以下的氨基酸序列至少60%同源的氨基酸序列的多肽SEQ ID NO :201,207, 212、202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663。
本文所用短語(yǔ)“非生物脅迫”指對(duì)植物代謝、生長(zhǎng)、繁殖和/或生存力的任何不利 作用。因此，非生物脅迫可由亞適環(huán)境生長(zhǎng)條件誘導(dǎo)，所述條件例如咸度、脫水、水分虧缺、 干旱、漫灌、冷凍、低溫或高溫(例如寒冷或過(guò)熱)、有毒化學(xué)污染、重金屬毒性、缺氧、營(yíng)養(yǎng) 缺乏、營(yíng)養(yǎng)過(guò)剩、大氣污染或UV輻射。非生物脅迫的含義論述于背景章節(jié)中。
本文所用短語(yǔ)“非生物脅迫耐受性”指植物耐受非生物脅迫而在代謝、生長(zhǎng)、生產(chǎn)力和/或生存力方面不經(jīng)受實(shí)質(zhì)改變的能力。
本文所用短語(yǔ)“植物生物量”指植物在生長(zhǎng)季節(jié)產(chǎn)生的組織的量(以風(fēng)干或干燥 組織的克數(shù)來(lái)測(cè)量)，它還能決定或影響植物產(chǎn)量或單位生長(zhǎng)面積產(chǎn)量。
本文所用短語(yǔ)“植物產(chǎn)量”指每一植物或每一生長(zhǎng)季節(jié)產(chǎn)生或收獲的組織的量 (以重量、體積或尺寸來(lái)測(cè)量)或數(shù)量(數(shù)字)。因此，增加產(chǎn)量能影響人們可從在某一生 長(zhǎng)面積和/或生長(zhǎng)時(shí)間的植物獲得的經(jīng)濟(jì)利益。
本文所用短語(yǔ)“植物活力”指在特定時(shí)間植物產(chǎn)生的組織的量(以重量來(lái)測(cè)量)。 因此，增加活力可決定或影響植物產(chǎn)量或每個(gè)生長(zhǎng)時(shí)間或生長(zhǎng)面積的產(chǎn)量。
本文所用術(shù)語(yǔ)“增加”指與天然植物[即未用本發(fā)明生物分子(多核苷酸或多肽) 改良的植物，例如在同樣生長(zhǎng)條件下生長(zhǎng)的同樣物種的非轉(zhuǎn)化植物]比較，在植物非生物 脅迫耐受性、生長(zhǎng)、生物量、產(chǎn)量和/或活力方面增加至少約2%、至少約3%、至少約4%、至 少約5%、至少約10%、至少約15%、至少約20%、至少約30%、至少約40%、至少約50%、 至少約60 %、至少約70 %、至少約80 %或更多。
本文所用短語(yǔ)“外源多核苷酸”指自然狀態(tài)下不可在所述植物中表達(dá)或者需要在 所述植物中過(guò)表達(dá)的異源核酸序列。可以以穩(wěn)定或瞬時(shí)方式將外源多核苷酸引入到植物 中，以便產(chǎn)生核糖核酸(RNA)分子和/或多肽分子。應(yīng)該注意，外源多核苷酸可包含與所述 植物的內(nèi)源核酸序列相同或部分同源的核酸序列。
如所述，本發(fā)明外源多核苷酸編碼多肽，所述多肽具有與選自SEQID NO :201、207、 212、202-206、208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1663 的氨基酸序列具有以下同源 性的氨基酸序列至少約60%、至少約65%、至少約70%、至少約75%、至少約80%、至少 約81 %、至少約82 %、至少約83 %、至少約84 %、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至 少約88 %、至少約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約94 %、 至少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更多例如100%。
可用任何同源性比較軟件來(lái)測(cè)定同源性(例如同源性百分比)，所述軟件包括例 如當(dāng)從多肽序列開始時(shí)例如通過(guò)用缺省參數(shù)的美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BlastP 或TBLASTN軟件；或例如通過(guò)用缺省參數(shù)的tBLASTX算法(可由NCBI獲得)，其在蛋白質(zhì) 序列數(shù)據(jù)庫(kù)中比較核苷酸查詢序列(兩條鏈)的六種讀框概念翻譯產(chǎn)物。
同源序列包括直向同源序列和旁系同源序列兩種序列。術(shù)語(yǔ)“旁系同源”涉及在 物種的基因組內(nèi)的基因復(fù)制，產(chǎn)生平行進(jìn)化同源基因。術(shù)語(yǔ)“直向同源”涉及在不同生物體 內(nèi)因祖先親緣關(guān)系產(chǎn)生的同源基因。
在單子葉植物種中鑒定直向同源物的一個(gè)選擇是實(shí)施交互blast搜索 (reciprocal blast search)。這可通過(guò)涉及在任何序列數(shù)據(jù)庫(kù)(例如公開獲得的NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)，可在此處找到http://WWW.ncbi.nlm.nih. gov)中搜索(blasting)目的序列的 第一次blast來(lái)進(jìn)行。如果搜索水稻的直向同源物，則在例如可從NCBI得到的來(lái)自水稻 日本晴(Oryza sativaNipponbare)的沘，469全長(zhǎng)cDNA克隆中搜索目的序列?？珊Y選 blast結(jié)果。然后在目的序列所來(lái)源的生物體序列中搜索(第二次blast)經(jīng)篩選的結(jié)果 或未經(jīng)篩選的結(jié)果的全長(zhǎng)序列。然后比較第一次blast和第二 blast的結(jié)果。當(dāng)在第一 次blast中產(chǎn)生最高分值(最佳擊中(best hit))的序列在第二次blast中鑒定出作為 最佳擊中的所述查詢序列(初始目的序列)時(shí)，則鑒定出直向同源物。用同樣推理來(lái)發(fā)現(xiàn)旁系同源物(與同一生物體中的基因同源)。在大序列家族情況下，可使用ClustalW程序 (http://ffffff. ebi. ac. uk/Tools/clustalw2/index. html)，接著用幫助顯現(xiàn)聚類的鄰接進(jìn) 化樹(neighbor-joining tree) (http://en.wikipedia.org/wiki/Neighbor-joining)。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，外源多核苷酸編碼由SEQ ID NO :201、207、212、 202-206、208-211、213-391、1655、961-1529、1660-1662 或 1663 所示的氨基酸序列組成的 多肽。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，外源多核苷酸包含與選自以下的核酸序列有至少約 60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約82 %、至少 約83 %、至少約84 %、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至 少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94 %、至少約95 %、 至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、例如100%同一性的核酸序列SEQ ID NO 1530、1561、1532、1531、1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、 1534、1536、1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、 1539、1550、1558、1565、1541、1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392-960 和 1656-1659。
可用任何同源性比較軟件測(cè)定同一性(例如同源性百分比)，所述軟件包括例如 通過(guò)用缺省參數(shù)的美國(guó)生物技術(shù)信息中心(NCBI)的BlastN軟件。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，外源多核苷酸為與選自以下的多核苷酸有至少約 60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約82 %、至少 約83 %、至少約84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少約89 %、至 少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94%、至少約95 %、 至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%、例如100%同一性的多核苷酸SEQ ID NO 1530、1561、1532、1531、1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、 1534、1536、1552、1553、1666、1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、 1539、1550、1558、1565、1541、1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392-960 和 1656-1659。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，外源多核苷酸由SEQ ID NO :1530、1561、1532、1531、 1562、1533、1538、1549、1665、1566、1554、1563、1557、1564、1534、1536、1552、1553、1666、 1547、1548、1556、1559、1560、1654、1555、1540、1543、1668、1539、1550、1558、1565、1541、 1667、1542、1544、1537、1551、1545、1-200、1653、392-960 和 1656-1658 或 1659 所示。
本文所用術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”指單鏈或雙鏈核酸序列，其以RNA序列、互補(bǔ)多核苷酸 序列(cDNA)、基因組多核苷酸序列和/或復(fù)合多核苷酸序列(例如以上多核苷酸序列的組 合)的形式分離及提供。
本文所用短語(yǔ)“互補(bǔ)多核苷酸序列”指用逆轉(zhuǎn)錄酶或任何其它依賴RNA的DNA聚 合酶從信使RNA逆轉(zhuǎn)錄而產(chǎn)生的序列。所述序列可隨后在體內(nèi)或在體外用依賴DNA的DNA 聚合酶擴(kuò)增。
本文所用短語(yǔ)“基因組多核苷酸序列”指源自染色體(從染色體鑒定或分離)的 序列，因此其代表染色體的一個(gè)連續(xù)部分。
本文所用短語(yǔ)“復(fù)合多核苷酸序列”指至少部分為互補(bǔ)序列及至少部分為基因組序列的序列。復(fù)合序列可包括編碼本發(fā)明多肽所需的某些外顯子序列以及插入其間的某些 內(nèi)含子序列。內(nèi)含子序列可為任何來(lái)源，包括其它基因，通常包括保守剪切信號(hào)序列。所述 內(nèi)含子序列可進(jìn)一步包括順式作用表達(dá)調(diào)控元件。
可優(yōu)化編碼本發(fā)明多肽的核酸序列以用于表達(dá)。在SEQ ID NO :1531中提供優(yōu)化 核酸序列的非限制性實(shí)例，其編碼包含SEQ ID NO :201所示氨基酸序列的多肽。這種序列 修飾的實(shí)例包括但不限于改變G/C含量，以便更接近通常在目的植物物種中發(fā)現(xiàn)的含量； 除去在所述植物物種中發(fā)現(xiàn)的非典型的密碼子，通常稱為密碼子優(yōu)化。
短語(yǔ)“密碼子優(yōu)化”指選擇在接近目的植物內(nèi)的密碼子用法的結(jié)構(gòu)基因或其片段 內(nèi)使用的合適的DNA核苷酸。因此，優(yōu)化的基因或核酸序列指其中天然或天然存在的基因 的核苷酸序列已被修飾以便在所述植物內(nèi)使用統(tǒng)計(jì)上優(yōu)選或統(tǒng)計(jì)上偏愛(ài)的密碼子的基因。 通常在DNA水平檢查核苷酸序列，并用任何合適的程序確定經(jīng)優(yōu)化用于在該植物物種中表 達(dá)的編碼區(qū)，所述合適程序例如如在Sardana等(1996，PlantCell Reports 15:677-681) 中所述。在該方法中，可通過(guò)首先發(fā)現(xiàn)天然基因的每一密碼子相對(duì)于高表達(dá)植物基因的密 碼子的用法的平方比例偏差(squared proportional deviation)，接著計(jì)算平均方差來(lái)計(jì) 算密碼子用法標(biāo)準(zhǔn)偏差(密碼子使用偏愛(ài)的量度)。所用公式為lSDCU = n= 1Ν
2/Ν，其中&指高表達(dá)植物基因中密碼子η的使用頻率，其中為目的基因中密碼子η 的使用頻率，N指目的基因中密碼子的總數(shù)。用Murray等的數(shù)據(jù)(1989，Nuc Acids Res. 17 477-498)匯編了來(lái)自雙子葉植物的高表達(dá)基因的密碼子用法表。
根據(jù)特定植物細(xì)胞類型的優(yōu)選密碼子用法優(yōu)化核酸序列的一種方法基于直 接使用密碼子優(yōu)化表，而不實(shí)施任何額外的統(tǒng)計(jì)計(jì)算，密碼子優(yōu)化表例如通過(guò)日本的 NIAS (National Institute of AgrobiologicaSiences) DNA 庫(kù)在密碼子用法數(shù)據(jù)庫(kù)中在線 提供的那些密碼子優(yōu)化表(http://ffffff. kazusa. or. jp/codon/)。密碼子用法數(shù)據(jù)庫(kù)含有用 于多種不同物種的密碼子用法表，每一密碼子用法表基于Genbank中所存在的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計(jì) 學(xué)上確定。
可通過(guò)使用上述表來(lái)確定特定物種(例如水稻)中對(duì)每種氨基酸最優(yōu)選或最偏愛(ài) 的密碼子，對(duì)編碼目的蛋白的天然核苷酸序列針于該特定植物物種進(jìn)行密碼子優(yōu)化。這可 通過(guò)用相應(yīng)的密碼子(對(duì)于氨基酸在統(tǒng)計(jì)學(xué)上更偏愛(ài))取代在特定物種基因組中可具有低 統(tǒng)計(jì)學(xué)發(fā)生概率的密碼子來(lái)實(shí)現(xiàn)。然而，可挑選一個(gè)或更多個(gè)較低偏愛(ài)的密碼子來(lái)刪除現(xiàn) 有的限制位點(diǎn)，以在潛在有用的接點(diǎn)制造新的限制位點(diǎn)(用以加入信號(hào)肽或終止盒的5' 和3'端，或可用于切割及將區(qū)段剪接在一起以形成正確的全長(zhǎng)序列的內(nèi)部位點(diǎn))，或以消 除可能負(fù)面影響mRNA穩(wěn)定性或表達(dá)的核苷酸序列。
在任何修飾之前，天然存在的編碼核苷酸序列可以已經(jīng)含有多個(gè)對(duì)應(yīng)于特定植物 物種中的統(tǒng)計(jì)學(xué)偏愛(ài)密碼子的密碼子。因此，天然核苷酸序列的密碼子優(yōu)化可包括確定在 天然核苷酸序列內(nèi)對(duì)于特定植物哪些密碼子不是統(tǒng)計(jì)學(xué)偏愛(ài)的密碼子，并根據(jù)特定植物的 密碼子用法表修改這些密碼子以產(chǎn)生密碼子優(yōu)化的衍生物。經(jīng)修飾的核苷酸序列可全部或 部分地根據(jù)植物密碼子用法進(jìn)行優(yōu)化，前提為經(jīng)修飾的核苷酸序列所編碼的蛋白質(zhì)以比由 相應(yīng)的天然存在的或天然的基因所編碼的蛋白質(zhì)更高的水平產(chǎn)生。通過(guò)改變密碼子用法構(gòu) 建合成基因闡述于例如PCT專利申請(qǐng)93/07278中。
因此，本發(fā)明包括上文所述核酸序列、其片段、可與其雜交的序列、與其同源的序列、具有不同密碼子用法的編碼相似多肽的序列、特征為突變的改變的序列，所述突變例如 缺失、插入或置換一個(gè)或更多個(gè)核苷酸，可為天然存在的或人工誘導(dǎo)的突變，可為隨機(jī)或定 向方式突變。
本發(fā)明提供分離的多肽，所述多肽具有與選自SEQ ID NO :201、207、212、202_206、 208-211、213-391、1655、961-1529和1660-1663的氨基酸序列有以下同源性的氨基酸序 列至少約60 %、至少約65 %、至少約70 %、至少約75 %、至少約80 %、至少約81%、至少約 82 %、至少約83 %、至少約84%、至少約85 %、至少約86 %、至少約87 %、至少約88 %、至少 約89 %、至少約90 %、至少約91%、至少約92 %、至少約93 %、至少約93 %、至少約94 %、至 少約95%、至少約96%、至少約97%、至少約98%、至少約99%或更高，例如為100%。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，所述多肽由SEQ ID NO :201、207、212、202_206、 208-211、213-391、1655、961-1529 和 1660-1662 或 1663 所示。
本發(fā)明還包括上述多肽的片段及具有突變的多肽，所述突變例如缺失、插入或置 換一個(gè)或更多個(gè)氨基酸，為天然存在的或人工誘導(dǎo)的突變，為隨機(jī)或定向方式的突變。
本文所用術(shù)語(yǔ)“植物”包括整株植物、所述植物的祖先及后代和植物部分，包括 種子、苗(shoot)、莖、根(包括塊莖)和植物細(xì)胞、組織和器官。植物可呈任何形式，包 括懸浮培養(yǎng)物、胚、分生組織區(qū)、愈傷組織、葉、配子體、孢子體、花粉和小孢子。在本發(fā)明 方法中尤其有用的植物包括屬于綠色植物(Viridiplantae)超科(superfamily)的所有 植物，尤其是單子葉植物和雙子葉植物，包括選自包含以下植物名單的豆科牧草(fodder or forage legume)、觀賞植物、糧食作物、喬木或灌木金合歡屬(Acacia spp.)、槭屬 (Acer spp·)、獼猴桃屬(Actinidia spp·)、七葉樹屬(Aesculus spp·)、澳大利亞貝殼 杉(Agathis australis)、合歡(Albizia amara)、蘭山與筆筒樹(Alsophila tricolor)、 須芒草屬(Andropogonspp.)、落花生屬(Arachis spp)、模榔(Areca catechu)、Astelia fragrans>0Hf^^^； (Astragalus cicer) >^zhBf(Baikiaea plurijuga)屬(Betula spp.) pfM (Brassica spp.) >7^1 (Bruguiera gymnorrhiza)、·{白克蘇7^ (Burkea africana) > I5P (Butea frondosa) > Cadaba farinosa> M^t^M (Calliandra spp)、大葉茶(Camellia sinensis)、美人蕉(Cannaindica)、辣椒屬(Capsicum spp.)、決明 屬(Cassia spp. ) >5M|l|j3. (Centroemapubescens) > Chacoomeles spp.、肉t圭(Cinnamomum cassia)、小果咖啡(Coffea arabica)、可樂(lè)豆木(Colophospermum mopane)、變異小冠 (Coronillia varia) > Cotoneaster serotina> ill 禾查屬(Crataegus spp·)、/R M (Cucumis spp.)、柏木屬(Cupressus spp.)、白粉豐沙欏蕨類(Cyatheadealbata)、溫梓 (Cydonia oblonga)、臼本柳杉(Cryptomeria japonica)、香茅屬(Cymbopogon spp·)、 白粉豐沙 羅蟲朱(Cynthea dealbata)、才顯豐孛(Cydoniaoblonga) > Dalbergia monetaria、大口十 骨碎補(bǔ)(Davallia divaricata)、山馬蝗屬(Desmodium spp·)、粗糙蛘殼蕨(Dicksonia squarosa)、Dibeteropogonamplectens、油麻藤屬(Dioclea spp·)、鍵扁豆屬(Dolichos spp. ) > Dorycnium rectum、金字塔禾卑(Echinochloa pyramidalis) > Ehraffia spp.、龍 JTl 禾§ (Eleusine coracana) > IHl jg ^ M (Eragrestis spp.)、束Ij 桐屬(Erythrinaspp.)、 ^ 屬(Eucalypfus spp. ) > Euclea schimperi> Eulalia vi/losa> ^ ^ M (Pagopyrum spp.)、費(fèi)約果(Fei joa sellowlana)、草莓屬(Fragaria spp·)、千斤拔屬(Flemingia spp.) > Freycinetia banksli、老鶴草(Geraniumthunbergii)、銀杏(GinAgo biloba)、野黃豆(Glycine javanica)、Gliricidiaspp.、陸地棉(Gossypium hirsutum)、銀禪 屬(Grevillea spp.)、非洲紅木(Guibourtia coleosperma)、巖黃蔑屬(Hedysarum spp.)、Hemaffhiaaltissima、Heteropogon contoffus、大麥(Hordeum vulgare)、紅 茍茅(Hyparrhenia rujfa)、小連 S (Hypericum erectum)、Hypeffhelia dissolute、 Indigo incamata、；^■屬(Iris spp.) Λ Leptarrhena pyrolifolia、古月枝子屬(Lespediza spp·)、萬(wàn)苣屬(Lettuca spp·)、銀合歡(Leucaena leucocephala)、Loudetia simplex、 Lotonus bainesli、百脈根屬(Lotus spp.)、大結(jié)豆(Macrotyloma axillare)、蘋果 屬(Malus spp.)、木薯(Manihot esculenta)、紫花苜猜(Medicago saliva)、水杉 (Metasequoia glyptostroboides)、大蕉(Musa sapientum)、煙草屬(Nicotianum spp·)、 驢食豆屬(Onobrychisspp.)、鳥足豆屬(Ornithopus spp.)、稻屬(Oryza spp.)、非洲雙翼 豆(Peltophorum africanum)、各良尾草屬(Pennisetum spp.)、魚辱_ (Perseagratissima) Λ 碧冬 JHjM (Petunia spp·)、菜豆屬(Phaseolus spp·)、針奏(Phoenix canariensis) λ§τ 西蘭僉J 麻(Phormium cookianum)、石 |南屬(Photinia spp·)、白云杉(Picea glauca)、 松屬(Pinus spp.)、豌豆(Pisumsativam)，新西蘭羅漢松(Podocarpus totara)、 Pogonarthria fleckii、Pogonaffhria squarrosa、楊屬(Populus spp.)、 iK 豆 M (Prosopis cineraria)、花方萁松(Pseudotsuga menziesii)、Pterolobium stellatum、西洋 梨(Pyruscommunis)、櫟屬(Quercus spp·)、厚葉石斑木(Rhaphiolepsis umbellata)、美 味棒花棕(Rhopalostylis sapida)、納塔爾鹽膚木(Rhus natalensis)、歐洲醋栗(Ribes grossularia)、醋栗屬(Ribes spp·)、洋槐(Robiniapseudoacacia)、薔礙屬(Rosa spp·)、 懸鉤子屬(Rubus spp.)、柳屬(Salixspp.)、紅裂禾孚草(Schyzachyrium sanguineum)、 金豐公(Sciadopitysvefficillata) Λ 匕美紅杉(Sequoia sempervirens) Λ 3匕美巨杉 (Sequoiadendrongiganteum)、兩色蜀黍(Sorghum bicolor)、菠菜屬(Spinacia spp·)、 Sporobolus fimbriatus、Stiburus alopecuroides、矮筆花豆(Stylosanthoshumilis)、 葫蘆荼屬(Tadehagi spp.)、落羽松(Taxodium distichum)、阿拉伯黃背草(Themeda triandra)、$ 車由胃 jg (Trifolium spp. )、/]、* (Triticumspp.) λ ^ Pf ^ ^ (Tsuga heterophylla)、越桔屬(Vaccinium spp·)、里予豌豆屬(Vicia spp·)、葡萄(Vitis vinifera)、維穗沃森花(Watsonia pyramidata)、馬蹄蓮(Zantedeschia aethiopica)、 玉米(Zea mays)、莧屬植物、洋薊(Artichoke)、蘆筍、青花椰菜、孢子甘藍(lán)(Brussels sprouts)、卷心菜、油菜、胡蘿卜、花椰菜、芹菜、羽衣甘藍(lán)(collard greens)、亞麻、球莖甘 藍(lán)、小扁豆、蕓苔、黃秋葵、洋蔥、馬鈴薯、水稻、大豆、稻桿(straw)、甜菜、甘蔗、向日葵、番 茄、squash tea、玉米、小麥、大麥、黑麥、燕麥、花生、豌豆、小扁豆和紫花苜蓿、棉花、油菜 籽、油菜、胡椒、向日葵、煙草、茄子、桉樹、樹、觀賞植物、多年生草和飼草作物?；蛘撸孱惣?其它非綠色植物可用于本發(fā)明方法。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，本發(fā)明方法所用的植物為農(nóng)作物，例如水稻、玉米、小 麥、大麥、花生、馬鈴薯、芝麻、橄欖樹、棕櫚油、香蕉、大豆、向日葵、油菜(cmola)、甘蔗、紫 花苜蓿、黍、豆科(Ieguminosae)(菜豆、豌豆)、亞麻、羽扇豆、油菜籽、煙草、白楊(popular) 和棉花。
通過(guò)用外源多核苷酸轉(zhuǎn)化一種或更多種植物細(xì)胞，接著從轉(zhuǎn)化細(xì)胞產(chǎn)生成熟植 株，并在適于在該成熟植株內(nèi)表達(dá)該外源多核苷酸的條件下栽培該成熟植株，來(lái)實(shí)現(xiàn)在植物內(nèi)表達(dá)本發(fā)明外源多核苷酸。
根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，通過(guò)將核酸構(gòu)建體導(dǎo)入植物細(xì)胞中來(lái)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)化，所述 核酸構(gòu)建體包括本發(fā)明某些實(shí)施方案的外源多核苷酸和至少一個(gè)能夠指導(dǎo)外源多核苷酸 在植物細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子。下文提供合適轉(zhuǎn)化方法的更詳細(xì)資料。
本文所用術(shù)語(yǔ)“啟動(dòng)子”指位于基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)位點(diǎn)上游的DNA區(qū)，RNA聚合酶結(jié)合 該區(qū)以啟動(dòng)RNA轉(zhuǎn)錄。啟動(dòng)子控制基因表達(dá)的位置(例如在植物的哪一部分)和/或時(shí)間 (例如在生物體的哪一階段或何種條件)。
本發(fā)明核酸構(gòu)建體可使用任何合適的啟動(dòng)子序列。根據(jù)本發(fā)明某些實(shí)施方案，啟 動(dòng)子為組成型啟動(dòng)子、組織特異性或非生物脅迫誘導(dǎo)型啟動(dòng)子。
合適的組成型啟動(dòng)子包括例如CaMV 35S啟動(dòng)子(SEQ IDNO 1546 ；Odell等， Nature 313 :810-812,1985)；擬南芥 At6669 啟動(dòng)子(SEQ ID NO 1652 ；參見 PCT
發(fā)明者A·迪伯, B·J·維諾庫(kù)爾, D·迪馬特, E·伊曼紐爾, G·羅南, H·卡奇, M·岡, S·阿亞爾 申請(qǐng)人:伊沃基因有限公司