專利名稱：：靶序列的富集的制作方法靶序列的富集相關(guān)申請本申請要求保護(hù)2007年8月1日提交的美國臨時申請?zhí)?0/962，838的利益。上述申請的完整教授內(nèi)容通過引用的方式并入本文。
背景技術(shù)：
：遺傳分析中常遇到的情況要求在極為過量的非變異序列(‘參考序列’)存在時鑒定低百分?jǐn)?shù)的變異DNA序列(‘靶序列’)。這類情況的例子包括(a)在大量過量的正常等位基因存在下鑒定并對少數(shù)突變的等位基因測序；(b)遺傳分析中在大量過量的非甲基化等位基因存在下鑒定少數(shù)甲基化等位基因(或相反情況)；(c)鑒定母體血液中循環(huán)的少數(shù)胎兒DNA序列并進(jìn)行基因分型，在所述母體血液中也存在極為過量的母體DNA序列；和(d)在極為過量的野生型等位基因存在下鑒定癌癥患者(或可疑患有癌癥的人)血液中的腫瘤_循環(huán)DNA。盡管最近描述了用于種系或高優(yōu)勢體細(xì)胞突變的可靠高通量篩選方法(Thomas，R.K.等人(2007)NatGenet,39,347-351；Chou,L.S.等人(2005)AmJClinPathol,124；330-338；Thomas,R.K.等人(2006)NatMed，12;852_855)，檢測具有不均一性、基質(zhì)雜質(zhì)的腫瘤或體液中的低優(yōu)勢體細(xì)胞突變?nèi)猿蓡栴}。另外，鑒定這些突變的臨床意義在幾種情況中重要。例如(a)在肺腺癌中，不能通過常規(guī)測序鑒定的低水平EGFR突變可以引起對酪氨酸激酶抑制劑的陽性應(yīng)答(Paez，J.G.，.等人(2004)Science，304；1497-1500.)或耐藥性(Janne,P.A.等人(2006)ClinCancerRes,12；751-758)(b)血漿中用作早期檢測(Diehl,F.等人(2005)ProcNatlAcadSciUSA,102；16368-16373)或腫瘤治療應(yīng)答(Kimura，Τ.等人(2004)ArmNYAcadSci,1022；55-60)的生物標(biāo)記的突變不能使用常規(guī)方法測序；并且(c)頻繁具有基質(zhì)雜質(zhì)如胰腺或前列腺的腫瘤中的突變可以因野生型等位基因存在被掩蔽，因而要求耗費(fèi)勞動力的顯微解剖或完全漏掉突變。發(fā)明概述本發(fā)明涉及用于富集來自樣品的低豐度等位基因的方法、組合物、軟件和裝置。所述方法部分地基于包括在臨界變性溫度或“Tc”保溫反應(yīng)混合物的的改良核酸擴(kuò)增方法。通過使用本發(fā)明，明顯改善全部基于PCR的技術(shù)的現(xiàn)有檢測限。“臨界溫度”或“Tc”指低于參考序列解鏈溫度“Tm”的溫度。在一些實(shí)施方案中，Tc低于參考序列和靶序列的Tm。臨界溫度利用雙鏈靶序列或交叉雜交的靶-參考雙鏈DNA雙鏈體的更低Tm，從而先于所述參考/參考同雙鏈體偏好地變性這些雙鏈體。當(dāng)靶序列和參考序列交叉雜交時，沿著短(例如<200bp)雙鏈DNA序列任意位置處一個或更多單核苷酸錯配的微小序列差異將導(dǎo)致該序列解鏈溫度(Tm)的細(xì)微但可預(yù)測性改變(Lipsky，R.H.等人(2001)ClinChem,47,635-644；Liew,M.等人(2004)ClinChem，50，1156-1164)。根據(jù)錯配的確切序列關(guān)系和位置，考慮0.1-20°C的解鏈溫度改變。臨界變性溫度(Tc)是這樣的溫度，在所述溫度以下參考核酸序列的PCR效率劇烈下降。例如，如果PCR變性溫度設(shè)在87V，良好地擴(kuò)增167bpp53序列，如果設(shè)在86.5°C，適度地擴(kuò)增，并且如果PCR變性溫度設(shè)在86V或更低，不產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。因而在本例子中，Tc是大約86.5°C。在第一方面，本發(fā)明涉及用于富集可疑具有靶序列和參考序列的核酸樣品中靶序列的方法。該方法包括使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于參考序列解鏈溫度“Tm”的第一變性溫度處理。隨后，降低擴(kuò)增反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致單鏈靶序列和參考序列雜交以形成雙鏈分子。因而，該反應(yīng)包括靶-靶、參考-參考的雜交同雙鏈體和靶鏈-參考鏈的雜交異雙鏈體。就定義而言，異雙鏈體是不完全匹配的雙鏈體，然而它含有維持反應(yīng)混合物中雙鏈體形式的鏈間足夠同源。就定義而言，同雙鏈體是完全匹配的雙鏈體。反應(yīng)混合物的溫度隨后提高至Tc，從而導(dǎo)致靶_參考序列雜交雙鏈體的偏好性變性。Tc或臨界溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在該Tc上，靶-參考序列雙鏈體(和僅在具有比參考序列更低的Tm時，靶-靶序列雙鏈體)基本上變性，而靶_靶雙鏈體(如果具有等于或大于參考序列Tm的Tm)和參考-參考序列雙鏈體基本上不變性?！盎旧稀币庵冈诮o定的變性或非變性形式中至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選至少98%。在偏好地變性靶-參考雙鏈體和靶-靶雙鏈體(比參考序列具有更低Tm的那些雙鏈體)后，向反應(yīng)混合物施加降低的溫度，從而導(dǎo)致引物對與靶序列復(fù)性。復(fù)性的引物隨后被延伸，因而相對于樣品中的參考序列富集靶序列。在另一個方面，本發(fā)明涉及富集靶序列的又一種方法。在該方法中，通過施加高于參考序列Tm的第一變性溫度使可疑含有每種靶序列和參考序列的核酸樣品變性。其次，靶鏈和參考鏈相互復(fù)性，從而形成雙鏈靶-參考序列雙鏈體。該靶-參考序列雙鏈體形式形成并連同雙鏈的靶-靶和參考-參考序列雙鏈體一起存在于反應(yīng)混合物中。通過施加所述Tc至樣品偏好地使雙鏈靶_參考雙鏈體和靶_參考序列雙鏈體變性。在該Tc上，靶-參考序列雙鏈體(和僅在具有比參考序列更低的Tm時，靶-靶序列雙鏈體)基本上變性，而靶_靶雙鏈體(如果具有等于或大于參考序列Tm的Tm)和參考-參考序列雙鏈體基本上不變性?！盎旧稀币庵冈诮o定的變性或非變性形式中至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選至少98%。一對引物隨后與靶序列復(fù)性并被延伸，因而相對于樣品中的參考序列增加靶序列的濃度。仍在另一個方面，本發(fā)明涉及用于通過實(shí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法而富集靶序列的方法。該擴(kuò)增反應(yīng)方案包括第一變性溫度和第二變性溫度。第一變性溫度高于參考序列的Tm并且第二變性溫度低于參考序列的Tm。在另一種方面，本發(fā)明涉及通過使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷降低該反應(yīng)混合物的溫度并延伸引物對的Tc處理而富集靶序列的方法，其中所述靶序列具有比相應(yīng)參考序列更低的Tm。該擴(kuò)增反應(yīng)混合物可疑含有靶序列和參考序列的每一種。該Tc低于參考序列的Tm，因而允許以更低Tm偏好性地變性靶序列。在該Tc上，靶-參考序列雙鏈體和靶-靶序列雙鏈體基本上變性，而參考-參考序列雙鏈體本上不變性?！盎旧稀币庵冈诮o定的變性或非變性形式中至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選至少98%。降低反應(yīng)混合物溫度的步驟導(dǎo)致引物對與靶序列復(fù)性。復(fù)性的引物隨后由聚合酶延伸，因而相對于參考序列增加樣品中靶序列的量。仍又在另一個方面，本發(fā)明涉及通過使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷復(fù)性條件和Tc的多個循環(huán)而富集靶序列的方法。可疑具有每種靶序列和參考序列的擴(kuò)增反應(yīng)混合物首先經(jīng)歷高于參考序列Tm的第一變性溫度處理。其次，樣品在溫度不同的兩個保溫步驟之間循環(huán)。在第一保溫步驟中，降低溫度，從而導(dǎo)致靶序列與參考序列雜交，從而形成雙鏈體。在第二保溫步驟中，提高溫度至低于參考序列Tm的Tc。在該Tc上，靶-參考序列雙鏈體(和僅在具有比參考序列更低的Tm時，靶-靶序列雙鏈體)基本上變性，而靶_靶雙鏈體(如果具有等于或大于參考序列Tm的Tm)和參考-參考序列雙鏈體基本上不變性?！盎旧稀币庵冈诮o定的變性或非變性形式中至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選至少98%。隨后重復(fù)這些第一和第二步驟一次或更多次。一旦循環(huán)保溫步驟結(jié)束，降低反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致引物對與靶序列復(fù)性。這些引物隨后由聚合酶延伸，因而相對于樣品中的參考序列富集靶序列。附圖簡述圖1說明使用第一變性溫度和Tc靶序列的本發(fā)明富集方法的一個實(shí)施方案。圖2說明使用往復(fù)復(fù)性/Tc步驟的本發(fā)明富集方法的一個實(shí)施方案。圖3說明所測試的借助靶序列富集方法富集的p53和Kras突變。圖4說明用靶序列富集方法富集p53突變等位基因。圖5說明用靶序列富集方法富集Kras突變等位基因。圖6說明來自肺腫瘤和結(jié)腸腫瘤的臨床樣品中突變等位基因的富集。圖7說明缺少錯配形成步驟的富集方法的實(shí)施方案對突變等位基因的富集。圖8A-8D說明在常規(guī)實(shí)時PCR中或通過以實(shí)時模式應(yīng)用的本發(fā)明富集方法的野生型和突變P53外顯子的擴(kuò)增曲線。(a)顯示常規(guī)實(shí)時PCR中連續(xù)稀釋細(xì)胞系的擴(kuò)增曲線，其中所述細(xì)胞系在P53外顯子8突變中含有突變體。(b)顯示以實(shí)時PCR模式應(yīng)用時本發(fā)明的富集方法中對連續(xù)稀釋的細(xì)胞系的擴(kuò)增曲線，其中所述細(xì)胞在P53外顯子8突變中含有突變體。(c)顯示常規(guī)實(shí)時PCR中4份臨床腫瘤樣品的擴(kuò)增曲線，其中已知所述臨床腫瘤樣品之一含有P53外顯子8突變(CT20)。(d)顯示以實(shí)時PCR模式對所述4份臨床腫瘤樣品應(yīng)用時本發(fā)明富集方法的擴(kuò)增曲線。圖9A-D說明使用DNA檢測染料(LCGreen)時野生型和突變p53的外顯子8的常規(guī)和富集實(shí)時PCR擴(kuò)增曲線。(a)顯示含有突變(SW480、TL6、CT20)和野生型(R27、TL8、TL18、TL81、TL82)p53外顯子8的樣品的常規(guī)實(shí)時PCR的擴(kuò)增曲線。(b)顯示以實(shí)時模式對含有突變(SW480、TL6、CT20)和野生型(R27、TL8、TL18、TL81、TL82)p53外顯子8的樣品應(yīng)用時，來自本發(fā)明富集方法的擴(kuò)增曲線。(c)顯示含有突變(SW480、CT7、HCC、CT20)和野生型p53外顯子8的樣品的常規(guī)實(shí)時PCR的擴(kuò)增曲線。(b)顯示以實(shí)時模式對含有突變(SW480、CT7、HCC、CT20)和野生型p53外顯子8的樣品應(yīng)用時本發(fā)明富集方法的擴(kuò)增曲線。圖10A-B說明有機(jī)溶劑(例如3%DMS0)對靶富集的影響。(a)實(shí)時PCR中野生型和突變體P53外顯子8的擴(kuò)增曲線。(b)以實(shí)時模式對突變和野生型p53外顯子8應(yīng)用時本發(fā)明富集方法的擴(kuò)增曲線。圖11說明AA761EGFR突變的Taql消化之后，使用本發(fā)明富集方法的改良限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)檢測。(a)說明當(dāng)常規(guī)PCR或富集方法后110，000(突變體基因組)稀釋時野生型和突變(AA761)EGFR的檢測。(b)說明通過常規(guī)PCR加以分析時野生型EGFR的檢測。發(fā)明詳述本發(fā)明涉及用于富集來自樣品的低豐度等位基因(例如靶序列)的方法、組合物、軟件和裝置。本發(fā)明部分地涉及通過施加臨界變性溫度至反應(yīng)混合物選擇性地富集靶序列。臨界變性溫度或Tc是低于參考序列解鏈溫度Tm的溫度。該臨界溫度利用雙鏈靶序列或交叉雜交的靶_參考雙鏈DNA雙鏈體的更低Tm，從而先于所述參考/參考同雙鏈體偏好地變性這些雙鏈體。眾多已知突變檢測方法仍可從使用選擇性富集靶序列的本發(fā)明受益。在大部分突變和測序反應(yīng)中利用PCR作為遺傳檢驗的初始步驟。通常，擴(kuò)增核酸序列(例如基因組DNA/cDNA)作為第一步驟，隨后是雙脫氧測序或突變篩選法(例如SSCP、dHPLC、MALDI-TOF、焦磷酸測序法、高分辨率解鏈法)。因此，如果在篩選之前的PCR步驟期間進(jìn)行含突變序列(例如靶序列)的富集，則基本上全部突變檢測方法的檢測限將一律受益。如本文中所用，術(shù)語“富集靶序列”指相對于樣品中的相應(yīng)參考序列，增加靶序列的量并提高靶序列的比率。例如，在樣品中靶序列對參考序列的比率初始地是5%至95%的情況下，靶序列可以在擴(kuò)增反應(yīng)中被偏好地擴(kuò)增，從而產(chǎn)生70%靶序列對30%參考序列的比率。因而，存在靶序列相對于參考序列的14倍富集。靶序列的富集導(dǎo)致靶序列相對于富集前的參考序列增加2倍至200倍。靶的富集是優(yōu)于參考序列的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更多倍數(shù)富集。靶序列的富集產(chǎn)生與參考序列相比具有10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、80%、90%、95%或更多靶序列的樣品(例如10%靶序列90%參考序列至95%靶序列5%參考序列)。如本文中所用，術(shù)語“靶序列”指核酸樣品中比參考序列較不優(yōu)勢的核酸。靶序列占據(jù)樣品中少于50%的參考序列+靶序列的總量。優(yōu)選地，靶序列相對于參考序列在RNA和/或DNA水平上以110、115、120、125倍、130、135、140、145、150、160、170、180、190、1100、1150、1200倍或更低水平表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，靶序列是突變等位基因。例如，樣品(例如血液樣品)可以含有眾多正常細(xì)胞和少數(shù)癌細(xì)胞。正常細(xì)胞含有非突變或野生型等位基因，而少數(shù)癌細(xì)胞含有體細(xì)胞突變。在這種情況下，突變體是靶序列而野生型序列是參考序列。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及檢測從母親獲得的核酸樣品中的胎兒DNA。在這個實(shí)施方案中，靶序列存在于胎兒DNA中而更優(yōu)勢的母親DNA含有參考序列。如本文中所用，靶序列意圖包括從妊娠母親獲得的胎兒DNA。如本文中所用，“靶鏈”指靶序列的單核酸鏈。靶序列長約17-2000個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，靶序列長20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900個或更多個核苷酸。靶序列與對應(yīng)的參考序列共有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源性，不過與該參考序列不同至少一個核苷酸?？梢越柚鶳CR，采用與用于參考序列的那些引物對相同的引物對擴(kuò)增本發(fā)明的靶序列。如本文中所用，術(shù)語“參考序列，，指核酸樣品中比對應(yīng)靶序列(例如相同基因，但不同的核酸序列)更優(yōu)勢的核酸。參考序列占據(jù)樣品中超過50%的總體參考序列+靶序列。優(yōu)選地，參考序列相對于靶序列在RNA和/或DNA水平上以10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、150倍、200倍或更高水平表達(dá)。在一個實(shí)施方案中，參考序列是野生型等位基因。例如，樣品(例如血液樣品)可以含有眾多正常細(xì)胞和少數(shù)癌細(xì)胞。正常細(xì)胞含有非突變或野生型等位基因，而少數(shù)癌細(xì)胞含有體細(xì)胞突變。在這種情況下，該野生型序列是參考序列而突變序列是靶序列(例如突變等位基因)。如本文中所用，“參考鏈”指參考序列的單核酸鏈。參考序列長約17-2000個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，參考序列長20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900個或更多個核苷酸。參考序列將與對應(yīng)的靶序列共有至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多同源性，不過與該靶序列不同至少一個核苷酸?？梢酝ㄟ^PCR，采用與用于靶序列的那些引物對相同的引物對擴(kuò)增本發(fā)明的參考序列。術(shù)語“等位基因”指基因、其部分或DNA非編碼區(qū)的變異形式，其中所述變異形式在核苷酸序列中具有至少一個差異的同源染色體上占據(jù)相同基因座或位置。術(shù)語“等位基因”可以用來描述來自任意生物的DNA，所述的任意生物包括但不限于細(xì)菌、病毒、真菌、原蟲、霉菌、酵母、植物、人、非人動物和古細(xì)菌。等位基因可以存在于單個細(xì)胞(例如，兩個等位基因，一個等位基因從父親遺傳并且另一個來自母親)或細(xì)胞群體內(nèi)部(例如，來自正常組織的野生型等位基因和來自發(fā)病組織的體細(xì)胞突變等位基因)。等位基因可以長17-2000個核苷酸。在一個實(shí)施方案中，等位基因長20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900個或更多個核苷酸。等位基因通常將相互共有50%、60%、70%、80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更多的同源性?？梢酝ㄟ^PCR，采用相同的引物對擴(kuò)增本發(fā)明的等位基因。在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明用來富集多態(tài)性。任意給定的基因可以沒有、具有一種或多種等位形式(多態(tài)性)。產(chǎn)生等位基因的常見突變性改變可以是天然或人工(例如化學(xué)致癌原)缺失、添加或替換核苷酸的結(jié)果。這些類型的改變的每一種可以單獨(dú)或與其余類型組合在給定序列中出現(xiàn)一次或更多次。已經(jīng)報道了幾種不同類型的多態(tài)性。限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)是DNA序列中變更限制性片段長度的變異(Botstein等人，Am.J.Hum.Genet.32:314_331(1980))。限制性片段長度多態(tài)性可以創(chuàng)造或缺失限制性位點(diǎn)，因而改變限制性片段的長度。RFLP已經(jīng)廣泛地用于人和動物遺傳分析中(見WO90/13668；WO90/11369；Donis-Keller,Cell51319-337(1987)；Lander等人，Genetics121:85-99(1989))。當(dāng)可遺傳性狀可能連鎖于特定的RFLP時，某個體中該RFLP的存在性可以用來預(yù)測該個體也將顯示展示該性狀的可能性。RFLP以與本文所述的富集方法聯(lián)合使用，從而增強(qiáng)對多態(tài)性的檢測。此類方法在本文實(shí)施例9中描述。其他多態(tài)性采取包含串聯(lián)、二、三和四核苷酸重復(fù)基序的短串聯(lián)重復(fù)序列(STR)形式。這些串聯(lián)重復(fù)序列也稱作可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)(VNTR)多態(tài)性。VNTR已經(jīng)用于身份和父子關(guān)系分析(美國專利號5，075，217;Armour等人，F(xiàn)EBSLett.307113-115(1992)；Horn等人，WO91/14003Jeffreys,EP370,719)和大量的遺傳作圖研究中。其他多態(tài)性采取相同物種的個體之間單核苷酸變異的形式。此類多態(tài)性遠(yuǎn)比RFLP、STR(短串聯(lián)重復(fù)序列)和VNTR(可變數(shù)目的串聯(lián)重復(fù)序列)頻繁。一些單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)于編碼蛋白質(zhì)的序列中，在這種情況下，所述多態(tài)性形式之一可以導(dǎo)致缺陷蛋白質(zhì)或其他變異蛋白質(zhì)表達(dá)并潛在地導(dǎo)致遺傳病。其他單核苷酸多態(tài)性出現(xiàn)在非編碼區(qū)中。這些多態(tài)性中某些也可以導(dǎo)致缺陷蛋白質(zhì)表達(dá)(例如作為缺陷剪接作用的結(jié)果)。其他單核苷酸多態(tài)性沒有表型效果。其他突變還包括體細(xì)胞突變。體細(xì)胞突變是DNA中受孕后出現(xiàn)的變異。體細(xì)胞突變可以在除生殖細(xì)胞(精子和卵子)之外的任何身體細(xì)胞中出現(xiàn)并因而不傳遞至兒童。這些變異可能(但不總是)導(dǎo)致癌癥或其他疾病。如本文中所用，術(shù)語“野生型”指群體中對于某種基因最常見的多核苷酸序列或等位基因。通常，野生型等位基因?qū)恼＜?xì)胞獲得。本文中所用，術(shù)語“突變體”指核酸序列中的核苷酸改變(即單個或多個核苷酸替換、缺失或插入)。攜帶突變的核酸具有在序列上不同于對應(yīng)野生型多核苷酸序列的核酸序列(突變等位基因)。本發(fā)明的方法尤其用于選擇性地富集含有1和500個之間核苷酸序列改變的突變等位基因。與對應(yīng)的野生型等位基因相比，突變等位基因可以具有1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200,300,400或500個核苷酸序列改變。優(yōu)選地，突變等位基因中的突變將含有1和10個之間的核苷酸序列改變并且更優(yōu)選地含有1和5個之間的核苷酸序列改變。該突變等位基因?qū)⑴c野生型等位基因具有50%,60%,70%,80%,85%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%、97%、98%、99%或更多的同源性。通常，突變等位基因?qū)陌l(fā)病的組織或細(xì)胞獲得并與疾病狀態(tài)相關(guān)。如本文中所用，術(shù)語“解鏈溫度”或“Tm”指多核苷酸與其互補(bǔ)序列解離的溫度。通常，Tm可以定義為這樣的溫度，在該溫度上雙鏈體核酸分子中的一半Watson-Crick堿基對被破壞或解離(即“解鏈”)，而其余一半Watson-Crick堿基對仍完好處于雙鏈構(gòu)象。換句話說，1定義為兩條互補(bǔ)序列的50%核苷酸復(fù)性(雙鏈)且50%核苷酸變性(單鏈)的溫度。Tm因而定義了從雙鏈核酸分子至單鏈核酸分子的轉(zhuǎn)變過程(或反過來從單鏈核酸分子至雙鏈核酸分子的轉(zhuǎn)變過程)的中間點(diǎn)。Tm可以通過眾多方法估計，例如按照Wetmur1991(ffetmur,J.G.1991.DNAprobes!applicationsoftheprinciplesofnucleicacidhybridization.CritRevBiochemMolBiol26:227_259，該文獻(xiàn)因而通過引用的方式并入)的最近鄰計算法和借助商用程序，所述商用程序包括01igOTMPrimerDesign和互聯(lián)網(wǎng)上可利用的程序?；蛘?，Tm可以通過實(shí)際實(shí)驗確定。例如，雙鏈DNA結(jié)合或嵌入染料溴化乙啶或SYBR-綠(MolecularProbes)可以用在確定核酸實(shí)際Tm的解鏈曲線測定法中。用于確定核酸Tm的額外方法是本領(lǐng)域熟知的并且在本文描述。如本文中所用，臨界溫度”或“Tc”指低于參考序列“Tm”的溫度。施加Tc以偏好地變性雙鏈的靶序列雙鏈體或靶序列/參考序列雙鏈的雙鏈體，從而導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)期間靶序列的選擇性富集。臨界變性溫度(Tc)是這樣的溫度，在所述溫度以下給定核酸序列的PCR效率劇烈下降。例如，如果PCR變性溫度設(shè)在87V，良好地擴(kuò)增167bpp53序列，如果設(shè)在86.5°C，適度地擴(kuò)增，并且如果PCR變性溫度設(shè)在86°C或更低，不產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。因而在本例子中，Tc是大約86.50C。Tc低于參考序列Tm約.1-20°C。更優(yōu)選地，Tc低于參考序列Tm約·l-10°c、·1-9°C、·l-8°c、·l-7°c、·1-6°C、·2°C_5°C、·3°C-4.5°C、·4-4°C、·5-3.5°C、.5-3°C、.5-3°C、.5-2.5°C、.5_2°C、.5-1.5°C、.5_1°C。在一些實(shí)施方案中，Tc低于參考序列和靶序列的Tm。例如，Tc可以低于靶序列1約.1-10°C、.1-90C,.1-8°C1-71-6°C、·2°C_5°C、·3°C-4.5°C、·4-4°C、·5-3.5°C、·5_3°C、·5_3°C、·5-2.5°C、·5_2°C、·5-1.5°C、·5-1°C。如本文中所用，術(shù)語“選擇性變性”或“偏好性變性”指偏好地破壞靶序列或靶/參考序列雙鏈體的雙鏈核酸分子中堿基對之間的氫鍵以產(chǎn)生單鏈靶序列。靶序列的選擇性變性通過施加臨界溫度至含有靶序列和參考序列的樣品實(shí)現(xiàn)。本文中所用，“引物對”指與靶序列和參考序列的對立鏈復(fù)性從而在PCR反應(yīng)期間形成擴(kuò)增產(chǎn)物的兩條引物。該引物對如此設(shè)計，從而具有該反應(yīng)Tc的Tm。如本文中所用，術(shù)語“交叉雜交”指在相異一個或多個核苷酸的兩個核酸序列之間借助互補(bǔ)性G與C堿基之間和互補(bǔ)性A與T堿基或A與U堿基之間氫鍵形成所產(chǎn)生的雙鏈體。這兩個互補(bǔ)性核酸序列以反平行構(gòu)象形成氫鍵。在優(yōu)選施方案中，這兩個核酸序列是靶序列和參考序列。交叉雜交的DNA將在參考序列與靶序列之間差異的位置處含有錯配。所述錯配可以包括多態(tài)性、突變、插入、缺失和產(chǎn)生此類差異的其他變異。例如，甲基化。例如，含有一個或多個核苷酸的環(huán)和/或單鏈區(qū)出現(xiàn)于缺失/插入位點(diǎn)處。交叉雜交一般涉及使靶序列和參考序列變性，例如通過加熱，隨后在導(dǎo)致雜交和雙鏈體形成發(fā)生的條件(如溫度)下復(fù)性。如本文中所用，“反應(yīng)混合物”是可疑含有靶序列雙鏈體的混合物，其中所述混合物包含導(dǎo)致靶序列變性的合適緩沖液。如本文中所用，“同一性”或“同源性”指兩個聚合物分子例如兩個多核苷酸或兩個多肽之間的次級單位序列相似性。當(dāng)這兩個分子中的次級單位位置被相同單體性次級單位占據(jù)時，例如，若兩個多肽之每一多肽中的某位置被絲氨酸占據(jù)，則這兩個多肽在該位置上相同。兩個序列之間的同一性是匹配數(shù)或相同位置的直接函數(shù)，例如，如果兩個肽或復(fù)合物序列中一半(例如長度10個次級單位的聚合物中的5個位置)位置是相同的，則這兩個序列是50%相同的；如果90%的位置(例如10個位置中9個位置)匹配，則這兩個序列共享90%序列同一性。核苷酸同一性百分?jǐn)?shù)可以通過BLAST的默認(rèn)參數(shù)確定。對于序列比較，一般地一個序列充當(dāng)檢驗序列與之比較的參考序列。當(dāng)使用序列比較算法時，將檢驗序列和參考序列輸入計算機(jī)，根據(jù)需要指定次級序列坐標(biāo)，并指定序列算法程序參數(shù)?？梢允褂媚J(rèn)程序參數(shù)或可以指定備選參數(shù)?；诔绦騾?shù)，序列比較算法隨后相對于參考序列計算檢驗序列的序列同一性百分?jǐn)?shù)。比較窗口包括針對具有任一連續(xù)位置數(shù)的節(jié)段的參考，所述的連續(xù)位置數(shù)選自由20至600、通常約50至約200、更通常約100至約150的組成的組，其中一個序列可以與具有相同連續(xù)位置數(shù)的參考序列在這兩個序列最佳比對后進(jìn)行比較。用于比較的序列比對方法是本領(lǐng)域熟知的。用于比較的最佳序列比對可以這樣進(jìn)行，例如通過Smith和Waterman,Adv.App1.Math.2482(1981)的局部同源性算法、通過Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48:443(1970)的同源性比對算法、通過Pearson和Lipman，Proc.Nat‘1.Acad.Sci.USA85:2444(1988)的相似性搜索方法、通過這些算法的計算機(jī)化執(zhí)行(GAP、BESTFIT、FASTA，和TFASTAintheWisconsinGenetics軟件包，GeneticsComputerGroup,575ScienceDr.、Madison、Wis.)或通過手工比對和目視審查(見，例如，CurrentProtocolsinMolecularBiolog(Ausubel等人編著，1995增補(bǔ)))。適用于確定序列同一性和序列相似性百分?jǐn)?shù)的算法例子是BLAST和BLAST2.O算法，它們分別在Altschul等人，Nuc.AcidsRes.25:3389_3402(1977)和Altschul等人，J.Mol.Biol.215=403-410(1990)中描述。用于開展BLAST分析的軟件是通過國家生物技術(shù)信息中心((http://www.ncbi.nlm.nih.gov/))可公開獲得的。該算法涉及首先通過查詢序列中長度W的短字鑒定高評分序列對(HSP)，其中所述短字與數(shù)據(jù)庫序列中具有相同長度的字比對時匹配或滿足某些正值閾評分Τ。T稱作鄰居字評分閾值(上文的Altschul等人)。這些初始鄰居字hit充當(dāng)啟動搜索的種子以發(fā)現(xiàn)含有這些種子的更長HSP。所述字hit沿每個序列向兩個方向延伸，只要可以提高累積比對評分。對于核苷酸序列，使用參數(shù)M(—對匹配殘基的報酬評分；總是>0)和N(錯配殘基的的懲罰評分；總是<0)計算累積評分。對于氨基酸序列，使用評分矩陣來計算累積評分。字hit在每個方向上的延伸在以下情況時停止累積比對評分從其最大實(shí)現(xiàn)值跌落達(dá)量X；累積評分因積累一個或更多負(fù)評分殘基比對比對結(jié)果而達(dá)到或低于零；或抵達(dá)兩個序列二者之一的末端。BLAST算法參數(shù)W、T和X決定比對的靈敏度和速度。BLASTN程序(對于核苷酸序列)使用字長度(W)ll、期望(E)10、M=5、N=-4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)。對于氨基酸序列，BLASTP程序使用字長度(W)11和期望(E)10，以及BL0SUM62評分矩陣(見Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA8910915(1989))、比對結(jié)果(B)50、M=5、N=_4和兩條鏈的比較作為默認(rèn)。BLAST算法也進(jìn)行兩個序列之間相似性的統(tǒng)計分析(見，例如，Karlin和Altschul,Proc.Nat'1Acad.Sci.USA90:58735787(1993))。由BLAST算法提供的相似性的一種度量是最小總和概率(P(N))，其提供兩個核苷酸序列或氨基酸序列之間的匹配會因偶然發(fā)生的概率指示。例如，如果最小總和概率在檢驗核酸與參考核酸的比較中小于約0.2、更優(yōu)選小于約0.01并且最優(yōu)選小于約0.001，則將認(rèn)為核酸相似于參考序列。在第一方面，本發(fā)明涉及用于富集可疑具有靶序列和參考序列的核酸樣品中靶序列的方法。參考序列和靶序列可以在本方法中使用之前被擴(kuò)增。即參考序列和目的靶序列可以在本方法中使用之前在PCR反應(yīng)中從基因組模板擴(kuò)增。隨后為用于選擇性富集方法中，轉(zhuǎn)移來自該P(yáng)CR反應(yīng)的等分試樣?；蛘?，參考序列和靶序列無需經(jīng)歷第一PCR反應(yīng)，不過可以在選擇性富集方法中以它們的天然形式(例如基因組DNA)使用。靶序列和參考序列可以從包括基因組DNA、cDNA、病毒DNA、哺乳動物DNA、胎兒DNA或細(xì)菌DNA的任意核酸序列獲得。在參考序列通常是野生型等位基因而靶序列是突變等位基因的同時，也可以反之亦然。突變等位基因可以包括任意一個或多個核苷酸缺失、插入或改變。在一些實(shí)施方案中，突變等位基因是體細(xì)胞突變。在其他實(shí)施方案中，靶序列是甲基化DNA而參考序列為非甲基化DNA?；蛘?，靶序列為非甲基化DNA而參考序列是甲基化DNA。一般如此設(shè)計本發(fā)明方法中使用的引物，從而產(chǎn)生大小約17至1000堿基、更優(yōu)選約25至500堿基和最優(yōu)選約50至100堿基的參考序列和靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物。該方法包括使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于參考序列解鏈溫度“Tm”的第一變性溫度處理。核酸的Tm可以通過實(shí)驗確定或通過計算估計。技術(shù)人員十分了解用于確定核酸Tm的眾多熟知方法，其中所述方法的某些在本文描述。根據(jù)PCR中所用標(biāo)準(zhǔn)方法設(shè)置第一變性溫度。因而，第一變性溫度應(yīng)當(dāng)足夠地高，從而導(dǎo)致靶序列和參考序列的充分變性(例如96°C)。在一個實(shí)施方案中，第一變性溫度高于參考序列Tm約1°C至30°C，參考序列的Tm更優(yōu)選地高于參考序列Tm約5°C至20°C。隨后，降低擴(kuò)增反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致靶序列和參考序列雜交。在優(yōu)選施方案中，該雜交溫度或中間溫度(低于第一變性溫度和Tc，但高于引物復(fù)性/延伸溫度的溫度，例如約60°C至80°C)高于引物對的Tm，并因而導(dǎo)致靶序列與參考序列雜交而阻止引物對與靶序列和/或參考序列的結(jié)合。這個復(fù)性步驟導(dǎo)致雙鏈的靶_靶、參考_參考和靶_參考序列的雜交雙鏈體形成。隨后通過提高反應(yīng)混合物的溫度至所述Tc偏好地變性靶-參考雜交雙鏈體。Tc或臨界溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在一個實(shí)施方案中，Tc低于參考序列的Tm約.3°C_5°C并且更優(yōu)選低于約.5°C至1.5°C。通常，Tc將是約70-90°。如果靶序列具有與參考序列相比產(chǎn)生更低Tm的核苷酸序列，靶-靶雜交雙鏈體也可以被偏好地變性。在該Tc上，靶-參考序列雙鏈體(和僅在具有比參考序列更低的Tm時，靶-靶序列雙鏈體)基本上變性，而靶-靶雙鏈體(如果具有等于或大于參考序列Tm的Tm)和參考-參考序列雙鏈體基本上不變性?！盎旧稀币庵冈诮o定的變性或非變性形式中至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選至少98%。一般施加該Tc約1秒至5分鐘、更優(yōu)選2秒至1分鐘并且最優(yōu)選5秒至30秒。在偏好性地變性靶_參考和/或靶_靶序列雜交雙鏈體后，降低反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致引物對與靶序列復(fù)性。復(fù)性的引物隨后由核酸聚合酶延伸，因而相對于樣品中的參考序列富集靶序列。該方法的所述步驟通常重復(fù)多個循環(huán)，旨在引起靶序列和參考序列充分?jǐn)U增。在一個實(shí)施方案中，該方法的步驟重復(fù)5-40個循環(huán)并更優(yōu)選地重復(fù)10-30個循環(huán)。最佳循環(huán)數(shù)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在PCR裝置中進(jìn)行，更優(yōu)選地在實(shí)時反應(yīng)條件下在實(shí)時檢測PCR裝置如SMARTCYCLER實(shí)時PCR裝置(C印heid，Sunnyvale,CA)和Mx3005P實(shí)時PCR裝置(Stratagene，LaJolla,CA)中進(jìn)行。在這個實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可以包含用于量化和/或監(jiān)測該反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸檢測試劑(例如核酸檢測染料如SYBRGreen染料或LC-Green染料或有效偶聯(lián)于熒光染料的探針)。一旦靶序列的富集完成，可以進(jìn)一步加工該樣品(例如以鑒定由該方法富集的任意遺傳變異，例如，經(jīng)歷測序反應(yīng))。富集的參考序列可以由多種方法進(jìn)一步加工，所述方法包括MALDI-T0F、HR解鏈法、雙脫氧測序、單分子測序、焦磷酸測序、RFLP、數(shù)字PCR和定量PCR。仍在另一個方面，本發(fā)明涉及用于通過實(shí)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)方法而富集靶序列的方法。該擴(kuò)增反應(yīng)方法包括第一變性溫度和第二變性溫度。第一變性溫度高于參考序列的Tm并且第二變性溫度低于參考序列的Tm。該方法包括使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于參考序列解鏈溫度“Tm”的第一變性溫度處理。核酸的Tm可以通過實(shí)驗確定或通過計算估計。技術(shù)人員十分了解用于確定核酸Tm的眾多熟知方法。第一變性溫度通常如一般將選擇PCR反應(yīng)的變性溫度那樣進(jìn)行選擇并且應(yīng)當(dāng)足夠地高，從而導(dǎo)致靶序列和參考序列的變性。在一個實(shí)施方案中，第一變性溫度高于參考序列Tm約1°C至30°C，參考序列的Tm更優(yōu)選地高于參考序列1約51至20°C。第二變性溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在一個實(shí)施方案中，Tc低于參考序列的Tm約.3°C_5°C并且更優(yōu)選低于參考序列的Tm約.5°C至1.5°C。通常，Tc將是約70-90°。一般施加第二變性溫度約1秒至5分鐘、更優(yōu)選2秒至1分鐘并且最優(yōu)選5秒至30秒。在另一種方面，本發(fā)明涉及通過使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷降低該反應(yīng)混合物的溫度并延伸引物對的Tc處理而富集靶序列的方法。該擴(kuò)增反應(yīng)混合物可疑含有靶序列和參考序列。在這個方面，靶序列具有低于參考序列1的！。該Tc低于參考序列的Tm，因而導(dǎo)致因其核苷酸組成(例如缺失)而具有比參考序列更低的、的靶序列的偏好變性。如同本發(fā)明的其他方面，參考序列和靶序列可以在本方法中使用之前擴(kuò)增。即參考序列和目的靶序列可以在本方法中使用之前在PCR反應(yīng)中從基因組模板擴(kuò)增。隨后為用于選擇性富集方法中，轉(zhuǎn)移來自該P(yáng)CR反應(yīng)的等分試樣?；蛘?，參考序列和靶序列無需經(jīng)歷第一PCR反應(yīng)，不過可以在選擇性富集方法中以它們的天然形式(例如基因組DNA)使用。所述靶序列和參考序列可以從包括基因組DNA、cDNA、病毒DNA、哺乳動物DNA、胎兒DNA或細(xì)菌DNA的任意核酸序列獲得。在參考序列通常是野生型等位基因而靶序列是突變等位基因的同時，也可以反之亦然。突變等位基因可以包括任意一個或多個核苷酸缺失、插入或改變。在一些實(shí)施方案中，突變等位基因是體細(xì)胞突變。一般如此設(shè)計本發(fā)明方法中使用的引物，從而產(chǎn)生大小約15至1000堿基、更優(yōu)選約25至500堿基和最優(yōu)選約50至100堿基的參考序列和靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物。通過提高反應(yīng)混合物的溫度至所述Tc偏好地變性靶_靶雜交雙鏈體。Tc或臨界溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在一個實(shí)施方案中，Tc低于參考序列的Tm約.3°C_5°C并且更優(yōu)選低于參考序列的Tm約.5°C至1.5°C。通常，Tc將是約70-90°C。一般施加該Tc約1秒至5分鐘、更優(yōu)選2秒至1分鐘并且最優(yōu)選5秒至30秒。在該Tc上，靶-參考序列雙鏈體和靶-靶序列雙鏈體基本上變性，而參考_參考序列雙鏈體本上不變性?！盎旧稀币庵冈诮o定的變性或非變性形式中至少60%、優(yōu)選至少70%、更優(yōu)選至少80%、甚至更優(yōu)選至少90%并且最優(yōu)選至少98%。降低反應(yīng)混合物溫度的步驟導(dǎo)致引物對與靶序列復(fù)性。復(fù)性的引物隨后由聚合酶延伸，因而增加樣品中靶序列的量。該方法的所述步驟通常重復(fù)多個循環(huán)，旨在引起靶序列和參考序列充分?jǐn)U增。在一個實(shí)施方案中，該方法的步驟重復(fù)5-40個循環(huán)并更優(yōu)選地重復(fù)10-30個循環(huán)。最佳循環(huán)數(shù)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在PCR裝置中進(jìn)行，更優(yōu)選地在實(shí)時反應(yīng)條件下在實(shí)時檢測PCR裝置如SMARTCYCLER實(shí)時PCR裝置(Cepheid,Sunnyvale,CA)和Mx3005P實(shí)時PCR裝置(Stratagene,Lajolla,CA)中進(jìn)行。在這個實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可以包含用于量化和/或監(jiān)測該反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸檢測試劑(例如核酸檢測染料如SYBRGreen染料或LC-Green染料或有效偶聯(lián)于熒光染料的探針)。一旦靶序列的富集完成，可以進(jìn)一步加工該樣品，例如，經(jīng)歷測序反應(yīng)。富集的等位基因可以由多種方法進(jìn)一步加工，所述方法包括MALDI-TOF、HR解鏈法、雙脫氧測序、單分子測序、焦磷酸測序、RFLP、數(shù)字PCR和定量PCR。仍又在另一個方面，本發(fā)明涉及通過使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷復(fù)性條件和通過施加Tc所致變性條件的輪換步驟而富集靶序列的方法。具有每種靶序列和參考序列的擴(kuò)增反應(yīng)混合物首先經(jīng)歷高于參考序列Tm的第一變性溫度處理。如在其余方面那樣，參考序列和靶序列可以在本方法中使用之前被擴(kuò)增。即參考序列和目的靶序列可以在本方法中使用之前在PCR反應(yīng)中從基因組模板擴(kuò)增。隨后為用于選擇性富集方法中，轉(zhuǎn)移來自該P(yáng)CR反應(yīng)的等分試樣。或者，參考序列和靶序列無需經(jīng)歷第一PCR反應(yīng)，不過可以在選擇性富集方法中以它們的天然形式(例如基因組DNA)使用。所述靶序列和參考序列可以從包括基因組DNA、cDNA、病毒DNA、哺乳動物DNA、胎兒DNA或細(xì)菌DNA的任意核酸序列獲得。在參考序列通常是等位基因而靶序列是突變等位基因的同時，也可以反之亦然。突變等位基因可以包括任意一個或多個核苷酸缺失、插入或改變。在一些實(shí)施方案中，突變等位基因是體細(xì)胞突變。在其他實(shí)施方案中，靶序列是甲基化DNA而參考序列為非甲基化DNA?；蛘?，靶序列為非甲基化DNA而參考序列是甲基化DNA。一般如此設(shè)計本發(fā)明方法中使用的引物，從而產(chǎn)生大小約15至1000堿基、更優(yōu)選約25至500堿基和最優(yōu)選約50至100堿基的參考序列和靶序列擴(kuò)增產(chǎn)物。核酸的、可以通過實(shí)驗確定或通過計算估計。技術(shù)人員十分了解用于確定核酸Tffl的眾多熟知方法。第一變性溫度通常如一般將選擇PCR反應(yīng)的變性溫度那樣進(jìn)行選擇并且應(yīng)當(dāng)足夠地高，從而導(dǎo)致靶序列和參考序列的變性。在一個實(shí)施方案中，第一變性溫度高于參考序列Tm約l°c至30°C，參考序列的Tm更優(yōu)選地高于參考序列Tm約5°C至20°C。其次，樣品在溫度不同的兩個保溫步驟之間循環(huán)。在第一保溫步驟中，降低溫度，從而導(dǎo)致靶序列與參考序列雜交。在第二保溫步驟中，提高溫度至低于參考序列Tm的Tc。隨后重復(fù)這些第一和第二步驟一次或更多次，更優(yōu)選3-20次并且最優(yōu)選5-10次。第一保溫步驟導(dǎo)致靶_靶、參考_參考和靶_參考序列的雜交雙鏈體形成。在優(yōu)選施方案中，該雜交溫度或中間溫度(低于第一變性溫度和Tc，但高于引物復(fù)性/延伸溫度的溫度，例如約60°C至80°C)高于引物對的Tm，并因而導(dǎo)致靶序列與參考序列雜交而阻止引物對與靶序列和/或參考序列的結(jié)合。隨后通過在第二保溫步驟中提高反應(yīng)混合物的溫度至所述Tc偏好地變性靶-參考和靶-靶(只要該靶具有比參考序列更低的TJ雜交雙鏈體。Tc或臨界溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在一個實(shí)施方案中，Tc低于參考序列的Tm約.3°C_5°C并且更優(yōu)選低于參考序列的Tm約.5°C至1.5°C。通常，Tc將是約70-90°C。如果靶序列具有與參考序列相比產(chǎn)生更低Tm的核苷酸序列，靶-靶雜交雙鏈體也被偏好地變性。一般施加該Tc約1秒至5分鐘、更優(yōu)選2秒至1分鐘并且最優(yōu)選5秒至30秒。一旦循環(huán)保溫步驟結(jié)束，降低反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致一個或多個引物與靶序列復(fù)性。這些引物隨后由聚合酶延伸，因而富集靶序列?！┟總€步驟完成，則該反應(yīng)可以重復(fù)多個循環(huán)，旨在引起靶序列和參考序列充分?jǐn)U增。在一個實(shí)施方案中，該方法的步驟重復(fù)5-40個循環(huán)并更優(yōu)選地重復(fù)10-30個循環(huán)。最佳循環(huán)數(shù)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在PCR裝置中進(jìn)行，更優(yōu)選地在實(shí)時反應(yīng)條件下在實(shí)時檢測PCR裝置如SMARTCYCLER實(shí)時PCR裝置(C印heid，Sunnyvale,CA)和Mx3005P實(shí)時PCR裝置(Stratagene，LaJolla，CA)中進(jìn)行。在這個實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可以包含用于量化和/或監(jiān)測該反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸檢測試劑(例如核酸檢測染料如SYBRGreen染料或LC-Green染料或有效偶聯(lián)于熒光染料的探針)。一旦靶序列的富集完成，樣品可以經(jīng)歷其他方法處理。其他方法包括MALDI-TOF、HR解鏈法、雙脫氧測序、單分子測序、焦磷酸測序、RFLP、數(shù)字PCR和定量PCR。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明的方法可以用來檢測甲基化是否已經(jīng)出現(xiàn)在靶序列或參考序列中。在又一個實(shí)施方案中，所述方法使用基因組DNA來分析甲基化。16甲基化檢測方法包括用于甲基化敏感處理DNA的化學(xué)方法或酶方法。化學(xué)處理包括將DNA與亞硫酸氫鈉保溫，所述的亞硫酸氫鈉選擇性地將非甲基化胞嘧啶轉(zhuǎn)換成尿嘧啶。該DNA首先進(jìn)行熱變性并隨后可以用pH5-7的5M亞硫酸氫鹽處理。在亞硫酸氫鹽處理前使用除去預(yù)先存在的尿嘧啶的基因組DNA預(yù)處理法。這種預(yù)處理法由pH7的5mM羥胺存在下的尿嘧啶糖基化酶處理組成。修飾的DNA現(xiàn)在可以在本發(fā)明的方法中使用。因為參考序列或靶序列的甲基化胞嘧啶被轉(zhuǎn)換成尿嘧啶，故與(靶或參考序列的)對立鏈成雙時，它們現(xiàn)在將在反應(yīng)的交叉雜交步驟期間形成錯配。在又一個方面，本發(fā)明的任意方法用來富集多重反應(yīng)中的多種不同靶序列。在這個實(shí)施方案中，所述方法包括針對額外靶序列的額外組引物對。在另一個方面，本發(fā)明涉及計算機(jī)可讀取介質(zhì)，其具有用于開展發(fā)明任意方法的程序指令。在又一個方面，本發(fā)明涉及用于富集靶序列的PCR系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括用于執(zhí)行計算機(jī)可讀取介質(zhì)的程序指令的存儲器。圖1和圖2說明本發(fā)明的兩個不同方面。圖1說明本發(fā)明的一個方面，其中所述方法使用具有第一變性溫度和臨界變性溫度或Tc的擴(kuò)增反應(yīng)。圖2也說明具有第一變性溫度和Tc的擴(kuò)增反應(yīng)，不過還包括在反應(yīng)的引物復(fù)性和延伸相之前往復(fù)或重復(fù)多次復(fù)性及臨界變性溫度步驟。圖1顯示用于富集具有靶序列和參考序列核酸樣品中靶序列的方法。所述靶序列和參考序列可以從包括基因組DNA、cDNA、病毒DNA、哺乳動物DNA、胎兒DNA或細(xì)菌DNA的任意核酸序列獲得。在參考序列通常是等位基因而靶序列是突變等位基因的同時，也可以反之亦然。突變等位基因可以包括任意一個或多個核苷酸缺失、插入或改變。在一些實(shí)施方案中，突變等位基因是體細(xì)胞突變。在其他實(shí)施方案中，靶序列是甲基化DNA而參考序列為非甲基化DNA?；蛘撸行蛄袨榉羌谆疍NA而參考序列是甲基化DNA。該方法包括使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于參考序列解鏈溫度“Tm”的第一變性溫度(圖1)處理。核酸的、可以通過實(shí)驗確定或通過計算估計。技術(shù)人員十分了解用于確定核酸Tm的眾多熟知方法，其中所述方法的某些在本文描述。第一變性溫度通常如一般將選擇PCR反應(yīng)的變性溫度那樣進(jìn)行選擇并且應(yīng)當(dāng)足夠地高(例如94°C)，從而導(dǎo)致靶序列和參考序列的充分變性。在一個實(shí)施方案中，第一變性溫度高于參考序列Tm約1°C至30°C，參考序列的Tm更優(yōu)選地高于參考序列Tm約5°C至20°C。隨后，降低擴(kuò)增反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致靶序列和參考序列雜交(圖1B)。這個復(fù)性步驟導(dǎo)致靶_靶、參考_參考和靶_參考序列的雜交雙鏈體形成。復(fù)性溫度的確定是技術(shù)人員熟知的。本發(fā)明方法中使用的引物設(shè)計成具有這樣的Tm，所述Tm防止所述引物在這個中間溫度與靶序列和參考序列結(jié)合，從而這些引物不干擾突變(靶)序列和野生型(參考)序列的交叉雜交。因為靶序列中的突變，故大部分靶序列的結(jié)構(gòu)與參考序列錯配，并因而與參考序列成雙時具有比完全匹配的參考/參考同雙鏈體更低的解鏈溫度。隨后通過提高反應(yīng)混合物的溫度至所述Tc偏好地變性靶_參考雜交雙鏈體(圖1C)。Tc或臨界溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在一個實(shí)施方案中，Tc低于參考序列的Tm約.3°C_5°C并且更優(yōu)選低于參考序列的Tm約.5°C至1.5°C。通常，Tc將是約70-90°。如果靶序列具有與參考序列相比產(chǎn)生更低、的核苷酸序列，靶-靶雜交雙鏈體也可以被偏好地變性。一般施加該Tc約1秒至5分鐘、更優(yōu)選2秒至1分鐘并且最優(yōu)選5秒至30秒。在偏好性地變性靶_參考和/或靶_靶序列雜交雙鏈體后，降低反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致一種或多種引物對與靶序列復(fù)性(圖1D)。復(fù)性的引物隨后由核酸聚合酶延伸，因而富集樣品內(nèi)所含核酸群體中的靶序列。該方法的所述步驟通常重復(fù)多個循環(huán)，旨在引起靶序列和參考序列充分?jǐn)U增。在一個實(shí)施方案中，該方法的步驟重復(fù)5-40個循環(huán)并更優(yōu)選地重復(fù)10-30個循環(huán)。最佳循環(huán)數(shù)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在PCR裝置中進(jìn)行，更優(yōu)選地在實(shí)時反應(yīng)條件下在實(shí)時檢測PCR裝置如SMARTCYCLER實(shí)時PCR裝置(C印heid，Sunnyvale,CA)和Mx3005P實(shí)時PCR裝置(Stratagene，LaJolla，CA)中進(jìn)行。在這個實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物可以包含用于量化和/或監(jiān)測該反應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物的核酸檢測試劑(例如核酸檢測染料如SYBRGreen染料或LC-Green染料或有效偶聯(lián)于熒光染料的探針)。一旦靶序列的富集完成，可以進(jìn)一步加工該樣品，例如，經(jīng)歷測序反應(yīng)。富集的等位基因可以由多種方法進(jìn)一步加工，所述方法包括MALDI-TOF、HR解鏈法、雙脫氧測序、單分子測序、焦磷酸測序、RFLP、數(shù)字PCR和定量PCR。通過在每個PCR-循環(huán)中開展富集方法，突變序列(靶序列)的量先于所述序列(參考序列)逐步富集。純合突變和雜合突變均通過本方法富集。相對于在94°C變性溫度進(jìn)行常規(guī)PCR，富集含有突變的序列10-60倍是尋常的。在給定的臨界變性溫度(Tc)，突變富集同時在全部序列位置處發(fā)生，盡管以不同效率進(jìn)行，這取決于序列環(huán)境和PCR擴(kuò)增子的整體大小。使用適宜的DNA解鏈軟件，臨界變性溫度Tc和在任意位置處的預(yù)期富集均是可預(yù)測的并且可以實(shí)驗地驗證。因而取決于突變在何處，可以預(yù)期稍微不同的富集，然而在全部情況下，可以實(shí)現(xiàn)相當(dāng)大的富集并且因而改善下游測定法(例如測序反應(yīng))的檢測限。圖2說明通過使擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷復(fù)性和臨界變性溫度的輪換步驟而富集靶序列的方法的實(shí)施方案。該實(shí)施方案利用在臨界溫度的偏好性變性和在雜交溫度的偏好性交叉雜交。具有每種靶序列和參考序列的擴(kuò)增反應(yīng)混合物首先經(jīng)歷高于參考序列Tm的第一變性溫度處理(圖2A)。其次，樣品在溫度不同的兩個保溫步驟之間循環(huán)。在第一保溫步驟中，降低溫度，從而導(dǎo)致靶序列偏好地與參考序列雜交(圖2B)。在第二保溫步驟中，提高溫度至Tc(圖2C)。隨后重復(fù)這些第一和第二步驟一次或更多次，更優(yōu)選3-20次并且最優(yōu)選5-10次。給定序列的偏好性雜交溫度是野生型等位基因以比含有突變的等位基因更快的速率與自身逆轉(zhuǎn)雜交的溫度。因為突變的等位基因遠(yuǎn)比野生型等位基因少，故野生型等位基因與自身的交叉雜交比突變等位基因與突變等位基因的交叉雜交或突變等位基因與等位基因(后者形成錯配)的交叉雜交更快地進(jìn)行。因此，當(dāng)PCR溫度降低至交叉雜交溫度時，突變等位基因的交叉雜交程度不如野生型等位基因的交叉雜交程度。在優(yōu)選施方案中，該雜交溫度或中間溫度(低于第一變性溫度和Tc，但高于引物復(fù)性/延伸溫度的溫度，例如約60°C至80°C)高于引物對的Tm，并因而導(dǎo)致靶序列與參考序列雜交而阻止引物對與靶序列和/或參考序列的結(jié)合。其次，提高反應(yīng)的溫度至Tc，從而引起靶_參考和靶_靶雜交雙鏈體偏好地變性(圖2C)。Tc或臨界溫度低于參考序列的Tm并且可以通過本文所述方法確定。在一個實(shí)施18方案中，Tc低于參考序列的1約.3°C_5°C并且更優(yōu)選低于參考序列的1約.5°C至1.5°C。通常，Tc將是約70-90°。如果靶序列具有與參考序列相比產(chǎn)生更低Tm的核苷酸序列，靶_靶雜交雙鏈體也可以被偏好地變性。一般施加該Tc約1秒至5分鐘、更優(yōu)選2秒至1分鐘并且最優(yōu)選5秒至30秒。該過程重復(fù)幾次，往復(fù)于復(fù)性溫度(圖2B)和臨界溫度(圖2C)之間，每次選擇性地產(chǎn)生比單鏈形式序列更多的單鏈形式的突變序列。一旦循環(huán)保溫步驟結(jié)束，降低反應(yīng)混合物的溫度，從而導(dǎo)致一個或多個引物與靶序列復(fù)性(圖2D)。這些引物隨后由聚合酶延伸，因而富集靶序列。該方法的所述步驟通常重復(fù)多個循環(huán)，旨在引起靶序列和參考序列充分?jǐn)U增。在一個實(shí)施方案中，該方法的步驟重復(fù)5-40個循環(huán)并更優(yōu)選地重復(fù)10-30個循環(huán)。最佳循環(huán)數(shù)可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員確定。優(yōu)選地，本發(fā)明方法在PCR裝置中進(jìn)行，更優(yōu)選地在實(shí)時反應(yīng)條件下在實(shí)時檢測PCR裝置中進(jìn)行。一旦靶序列的富集完成，樣品可以經(jīng)歷其他方法處理。其他方法包括MALDI-T0F、HR解鏈法、雙脫氧測序、單分子測序、焦磷酸測序、RFLP、數(shù)字PCR和定量PCR。數(shù)字PCR可以與富集方法聯(lián)合用于超低水平突變的檢測中。在數(shù)字PCR中，將DNA樣品稀釋成單個分子，從而在每個PCR反應(yīng)中起始材料是野生型或突變的。在源自相同起始材料的大量PCR反應(yīng)后，分離并檢測突變分子。Fluidigm(SouthSanFrancisco,CA)出售多種基于數(shù)字PCR的系統(tǒng)，它們可以與本發(fā)明一起使用。因此，可以同時在數(shù)千個平行富集反應(yīng)中從單個分子進(jìn)行實(shí)時富集，從而允許鑒定源自突變DNA的PCR反應(yīng)。這種系統(tǒng)特別用于檢測癌癥基因組中的超低突變。數(shù)字PCR與富集方法的組合可以類似地有益于單分子測序應(yīng)用。核酸擴(kuò)增反應(yīng)在一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中使用的核酸樣品包含具有靶序列和參考序列的基因組DNA。在另一個實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的核酸樣品包含先前在核酸擴(kuò)增反應(yīng)中擴(kuò)增的靶序列和參考序列。技術(shù)人員將理解存在可用于擴(kuò)增核酸的眾多方法。最流行的方法可能是聚合酶鏈反應(yīng)(PCR；例如見，美國專利號4，683，195和4，683，202，以及Saiki等人，Science2301350-1354(1985)和Gyllensten等人，PNAS(USA)85:7652_7656(1985))。PCR方法的優(yōu)選變型是非對稱PCR(例如見Mao等人，Biotechniques27(4):674_678(1999)；Lehbein等人，Electrophoresis19(8-9)1381-1384(1998)；Lazaro等人，Molec.Cell.Probes6(5)=357-359(1992)；和美國專利號6，197，499)。其他擴(kuò)增方法包括，但不限于鏈置換擴(kuò)增(SDA)(見，Walker等人，Nuc.AcidsRes.20(7)1691-1696(1992)以及美國專利號5，744，311，5，648，211和5，631，147)、滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)(見PCT公開WO97/19193)、基于核酸序列的擴(kuò)增(NASBA)(見Compton，Nature350:91-92(1991)；以及美國專利號5，409，818和5，554，527)、轉(zhuǎn)錄物介導(dǎo)的擴(kuò)增(TMA)(見Kwoh等人，PNAS(USA)861173-1177(1989)，以及美國專利號5，399，491)，自持式序列復(fù)制(3SR)(見Guatelli等人，PNAS(USA)871874-1879(1990)和連接酶鏈反應(yīng)(LCA)(見美國專利號5，427，930禾口5，792，607)。本發(fā)明方法使用改良的PCR。PCR如Mullis和Faloona，1987,MethodsEnzymol.，155335中所述進(jìn)行，所述文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)技術(shù)在美國專利號4，683，202，4，683，195和4，800，159中披露。在其最簡單形式下，PCR是使用與對立鏈雜交并分布于靶DNA中目的區(qū)域側(cè)翼的兩條寡核苷酸引物，用于酶合成特定DNA序列的體外方法。涉及模板變性、引物復(fù)性和復(fù)性引物由DNA聚合酶延伸的重復(fù)系列的反應(yīng)步驟致其末端由所述引物5'末端定義的特定片段的指數(shù)式累積。據(jù)報道PCR能夠引起特定DNA序列選擇性富集達(dá)IO9倍。PCR方法也在Saiki等人，1985，Science2301350中描述。使用模板DNA(靶序列和參考序列)(至少Ifg;更有用地，Ι-lOOOng)和至少25pmol寡核苷酸引物進(jìn)行PCR。常見反應(yīng)混合物包括2μ1的DNA，25pmol寡核苷酸引物，2.5μ1的適合緩沖液，0.4μ1的1.25μMdNTP,2.5單位TaqDNA聚合酶(Stratagene)和去離子水至25μ1總體積。使用可編程熱循環(huán)儀進(jìn)行PCR。根據(jù)實(shí)際的嚴(yán)格性要求調(diào)整PCR循環(huán)的每個步驟的長度和溫度以及循環(huán)數(shù)。復(fù)性溫度和時間由引物預(yù)期與模板復(fù)性的效率和待容忍的錯配程度二者決定。優(yōu)化引物復(fù)性條件的嚴(yán)格性的能力完全在本領(lǐng)域中等技術(shù)人員的知識范圍內(nèi)。使用30°C與72°C之間的復(fù)性溫度。模板分子的初始變性通常在92°C與99°C之間進(jìn)行4分鐘，隨后是由變性(94-99°C，15秒至1分鐘)、復(fù)性(如上文所討論那樣確定的溫度；1-2分鐘)和延伸(72°C，1分鐘)組成的20-40個循環(huán)。終末延伸步驟通常在72°C實(shí)施4分鐘并且可以后續(xù)一個在4°C的無限(0-24小時)步驟。PCR使用核酸聚合酶或催化核苷酸三磷酸聚合的酶。通常，所述酶將在與靶序列復(fù)性的引物3'末端啟動合成并將在5'-方向沿模板前進(jìn)。已知的DNA聚合酶包括例如大腸桿菌(E.coli)DNA聚合酶I、T7DNA聚合酶、嗜熱棲熱菌(Thermusthermophilus)(Tth)DNA聚合酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillusstearothermophilus)DNA聚合酶、ThermococcuslitoralisDNA聚合酶、水生棲熱菌(Thermusaquaticus)(Taq)DNA聚合酶和強(qiáng)烈熾熱球菌(Pyrococcusfuriosus)(Pfu)DNA聚合酶。術(shù)語“核酸聚合酶”也包括RNA聚合酶。如果核酸模板是RNA，則“核酸聚合酶”指RNA依賴性聚合活性，如逆轉(zhuǎn)錄酶。在本發(fā)明的方法中，PCR方法還包括關(guān)鍵變性步驟。這些方法在本文充分地描述并在圖1和圖2中說明。優(yōu)選地，所述富集方法在PCR裝置中進(jìn)行，更優(yōu)選地在實(shí)時反應(yīng)條件下在實(shí)時PCR裝置中進(jìn)行。實(shí)時反應(yīng)條件還使用核酸檢測試劑(例如染料或探針)旨在PCR產(chǎn)物產(chǎn)生時測量/檢測之。在一個實(shí)施方案中，所述富集方法以多重模式實(shí)施。多重PCR是在PCR反應(yīng)中使用多于一個引物對來檢測多于一種靶序列時的PCR。多重PCR的目標(biāo)是同時擴(kuò)增多于一種靶序列并因而節(jié)省時間和使開支最小化。它能夠在一個運(yùn)行中擴(kuò)增多種靶序列。通常，多重PCR連同本發(fā)明一起使用旨在富集同時擴(kuò)增的全部序列中的少數(shù)等位基因，如此設(shè)計引物，從而所得的PCR-擴(kuò)增子全部共有大致相同的Tc(臨界變性溫度)。確定L和TcTm可以定義為這樣的溫度，在該溫度上雙鏈體核酸分子中的一半Watson-Crick堿基對被破壞或解離(即“解鏈”)，而其余一半Watson-Crick堿基對仍完好處于雙鏈構(gòu)象?！芭R界溫度”、“臨界變性溫度”或“Tc”指低于參考序列Tm的溫度。施加Tc以選擇性地變性核酸樣品中雙鏈靶序列或靶序列/參考序列雙鏈的雙鏈體，從而導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)期間靶序列的選擇性富集。給定成對的核酸鏈的Tm指示鏈與鏈結(jié)合作用的穩(wěn)定性并且取決于鏈的互補(bǔ)性、序列長度，GC含量、雙鏈區(qū)內(nèi)部存在或不存在錯配和不太重要的其他因素，例如樣品的鹽濃度(Lewin,GenesV,第5章，OxfordUniversityPressandCellPress:NewYork,(1994)第109-126頁；SantaLucia,1998)。一般通過使樣品經(jīng)歷溫度的持續(xù)增加并且連續(xù)測量雜交雙鏈體至單鏈的解離過程而實(shí)驗地確定解鏈點(diǎn)溫度。解離過程可以由眾多不同的方法檢測，例如通過UV吸光度轉(zhuǎn)變、雙鏈DNA結(jié)合染料的熒光、通過表面等離子共振或優(yōu)選地通過熒光檢測。在后者情況下，雜交探針通常用熒光實(shí)體標(biāo)記，并且熒光信號的產(chǎn)生或多或少取決于雜交雙鏈體的形成。Tm可以實(shí)驗決地確定或基于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的充分定義的方法進(jìn)行估計。觀察和分析核酸變性躍遷的方法包括通過差異性掃描量熱法(DSC)在樣品變性時測量該樣品內(nèi)部的熵改變(Kulinski等人，NucleicAcidsRes.19(9):2449_2455(1991)；PanerφA,Biopolymers29:1715-1734(1990)；VolkerφA,Biopolymers50:303-318(1999))、測量共價連接的成對熒光團(tuán)的熒光(Vamosi和Clegg，Biochemistry3714300-14316(1998))和監(jiān)測核酸增色度的改變(Haugland，“InVitroApplicationsforNucleicAcidStainsandProbes，，,在HandbookofFluorescentProbesandResearchChemicalss,第6版，MolecularProbesInc,EugeneOR(1996)第161-174頁)。雙鏈核酸的Tm值也可以通過監(jiān)測與核酸組合的雙鏈DNA-特異性染料的熒光觀察到(Wittwer等人，1996)。雙鏈特異性染料是結(jié)合核酸的熒光團(tuán)。一般，這些染料的熒光在結(jié)合至配對的核酸時增加(Wittwer等人，BioTechniques22:176-181(1997))。Ririe等人(1997)證實(shí)可以通過解鏈曲線分析，使用雙鏈核酸結(jié)合染料SYBRGreenI區(qū)分后期PCR產(chǎn)物。SYBRGreenI偏好地與雙鏈核酸結(jié)合(Haugland，1996)。用于確定雙鏈核酸Tm的其他合適染料包括SYBRGold、溴化乙啶、吖啶橙、碘化丙啶、PicoGreen、Hoechst33258、Hoechst33342、Hoechst34580、YO-PRO_1和YOYO_1。例如，MolecularProbes(Eugene,Oreg.)目錄第八版HandbookofFluorescentProbesandResearchProducts(2001年5月在CD-ROM上的；該文獻(xiàn)通過引用的方式并入本文)第8章列出可以在本發(fā)明中使用的許多染料。如技術(shù)人員將理解，任何雙鏈核酸結(jié)構(gòu)的解鏈通常在限定溫度范圍內(nèi)在巨大比例的相似核酸群中發(fā)生并且一般將在該核酸的大致Tm上具有解鏈峰(特別迅速的躍遷)。因而，熒光發(fā)射的此類變化峰可以用來計算雙鏈核酸的Tm。解鏈溫度譜可以通過-dF/dT對T作圖以圖示方式描述，其中dF是所測量熒光發(fā)射的的改變，dT是該核酸溫度的改變并且和T是該核酸的溫度。這種圖示將顯示熒光最迅速改變發(fā)生的溫度峰值，其指示解鏈溫度。用于確定雙鏈核酸Tm的其他方法是本領(lǐng)域已知的，包括在美國專利號7，226，736和6，030，115中描述的那些方法，所述每個專利因而通過引用的方式完整地并入。Tm可以從經(jīng)驗等式預(yù)測。已知Tm依賴于形成互補(bǔ)堿基對(η)的核酸的序列的長度、該序列中的G和C含量、鹽濃度(μ)和樣品溶液中的變性劑(％FA)，并且一般遵循經(jīng)驗等式Tm=81.5+16.61og(y)+0.41(%GC)-500/n_0.61(%FA)。Tm可以通過眾多方法估計，例如按照Wetmurl991(Wetmur,J.G.1991.DNAprobes!applicationsoftheprinciplesofnucleicacidhybridization.CritRevBiochemMolBiol26:227_259，該文獻(xiàn)因而通過引用的方式并入)的最近鄰計算法和借助商用程序，所述商用程序包括01igOTMPrimerDesign和互聯(lián)網(wǎng)上可利用的程序。“臨界溫度”或“Tc”指低于參考序列“Tm”的溫度。施加Tc以先于參考/參考序列雙鏈體變偏好地性雙鏈的靶序列雙鏈體或靶序列/參考序列雙鏈的雙鏈體，從而導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)期間靶序列的選擇性富集。臨界溫度利用雙鏈靶序列或交叉雜交的靶_參考雙鏈DNA雙鏈體的更低Tm。當(dāng)靶序列和參考序列交叉雜交時，沿著短(例如<200bp)雙鏈DNA序列任意位置處一個或更多單核苷酸錯配的微小序列差異將導(dǎo)致該序列解鏈溫度(Tm)的細(xì)微但可預(yù)測性改變(Lipsky，R.H.等人(2001)ClinChem,47,635-644；Liew,M.等人(2004)ClinChem,50,1156-1164)。取決于錯配的確切序列關(guān)系和位置，0.5-1.5°C的解鏈溫度改變對至多到200bp的序列是常見的。因而，靶-參考序列的復(fù)性因錯配將基本上具有比已知等位基因(例如參考序列)更低的Tm。至少部分地，本發(fā)明利用完全匹配序列與錯配序列之間的細(xì)微Tm差異。因為臨界變性在每個PCR循環(huán)中進(jìn)行，故含有突變的等位基因的差異性富集以指數(shù)方式被激勵并導(dǎo)致循環(huán)結(jié)束時突變等位基因和野生型等位基因之間整體擴(kuò)增效率的巨大差異。Tc低于參考序列1約.1-20°C。更優(yōu)選地，Tc低于參考序列Tm約.1-15°C、·1-10°C、·1-9°C、·1-8°C、·1_7°C、·1_6°C、.2C_5°C、.3C—4.5°C、.4_4°C、.5—3.5°C、.5_3°C、·53C-、·52·5C-、·52C-、·51.5C-、·51C-。在一些實(shí)施方案中，Tc可以低于參考序列和靶序列的Tm。例如，在一個例子中，野生型序列的Tm是84°C并且突變序列的Tm是83.8°C。當(dāng)使用快速形式的富集方法時，最佳Tc是83.5°C。在一些優(yōu)選施方案，如此選擇Tc，從而它低于參考序列和全部可能靶序列的Tm。例如，在一個例子中，野生型序列的Tm是841并且在不同位置處突變(單點(diǎn)突變)的序列的、是83.8°C、83.7°C、83.9°C、83.6°C、83.75°C。當(dāng)使用快速形式的富集方法時，最佳Tc是83.5"C。臨界變性溫度(Tc)是這樣的溫度，在所述溫度以下給定核酸序列的PCR效率劇烈下降。例如，如果PCR變性溫度設(shè)在87V，良好地擴(kuò)增167bpp53序列，如果設(shè)在86.5°C，適度地擴(kuò)增，并且如果PCR變性溫度設(shè)在86°C或更低，不產(chǎn)生可檢測的產(chǎn)物。如同Tm，給定序列的Tc可以實(shí)驗地或通過計算確定。為實(shí)驗地確定給定PCR產(chǎn)物的Tc，執(zhí)行嵌入染料(LC-GREEN或SYBR-Green)存在下的實(shí)時解鏈曲線以獲得序列的平均解鏈溫度Tm(見關(guān)于確定Tm的上文)。低于Tm約0.5-1.5°C溫度通常是導(dǎo)致靶序列富集的適宜臨界變性溫度。也可通過確定DNA序列的ΔΤω估計Tc，其中所述ΔTm因(如在交叉雜交的靶-參考雙鏈體中會存在的)堿基對錯配所致。與完美參考/參考序列匹配相比，這種差異是從約.1°C至約12.5°C。因而，在一個實(shí)施方案中，Tc可以由等式Tc=Tm-ATm描述，其中Tm是參考/參考序列雙鏈體的解鏈溫度并且△Tm是因一個或更多堿基對錯配所致參考序列Tm的改變，其中所述堿基對錯配可以在靶/參考序列的交叉雜交期間形成。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)ATm取決于靶/參考序列雙鏈體的長度、取決于鳥嘌呤-胞嘧啶百分(％GC)含量并且還取決于雙鏈體中點(diǎn)突變或堿基對錯配的位置。例如，如果錯配位于雙鏈體的任意末端，ΔΤω通常將更低，一般在約.1°C至約8°C范圍內(nèi)。例如，如果錯配位于雙鏈體的中央，ΔΤω通常相對較高，一般在約.2°C至約irC范圍內(nèi)。ΔTm通常等于靶_參考交叉雜交雙鏈體中每個堿基錯配百分?jǐn)?shù)約.5°C至約1.5°C。應(yīng)當(dāng)理解ΔTm將不僅根據(jù)雙鏈體的長度和突變位置變化，還將取決于序列的具體順序。因而，全部此類變化均在本公開的范圍內(nèi)。本發(fā)明的核酸用于本發(fā)明中的核酸序列本發(fā)明提供富集核酸樣品中靶序列的方法并且也使用引物以擴(kuò)增模板核酸序列。如本文中所用，術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”指待檢測的引物、探針和寡聚物片段，并且上位于聚脫氧核糖核苷酸(含有2-脫氧-D-核糖)、聚核糖核苷酸(含有D-核糖)和任意其他類型的多核苷酸，所述多核苷酸是嘌呤或嘧啶堿基或修飾的嘌呤或嘧啶堿基(包含非堿性部位)的糖苷。在術(shù)語“核酸”、“多核苷酸”和“寡核苷酸”之間不存在詳細(xì)的有意區(qū)分，并且這些將互換使用。這些術(shù)語僅指分子的一級結(jié)構(gòu)。因而，這些術(shù)語包括雙鏈和單鏈DNA，以及雙鏈和單鏈RNA。寡核苷酸實(shí)際上不從任何現(xiàn)存或天然序列物理地衍生，不過可以以任意方式產(chǎn)生，包括化學(xué)合成、DNA復(fù)制、逆轉(zhuǎn)錄或其組合。術(shù)語“寡核苷酸”或“核酸”意指基因組DNA或RNA、半合成或合成來源的cDNA的多核苷酸，所述多核苷酸因其合成來源或操作而(1)不與自然界中同該多核苷酸聯(lián)合的多核苷酸的全部或一部分聯(lián)合；和/或(2)連接至自然界中與該多核苷酸連接的多核苷酸不同的多核苷酸。在一個實(shí)施方案中，所述方法中使用的核酸含有修飾的核苷酸，從而增加參考/參考序列同雙鏈體與靶/參考序列異雙鏈體之間的變性溫度差異。此類修飾將增強(qiáng)靶序列的富集?？梢栽诟患椒ㄖ盎蚱陂g摻入修飾或非天然的核苷酸。構(gòu)思用于本發(fā)明方法中的修飾核苷酸包括二氨基_嘌呤類似物(例如2’-0-甲基-2，6-二氨基嘌呤)、尿嘧啶、肽核酸類似物、上述類似的生物素修飾類似物、上述類似的熒光團(tuán)修飾的類似物、肌苷、7-去氮鳥嘌呤、2'-脫氧-2'-氟-β-D-阿拉伯糖核酸(2’F-ANA)核苷酸、鎖核酸(LNAs)、ENA2'-0,4'-C-乙烯-橋接核酸和其他。修飾的核苷酸可以摻入本發(fā)明的任意核酸，包括模板、引物和探針核酸。這些修飾可以增加匹配堿基與和錯配堿基之間的Tm差異并因而提高用本發(fā)明方法獲得的富集作用。例如，鎖核酸代表一類構(gòu)象受限的核苷酸類似物，所述的核苷酸類似物例如在通過參考并入的WO99/14226中描述，提高核酸的解鏈溫度。在Koshkin，Α.Α.等人，Tetrahedron(1998)，54:3607_3630)^PObika,S.等人，TetrahedronLett.(1998)，395401-5404)中描述含有鎖核苷酸的寡核苷酸，所述兩份文獻(xiàn)通過引用的方式并入。鎖核苷酸導(dǎo)入寡核苷酸改善了針對互補(bǔ)序列的親和力并提高解鏈溫度達(dá)幾度(Braasch，D.Α.和D.R.Corey，Chem.Biol.(2001)，8:1_7)。本發(fā)明可以用本領(lǐng)域已知的任意LNA(例如在WO99/14226和在LatorraD等人，2003.Hum.Mutat.22:79_85中披露的那些LNA)實(shí)施。互補(bǔ)性無需是完全的；穩(wěn)定的雙鏈體可以含有錯配堿基對或不匹配的堿基。核酸
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以在考慮眾多變量的情況下經(jīng)驗地確定雙鏈體穩(wěn)定性，所述變量例如包括寡核苷酸的長度，寡核苷酸的堿基組成和序列、離子強(qiáng)度和錯配堿基對的發(fā)生率。核酸雙鏈體的穩(wěn)定性由解鏈溫度或“Tm”度量。本發(fā)明提供用于擴(kuò)增模板核酸序列的寡核苷酸弓I物。術(shù)語“引物”可以指多于一種引物并且指這樣的寡核苷酸，無論天然存在(如純化的限制性消化產(chǎn)物中)或合成地產(chǎn)生，其中所述寡核苷酸處在催化互補(bǔ)于核酸鏈的引物延伸產(chǎn)物合成的條件下之時，能夠充當(dāng)沿互補(bǔ)鏈合成的起始點(diǎn)。此類條件包括在適宜緩沖液(“緩沖液”包括作為輔因子或影響PH、離子強(qiáng)度等的取代基)中存在四種不同的脫氧核糖三磷酸核苷和聚合誘導(dǎo)劑如DNA聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶和在適合的溫度上。為擴(kuò)增中的最大效率，引物優(yōu)選地是單鏈的。根據(jù)本發(fā)明有用的寡核苷酸引物是與模板核酸序列可雜交并引發(fā)核酸鏈的酶合成的單鏈DNA或RNA分子。引物互補(bǔ)于核酸分子匯集物中存在的一部分靶分子。構(gòu)思通過化學(xué)合成或酶合成方法制備本發(fā)明的寡核苷酸引物?；蛘?，這種分子或其片段是天然存在的，并從其天然來源分離或從供貨者處購買。寡核苷酸引物的長度是5至100個核苷酸，理想地是17至40個核苷酸，盡管不同長度的引物是有用的。用于擴(kuò)增的引物優(yōu)選地長約17-25個核苷酸。也通過解鏈溫度估計方法設(shè)計具有特定解鏈溫度(Tm)的根據(jù)本發(fā)明有用的引物。包括01igo、PrimerDesign和互聯(lián)網(wǎng)上可用的程序(包括Primer3和OligoCalculator)的商用程序可以用來計算根據(jù)本發(fā)明有用的核酸序列的Tm。優(yōu)選地，根據(jù)本發(fā)明有用的擴(kuò)增引物的Tm(如通過例如OligoCalculator計算)優(yōu)選地在約45°C與65°C之間并更優(yōu)選地在約50°C與60°C之間。一般，當(dāng)兩個核酸序列在至少14至25個核苷酸區(qū)段范圍內(nèi)基本上互補(bǔ)(在至少14至25個核苷酸區(qū)段范圍內(nèi)至少約65%互補(bǔ)、優(yōu)選至少約75%、優(yōu)選至少約90%互補(bǔ))時，選擇性雜交出現(xiàn)。見通過引用方式并入本文的Kanehisa，M.，1984，NucleicAcidsRes.12:203。因而，預(yù)計在引發(fā)部位處容忍某種程度的錯配。這種錯配可以是細(xì)微的，如單、二或三核苷酸?；蛘?，錯配區(qū)域可以包括環(huán)，所述環(huán)定義為其中在4個或更多個核苷酸不間斷串聯(lián)中存在錯配的區(qū)域。在一個實(shí)施方案中，富集方法可以與肽核酸(PNA)引物組合使用，從而提高突變富集的靈敏度。PNA僅用來抑制野生型(參考)序列的擴(kuò)增。在這個實(shí)施方案中，可以如此合成引物以區(qū)分靶(突變)序列和參考序列?；赑NA的引物以比結(jié)合突變序列的引物更高的熱穩(wěn)定性和特異性識別并結(jié)合互補(bǔ)野生型序列。這不僅增加PNA引物-參考核酸與常規(guī)引物-靶核酸之的Tm差異，還防止基于PNA的引物被DNA聚合酶延伸，因而引起靶序列進(jìn)一步富集。此類測定法是本領(lǐng)域已知的并且在Orum等人NucleicAcidsResearch,21(23)5332-5336(1993)中描述?？梢栽诳紤]這些的同時設(shè)計寡核苷酸弓I物并根據(jù)以下方法合成它們。寡核苷酸引物設(shè)計策略設(shè)計用于測序或PCR目的特定寡核苷酸引物涉及選擇這樣的序列，所述序列能夠識別靶序列，不過具有最少的預(yù)測二級結(jié)構(gòu)。寡核苷酸序列可以僅結(jié)合于或可以不僅僅結(jié)合于靶核酸中的單個位點(diǎn)。另外，通過分析寡核苷酸的長度和GC含量優(yōu)化該寡核苷酸的Tm。另外，當(dāng)設(shè)計用于擴(kuò)增基因組DNA的PCR引物時，所選引物序列不顯示與GenBank數(shù)據(jù)庫(或其他可用數(shù)據(jù)庫)中序列的明顯匹配。通過使用輕易可用的計算機(jī)程序促進(jìn)設(shè)計根據(jù)本發(fā)明有用的引物，其中開發(fā)所述計算機(jī)程序以輔助評價上文所述的幾個參數(shù)并優(yōu)化引物序列。此類程序的例子是DNAStar軟件包(DNAStar，Inc.；Madison，WI)的“PrimerSelect”、OLIGO4.0(NationalBiosciences,Inc.)、PRIMER、OligonucleotideSelectionProgram、PGEN禾口Amplify(在Ausubel等人，1995,ShortProtocolsinMolecularBiology,3版，JohnWiley&Sons中描述)O在優(yōu)選施方案中，如此設(shè)計本發(fā)明的引物，從而其具有低于靶/參考序列交叉雜交步驟期間所施加溫度的Tm。因而，在這個實(shí)施方案中，引物在這個雜交步驟期間不與靶序列或參考序列復(fù)性(見圖1)。在一個實(shí)施方案中，引物的Tm在交叉雜交復(fù)性步驟溫度以下5-10°C。^^使用本領(lǐng)域也熟知的技術(shù)合成引物本身。用于制備具有特定序列的寡核苷酸的方法是本領(lǐng)域已知的，并且包括例如克隆和限制酶消化分析適宜序列和直接化學(xué)合成。一旦設(shè)計，則使用商用自動化寡核苷酸合成儀(市售)或VLSIPS技術(shù)，通過合適的化學(xué)合成方法(包括例如Narang等人，1979，MethodsinEnzymology,68:90描述的磷酸三酯法、Brown等人，1979，MethodsinEnzymology,68109描述的磷酸二酯法、在Beaucage等人，1981，TetrahedronLetters,221859中披露的二乙基焦磷酰胺法和在美國專利號4，458，066中披露的固體支持物法)或通過其他化學(xué)方法制備寡核苷酸。引物也可以用修飾的核酸通過本領(lǐng)域熟知的方法合成。MM如本文中所用，“樣品”指任意物質(zhì)，其含有或假定含有目的核酸(靶序列和參考序列)或本身是含有或假定含有目的核酸的核酸。術(shù)語“樣品”因而包括核酸(基因組DNA、cDNA、RNA)、細(xì)胞、生物、組織、流體或物質(zhì)(其包括但不限于例如血漿、血清、腦脊液、淋巴液、滑膜液、尿、淚、糞便)、皮膚、呼吸道、腸道生殖道的外分泌物、唾液、血液細(xì)胞、腫瘤、器官、組織的樣品、體外細(xì)胞培養(yǎng)物成分的樣品、天然分離物(如飲用水、海水、固體材料)、微生物標(biāo)本和已經(jīng)用核酸示蹤分子“標(biāo)記”的物體或標(biāo)本。本發(fā)明的核酸序列可以從基因組DNA擴(kuò)增?；蚪MDNA可以根據(jù)以下方法從組織或細(xì)胞分離?；蛘?，本發(fā)明的核酸序列可以通過本領(lǐng)域熟知的方法從血液分離。分離特定組織以促進(jìn)從該組織檢測基因的變異形式。為從哺乳動物組織分離基因組DNA，將組織切碎并冷凍于液氮中。冷凍的組織用預(yù)冷的研缽研磨成細(xì)粉并且以每IOOmg組織1.2ml消化緩沖液懸浮于消化緩沖液(IOOmMNaCl,IOmMTris-HCl,pH8.0,25mMEDTA，pH8.0,0.5%(w/v)SDS，0.lmg/ml蛋白酶K)。為從哺乳動物組織培養(yǎng)細(xì)胞分離基因組DNA，將細(xì)胞通過以500xg離心5分鐘沉淀，重懸于I-IOml冰冷的PBS中，以500xg離心5分鐘再沉淀并重懸于1體積的消化緩沖液中。消化緩沖液中的樣品在50°C保溫(伴以振蕩)12-18小時，并隨后用等體積的酚/氯仿/異戊醇提取。如果離心步驟(1700Xg，10分鐘)后相沒有分離，添加另一個體積的消化緩沖液(無蛋白酶K)并重復(fù)離心步驟。如果在兩相的界面處濃稠白色物質(zhì)明顯，則重復(fù)有機(jī)物提取步驟。在提取上層相后，將水層轉(zhuǎn)移至一個新管內(nèi)，向其中添加1/2體積的7.5M乙酸銨和2體積的100%乙醇。核酸通過1700Xg上離心2分鐘沉淀、用70%乙醇洗滌、空氣干燥并以lmg/ml重懸于TE緩沖液(IOmMTris-HCl，pH8.0，ImMEDTA,pH8.0)中。通過在37°C在0.1%SDS和1μg/ml無DNA酶的RNA酶存在保溫樣品1小時并重復(fù)提取和乙醇沉淀步驟，除去殘余RNA。根據(jù)該方法的基因組DNA的產(chǎn)率預(yù)計是大約2mgDNA/lg細(xì)胞或組織(上文的Ausubel等人)。按照該方法分離的基因組DNA可以根據(jù)本發(fā)明使用。也可以從全血提取靶DNA。例如，血液可以通過標(biāo)準(zhǔn)方法抽至收集管，優(yōu)選地包含硅化玻璃，所述收集管不含抗凝劑以制備血清，或含有EDTA、檸檬酸鈉、肝素或相似的抗凝齊IJ，最優(yōu)選地含有EDTA，以制備血漿。盡管并非絕對要求，優(yōu)選方法是血漿或血清應(yīng)當(dāng)從全血分離。血漿或血清可以通過離心、優(yōu)選以300至800Xg溫和離心5至10分鐘從全血分離。因為肝素可能干擾PCR，故肝素化血液的使用可能要求用肝素酶預(yù)處理。因而，EDTA是血液標(biāo)本的優(yōu)選抗凝劑?？梢栽诒景l(fā)明方法使用新鮮收集的血漿或血清或冷凍(貯存的)并隨后融化的血漿或血清。貯存的血漿或血清應(yīng)當(dāng)保持在_20°C至_70°C，而新鮮收集的血漿或血清保持冷藏或維持在冰上直至使用。DNA可以隨后通過本領(lǐng)域熟知的方法以及本文所述那些方法提取。診斷測定法本發(fā)明提供用于從患者樣品富集靶序列以診斷、檢測、監(jiān)測、評價或治療疾病、尤其動物或人類中腫瘤疾病或增生性疾病的方法。在優(yōu)選施方案中，核酸從編碼腫瘤基因或其他腫瘤相關(guān)DNA的核酸衍生。靶序列的偏好性富集允許進(jìn)一步分析或操作DNA。例如，可以分析富集的等位基因以定義從中衍生所述DNA的細(xì)胞的特征。根據(jù)想要的信息，可以幾種方法中任意方法，包括核酸測序、RFLP、數(shù)字PCR、光譜法(包括質(zhì)子NMR光譜法)、生物化學(xué)分析和免疫分析。在一個實(shí)施方案中，擴(kuò)增的DNA通過從瓊脂糖凝膠切下突變DNA條帶進(jìn)行分離、再擴(kuò)增、克隆至質(zhì)粒載體例如PGEM-T載體質(zhì)粒(Promega)并使用商業(yè)試劑盒如Sequenase2.0(USB)測序。定義靶DNA特征并因而定義例如腫瘤的分析法提供了廣泛的臨床用途，包括描述、表征或?qū)?xì)胞(例如腫瘤)(無論已知或隱匿)分類，如通過組織源、通過類型(如惡變前或惡變)、表型和基因型并通過描述或表征腫瘤特征、生理學(xué)和生物化學(xué)，從而獲得對腫瘤侵襲力、轉(zhuǎn)移嗜好和針對多種療法的敏感性或耐受性的理解，因而允許預(yù)測針對現(xiàn)行或計劃療法的反應(yīng)，并進(jìn)一步允許評價預(yù)后。靶DNA特征與先前活組織檢查或手術(shù)標(biāo)本的比較允許與該標(biāo)本相比進(jìn)一步評價腫瘤不均一性或相似性并因而評價腫瘤復(fù)發(fā)。在靶序列的選擇性富集后，也可以從該DNA轉(zhuǎn)錄或制造互補(bǔ)性核糖核酸(RNA)。在優(yōu)選的施方案中，通過在擴(kuò)增反應(yīng)中使用帶RNA聚合酶啟動子區(qū)的引物進(jìn)行RNA的轉(zhuǎn)錄，其中所述RNA聚合酶啟動子連接于針對目的DNA的標(biāo)準(zhǔn)引物序列(步驟3)。隨后從連接的啟動子區(qū)轉(zhuǎn)錄與該DNA互補(bǔ)的RNA。在備選方法中，將擴(kuò)增的等位基因DNA克隆至表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)錄與該DNA互補(bǔ)的RNA。另外，作為任選的優(yōu)選施方案，在體外翻譯反應(yīng)中使用互補(bǔ)性RNA來生產(chǎn)腫瘤相關(guān)或腫瘤特異性蛋白質(zhì)。等位基因表征、腫瘤衍生或腫瘤相關(guān)性DNA的擴(kuò)增及互補(bǔ)性RNA的表征、轉(zhuǎn)錄以及翻譯成腫瘤相關(guān)或腫瘤特異性蛋白提供在確定療法和開發(fā)腫瘤特異性療法中的重要用途。胞外DNA的測序或互補(bǔ)性RNA的轉(zhuǎn)錄允許確定或開發(fā)反義化合物，包括對胞外DNA適度特異的合成性寡核苷酸和其他反義構(gòu)建體，如通過構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，如通過調(diào)整Aoki等人(1995,CancerRes.55=38103816)的方法。類似地，定義腫瘤特征允許確定特異性單克隆抗體或?qū)U(kuò)增的DNA適度特異的疫苗療法。相應(yīng)免疫原性蛋白質(zhì)的生產(chǎn)可以用于開發(fā)腫瘤特異性單克隆抗體。類似地，翻譯的蛋白質(zhì)可以用于腫瘤特異性疫苗開發(fā)。特別有價值的是本發(fā)明允許開發(fā)和應(yīng)用這些腫瘤-特異性療法或診斷法，甚至僅存在惡變前腫瘤、早期癌癥或隱匿癌癥時也是如此。因而，在腫瘤負(fù)荷低、免疫功能相對完好并且患者未受損害(這些均提高治愈的可能性)時，本發(fā)明允許治療性介入。對所富集序列的其他處理本發(fā)明方法與MALDI-T0F、高分辨率解鏈或單分子測序的組合將應(yīng)對突變檢測中3種截然不同的需要快速檢測已知或可疑與臨床結(jié)果相關(guān)的體細(xì)胞突變(MALDI-T0F)；對各份患者樣品快速掃描未知體細(xì)胞突變(HR-解鏈)、隨后對少數(shù)外顯子選擇性測序和對‘苛刻樣品’(來自具有不均一性、基質(zhì)污染或體液的腫瘤中的樣品)中多種基因的海量平行測序(單分子測序，SMS)，在所述樣品中臨床相關(guān)突變可以處于0.5-5%水平。質(zhì)譜法在一個實(shí)施方案中，使富集的靶序列經(jīng)歷MALDI-T0F測序。質(zhì)譜法(MS)已經(jīng)形成DNA測序中的一種有力工具。質(zhì)譜計產(chǎn)生可在飛摩爾和納摩爾范圍內(nèi)以秒或分鐘獲得的直接質(zhì)量量值(dirctmassmeasurement)。基質(zhì)輔助解吸電離(MALDI)時間飛行(TOF)MS已經(jīng)成功地用于快速DNA測序和有效確定DNA分子大小。MALDI-TOFMS的出現(xiàn)已經(jīng)使電離完好巨大的DNA分子和測量其質(zhì)荷比更容易。500核苷酸(nt)長度的單鏈和雙鏈聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)產(chǎn)物已經(jīng)由MALDI-TOFMS檢測。使用減少DNA片段化的優(yōu)化基質(zhì)激光組合，已經(jīng)以精度士0.5-1%報道了合成性DNA、質(zhì)粒DNA的限制酶片段和大小至多到2180nt的RNA轉(zhuǎn)錄物的紅外MALDI質(zhì)譜。雖然已經(jīng)通過MALDI-TOFMS檢測了大的寡聚物，不過通常認(rèn)為現(xiàn)在慣例至多到100聚物。對于幾種基因而言，臨床重要的突變并不在基因組中隨機(jī)出現(xiàn)(例如在大部分已知腫瘤基因中出現(xiàn)的增加功能的點(diǎn)突變)。相反，影響相對少數(shù)密碼子的改變往往是大部分體細(xì)胞突變的原因。則原則上，有限數(shù)目的審慎設(shè)計的遺傳測定法應(yīng)當(dāng)有效地探查巨大比例的臨床相關(guān)突變。例如，Garraway及同事(Thomas,R.K.等人(2007)NatGenet,39,347-351)證實(shí)RAS、EGFR和BRAF中每個基因16-44個MALDI-TOF測定法捕獲了人惡性腫瘤中迄今對這些基因觀察到的90%-99%突變優(yōu)勢。因而，提出高通量基因分型可能提供大規(guī)模檢測臨床標(biāo)本中關(guān)鍵和/或’可靶向’癌癥突變的有效手段。MALDI-T0F理想地適用于檢測非異質(zhì)性腫瘤樣品中先前鑒定的突變。然而，盡管關(guān)于MALDI-TOF對種系突變或SNP-鑒定的可靠性沒有疑問，然而在檢測體細(xì)胞突變方面的經(jīng)驗是相對新近的。因而，當(dāng)使用具有<10%突變細(xì)胞的異質(zhì)性樣品(例如胰腺癌、肺癌或前列腺癌)或當(dāng)準(zhǔn)備篩選來自體液的DNA時，MALDI-T0F的可靠性大幅度降低。通過改善靈敏度，本發(fā)明的富集方法能夠使MALDI-T0F檢測低水平體細(xì)胞突變并還將提供對主流外科腫瘤樣品篩選法為必需的所要求的可靠性。高分辨率解鏈法在另一個實(shí)施方案中，使富集的靶序列經(jīng)歷高分辨率解鏈法。通過突變掃描法而非個體突變基因分型法更容易篩選沿外顯子在眾多位置處含有臨床相關(guān)突變的基因，如p53。HR-解鏈法是最近幾年引入的高通量突變掃描技術(shù)，具有發(fā)現(xiàn)SNP或種系突變的出色能力(Chou，L.S.等人(2005)；AmJClinPathol，124，330-338；ffittwer,C.Τ.等人(2003)；ClinChem,49,853-860；Reed,G.H.和Wittwer，C.Τ·(2004)；ClinChem，50，1748-1754)。在嵌入熒光染料(LCGreen或Sybr-Green)存在下PCR擴(kuò)增目的基因組區(qū)域后，不做任何擴(kuò)增后處理，即刻通過仔細(xì)的解鏈曲線分析和與野生型的比較實(shí)時鑒定突變的存在。此外，高分辨率解鏈解鏈分析在使用常規(guī)方法時所要求的一部分時間內(nèi)同時實(shí)現(xiàn)基因掃描和突變基因分型(即SNP鑒定)，與此同時維持管封閉環(huán)境。PCR需要<30分鐘(毛細(xì)管)或1.5小時(96-孔或384-孔平板)而解鏈搜索花費(fèi)每只毛細(xì)管1-2分鐘或或每平板5分鐘。然而，如同MALDI-T0F，使用HR-解鏈法的優(yōu)勢不能對低于大約20%突變體-對-野生型比率的體細(xì)胞突變外推，因而不能借助HR-解鏈法可靠地篩選幾個類型的臨床樣品。通過提高檢測限，本發(fā)明能夠?qū)R-解鏈法的便利性和高通量應(yīng)用于主流外科腫瘤樣品篩選法并且還用于檢測具有基質(zhì)污染的‘苛刻’臨床樣品或來自體液的DNA中的低水平體細(xì)胞突變。單分子測序在另一個實(shí)施方案中，使富集的靶序列經(jīng)歷單分子測序法(Thomas，R.K.等人(2006)；NatMed，12，852-855)。單分子測序法的能力也會得益于本發(fā)明的并入。例如對于患者樣品中的突變篩選，在啟動第二輪測序前仍需要在常規(guī)PCR儀中從基因組DNA中PCR擴(kuò)增所選的外顯子。另外，檢測臨床樣品中在1-5%突變體-對-野生型比率水平上的突變要求對眾多‘個體事件’重復(fù)測序，以獲得可接受的統(tǒng)計值。這最終降低通量能力，并且對于1%水平上的突變，如果所述突變居優(yōu)勢，僅可以同時篩選10-20個序列，如與大約4，000個序列形成對比(per454LifeSciences,TechnicalService)。通過在單分子測序之前開展本發(fā)明，突變的優(yōu)勢作為總體數(shù)目或等位基因的一部分將提高1-2個數(shù)量級，因而提高單分子測序法的通量至同等程度。在一個實(shí)施方案中，在單分子測序反應(yīng)的內(nèi)部乳化階段期間應(yīng)用選擇性富集方法。在這個實(shí)施方案中，使富集的靶序列經(jīng)歷焦磷酸測序法。引物延伸在另一個實(shí)施方案中，使富集的靶序列經(jīng)歷引物延伸測序反應(yīng)。在引物延伸中，使用寡核苷酸來相對于序列已知的核酸評估序列中該序列預(yù)定位置處的變異。提供作為單鏈分子的樣品寡核苷酸，該單鏈分子與誘導(dǎo)劑、標(biāo)記的核苷酸和引物混合以形式混合物，其中所述引物具有與分布在預(yù)定位置側(cè)翼的區(qū)域相同的序列，所述混合物基本上缺少由以下堿基構(gòu)成的核苷酸，所述堿基不同于構(gòu)成標(biāo)記核苷酸的堿基。隨后使該混合物經(jīng)歷這樣的條件，所述條件引起引物與單鏈分子復(fù)性并形成摻入標(biāo)記核苷酸的引物延伸產(chǎn)物，并且對該混合物分析含有標(biāo)記核苷酸的引物延伸產(chǎn)物的存在性(美國專利號5，846，710)。緩沖液構(gòu)思在本發(fā)明擴(kuò)增方法中包含有機(jī)溶劑以增加錯配和匹配雙鏈體之間的Tm差異。某些有機(jī)溶劑的包含可以改善靶序列的富集。例如，包含有機(jī)溶劑可以增加參考DNA序列和靶序列之間的變性溫度差異并因而輔助偏好地擴(kuò)增靶序列。有機(jī)溶劑如DMS0、甲酰胺、甜菜堿或甘油(Pomp,D.和Medrano，J.F.，Biotechniques，10，58-59(1991))可以增加錯配(參考/參考)序列與匹配(靶/參考)序列之間的Tm差異。因此，由于本發(fā)明的中間雜交步驟(交叉_雜交)形成含有錯配的靶-參考序列，故有利的是包含有機(jī)溶劑至它們不抑制聚合酶作用的程度。因而，在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物以1-10%體積對體積或優(yōu)選3-8%體積對體積或最優(yōu)5-6%體積對體積的水平補(bǔ)充有DMS0、甲酰胺、甜菜堿、甘油或其組合。實(shí)施例8說明DMSO在富集方法中的用途。使用有機(jī)溶劑的另一個實(shí)踐優(yōu)勢是對給定序列適宜的Tc在反應(yīng)中使用有機(jī)溶劑時改變。因而，在DMSO不存在下，序列的Tc是83.5°C，在3%DMS0存在下，該Tc是80.5°C。因而，通過添加不同量的DMSO或其他溶劑至不同序列，可以確保Tc對于全部序列是相同的。這對于單個PCR儀運(yùn)行中針對多種序列進(jìn)行眾多富集反應(yīng)是有用的，因為變性溫度隨后對全部序列是相同的。實(shí)施例實(shí)施例1.用于富集靶序列的材料與方法用于確認(rèn)COLD-PCR的序列為確認(rèn)本發(fā)明，使用一系列在p53外顯子8和Kras外顯子2(密碼子12-13)的不同位置含有突變的基因組DNA和細(xì)胞系(圖3)。p53外顯子8突變與肺癌中的不良預(yù)后相關(guān)并且是癌癥患者血漿中的低優(yōu)勢突變。類似地，Kras突變在肺腺癌中具有預(yù)后意義。富集方法和引物PCR在0.IXLC-Green嵌入染料存在下并按照實(shí)時方式在Cepheid儀進(jìn)行。PCR的實(shí)時追蹤并非必需但是方便，因而將其用于全部實(shí)驗。對于167bp的p53序列，正常PCR首先進(jìn)行10個循環(huán)旨在產(chǎn)生用于富集方法中的足夠產(chǎn)物。C印heid儀用以下循環(huán)參數(shù)編程95°C，120秒；(95°C，15秒/55°C熒光讀出ON,30秒/72°C，1分鐘延伸)X10個循環(huán)。所得PCR產(chǎn)物隨后11000稀釋并進(jìn)行以下富集方法處理，所述富集方法也在圖1中說明。95°C，15秒；70°C，120秒；在Tc=86.5°C變性3秒；55°C熒光讀出ON持續(xù)30秒；隨后72°C，1分鐘延伸，30個循環(huán)。為制備用于Sanger雙脫氧測序法的PCR產(chǎn)物，所述產(chǎn)物用核酸外切酶I和Shrimp堿性磷酸酶處理。以下引物用于所述測序方法中167bp片段5'-GCTTCTCTTTTCCTATCCTG-3'正向；5'-CTTACCTCGCTTAGTGCT-3'反向；對于87bp和210bp的p53片段和135bp的Kras片段，富集方法如上文所述，不過臨界變性溫度分別設(shè)在Tc=83.5,87.5和80°C。用于所述測序方法中的引物是5'-TGGTAATCTACTGGGACG—3'正向；5，CGGAGATTCTCTTCCTCT-3'反向(87bpp53外顯子8片段)5'-GCTTCTCTTTTCCTATCCTG-3'正向；5，-TAACTGCACCCTTGGTC-3'反向(210bpp53外顯子8片段)5，-AACTTGTGGTAGTTGGACCT-3，正向；5，-CTCTATTGTTGGATCATATT-3，反向(Kras外顯子2片段)。在3-6個獨(dú)立實(shí)驗中檢驗全部富集方法的重復(fù)性。MMp53外顯子8突變當(dāng)使用臨界變性溫度Tc=86.5°C的富集方法應(yīng)用于167bp外顯子8片段時，富集對于所測試的全部突變是明顯的。圖4描述各自結(jié)果。例如，在該富集方法后，如通過觀察測序圖色譜圖估計，來自HCC細(xì)胞的野生型細(xì)胞中初始稀釋降至5%突變體-對-野生型比率的DNA變?yōu)榧s70%突變體-對-野生型比率(即富集達(dá)大約14倍)。類似地，在該富集方法后，富集來自SW480細(xì)胞(在密碼子273處的純合G>A突變)的10倍稀釋至野生型的DNA達(dá)大約7倍。還觀察到CT7樣品(雜合C>A突變)富集達(dá)大約12倍并且MDA-MB231樣品((雜合C>T突變)富集達(dá)大約6倍。借助富集方法擴(kuò)增的野生型P53樣品顯示無突變(圖4)。如圖2中所列出，在對于167bp片段研究的全部p53突變范圍內(nèi)，富集作用變化達(dá)5-14倍。富集過程提高含有突變的全部序列的優(yōu)勢，無論突變在何處。Kras密碼子12/13突變圖5說明來自Kras的135bp片段的結(jié)果。所述結(jié)果與94°C變性溫度上進(jìn)行的常規(guī)巢式PCR比較并且隨后進(jìn)行Sanger測序。圖5說明使用Sanger測序，可以明白無誤地檢測到低至3%突變體-對-野生型的突變。實(shí)施例2臨床樣品的Sanger測序為使用本發(fā)明分析臨床樣品，使先前按照常規(guī)PCR測序的20份結(jié)腸腫瘤臨床樣品和肺腺癌臨床樣品經(jīng)歷如實(shí)施例1中所述的富集方法和sanger測序。結(jié)果顯示借助常規(guī)PCR-Sanger測序所鑒定的全部突變也通過所述富集方法、隨后測序而鑒定到。然而，所述富集方法還鑒定到常規(guī)測序錯過的突變。圖描述了2臨床樣品TL64和CT20，其中通過p53外顯子8密碼子273的所述富集方法-Sanger測序檢測到低優(yōu)勢G>A突變，不過所述突變沒有通過測序隨后常規(guī)PCR法檢測到。使用基于RFLP的測序法實(shí)施突變存在性的獨(dú)立驗證。此外，在源自結(jié)腸癌癥患者的血漿_循環(huán)DNA中通過所述富集方法-Sanger測序法檢測到P53外顯子8(G>A)突變，而通過常規(guī)PCR-Sanger測序法沒有檢測到此突變。其次，使用從福爾馬林固定(FFPE)的標(biāo)本獲得的DNA，也揭示被常規(guī)測序法錯過的p53(C>Τ)突變，其中所述標(biāo)本從非細(xì)胞肺癌癥患者(NSCLC)獲得(圖6)。圖6中的底部色譜圖顯示從一位NSCLC患者獲得的另一份FFPE樣品中Kras密碼子12突變的檢測結(jié)果。隨后通過RFLP方法獨(dú)立地從基因組DNA驗證由所述富集方法鑒定的突變。因而，使用COLD-PCR-測序法，被常規(guī)PCR-測序法錯過的相關(guān)突變輕易變得可檢測。實(shí)施例3._可以在無錯配復(fù)性步驟下富集降低L的突變當(dāng)變性溫度設(shè)在臨界溫度(Tc)時，PCR對核苷酸序列的依賴性如此明顯，從而甚至PCR期間不形成錯配的情況下，存在降低Tm的那些突變的富集。因而，當(dāng)G和A等位基因存在時，A-等位基因?qū)⒃贑OLD-PCR期間富集，因為這降低該等位基因的Tm。為證實(shí)這一點(diǎn)并且也為檢驗富集過程對所檢驗序列的大小的依賴性，檢驗了含有與P53外顯子8的167bp片段相同的突變的87bp片段和210bp片段(圖3)。如同167bp片段那樣，通過巢式PCR、隨后借助所述富集方法從初始P53外顯子8擴(kuò)增子擴(kuò)增這兩個片段。然而，在這種情況下，使用實(shí)施例1的擴(kuò)增方案的縮短形式，不過省去在70°C的錯配形成步驟以及94°C步驟(對于87bp片段，臨界變性溫度Tc=83.5°C并且對于210bp片段，Tc=87.5°C)。因而，在這種形式的富集方法中，PCR僅在臨界變性溫度(Tc)、引物結(jié)合步驟(例如55°C)和引物合成步驟(例如72°C)之間循環(huán)。圖7A顯示87bp片段的測序色譜圖(根據(jù)突變存在87bp序列上哪個地點(diǎn)，進(jìn)行正向測序或反向測序)。數(shù)據(jù)顯示使用這種形式的改良富集方法，20-50倍富集87bp片段。例如，在所述富集即大約50倍富集后，SW480DNA的突變體-對-野生型DNA的初始稀釋產(chǎn)生50%突變體-對-野生型。隨后的Sanger測序揭示出‘雜合’序列。在圖7B中描述大小對借助所述縮略富集方法的富集作用的影響。該數(shù)據(jù)說明富集作用對<IOObp的片段最高，不過對于至多到210bp的片段仍明顯(大約8-10倍)。實(shí)施例4-雖然各種癌樣品中遇到的大部分(大約70%)突變降低Tm，然而大約15%的突變提高τω(例如A>G)而大約15%的突變持平Tm(例如G>C)。為能夠富集全部可能的突變，包括G>A和A>G突變和缺失，優(yōu)選完整的富集程序(圖1)。為展示能夠富集具有提高或降低Tm的突變的靶序列，借助圖1的富集方法擴(kuò)增具有C或T核苷酸(野生型對HCC細(xì)胞系)的167bpp53外顯子8片段。形成兩種混合物，一種混合物少量地具有C等位基因(CT110)并且另一種混合物少量地具有T等位基因(TC110)。在所述富集方法或備選地在常規(guī)PCR后，將產(chǎn)物測序。在兩種情況下，均富集少數(shù)的等位基因即C或T，這取決于哪種等位基因在擴(kuò)增前更稀少。假定地，錯配的序列具有比C或T等位基因更低的解鏈溫度，因而通過進(jìn)行圖1的方案，錯配d序列總是被偏好地變性。因此，通過富集方法期間在中間溫度(大約70°C)形成錯配，總是存在少數(shù)等位基因的富集，即便特定核苷酸改變趨向于提高局部Tm。實(shí)施例5-MALDI-T0F測序本發(fā)明也期望改善大部分其他基于PCR的技術(shù)，包括用于體細(xì)胞突變檢測的MALDI-T0F。為證實(shí)這點(diǎn)，使用實(shí)施例1中用于Sanger測序的相同模式來比較富集方法對常規(guī)PCR之后的MALDI-T0F，其中所述Sanger測序旨在使用野生型樣品內(nèi)含有突變的細(xì)胞系的連續(xù)稀釋物鑒定具體P53外顯子8突變。在所述富集方法或常規(guī)PCR后，通過在37°C與0.3Ushrimp堿性磷酸酶(USB)保溫20分鐘隨后在85°C保溫5分鐘以失活該酶而從反應(yīng)除去過量dNTP。在SNP或插入/缺失范圍內(nèi)的單引物延伸以終濃度600nM每種延伸引物、50μMd/ddNTP和0.126U熱測序酶(Thermosequenase)(SolisBiodyne)進(jìn)行并在94°C保溫2分鐘，隨后45個下述循環(huán)94°C，5秒；52°C，5秒和72°C，5秒。所用的延伸引物由MALDI-TOFHarvardCoreFacility使用MassArrayAssayDesign軟件3.1.2.2版對所研究的每種p53突變設(shè)計。針對每種突變所用的引物是p53_sw480CAGGACAGGCACAAACA；p53_CT7:AGGACAGGCACAAACAC；p53_DU145:ACAGCTTTGAGGTGCGT；KRAS_SW480:TGTGGTAGTTGGACCTG；KRAS_A549:ACTCTTGCCTACGCCAC。隨后通過添加陽離子交換樹脂，隨后混合并離心以沉淀管內(nèi)容物而將反應(yīng)物脫鹽。將延伸產(chǎn)物點(diǎn)樣于384孔光譜CHIP，隨后MALDI-T0F質(zhì)譜儀(Sequenom)上運(yùn)行。結(jié)果在表I中顯示。在表I的第三列中列出突變富集倍數(shù)。通過與使用常規(guī)PCRMALDI-T0F時獲得的值比較來計算富集作用。對于大部分所研究的突變，獲得10-60富集倍數(shù)。當(dāng)突變體-對-野生型降低時，富集作用增加，這表明富集倍數(shù)對突變初始濃度的非線性依賴性。表IPS3突變顯示了多種P53外顯子8突變的％突變或野生型等位基因__MALDI-TOF結(jié)果__pS3外顯子8突變=14484G>A___富集-PCR_篩選的細(xì)胞系稀釋物_%A突變體%G野生型富集_SW480-野生型比率1:5常規(guī)PCR_15_85__SW480-野生型比率1:10常規(guī)PCR_5(質(zhì)譜檢測限)95__SW480-野生型比率1:33常規(guī)PCR_O_100__SW480-野生型比率1:10CO.L.D-PCR45_55_-9_SW480-野生型比率1:100CO.L.D-PCR33_67_>10_SW480-野生型比率1:300CO.L.D-PCR31_69_>30_僅野生型，CO.L.D-PCR_0_100_%_MALDI-TOF結(jié)果__p53外顯子8突變=14483C>T___CO丄.D-PCR篩選的細(xì)胞系稀釋物_%T突變體％C野生型富集_CT7-野生型比率1:5常規(guī)PCR_28_72_N/A_CT7-野生型比率1:10常規(guī)PCR_18_82_N/A_CT7-野生型比率1:33常規(guī)PCR_5(質(zhì)譜檢測限)95_NM._CT7-野生型比率1:100CO.L.D-PCR45_54_-18_CT7-野生型比率1:200CO.L.D-PCR28_72_-40_CT7-野生型比率1:300CO.L.D-PCR27_73_-60_僅野生型，CO.L.D-PCR_0_100_%_MALDI-TOF結(jié)果__p53外顯子8突變=14486G>T__CO.L.D-FCR篩選的細(xì)胞系稀釋物_%G突變體%T野生型富集_DU145-野生型比率1:5常規(guī)PCR_28_72_NTA_DU145-野生型比率1:10常規(guī)PCR_18_82_Ν/Α_DU145-野生型比率1:33常規(guī)PCR_0_100_NM._<table>tableseeoriginaldocumentpage33</column></row><table>富集-PCR-MALDI-TOF與常規(guī)-PCR-MALDI-TOF的比較。在最末列中列出獲得的突變富集。實(shí)施例6-比較基于TAQMAN的常規(guī)實(shí)時PCR和基于富集的實(shí)時PCR進(jìn)行核酸擴(kuò)增反應(yīng)以比較常規(guī)實(shí)時下的TAQMAN探針測定法和基于富集的實(shí)時PCR0比較這兩種實(shí)時檢測方法，在野生型序列中的多種稀釋度上分析具有p53外顯子8內(nèi)G>A突變的基因組DNA和臨床腫瘤樣品。將源自SW480的基因組DNA連續(xù)稀釋(13、110、130、1100禾Pl300)至野生型DNA中。具體地，在0.2μΜTaqman探針5，-6-Fam-TTTGAGGTGCATGTTTGTGCC-BHQ_1_3，存在下，在20ng基因組DNA上直接進(jìn)行實(shí)時PCR反應(yīng)，其中所述Taqman探針完全匹配源自SW480細(xì)胞的DNA上含有p53突變的序列。其他試劑的終濃度是1XGoTaqFlexi緩沖液(Promega)，1XGoTaq聚合酶(Promega)O.2mM各種dNTP，0.2μΜ正向引物，5'-TGGTAATCTACTGGGACG-3',Ο.2μΜ反向引物，5，-CGGAGATTCTCTTCCTCT-3‘，MgCl23mM，加DNA。PCR擴(kuò)增子的大小是87bp并且Tc=83.5°C?？焖貱OLD-PCR循環(huán)是95°C，120秒；(95°C，15秒；58°C熒光讀數(shù)0N，60秒)X25個循環(huán)；(83.50C15秒；58°C熒光讀數(shù)0N，60秒)X25個循環(huán)。對于常規(guī)PCR循環(huán)，使用相同程序，不過變性溫度在整個PCR期間是95°C。在獨(dú)立實(shí)驗中重復(fù)實(shí)驗至少5次。在圖8A和8B中描述擴(kuò)增曲線，所述擴(kuò)增曲線說明當(dāng)應(yīng)用于源自結(jié)腸癌癥細(xì)胞系SW480的基因組DNA時常規(guī)和富集實(shí)時PCR的靈敏度。圖8B證實(shí)富集實(shí)時PCR可以在1300突變體對野生型等位基因比率上檢測突變的存在。相反，在除Tc步驟之外完全相同的條件下實(shí)施的常規(guī)實(shí)時PCR僅可以在110最大稀釋度上檢測突變體(圖8A)。因而，使用富集方法，該測定法的靈敏度更好30倍。在圖8C和8D中說明具有p53外顯子8突變的臨床腫瘤樣品(已知所述臨床樣品之一含有在P53外顯子8中的一個低水平突變(5%突變體對野生型)CT20)中常規(guī)和富集實(shí)時PCR的靈敏度的擴(kuò)增曲線。富集實(shí)時PCR輕易地能夠檢測突變(圖8D)，而常規(guī)PCR不能(圖8C)。已知為野生型樣品的剩余樣品(TL6、TL8和TL18)在相同條件下不擴(kuò)增(圖8C)。實(shí)施例7-借助富集實(shí)時PCR的突變掃描產(chǎn)生核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物以比較使用DNA檢測染料的常規(guī)和富集實(shí)時PCR檢測沿P53外顯子8任意位置含有突變的樣品的能力。該方法提供了鑒定未知突變或雜合SNP的快速且便利方法。因而，本發(fā)明方法可以由本領(lǐng)域普通技術(shù)人員采用以掃描大量基因的種系或體細(xì)胞突變用于各種不同的用途(例如在具有發(fā)生乳腺/卵巢CA的高風(fēng)險的群體中掃描BRCA1/2突變，掃描完整遺傳突進(jìn)以鑒定突變等)。圖9A和9B說明擴(kuò)增曲線，所述擴(kuò)增曲線比較在已知含有p53外顯子8內(nèi)突變的多種細(xì)胞系和臨床樣品中使用LC-Green染料的常規(guī)和富集實(shí)時PCR。數(shù)據(jù)表明實(shí)時常規(guī)PCR(圖9A)不能區(qū)別突變體(SW480、TL6和CT20)和野生型(R27、TL8、TL18、TL81和TL82)樣品，而富集實(shí)時PCR能夠區(qū)分(圖9B)。富集方法對于含有突變的樣品提供比野生型樣品更早的閾值檢測。圖9C和9D說明來自與圖9A和9B中所述完全相同的反應(yīng)條件下制備的擴(kuò)增反應(yīng)中的結(jié)果，不過所述樣品全部是肺腫瘤。數(shù)據(jù)表明實(shí)時常規(guī)PCR(圖9C)不能區(qū)別突變樣品和野生型樣品，而富集實(shí)時PCR能夠區(qū)分(圖9D)。富集方法對于含有突變的樣品提供比野生型樣品更早的閾值檢測。另外，富集檢測方法能夠鑒定樣品TL6中先前未知的C>T突變。實(shí)施例8-有機(jī)溶齊時曾力D常規(guī),禾Π曾強(qiáng)型實(shí)時PCR其月丨旬突變的富集制備核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物以評估有機(jī)溶劑對常規(guī)和富集實(shí)時PCR的影響。反應(yīng)在有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑(3%DMS0)存在或不存在下進(jìn)行。所用方法與如實(shí)施例7中所述和在圖9C和9D中所繪那樣相同，除了添加3%DMSO之外。有機(jī)溶劑的存在增強(qiáng)含有突變序列的樣品與含有野生型序列的那些樣品的擴(kuò)增曲線之間的區(qū)分(圖10)。例如，野生型樣品和突變體樣品之間閾值差異從大約5個循環(huán)(無DMSO的實(shí)時富集，見圖9A)增加至超過10個循環(huán)(有DMSO的實(shí)時富集，見圖10A)。實(shí)施例9-使用與富集PCR組合的RFLP檢測超低水平突變與RFLP-PCR組合的富集PCR可以用與改善超低水平突變的鑒定，例如用于在極早階段即治療前鑒定癌癥基因組中的隨機(jī)突變或癌樣品中的抗性突變。例如，用TaqI酶選擇性地消化含有野生型EGFR外顯子19的樣品。隨后使至多到110，000突變體-對-基因組DNA的稀釋物以富集模式(Tc=81.5或81°C)或以常規(guī)PCR模式(95°C經(jīng)歷PCR處理。突變的富集作用由TaqI消化隨后dHPLC量化(圖11)。存在的突變的量通過在約7min停留時間上獨(dú)立突變峰的存在進(jìn)行量化。在富集方法后，突變峰比常規(guī)PCR后明顯得多?？傊?，富集方法明顯地改善借助RFLP-PCR所鑒定的極低水平突變的檢測。本文中引用的全部專利、專利申請和公開的參考文獻(xiàn)因而通過引用的方式完整并入。盡管已經(jīng)參考本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)例實(shí)施方案具體地顯示和描述了本發(fā)明，本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解可以在其中進(jìn)行形式和細(xì)節(jié)方面的多種改變而不脫離由所附權(quán)利要求書包括的本發(fā)明范圍。權(quán)利要求用于富集靶序列的方法，所述方法包括a.使可疑具有所述靶序列和參考序列的反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于參考序列解鏈溫度(Tm)的第一變性溫度，從而允許所述靶序列和所述參考序列變性，其中所述靶序列至少50％同源于所述參考序列并且是可通過與所述參考序列相同的引物對擴(kuò)增的；b.降低擴(kuò)增反應(yīng)混合物的溫度，從而允許靶鏈/參考鏈雙鏈體的形成；c.使所述擴(kuò)增反應(yīng)混合物經(jīng)歷低于所述參考序列Tm的臨界溫度(Tc)，從而允許步驟(b)的所述雙鏈體的偏好性變性以形成變性的靶鏈和參考鏈。d.降低反應(yīng)混合物的溫度，從而允許所述引物對與所述靶鏈和參考鏈復(fù)性；并且e.延伸所述引物對，從而相對于所述參考序列富集所述靶序列。2.用于富集靶序列的方法，所述方法包括a.通過使可疑具有所述靶序列和參考序列的核酸樣品經(jīng)歷高于所述參考序列解鏈溫度(Tm)的第一變性溫度而變性所述核酸樣品；b.形成靶鏈/參考鏈雙鏈體；c.通過使核酸樣品經(jīng)歷低于所述參考序列Tm的臨界溫度(Tc)而變性所述靶鏈/參考鏈雙鏈體；d.將所述引物對與所述靶鏈和參考鏈復(fù)性；并且e.延伸所述引物對，從而相對于所述參考序列富集所述靶序列。3.用于富集靶序列的方法，所述方法包括使可疑具有所述靶序列和參考序列的核酸樣品經(jīng)歷第一變性溫度和第二變性溫度，其中所述第一變性溫度高于所述參考序列的Tm，從而引起所述靶序列和參考序列的變性，并且所述第二變性溫度低于所述參考序列的Tm，從而引起靶鏈/參考鏈雙鏈體的偏好性變性，并且使所述的核酸樣品經(jīng)歷核酸擴(kuò)增條件，從而相對于所述參考序列富集所述的靶序列。4.用于富集靶序列的方法，所述方法包括執(zhí)行包含第一變性溫度和第二變性溫度的核酸擴(kuò)增反應(yīng)方案，其中所述第一變性溫度高于參考序列的Tm，從而引起所述靶序列和參考序列的變性并且所述第二變性溫度低于所述參考序列的Tm，從而引起靶鏈/參考鏈雙鏈體的偏好性變性。5.用于富集靶序列的方法，所述方法包括a.使可疑具有靶序列和參考序列的反應(yīng)混合物經(jīng)歷低于所述參考序列Tm的臨界溫度(Tc)，從而偏好地變性所述靶序列；b.降低反應(yīng)混合物的溫度，從而引起引物對與所述靶序列復(fù)性；并且c.延伸所述引物對，從而相對于所述參考序列富集所述靶序列。6.用于富集靶序列的方法，所述方法包括a.使可疑具有靶序列和參考序列的反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于所述參考序列解鏈溫度(Tm)的第一變性溫度，從而引起所述靶序列和參考序列的變性；b.備選地重復(fù)一次或更多次以下步驟i降低反應(yīng)混合物的溫度，從而引起靶鏈/參考鏈雙鏈體的形成，和ii使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷低于所述參考序列Tm的臨界溫度(Tc)，從而引起靶鏈/參考鏈雙鏈體的偏好性變性。c.降低反應(yīng)混合物的溫度，從而引起引物對與所述的靶序列和參考序列復(fù)性；并且d.延伸所述引物對，從而相對于所述的參考序列富集所述靶序列。7.用于富集靶序列的方法，所述方法包括a.使可疑具有靶序列和參考序列的反應(yīng)混合物經(jīng)歷高于所述參考序列解鏈溫度(Tm)的第一變性溫度，從而引起所述靶序列和參考序列的變性；b.備選地重復(fù)一次或更多次以下步驟i降低反應(yīng)混合物的溫度，從而引起靶鏈/參考鏈雙鏈體的形成，和使所述反應(yīng)混合物經(jīng)歷低于所述參考序列Tm并低于相同擴(kuò)增子中任意靶序列Tm的臨界溫度(Tc)處理，從而引起靶鏈/參考鏈雙鏈體的偏好性變性，c.降低反應(yīng)混合物的溫度，從而引起引物對與所述靶序列和參考序列復(fù)性；并且d.延伸所述引物對，從而相對于所述的參考序列富集所述靶序列。8.權(quán)利要求2的方法，其中在進(jìn)行步驟d之前重復(fù)步驟b和c兩次或更多次。9.權(quán)利要求1-3和5-8任一項的方法，其中所述靶序列和參考序列首先通過PCR擴(kuò)增。10.權(quán)利要求1-3和5-8任一項的方法，其中所述參考序列是野生型等位基因。11.權(quán)利要求10的方法，其中所述靶序列是突變等位基因。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述突變等位基因包含一個或多個核苷酸缺失。13.權(quán)利要求11的方法，其中所述突變等位基因包含一個或多個核苷酸插入。14.權(quán)利要求11的方法，其中所述突變等位基因包含一個或多個核苷酸改變。15.權(quán)利要求11的方法，其中所述靶序列是體細(xì)胞突變。16.權(quán)利要求1-3和5-15任一項的方法，其中所述靶序列和參考序列是15至1000個堿基。17.權(quán)利要求16的方法，其中所述靶序列和參考序列是25至500個堿基。18.權(quán)利要求16的方法，其中所述靶序列和參考序列是50至200個堿基。19.權(quán)利要求1-18任一項的方法，其中所述第一變性溫度比所述參考序列Tm高1°C至30"C。20.權(quán)利要求19的方法，其中所述第一變性溫度比所述參考序列Tm高5°C至20°C。21.權(quán)利要求1、2或5-20任一項的方法，其中所述Tc比所述參考序列Tm低.3°C_5°C。22.權(quán)利要求1、2或5-20任一項的方法，其中所述Tc比所述參考序列Tm低.5°C至1.5°C。23.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述第二變性溫度比所述參考序列Tm低.3°C-5°C。24.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述第二變性溫度比所述參考序列Tm低.5°C至1.5°C。25.權(quán)利要求1-24任意項的方法，其中所述方法重復(fù)2個或更多個循環(huán)。26.權(quán)利要求1-24任意項的方法，其中所述方法重復(fù)5-40個循環(huán)。27.權(quán)利要求1-24任意項的方法，其中所述方法重復(fù)10-30個循環(huán)。28.權(quán)利要求1-24任意項的方法，還包括使所述富集的靶序列經(jīng)歷進(jìn)一步處理。29.權(quán)利要求1-24任意項的方法，其中所述進(jìn)一步處理選自由MALDI-TOF、HR解鏈、雙脫氧測序、單分子測序、焦磷酸測序、RFLP、數(shù)字PCR和定量PCR組成的組。30.權(quán)利要求1-29任一項的方法，其中所述靶序列具有比所述參考序列更低的Tm。31.權(quán)利要求1-29任一項的方法，其中所述靶序列具有比所述參考序列更高的Tm。32.權(quán)利要求1、2或5-8任一項的方法，其中所述Tc應(yīng)用1秒-5分鐘。33.權(quán)利要求1、2或5-8任一項的方法，其中所述Tc應(yīng)用2秒-1分鐘。34.權(quán)利要求1、2或5-8任一項的方法，其中所述Tc應(yīng)用5秒-30秒。35.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述第二變性溫度應(yīng)用1秒_5分鐘。36.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述第二變性溫度應(yīng)用2秒-1分鐘。37.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述第二變性溫度應(yīng)用5秒-30秒。38.權(quán)利要求1-3或5-22、25-34任一項的方法，其中所述引物對在與所述靶序列復(fù)性時具有低于Tc的解鏈溫度。39.權(quán)利要求1、2或5-22、25-34任一項的方法，其中所述Tc是70_85°C。40.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述第二變性溫度是70-85°C。41.權(quán)利要求1-40任一項的方法，其中所述靶序列和參考序列是人DNA。42.權(quán)利要求1-41任一項的方法，其中所述靶序列是已經(jīng)用亞硫酸氫鈉處理過的甲基化DNA。43.權(quán)利要求1-42任一項的方法，其中參考序列是已經(jīng)用亞硫酸氫鈉處理過的甲基化DNA。44.權(quán)利要求1-43任一項的方法，其中所述反應(yīng)混合物包含核酸檢測染料。45.權(quán)利要求44任一項的方法，其中所述方法在實(shí)時PCR裝置中進(jìn)行。46.計算機(jī)可讀取介質(zhì)，包含用于進(jìn)行權(quán)利要求1-8任一項的方法的程序指令。47.用于富集靶序列的系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含用于執(zhí)行權(quán)利要求46的計算機(jī)可讀取介質(zhì)的程序指令的的存儲器。48.權(quán)利要求11的方法，其中所述突變等位基因包含SNP。49.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一變性溫度是90-99°C并且所述的Tc是65_89°C。50.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一變性溫度是86-99°C并且所述的Tc是65_85°C。51.權(quán)利要求1的方法，其中所述第一變性溫度是80-99°C并且所述的Tc是65_79°C。52.權(quán)利要求1-3和5-8任一項的方法，其中所述方法用來富集兩種或更多種不同的靶序列并且所述方法還包括對所述靶序列特異的一個或更多個額外引物對。53.權(quán)利要求1、2、5、6-22、25-34、38-39、41-45和48-52任一項的方法，其中所述方法還包括鑒定所述Tc，其中所述Tc允許所述靶序列/參考序列雙鏈體的偏好性變性。54.權(quán)利要求3或4的方法，其中所述方法還包括鑒定所述第二變性溫度，其中所述第二變性溫度允許所述靶序列/參考序列雙鏈體的偏好性變性。55.權(quán)利要求1的方法，其中所述引物對具有低于步驟(b)中所用溫度的解鏈溫度。56.權(quán)利要求6的方法，其中所述引物對具有低于步驟(b)(i)中所用溫度的解鏈溫度。57.權(quán)利要求55的方法，其中所述引物對的解鏈溫度低于步驟(b)的溫度至少5°C。58.權(quán)利要求56的方法，其中所述引物對的解鏈溫度低于步驟(b)(i)的溫度至少5°C。59.權(quán)利要求1-45或48-58任一項的方法，其在實(shí)時反應(yīng)條件下進(jìn)行。60.權(quán)利要求59的方法，其中實(shí)時反應(yīng)條件使用核酸檢測染料。61.權(quán)利要求59的方法，其中實(shí)時反應(yīng)條件使用標(biāo)記的探針。62.權(quán)利要求1-45或48-61任一項的方法，其中所述方法在多重測定法中進(jìn)行。63.權(quán)利要求1-45或48-61任一項的方法，其中所述方法在數(shù)字PCR平臺中進(jìn)行。64.權(quán)利要求1-3或5-8任一項的方法，其中反應(yīng)混合物包含修飾的核酸。65.權(quán)利要求64的方法，其中修飾的核酸是肽核酸。66.權(quán)利要求65的方法，其中修飾的核酸是對參考序列特異的引物。67.權(quán)利要求1-45或48-66任一項的方法，其中反應(yīng)混合物包含有機(jī)溶劑。68.權(quán)利要求67的方法，其中有機(jī)溶劑選自由DMSO、甲酰胺、甜菜堿、甘油或其組合組成的組。69.權(quán)利要求1、2、5-22、25-34或38-68的方法，其中所述Tc低于參考序列和靶序列二者的Tm。全文摘要本發(fā)明涉及用于富集來自樣品的低豐度等位基因的方法、組合物、軟件和裝置。所述方法部分地基于包括在臨界變性溫度或“Tc”保溫反應(yīng)混合物的改良核酸擴(kuò)增方法。通過使用本發(fā)明，明顯改善全部基于PCR的技術(shù)的現(xiàn)有檢測限。文檔編號C12P19/34GK101815789SQ200880109823公開日2010年8月25日申請日期2008年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年8月1日發(fā)明者G·馬克里吉奧古斯申請人:達(dá)納-法伯癌癥研究院有限公司