專利名稱：：調(diào)控纖維化的微小rna家族及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：—般而言，本發(fā)明涉及發(fā)育生物學(xué)和分子生物學(xué)領(lǐng)域。更具體的說，它關(guān)注miR-29家族對成纖維細(xì)胞中的基因調(diào)控和細(xì)胞生理。此miRNA家族在膠原沉積，特別是由成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的膠原沉積中發(fā)揮重要作用。
背景技術(shù)：
：心臟病及其表現(xiàn)，包括冠心病、心肌梗死、充血性心力衰竭和心臟肥大，清楚代表了美國當(dāng)今的一項(xiàng)重大健康風(fēng)險(xiǎn)。診斷、治療和支持罹患這些疾病的患者的花費(fèi)完全達(dá)到數(shù)十億美元。心臟病的兩項(xiàng)特別嚴(yán)重的表現(xiàn)是心肌梗死和心臟肥大。就心肌梗死而言，典型的是，由于動(dòng)脈粥樣硬化，在冠狀動(dòng)脈中發(fā)生急性血小板性冠狀動(dòng)脈閉塞，引起心肌細(xì)胞死亡。因?yàn)樾募〖?xì)胞，即心臟肌肉細(xì)胞，是終末分化的且一般沒有能力進(jìn)行細(xì)胞分裂，所以當(dāng)它們在急性心肌梗死過程期間死亡時(shí)它們一般被瘢痕組織代替。瘢痕組織沒有收縮性，無助于心臟功能，而且常常通過在心臟收縮期間擴(kuò)張，或通過增加心室的大小和有效半徑，例如變得肥大，而在心臟功能中發(fā)揮有害作用。雖然初始的膠原沉積是梗死愈合和預(yù)防心臟破裂所需要的，但是成纖維細(xì)胞持續(xù)生成膠原在梗死緣帶中的肌細(xì)胞周圍和梗死心臟的遠(yuǎn)端心肌(remotemyocardium)誘發(fā)間質(zhì)性纖維化。由于壓力的增大，此纖維化誘發(fā)僵硬、舒張功能障礙、和心肌細(xì)胞肥大，而且還能導(dǎo)致心率失常(arrythmias)。心臟肥大是心臟對實(shí)際上所有形式心臟病(包括那些源自高血壓、機(jī)械負(fù)荷、心肌梗死、心臟心率失常、內(nèi)分泌病癥、和心臟收縮蛋白質(zhì)基因中遺傳突變的)的適應(yīng)性應(yīng)答。雖然肥大性應(yīng)答最初是提高心輸出量的代償機(jī)制，但是持久的肥大能導(dǎo)致擴(kuò)張性心肌病(DCM)、心力衰竭、和猝死。在美國，每年有大約50萬人診斷出心力衰竭，死亡率接近50%。心臟肥大的前因后果已經(jīng)被廣泛證明，但是根本的分子機(jī)制尚未闡明。了解這些機(jī)制是心臟病的預(yù)防和治療中的一項(xiàng)重大關(guān)注點(diǎn)，而且作為設(shè)計(jì)特異性靶向心臟肥大和心臟心力衰竭的新藥物中的治療形態(tài)會(huì)是至關(guān)重要的。用藥理學(xué)藥劑進(jìn)行的治療代表了用于減輕或消除心力衰竭表現(xiàn)的主要機(jī)制。利尿藥構(gòu)成了輕度至中度心力衰竭的一線治療。如果利尿藥無效，那么可使用血管擴(kuò)張藥，諸如血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑(例如enalopril和lisinopril)或肌力藥療法(即通過提高心肌肌肉收縮力量來提高心輸出量的藥物)。不幸的是，這些標(biāo)準(zhǔn)療法中的許多具有眾多不良反應(yīng)，而且在有些患者中是禁忌的。如此，當(dāng)前使用的藥理學(xué)藥劑在特定患者群中具有嚴(yán)重缺陷。新的、安全的且有效的藥劑的可得性無疑會(huì)惠及不能使用目前可得的藥理學(xué)形態(tài)的患者或沒有自那些形態(tài)獲得足夠緩解的患者。心肌細(xì)胞在正常情況中由膠原纖維的精細(xì)網(wǎng)絡(luò)所包圍。響應(yīng)病理性壓力，心臟成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)不成比例地且過度地積累。心肌纖維化，即所有形式病理性肥大的一項(xiàng)特征，導(dǎo)致機(jī)械僵硬，這促成收縮功能障礙(Abraham等，2002)。病理性肥大和心力衰竭的另一項(xiàng)標(biāo)志是對一組胎兒心臟基因(包括那些編碼心房利鈉肽(ANP)、B-型利鈉肽(BNP)和收縮蛋白質(zhì)胎兒同等型諸如骨骼α-肌動(dòng)蛋白和β_肌球蛋白重鏈(MHC))的重新激活。這些基因通常在出生后受到遏制，并被一組成人心臟基因的表達(dá)替換(McKinsey和01SOn，2005)。胎兒基因表達(dá)對心臟功能和重塑的后果(例如纖維化)尚未完全了解。然而，已經(jīng)提出響應(yīng)壓力而發(fā)生的β-MHC(—種慢速ATP酶)上調(diào)和α-MHC(—種快速收縮ATP酶)下調(diào)涉及心臟功能的降低(Bartel，2004)，而且已知BNP在心臟纖維化中發(fā)揮支配性作用。在心臟纖維化之外，有許多病癥或疾患與各種組織的纖維化有關(guān)。先天性肝纖維化(一種常染色體隱性疾病)是一種影響肝和腎二者的罕見遺傳病。該疾病的特征為肝異常，諸如肝大、門高血壓、和遍及整個(gè)肝的纖維樣結(jié)締組織(肝纖維化)。肺纖維化(或肺瘢痕形成)源自正常肺氣囊逐漸被纖維變性組織替換。當(dāng)瘢痕形成時(shí)，組織變厚，引起組織運(yùn)送氧進(jìn)入血流的能力不可逆地丟失。最流行的想法是肺組織中的纖維變性過程是對肺微觀損傷的反應(yīng)(因遺傳而易感)。雖然尚不知道確切的起因，但是已經(jīng)得出與吸入的環(huán)境和職業(yè)污染物、吸煙、疾病(諸如硬皮病、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡和結(jié)節(jié)病)、某些藥療和治療性輻射有關(guān)。硬皮病是一種特征為膠原在皮膚或其它器官中過度沉積的慢性病。該疾病的局限性類型盡管使人失去能力，但不太會(huì)致命。作為心、腎、肺或腸損傷的結(jié)果，系統(tǒng)性類型或系統(tǒng)性硬化病(它是該疾病的全身性類型)會(huì)是致命的。硬皮病影響皮膚，而且在更加嚴(yán)重的情況中，它能影響血管和內(nèi)臟器官。骨骼肌纖維化是常常在患病或受損肌肉中發(fā)生的現(xiàn)象。它以纖維組織的過度生長為特征，這通常源自身體試圖自損傷恢復(fù)的企圖。纖維化損害肌肉功能并引起虛弱。肌肉功能丟失的程度一般隨纖維化的程度而增大。肌肉營養(yǎng)不良(特別是貝克(Becker)肌營養(yǎng)不良(BMD)和更嚴(yán)重深入的等位基因表現(xiàn)，迪謝內(nèi)(Ducherme)肌營養(yǎng)不良(DMD))的受害者隨著疾病進(jìn)展常常罹患日益增多的骨骼肌纖維化。已知其它病痛(諸如去神經(jīng)萎縮)造成骨骼肌纖維化，以及神經(jīng)肌肉疾病，諸如急性多神經(jīng)炎、脊髓灰質(zhì)炎、fferdig/Hoffman病、肌萎縮側(cè)索硬化(LouGehrig病)、和漸進(jìn)性延髓萎縮疾病。最近提出微小RNA涉及多種生物學(xué)過程，包括對發(fā)育時(shí)機(jī)、凋亡、脂肪代謝、和造血細(xì)胞分化等的調(diào)節(jié)。微小RNA(miR)指自常常編碼多種密切相關(guān)miRNA的多順反子轉(zhuǎn)錄物、蛋白質(zhì)編碼基因的內(nèi)含子、或各miRNA基因衍生的，長度為約18個(gè)至約25個(gè)核苷酸的小型、非蛋白質(zhì)編碼RNA。參見綜述Carrington等(2003)。miR起靶物mRNA的阻抑物的作用，這通過促進(jìn)它們的降解(當(dāng)它們的序列優(yōu)選互補(bǔ)時(shí))或通過抑制翻譯(當(dāng)它們的序列含有錯(cuò)配時(shí))來實(shí)現(xiàn)。miRNA由RNA聚合酶II(polII)或RNA聚合酶III(polIII；參見Qi等(2006)Cellular&MolecularImmunologyVol.3:411_419)轉(zhuǎn)錄，而且源自稱作初級(jí)miRNA轉(zhuǎn)錄物(pri-miRNA)的初始轉(zhuǎn)錄物，它們一般長數(shù)千堿基。pri_miRNA在細(xì)胞核中被RNA酶Drosha加工成約70個(gè)至約100個(gè)核苷酸的發(fā)夾形前體(pre-miRNA)。轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)后，發(fā)夾pre-miRNA被Dicer進(jìn)一步加工以生成雙鏈miRNA。然后將成熟miRNA鏈摻入RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物(RISC)，在那里它通過堿基對互補(bǔ)性與它的靶mRNA聯(lián)合。在相對罕見的、miRNA與mRNA靶物完美堿基配對的情況中，它促進(jìn)mRNA降解。更常見的是，miRNA與靶mRNA形成不完美的異源雙鏈體，從而影響mRNA穩(wěn)定性或抑制mRNA翻譯?？缭綁A基2-8(稱作“種子”區(qū))的miRNA的5'部分對于靶物識(shí)別是尤其重要的(Krenz和Robbins，2004；Kiriazis和Kranias，2000)。種子的序列與靶序列的系統(tǒng)發(fā)生保守性一起構(gòu)成許多當(dāng)前靶物預(yù)測模型的基礎(chǔ)。雖然可獲得目益增多的用于預(yù)測miRNA及其靶物的深?yuàn)W計(jì)算辦法，但是靶物預(yù)測仍然是一項(xiàng)重大挑戰(zhàn)，而且需要實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。將miRNA的功能歸于對特定mRNA靶物的調(diào)節(jié)因各miRNA與數(shù)以百計(jì)的潛在的高和低親和力mRNA靶物堿基配對的能力及使多種miRNA靶向各mRNA變得更加復(fù)雜。增強(qiáng)的對miRNA功能的了解無疑會(huì)揭示促成正常發(fā)育、分化、細(xì)胞間和細(xì)胞內(nèi)通訊、細(xì)胞周期、血管發(fā)生、凋亡、和許多其它細(xì)胞過程的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)。最近，發(fā)明人報(bào)告了一種心臟特異性微小RNA，miR-208，它是由α-肌球蛋白重鏈(MHC)基因的內(nèi)含子編碼的，而且是響應(yīng)心臟壓力而上調(diào)β-MHC表達(dá)和遏制心臟中的快速骨骼肌基因所需要的(參見共同懸而未決的申請W02008/016924，通過述及將其完整收入本文)。本發(fā)明詳述了微小RNA在心臟以及其它組織中的參與。發(fā)明概述本發(fā)明基于如下的發(fā)現(xiàn)，即miR-29家族(其在心臟中響應(yīng)壓力而下調(diào))調(diào)節(jié)膠原沉積和纖維化(包括心臟纖維化)形成。miR-29a-c表達(dá)或功能的上調(diào)導(dǎo)致膠原和纖維蛋白基因的表達(dá)降低，導(dǎo)致降低的心臟纖維化。因而，本發(fā)明提供了一種在有所需要的受試者中治療心臟纖維化、心臟肥大、或心力衰竭的方法，包括鑒定具有心臟纖維化、心臟肥大或心力衰竭的受試者；并給所述受試者施用miR-29a-c表達(dá)或功能的激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR-29a-c激動(dòng)劑是包含miR-29a、miR-29b、miR-29C、或其組合的成熟序列的多核苷酸。所述miR-29a-c激動(dòng)劑可以通過胃腸外施用(例如靜脈內(nèi)或皮下)、口服、經(jīng)皮、持續(xù)釋放、受控釋放、延遲釋放、栓劑、導(dǎo)管或舌下施用來施用。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括給所述受試者施用第二療法。所述第二療法選自下組β-阻滯劑、肌力藥、利尿藥、ACE-I、AII拮抗劑、BNP、Ca++-阻滯劑、內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑、和HDAC抑制劑。本發(fā)明還提供了一種在有所需要的受試者中預(yù)防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭的受試者；并提升所述受試者的心臟細(xì)胞中的miR-29a-c的表達(dá)或活性。在一個(gè)實(shí)施方案中，提升miR-29a-c的表達(dá)或活性包括對所述心臟細(xì)胞遞送miR-29a-c的激動(dòng)劑或編碼miR-29a-c的表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有風(fēng)險(xiǎn)的受試者展現(xiàn)出一種或多種選自下組的風(fēng)險(xiǎn)因素長期存在的不受控制的高血壓、未矯正的瓣膜病、慢性心絞痛(chronicangina)、近期的心肌梗死、對心臟病的先天性素因、和病理性肥大。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述有風(fēng)險(xiǎn)的受試者已經(jīng)診斷為具有對心臟肥大的遺傳素因。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，所述有風(fēng)險(xiǎn)的受試者具有心臟肥大的家族史。本發(fā)明還涵蓋一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞未能表達(dá)功能性miR-29a、miR29b、和/或miR29c。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞包含在異源啟動(dòng)子控制下的miR-29a-c編碼區(qū)，所述異源啟動(dòng)子在所述非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中有活性。所述轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物可以是小鼠。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在有所需要的受試者中治療心肌梗死的方法，包括提升所述受試者的心臟細(xì)胞中的miR-29a-c的表達(dá)或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在有所需要的受試者中預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張性心肌病的方法，包括提升所述受試者的心臟細(xì)胞中的miR-29a-c的表達(dá)或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種在有所需要的受試者中抑制心臟肥大進(jìn)展的方法，包括提升所述受試者的心臟細(xì)胞中的miR-29a-c的表達(dá)或活性。本發(fā)明還涵蓋一種在受試者中治療或預(yù)防組織纖維化的方法，包括鑒定具有組織纖維化或有組織纖維化風(fēng)險(xiǎn)的受試者；并提高所述受試者的骨骼肌或成纖維細(xì)胞細(xì)胞中的miR-29a-c的表達(dá)和/或活性。所述組織纖維化可以是心臟纖維化、硬皮病、骨骼肌纖維化、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、或糖尿病纖維化。在一些實(shí)施方案中，提高miR-29a-c的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用miR-29a-c的激動(dòng)劑。miR-29a-c的激動(dòng)劑可以是包含成熟miR-29a、miR_29b、和/或miR_29c序列之序列的多核苷酸。所述miR-29a_c激動(dòng)劑還可以是編碼miR-29a、miR-29b、和/或miR-29c的表達(dá)載體。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括給所述受試者施用非miR-29a-c抗纖維變性療法。本發(fā)明還提供了一種鑒定miR-29a-c調(diào)控物的方法，包括使細(xì)胞接觸候選化合物；評估m(xù)iR-29a-c活性或表達(dá)；并比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在所述候選化合物時(shí)miR-29a-c的活性或表達(dá)，其中測量得到的miR-29a-c活性或表達(dá)間的差異指示所述候選化合物是miR-29的調(diào)控物?？梢栽隗w外或在體內(nèi)使所述細(xì)胞接觸所述候選化合物。合適的候選化合物包括蛋白質(zhì)、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。本發(fā)明還涵蓋一種藥物組合物，其包含miR-29a-c的激動(dòng)劑或拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述藥物組合物可以是為注射或局部施用而配制的。用于局部施用的配制劑可以是凝膠(gel)、乳膏(cream)、洗劑(lotion)、或軟膏劑(ointment)。本發(fā)明提供了一種在組織中誘導(dǎo)膠原沉積的方法，包括使所述組織接觸miR-29a-c的拮抗劑。所述拮抗劑可以是miR-29a、miR_29b、或miR_29c的拮抗劑。所述拮抗劑可以是miR-29a-c的小RNA拮抗劑(antagomir)、靶向成熟miR-29a-c序列的反義寡核苷酸、或包含與成熟miR-29a-c序列相同的序列的抑制性RNA分子(諸如siRNA或shRNA)、或核酶或其它抑制性核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使所述組織接觸第二藥劑。所述第二藥劑可以是局部維生素A、局部維生素C、或維生素E。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對所述組織進(jìn)行第二處理，諸如化學(xué)脫皮、激光處理、皮膚整平(dermaplaning)、或皮膚磨削術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織在罹患埃勒斯一當(dāng)洛綜合征(Ehler，s-Danlossyndrome)或維生素C缺乏病的受試者中。附圖簡述通過參考這些附圖中的一幅或多幅并與本文所呈現(xiàn)的具體實(shí)施方案的詳述組合，可以更好地理解本發(fā)明。圖IA-B。miR-208由α-MHC基因編碼并在心臟中特異性表達(dá)。(圖lA)miR_208在α-MHC基因的內(nèi)含子內(nèi)編碼。星號(hào)指示序列保守性(SEQIDNO1-5)0(圖IB)通過Northern分析對成年小鼠組織的miR-208轉(zhuǎn)錄物的檢測。TOmRNA充當(dāng)加載對照。圖2A-B。對α-和β-MHC的調(diào)節(jié)。(圖2Α)甲狀腺激素和TRE對類別轉(zhuǎn)變的調(diào)節(jié)。(圖2Β)快速向慢速的肌肉纖維收縮性轉(zhuǎn)變中的壓力/甲狀腺功能減退癥的模型。圖3。人類心臟中miR-208的檢測。通過來自六名正常個(gè)體和六名具有特發(fā)性心肌病的個(gè)體的心臟組織的Northern印跡檢測α-MHC和miR-208的轉(zhuǎn)錄物。在α-MHC與pre-miR-208的表達(dá)水平間存在密切相關(guān)性，而成熟miR-208表達(dá)在后者下調(diào)后得到維持。圖4A-B。miR-208突變小鼠的牛成。(圖4A)通過同源重組生成miR-208突變小鼠的策略。用側(cè)翼為IoxP位點(diǎn)的新霉素抗性盒替換pre-miRNA序列(在大多數(shù)轉(zhuǎn)錄物中位于小鼠α-MHC基因的內(nèi)含子29內(nèi))。通過將雜合小鼠與攜帶CAG-Cre轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)基因小鼠育種，清除小鼠種系中的新霉素盒。(圖4Β)通過來自野生型和miR-208突變小鼠的心臟的Northern分析檢測miR-208轉(zhuǎn)錄物。圖5。所示基因型的新牛小鼠的心臟中α-MHC和β-MHC蛋白質(zhì)水平的Western分近。每種基因型分析兩只小鼠。檢測GAPDH作為加載對照。圖6。miR-208^小鼠顯示出響應(yīng)壓力過載的心臟吧大減輕。野生型和miR-208+小鼠的心臟的組織學(xué)切片Masson三色染色。miR-208的缺失消除了在接受21天胸主動(dòng)脈綁扎(TAB)的野生型小鼠中看到的肥大和纖維化。頂圖中的標(biāo)度條等于2mm，而底圖中的等于20μm。圖7。miR-208^小鼠顯示出響應(yīng)鈣依賴磷酸酶活化的心臟肥大減輕。表達(dá)鈣依賴磷酸酶轉(zhuǎn)基因的6周齡小鼠的心臟(CnA-Tg)和miR-208+；CnA-Tg的心臟的組織學(xué)切片Masson三色染色。miR-208的缺失消除在CnA-Tg小鼠中看到的肥大和纖維化。標(biāo)度條=2mm(頂圖)或2Oym(底圖)。圖8。miR-208=Zz小鼠未能響應(yīng)TAB和鈣依賴磷酸酶活化而上調(diào)β-MHC0圖9。成年野生型和miR-208轉(zhuǎn)基因動(dòng)物中α和β-MHC蛋白質(zhì)水平的Western分析。檢測GAPDH作為加載對照。圖10。miR-208=Zz小鼠未能響應(yīng)PTU處理的甲狀腺功能減退而上調(diào)β-MHC0圖11。miR-208在控制β-MHC表達(dá)中的作用的示意圖。圖12。miR-208在經(jīng)Thrapl調(diào)節(jié)β-MHC和快速骨骼肌基因表達(dá)中的作用的示意凰。圖13。微小RNA在心臟肥大期間的作用機(jī)制。圖14A-C。心臟肥大和重塑期間的miRNA表達(dá)。(圖14A)來自假和TAB21天后的小鼠和來自CnATg小鼠的代表性心臟的H&E染色切片。標(biāo)度條等于2mm(圖14B)下面顯示了顯示在每種心臟類型中的表達(dá)有變化的微小RNA的數(shù)目的Verm圖。(圖14C)肥大期間的表達(dá)有變化的微小RNA的Northern印跡。檢測TORNA作為加載對照。圖15。miR-29a-c表達(dá)響應(yīng)心臟壓力而下調(diào)。在左邊顯示了來自野生型小鼠(WT)和具有鈣依賴磷酸酶轉(zhuǎn)基因(CnA)或TAB誘發(fā)的肥大和纖維化小鼠的心臟。在右邊顯示了miR-29a-c在每種心臟類型中的相對表達(dá)水平。圖16。與野生型相比，來自miR-208敲除小鼠的心臟的微陣列分析。在6周齡時(shí)對自野生型和miR-208無效心臟分離的mRNA實(shí)施了微陣列分析。位居miR-208之后下調(diào)最多的miRNA是miR-499。圖17。miR-29家族在miR-208無效心臟中顯著上調(diào)。圖18。miR-29家族靶向編碼膠原和細(xì)胞外基質(zhì)的渉及纖維化的其它成分的mRNA?；谒鼈兊母叨刃蛄型葱裕琺iR29家族由4個(gè)成員組成；miR-29a、miR29b_l和-2、及miR-29c。顯示了成熟miRNA的序列(SEQIDN0:18_20)。miR-29b_l和miR-29b_2的成熟序列是相同的。此家族一起針對細(xì)胞外基質(zhì)的涉及纖維化的許多成分。圖19。miR-208和miR-29家族控制心臟纖維化的樽型。在正常心臟中，miR-208抑制miR-29a-c表達(dá)。在沒有miR-208時(shí)，miR-29a_c表達(dá)上調(diào)，阻止響應(yīng)壓力而發(fā)生的纖維化和細(xì)胞外基質(zhì)表達(dá)。miR-208、miR-499和miR-29的功能是連環(huán)的。通過阻止miR-499表達(dá)和上調(diào)miR-29a-c表達(dá)，由此阻斷纖維化，miR-208的丟失會(huì)是心臟保護(hù)性的。圖20A-D。miR-29a-c調(diào)節(jié)細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的表汰。(圖20A)關(guān)鍵纖維變性基因的3'UTR區(qū)中miR-29a-c的潛在結(jié)合位點(diǎn)。(圖20B)MI后3天緣帶和遠(yuǎn)端心肌層二者中預(yù)測靶基因的實(shí)時(shí)PCR分析顯示了miR-29a-c的降低，與膠原(C0L1A1、C0L1A2和C0L3A1)和微纖維蛋白(FBm)的升高有關(guān)，而彈性蛋白(ELNl)沒有顯著變化。(圖20C)經(jīng)漸增量的編碼miR-29b-l/miR-29a簇的CMV表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的COS細(xì)胞的Northern印跡分析顯示miR-29a-b的有效過表達(dá)。頂部的帶對應(yīng)于pre-miRNA，而下面的帶對應(yīng)于成熟miRNA。(圖20D)使用預(yù)測靶基因的內(nèi)源UTR序列進(jìn)行的螢光素酶實(shí)驗(yàn)，顯示了響應(yīng)漸增量的miR-29a-c，miR-29a-c遏制螢光素酶表達(dá)，而在使用無關(guān)miR(即miR-206)時(shí)沒有這種降低。圖2認(rèn)-8。1^1^293-(；表達(dá)響應(yīng)163。(圖21A)實(shí)時(shí)PCR分析指示所有三個(gè)miR-29家族成員在成纖維細(xì)胞中響應(yīng)TGFβ而下調(diào)。(圖21Β)顯示miR-29a-c表達(dá)在miR-208突變動(dòng)物中上調(diào)的Northern分析，與通過實(shí)時(shí)PCR測定的BNP表達(dá)升高一致。圖22A-G。miR-29a~c抑制在體內(nèi)誘導(dǎo)纖維化。(圖22A)反miR-29a_c和錯(cuò)配(讓)miR-29a-c的結(jié)構(gòu)。(圖22B)Northern印跡分析，顯示了3天后響應(yīng)靜脈內(nèi)注射80mg/kg反miR-29a-c或mmmiR-29a-c或相當(dāng)體積的鹽水而發(fā)生的組織特異性敲低。(圖22C)肝提取物的實(shí)時(shí)PCR分析指示膠原表達(dá)響應(yīng)miR-29a-c敲低的顯著升高，而在注射鹽水或mm后沒有這種效果。(圖22D)連續(xù)兩天靜脈內(nèi)注射80mg/kg反miR-29a-c或mmmiR-29a-c寡核苷酸或相當(dāng)體積的鹽水后三周收集的組織指示心、肝和腎中miR-29a-c的劇烈敲低，而肺中的miR-29a-c水平表現(xiàn)出不受影響。(圖22E)心提取物的實(shí)時(shí)PCR分析指示心臟膠原表達(dá)響應(yīng)miR-29a-c敲低而升高。(圖22F)實(shí)時(shí)PCR分析指示miR_29b模擬物處理后兩天成纖維細(xì)胞中miR-29b表達(dá)升高，而miR-29a水平?jīng)]有變化，miR_29c水平只有略微升高。(圖22G)成纖維細(xì)胞中的miR-29b過表達(dá)遏制膠原基因表達(dá)，如實(shí)時(shí)PCR分析所測定的。圖23。miR-29家族成員在各種組織中響應(yīng)miR_29b敲低的表達(dá)。不同組織中所有miR-29成員的敲低指示miR-29b顯示響應(yīng)反miR_29b在心臟中降低50%，而miR_29a和-C只顯示邊緣性變化。然而，肝和腎中miR-29b響應(yīng)反miR-29b的敲低幾乎是完全的，而miR-29a和-c也表現(xiàn)出在這些組織中響應(yīng)反miR_29b而降低。發(fā)明詳述心肌和骨骼肌通過調(diào)控肌球蛋白的調(diào)節(jié)收縮效率的各同等型的表達(dá)來響應(yīng)多種病理生理刺激，諸如工作負(fù)荷、甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)和損傷。最近，發(fā)明人報(bào)告了一種心臟特異性微小RNA，即miR-208，它是由α-肌球蛋白重鏈(MHC)基因的內(nèi)含子編碼的，而且是在心臟中響應(yīng)心臟壓力而上調(diào)β-MHC表達(dá)和遏制快速骨骼肌基因所需要的(參見共同懸而未決的申請W02008/016924，通過述及而完整收入本文)。在此，發(fā)明人延伸了他們早先的工作，并且顯示了miR-208還下調(diào)一個(gè)相關(guān)miRNA家族，即miR-29a-c。由于miR-29a-c遍在表達(dá)，而且涉及對膠原沉積的調(diào)節(jié)，因此調(diào)節(jié)miR-29a-c表達(dá)的策略可應(yīng)用于預(yù)防多種組織纖維化，包括心臟纖維化，以及骨骼肌、肝、肺、糖尿病和腎纖維化。對心臟細(xì)胞(諸如心臟成纖維細(xì)胞)中miR-29a-c的調(diào)節(jié)可用于在受試者中治療或預(yù)防心臟肥大或心力衰竭。如此，本發(fā)明的一個(gè)方面是對miR-29a-c表達(dá)或活性的激動(dòng)，任選與抑制miR-208聯(lián)合。激動(dòng)可涉及將外源miR-29a-c導(dǎo)入心臟或其它感興趣組織，或是直接使用裸的核酸或遞送媒介物(vehicle)(諸如脂質(zhì)/脂質(zhì)體/納米顆粒)，或是經(jīng)由基因表達(dá)，例如通過使用腺病毒載體或其它異位表達(dá)手段，以降低纖維化。還涵蓋經(jīng)由藥物“小分子”來激活miR-29a-c的抗纖維變性功能，正如用于鑒定此類化合物的篩選。遏制miR-29a-c表達(dá)后，例如在心肌梗死(MI)和其它壓力形式后發(fā)生的膠原增多可指示miR-29a-c的另一項(xiàng)作用。發(fā)明人的工作的一個(gè)焦點(diǎn)是心臟纖維化，而且對一個(gè)關(guān)鍵調(diào)節(jié)基因子集(即膠原I、III、彈性蛋白和微纖維蛋白)的檢查顯示了這兩種膠原和微纖維蛋白響應(yīng)miR-29a-c下調(diào)的驚人增多，而彈性蛋白沒有增多。因此，治療性遏制miR-29a-c來增加膠原沉積為解決以膠原丟失為特征的狀況(諸如在化妝品應(yīng)用和瘢痕形成)呈現(xiàn)了一個(gè)獨(dú)特選項(xiàng)。微小RNA29(miR-29)是一個(gè)微小RNA家族，由4個(gè)已知成員組成，即miR_29a、bl和2(相同的)和c。雖然miR29b-l和29a滋生自源自人類染色體7和小鼠染色體6的相同轉(zhuǎn)錄物，但是含有miR29b-2和miR29c的miRNA簇在這兩種物種中都是自染色體1轉(zhuǎn)錄的。下面列出了每一個(gè)人類miR-29家族成員的成熟miRNA序列hsa-miR-29auagcaccaucugaaaucgguua(SEQIDNO18)hsa-miR-29b_l禾口b_2uagcaccauuugaaaucaguguu(SEQIDNO19)hsa-miR-29cuagcaccauuugaaaucgguua(SEQIDNO20)這些微小RNA基于它們的序列同源性而形成家族(Yu等；2006)。由于在家族各成員間只有微小的差異，而且各成員具有100%保守的種子區(qū)(其有助于限定靶物決定)，因此它們很有可能靶向相同的mRNA靶物(圖18)，而且降低這些特定靶基因的基因表達(dá)。miR-29家族的靶物決定揭示了miR-29家族顯示出對靶向涉及膠原形成的基因以及其它細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(諸如諸如彈性蛋白(ELN)、微纖維蛋白1(FBm)、膠原I型α1和a2(C0LlAl,C0L1A2)膠原III型a1(C0L3A1)、金屬肽酶、和整聯(lián)蛋白)的高度偏愛。在響應(yīng)病理壓力時(shí)，心臟成纖維細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)不成比例地且過度地積累。心肌纖維化(所有形式的病理性肥大的一項(xiàng)特征)導(dǎo)致機(jī)械僵硬，這促成收縮功能障礙(Berk等，2007)。由于miR-29家族在此重塑過程期間下調(diào)，因此此家族有可能在對膠原沉積的調(diào)控中發(fā)揮積極作用，并由此調(diào)節(jié)心臟纖維化和心臟收縮性，這繼發(fā)地能誘導(dǎo)肥大和病理性重塑。正如先前所討論的，miR-208表現(xiàn)出調(diào)節(jié)miR-29表達(dá)，因?yàn)閙iR-29在miR-208的兩個(gè)拷貝都缺失的小鼠的心臟中顯著上調(diào)(見實(shí)施例1)。如此，對miR-208的調(diào)控能影響miR-29的表達(dá)以及miR-29靶基因的表達(dá)。miR-208是位于α-MHC基因內(nèi)含子內(nèi)的內(nèi)含子HiiRNA0精確的內(nèi)含子位置取決于具體的物種和具體的轉(zhuǎn)錄物。例如，在人類中，miR-208是在α-MHC基因的第28內(nèi)含子內(nèi)編碼的，而在小鼠中，它是在第29內(nèi)含子內(nèi)編碼的。SEQIDN0:14、SEQIDN0:15、SEQIDN0:16、SEQIDNO:17中分別提供了人類、小鼠、大鼠、和犬的miR-208的pre-miRNA編碼序列。SEQIDNO:5中提供了成熟miR-208序列。像α-MHC一樣，miR-208僅僅在心臟中表達(dá)(圖1)。人pre-miR-208(SEQIDNO14)acgggcgagcttttggcccgggttatacctgatgctcacgtataagacgagcaaaaagcttgttggtcaga小鼠pre-miR-208(SEQIDNO15)acgggtgagcttttggcccgggttatacctgactctcacgtataagacgagcaaaaagcttgttggtcaga大鼠pre-miR-208(SEQIDNO16)acgggtgagcttttggcccgggttatacctgactctcacgtataagacgagcaaaaagcttgttggtcaga犬pre-miR-208(SEQIDNO17)acgcatgagcttttggctcgggttatacctgatgctcacgtataagacgagcaaaaagcttgttggtcaga使用用于鑒定miRNA靶物的PicTar算法(Krek等，2005)，發(fā)明人鑒定出甲狀腺激素受體相關(guān)蛋白質(zhì)I(THRAPl)作為miR-208的預(yù)測靶物。SEQIDNO:6、SEQIDNO:7、SEQIDN0:8、SEQIDN0:9、SEQIDNO:10、SEQIDNO11、SEQIDNO:12、和SEQIDNO:13中分別提供了來自人類、黑猩猩、小鼠、大鼠、犬、雞、河豚、和斑馬魚的THRAPl3'UTR序列。人THRAPl3‘UTR(SEQIDNO6)uucuugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuuaauuaaaaaguugcaguaggguugc黑猩猩THRAPl3‘UTR(SEQIDNO7)uucuugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuuaauuaaaacguugcaguaggguugc小鼠THRAPl3‘UTR(SEQIDNO8)uucuugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuuaauuaaaacguugcaguaggguugc大鼠THRAPl3‘UTR(SEQIDNO9)uucuugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuuaauuaaaacguugcaguaggguugc犬THRAPl3‘UTR(SEQIDNO10)uucuugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuuaauuaaaacguugcaguaggguugc雞THRAPl3‘UTR(SEQIDNO11)uucuugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuuaauuaaaacguugcaguaggguugc河豚THRAPl3‘UTR(SEQIDNO12)uuccugcuuuaagcaauugguugaaaauauauguauguaauggucuuaauuaaaaaaacaaacuaagacaaa斑馬魚THRAPl3‘UTR(SEQIDNO13)uuccugcuuuaaagcaauuggucuaaaauauauguaaucgucuucauuacaaaaacgaaccaucaaacg本發(fā)明提供了在有所需要的受試者中治療心臟纖維化、心臟肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定具有心臟纖維化、心臟肥大或心力衰竭的受試者；并對所述受試者施用miR-29表達(dá)或功能的激動(dòng)劑。所述miR-29激動(dòng)劑可以是miR-29a、miR_29b和/或miR_29c的激動(dòng)劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-29a-c的激動(dòng)劑可以是包含成熟miR-29a-c序列的多核苷酸。在一些實(shí)施方案中，所述多核苷酸包含序列SEQIDNO18,SEQIDN0:19、或SEQIDNO:20ο在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR-29a-c激動(dòng)劑可以是包含miR-29a、miR-29b、和/或miR-29c之pri_miRNA或pre_miRNA序列的多核苷酸。所述包含成熟miR-29a_c、pre-miR-29a-C、或pri-miR-29a-C序列的多核苷酸可以是單鏈的或雙鏈的。所述多核苷酸可含有一處或多處化學(xué)修飾，諸如鎖定核酸、肽核酸、糖修飾(諸如2'-O-烴基(例如2'-O-甲基、2'-O-甲氧乙基)、2'-氟、和4'-硫修飾)、和主鏈修飾(諸如一個(gè)或多個(gè)硫代硫酸酯、嗎啉代、或膦羧酸酯連接。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述包含miR-29a-c序列的多核苷酸偶聯(lián)有膽固醇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述miR-29a-c激動(dòng)劑可以是不同于miR-29a-c，起提高、補(bǔ)充、或代替miR-29a-c功能的作用的藥劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在體內(nèi)自載體表達(dá)所述miR-29a-c激動(dòng)劑?！拜d體，，指可用于將感興趣核酸遞送至細(xì)胞內(nèi)部的物質(zhì)組合物。本領(lǐng)域已知眾多載體，包括但不限于線性多核苷酸、與離子的或兩親性的化合物有關(guān)的多核苷酸、質(zhì)粒、和病毒。如此，術(shù)語“載體”包括自主復(fù)制的質(zhì)粒或病毒。病毒載體的例子包括但不限于腺病毒載體、腺伴隨病毒載體、逆轉(zhuǎn)錄病毒載體、等等。表達(dá)構(gòu)建體能在活細(xì)胞中復(fù)制，或者它能合成制備。為了本申請，術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”、“表達(dá)載體”、和“載體”可互換使用，以一般性的、例示性的意義演示本發(fā)明的應(yīng)用，而且并非意圖限制本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)miR-29a-c的表達(dá)載體包含與編碼miR_29a、miR-29b、miR-29c、或其組合的多核苷酸“可操作連接”的啟動(dòng)子。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸可編碼miR-29b-l/miR-29a簇。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多核苷酸可編碼miR-29b-2/miR-29c簇。如本文中所使用的，短語“可操作連接”或“在轉(zhuǎn)錄控制下”意味著啟動(dòng)子相對于多核苷酸處于正確的定位和取向以控制RNA聚合酶進(jìn)行的轉(zhuǎn)錄的和多核苷酸的表達(dá)的啟動(dòng)。編碼miR-29a-c的多核苷酸可編碼一級(jí)微小RNA-29a-c序列(pri-RNA-29a_c)、前體微小RNA_29a_c序列(pre-RNA-29a-c)或成熟RNA_29a-C序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQIDN0:18o在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQIDNO:19。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體包含與啟動(dòng)子可操作連接的多核苷酸，其中所述多核苷酸包含序列SEQIDNO:20ο所述包含序列SEQIDNO18,SEQIDNO:19、或SEQIDNO20的多核苷酸可以是長約18個(gè)至約2000個(gè)核苷酸、長約70個(gè)至約200個(gè)核苷酸、長約20個(gè)核苷酸至約50個(gè)核苷酸、或長約18個(gè)核苷酸至約25個(gè)核苷酸。貫穿本申請，術(shù)語“表達(dá)構(gòu)建體”意圖包括任何類型的遺傳構(gòu)建體，其包含編碼基因產(chǎn)物的核酸，其中部分或整個(gè)核酸編碼序列能夠被轉(zhuǎn)錄。一般而言，編碼基因產(chǎn)物的核酸在啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄控制下。“啟動(dòng)子”指受到細(xì)胞的合成機(jī)械、或?qū)氲暮铣蓹C(jī)械識(shí)別，啟動(dòng)基因的特異性轉(zhuǎn)錄所需要的DNA序列。術(shù)語啟動(dòng)子在本文中會(huì)用于指在RNA聚合酶的啟動(dòng)位點(diǎn)周圍聚簇的一組轉(zhuǎn)錄控制模塊。關(guān)于如何組織啟動(dòng)子的許多思考衍生自對數(shù)種病毒啟動(dòng)子的分析，包括HSV胸苷激酶(tk)和SV40早期轉(zhuǎn)錄單元的。這些研究(得到最近工作的擴(kuò)充)顯示了啟動(dòng)子是由離散功能模塊構(gòu)成的，其中每個(gè)模塊由大約7-20bpDNA組成，且含有轉(zhuǎn)錄激活物或阻抑物蛋白質(zhì)的一個(gè)或多個(gè)識(shí)別位點(diǎn)。每種啟動(dòng)子中的至少一個(gè)模塊發(fā)揮定位RNA合成起始位點(diǎn)的功能。這知道得最多的例子是TATA盒，但是在一些缺少TATA盒的啟動(dòng)子中，諸如哺乳動(dòng)物末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶基因的啟動(dòng)子和SV40晚期基因的啟動(dòng)子，與起始位點(diǎn)自身交疊的一個(gè)離散元件有助于固定啟動(dòng)位置。別的啟動(dòng)子元件調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄起始的頻率。典型的是，這些位于起始位點(diǎn)上游30-1IObp的區(qū)域中，盡管許多啟動(dòng)子最近顯示出在起始位點(diǎn)下游也含有功能元件。各啟動(dòng)子元件間的間距通常是靈活的，使得當(dāng)各元件彼此相對被倒置或移動(dòng)時(shí)啟動(dòng)子功能得到保留。在tk啟動(dòng)子中，各啟動(dòng)子元件間的間距能增加至相距50bp，之后活性才開始下降。取決于啟動(dòng)子，各元件表現(xiàn)出能協(xié)同地或獨(dú)立地發(fā)揮激活轉(zhuǎn)錄的功能。在其它實(shí)施方案中，人巨細(xì)胞病毒(CMV)立即早期基因啟動(dòng)子、SV40早期啟動(dòng)子、勞氏肉瘤病毒長末端重復(fù)、大鼠胰島素啟動(dòng)子、RNApolIII啟動(dòng)子、和甘油醛-3-磷酸脫氫酶啟動(dòng)子可用于獲得感興趣多核苷酸的高水平表達(dá)。還涵蓋本領(lǐng)域公知的用于實(shí)現(xiàn)感興趣多核苷酸表達(dá)的其它病毒或哺乳動(dòng)物細(xì)胞或細(xì)菌噬菌體啟動(dòng)子的使用，只要表達(dá)水平對于給定目的是足夠的。通過采用具有公知特性的啟動(dòng)子，可優(yōu)化轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化后感興趣多核苷酸的表達(dá)水平和樣式。另外，響應(yīng)特定生理學(xué)信號(hào)而受到調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子的選擇能容許基因產(chǎn)物的誘導(dǎo)型表達(dá)。表1和表2列舉了在本發(fā)明的背景中可采用來調(diào)節(jié)感興趣基因表達(dá)的數(shù)種調(diào)節(jié)元件。此列表并非意圖是窮盡提高基因表達(dá)所涉及的所有可能的元件，但是僅僅是它們的例7J\ο增強(qiáng)子是提高來自位于同一DNA分子上不同位置處的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄的遺傳元件。增強(qiáng)子的組織與啟動(dòng)子很像。也就是說，它們由許多單獨(dú)的元件構(gòu)成，其中每個(gè)元件結(jié)合一種或多種轉(zhuǎn)錄蛋白。增強(qiáng)子與啟動(dòng)子之間的基本區(qū)別是運(yùn)作。增強(qiáng)子區(qū)作為整體必須能夠刺激遠(yuǎn)處的轉(zhuǎn)錄；而啟動(dòng)子區(qū)或其構(gòu)成元件不必如此。另一方面，啟動(dòng)子必須具有一種或多種指導(dǎo)特定位點(diǎn)處和特定取向的RNA合成啟動(dòng)的元件，而增強(qiáng)子缺少這些特異性。啟動(dòng)子和增強(qiáng)子常常是交疊的且毗鄰的，常常表現(xiàn)出具有非常相似地模塊組構(gòu)。下文是可以在表達(dá)構(gòu)建體中與編碼感興趣基因的核酸組合使用的病毒啟動(dòng)子、細(xì)胞啟動(dòng)子/增強(qiáng)子和誘導(dǎo)型啟動(dòng)子/增強(qiáng)子的列表(表1和表2)。另外，也可以使用任何啟動(dòng)子/增強(qiáng)子組合(按照真核啟動(dòng)子數(shù)據(jù)庫EPDB)來驅(qū)動(dòng)所述基因的表達(dá)。如果提供適宜的細(xì)菌聚合酶(或是作為遞送復(fù)合物的一部分或是作為另外的基因表達(dá)構(gòu)建體)的話，真核細(xì)胞能支持來自某些細(xì)菌啟動(dòng)子的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，編碼miR-29a-c或miR-29a-c拮抗劑的多核苷酸與成纖維細(xì)胞特異性啟動(dòng)子可操作連接。表1:啟動(dòng)子和/或增強(qiáng)子啟動(dòng)子/增強(qiáng)子參考文獻(xiàn)等，1980,1981;Tyndell等，1981;Dandolo等，1983;deVilliers等，1984;Hen等，1986;Satake等，1988;Campbell和A^Villarreal,1988逆轉(zhuǎn)錄病毒Kriegler等，1982，1983;Levinson等，1982;Kriegler等，1983，1984a,b，1988；Bosze等，1986;Miksicek等，1986;Celander等，1987;Thiesen等，1988;Celander等，1988;Choi等，1988;Reisman等，1989乳頭瘤病毒Campo等，1983;Lusky等，1983;Spandidos和/或Wilkie，1983;Spalholz等，1985;Lusky等，1986;Cripe等，1987;Gloss等，1987;Hirochika等，1987;Stephens等，1987乙肝病毒Bulla等，1986;Jameel等，1986;Shaul等，1987;Spandau等，1988;Vannice等，1988人免疫缺陷病毒Muesing等’1987;Hauber等，1988;Jakobovits等，1988;Feng等，1988;Takebe等，1988;Rosen等，1988;Berkhout等，1989;Laspia等，1989;Sharp等，1989;Braddock等，1989巨細(xì)胞病毒(CMV)Weber等，1984;Boshart等，1985;Foecking等，1986長臂猿白血病病毒Holbrook等，1987;Quinn等，1989在采用cDNA插入物的情況中，通常會(huì)希望包括聚腺苷酸化信號(hào)來實(shí)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄物的正確聚腺苷酸化。認(rèn)為聚腺苷酸化信號(hào)的本質(zhì)對于本發(fā)明的成功實(shí)施不是至關(guān)重要的，而且可采用任何此類序列，諸如人生長激素和SV40聚腺苷酸化信號(hào)。作為表達(dá)盒元件還涵蓋終止子。這些元件能用來增強(qiáng)信息水平和自該盒進(jìn)入其它序列的通讀最小化。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，含有本發(fā)明核酸構(gòu)建體的細(xì)胞可以在體外或在體內(nèi)通過在表達(dá)構(gòu)建體中包括標(biāo)志物來鑒定。此類標(biāo)志物會(huì)賦予細(xì)胞以可鑒定的變化，容許容易地鑒定含有表達(dá)構(gòu)建體的細(xì)胞。通常，包括藥物選擇標(biāo)志物有助于克隆和選擇轉(zhuǎn)化體，例如賦予針對新霉素、嘌呤霉素、潮霉素、DHFR、GPT、zeocin和組氨醇的抗性的基因是有用的選擇標(biāo)志?；蛘?，可采用酶，諸如單純皰疹病毒胸苷激酶(tk)或氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(CAT)。還能采用免疫學(xué)標(biāo)志物。認(rèn)為所采用的選擇標(biāo)志不是重要的，只要它能夠與編碼基因產(chǎn)物的核酸同時(shí)表達(dá)。選擇標(biāo)志的其它例子是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的。有多種方式可將表達(dá)載體導(dǎo)入細(xì)胞中。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體包含病毒或自病毒基因組衍生的工程改造的構(gòu)建體。某些病毒經(jīng)受體介導(dǎo)的胞吞進(jìn)入細(xì)胞、整合入宿主細(xì)胞基因組和穩(wěn)定且高效表達(dá)病毒基因的能力使得它們成為將外來基因轉(zhuǎn)移入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的誘人候選(Ridgeway,1988；Nicolas和Rubinstein，1988；Baichwal和Sugden,1986；Temin,1986)。用于體內(nèi)遞送的優(yōu)選方法之一涉及使用腺病毒表達(dá)載體?！跋俨《颈磉_(dá)載體”意圖包括那些含有足以(a)支持構(gòu)建體的包裝和(b)表達(dá)其中克隆的多核苷酸的腺病毒序列的構(gòu)建體。表達(dá)載體包含遺傳工程形式的腺病毒。關(guān)于腺病毒(一種36kB，線性，雙鏈DNA病毒)的遺傳組構(gòu)的知識(shí)容許用長達(dá)7kB的外來序列替代大段腺病毒DNA(Grunhaus和Horwitz,1992)。與逆轉(zhuǎn)錄病毒形成對比，宿主細(xì)胞的腺病毒感染不導(dǎo)致染色體整合，因?yàn)橄俨《綝NA能以附加體方式復(fù)制，沒有潛在的遺傳毒性。而且，腺病毒在結(jié)構(gòu)上是穩(wěn)定的，而且廣泛擴(kuò)增后沒有檢測到基因組重排。腺病毒能感染實(shí)際上所有上皮細(xì)胞，不管它們的細(xì)胞周期階段。腺病毒特別適合于用作基因轉(zhuǎn)移載體，因?yàn)樗兄械却笮〉幕蚪M、易于操作、滴度高、靶細(xì)胞范圍廣且感染性高。該病毒基因組的兩個(gè)末端都含有100-200個(gè)堿基對的反向重復(fù)(ITR)，它們是病毒DNA復(fù)制和包裝所必需的順式元件。在腺病毒載體是復(fù)制缺陷的或至少條件性缺陷的要求之外，認(rèn)為腺病毒載體的本質(zhì)對于本發(fā)明的成功實(shí)施不是至關(guān)重要的。所述腺病毒可以是42種不同的已知血清型或亞群A-F中的任一種。為了獲得供本發(fā)明中使用的條件性復(fù)制缺陷型腺病毒載體，亞群C的5型腺病毒是優(yōu)選的起始材料。這是因?yàn)?型腺病毒是人腺病毒，關(guān)于它知道極多的生化和遺傳信息，而且它在歷史上用于大多數(shù)采用腺病毒作為載體的構(gòu)建。如上所述，依照本發(fā)明的典型載體是復(fù)制缺陷的，而且不會(huì)具有腺病毒El區(qū)。如此，在消除El編碼序列的位置導(dǎo)入編碼感興趣基因的多核苷酸會(huì)是最方便的。然而，腺病毒序列內(nèi)插入構(gòu)建體的位置對于本發(fā)明不是至關(guān)重要的。也可以將編碼感興趣基因的多核苷酸插入E3置換型載體中，代替被刪除的E3區(qū)，如Karlsson等(1986)所述，或者在E4區(qū)中，在這種情況中輔助細(xì)胞系或輔助病毒補(bǔ)足E4缺陷。腺病毒載體已經(jīng)用于真核基因表達(dá)(Levrero等，1991;Gomez-Foix等，1992)和疫苗開發(fā)(Grunhaus和Horwitz,1992；Graham和Prevec,1991)。最近，動(dòng)物研究提示重組腺病毒可用于基因療法(Stratford-Perricaudet和Perricaudet，1991；Stratford-Perricaudet等，1990；Rich等，1993)。對不同組織施用重組腺病毒的研究包括氣管滴注(Rosenfeld等，1991；Rosenfeld等，1992)、肌肉注射(Ragot等，1993)、外周靜脈內(nèi)注射(Herz和Gerard，1993)和定向(stereotactic)接種入腦中(LeGalLaSalle等，1993)。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體也適合于在細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明的多核苷酸。逆轉(zhuǎn)錄病毒是以在受感染細(xì)胞中通過逆轉(zhuǎn)錄過程將它們的RNA轉(zhuǎn)變成雙鏈DNA的能力為特征的一組單鏈RNA病毒(Coffin，1990)。然后所得DNA穩(wěn)定整合入細(xì)胞染色體中，作為原病毒，并指導(dǎo)病毒蛋白質(zhì)的合成。所述整合導(dǎo)致病毒基因序列在受體細(xì)胞及其后代中的保持。逆轉(zhuǎn)錄病毒基因組含有分別編碼殼體蛋白、聚合酶、和包膜成分的三種基因，即gag、pol、和env。在gag基因上游找到的一段序列含有將基因組包裝入病毒體中的信號(hào)。在病毒基因組的5'和3'末端存在兩段長末端重復(fù)(LTR)序列。這些含有強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子序列，而且還是整合入宿主細(xì)胞基因組所需要的(Coffin，1990)。為了構(gòu)建逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，將編碼感興趣基因的核酸插入病毒基因組中，代替某些病毒序到，以生成復(fù)制缺陷型病毒。為了生成病毒體，構(gòu)建含有g(shù)ag、pol、和env基因但沒有LTR和包裝構(gòu)件的包裝細(xì)胞系(Marm等，1983)。當(dāng)含有cDNA以及逆轉(zhuǎn)錄病毒LTR和包裝序列的重組質(zhì)粒被導(dǎo)入此細(xì)胞系(例如通過磷酸鈣沉淀)時(shí)，包裝序列容許重組質(zhì)粒的RNA轉(zhuǎn)錄物被包裝入病毒顆粒中，然后分泌入培養(yǎng)物的培養(yǎng)基中(Nicolas和Rubenstein，1988；Temin,1986；Mann等，1983)。然后收集含有重組逆轉(zhuǎn)錄病毒的培養(yǎng)基，任選濃縮，并用于基因轉(zhuǎn)移。逆轉(zhuǎn)錄病毒載體能夠感染極其多種細(xì)胞類型。然而，整合和穩(wěn)定表達(dá)要求宿主細(xì)胞分裂(Paskind等，1975)?？刹捎闷渌《据d體作為本發(fā)明中的表達(dá)構(gòu)建體?？刹捎米灾T如牛痘病毒(Ridgeway,1988；Baichwal和Sugden,1986；Coupar等，1988)、腺伴隨病毒(AAV)(Ridgeway,1988；Baichwal禾口Sugden，1986；Hermonat禾口Muzycska，1984)禾口抱疫病毒等病毒衍生的載體。它們?yōu)楦鞣N哺乳動(dòng)物細(xì)胞提供數(shù)項(xiàng)誘人特征(Friedmarm，1989；Ridgeway,1988；Baichwal和Sugden，1986；Coupar等，1988；Horwich等，1990)。為了實(shí)現(xiàn)有義或反義基因構(gòu)建體的表達(dá)，必須將表達(dá)構(gòu)建體遞送入細(xì)胞中。此遞送可以在體外(像用于轉(zhuǎn)化細(xì)胞系的實(shí)驗(yàn)室規(guī)程中)或者在體內(nèi)或回體(像某些疾病狀態(tài)的治療中)實(shí)現(xiàn)。一種遞送機(jī)制是經(jīng)病毒感染，其中將表達(dá)構(gòu)建體包裹在感染性病毒顆粒的殼體中。本發(fā)明還涵蓋用于將表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入培養(yǎng)的哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的數(shù)種非病毒方法。這些包括磷酸鈣沉淀(Graham和VanDerEb,1973；Chen和Okayama，1987；Rippe等，1990)、DEAE-右旋糖苷(Gopal，1985)、電穿孔、(Tur-Kaspa等，1986；Potter等，1984)、直接顯微注射、(Harland和Weintraub，1985)、加載了DNA的脂質(zhì)體(NicolauandSene,1982；Fraley等，1979)和Lipofectamine-DNA復(fù)合物、細(xì)胞超聲處理(Fechheimer等，1987)、使用高速微彈進(jìn)行的基因轟擊(Yang等，1990)、和受體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染(Wu和Wu，1987；Wu和Wu，1988)。這些技術(shù)中的一些可成功適應(yīng)體內(nèi)或回體使用。一旦已經(jīng)將表達(dá)構(gòu)建體遞送入細(xì)胞中，編碼感興趣基因的核酸可以在不同部位定位和表達(dá)。在某些實(shí)施方案中，編碼基因的核酸可以穩(wěn)定整合入細(xì)胞的基因組中。此整合可以經(jīng)同源重組而處于相關(guān)定位和取向(基因替代)，或者它可以以隨機(jī)的、非特異性的位置整合(基因增強(qiáng))。在還有一些實(shí)施方案中，核酸可以作為分開的、附加型的DNA區(qū)段在細(xì)胞中穩(wěn)定維持。此類核酸區(qū)段“附加體”編碼足以容許不依賴宿主細(xì)胞周期地或與宿主細(xì)胞周期同步地維持和復(fù)制的序列。如何將表達(dá)構(gòu)建體遞送至細(xì)胞和核酸在細(xì)胞中保持在何處取決于所采用的表達(dá)構(gòu)建體的類型。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，表達(dá)構(gòu)建體可以僅僅由裸的重組DNA或質(zhì)粒組成。所述構(gòu)建體的轉(zhuǎn)移可以通過上文所述物理或化學(xué)透化細(xì)胞膜的任何方法來實(shí)施。這特別適用于體外轉(zhuǎn)移，但是它也可應(yīng)用于體內(nèi)使用。Dubensky等(1984)成功地以磷酸鈣沉淀物的形式將多瘤病毒DNA注射入成年和新生小鼠的肝和脾中，展現(xiàn)出活躍的病毒復(fù)制和急性感染。Benvenisty和Neshif(1986)也證明了直接腹膜內(nèi)注射磷酸鈣沉淀的質(zhì)粒導(dǎo)致所轉(zhuǎn)染基因的表達(dá)。也可以在體內(nèi)以相似方式轉(zhuǎn)移編碼感興趣基因的DNA并表達(dá)基因產(chǎn)物。在本發(fā)明的還有一個(gè)實(shí)施方案中，將裸的DNA表達(dá)構(gòu)建體轉(zhuǎn)移入細(xì)胞中可涉及顆粒轟擊。此方法依賴于將DNA包被的微彈加速至高速的能力，所述高速容許微彈穿透細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞，但不殺死它們(Klein等，1987)。已經(jīng)開發(fā)了數(shù)種用于加速小顆粒的裝置。一種這樣的裝置依賴于高壓放電來產(chǎn)生電流，該電流繼而提供原動(dòng)力(Yang等，1990)。所使用的微彈由生物學(xué)惰性物質(zhì)組成，諸如鎢或金珠。已經(jīng)在體內(nèi)轟擊了大鼠和小鼠的選定器官，包括肝、皮膚、和肌肉組織(Yang等，1990；Zelenin等，1991)。這可能要求手術(shù)暴露組織或細(xì)胞，以消除槍與靶器官之間的任何居間組織，即回體處理。再次，編碼特定基因的DNA可以經(jīng)此方法遞送，而且仍然收入本發(fā)明。在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施方案中，可以將表達(dá)構(gòu)建體封裝在脂質(zhì)體中。脂質(zhì)體是以磷脂雙層膜和內(nèi)部水介質(zhì)為特征的囊泡結(jié)構(gòu)。多層脂質(zhì)體具有多個(gè)由水介質(zhì)隔開的脂質(zhì)層。它們在將磷脂懸浮在過量的水溶液中時(shí)自發(fā)形成。脂質(zhì)成分在形成閉合的結(jié)構(gòu)之前經(jīng)歷自我重排并在脂質(zhì)雙層間封裝水和溶解的溶質(zhì)(Ghosh和Bachhawat，1991)。還涵蓋Lipofectamine-DNA復(fù)合物。體外脂質(zhì)體介導(dǎo)的核酸遞送和外來DNA表達(dá)已經(jīng)非常成功。Wong等，(1980)在培養(yǎng)的雞胚、HeLa和肝瘤細(xì)胞中證明了脂質(zhì)體介導(dǎo)的外來DNA遞送和表達(dá)的可行性。Nicolau等，(1987)在大鼠中在靜脈內(nèi)注射后實(shí)現(xiàn)了成功的脂質(zhì)體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。在本發(fā)明的某些實(shí)施方案中，可以將脂質(zhì)體與血細(xì)胞凝集病毒(HVJ)復(fù)合。這顯示出促進(jìn)與細(xì)胞膜的融和和提升脂質(zhì)體封裝的DNA進(jìn)入細(xì)胞(Kaneda等，1989)。在其它實(shí)施方案中，可以將脂質(zhì)體與細(xì)胞核中非組蛋白的染色體蛋白質(zhì)(HMG-I)復(fù)合或聯(lián)合采用(Kato等，1991)。在還有一些實(shí)施方案中，可以將脂質(zhì)體與HVJ和HMG-I二者復(fù)合或聯(lián)合采用。由于此類表達(dá)構(gòu)建體已經(jīng)成功用于體外和體內(nèi)核酸轉(zhuǎn)移和表達(dá)，所以它們適用于本發(fā)明。在DNA構(gòu)建體中采用細(xì)菌啟動(dòng)子的情況中，還會(huì)希望在脂質(zhì)體內(nèi)包括適宜的細(xì)菌聚合酶。其它能采用來將編碼特定基因的核酸遞送入細(xì)胞中的表達(dá)構(gòu)建體是受體介導(dǎo)的遞送媒介物。這些利用幾乎在所有真核細(xì)胞中的受體介導(dǎo)的胞吞對高分子的選擇性攝取。因?yàn)楦鞣N受體的細(xì)胞類型特異性分布，所以所述遞送會(huì)是高度特異性的(Wu和Wu，1993)。受體介導(dǎo)的基因靶向媒介物一般由兩種成分組成細(xì)胞受體特異性配體和DNA結(jié)合劑。數(shù)種配體已經(jīng)用于受體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移。最廣泛表征的配體是脫唾液酸血清類粘蛋白(ASOR)(Wu和Wu，1987)和運(yùn)鐵蛋白(Wagner等，1990)。最近，一種合成的擬糖蛋白(neoglycoprotein)(其與ASOR識(shí)別相同受體)已經(jīng)用作基因遞送媒介物(Ferkol等，1993；Perales等，1994)，而且表皮生長因子(EGF)也已經(jīng)用于將基因遞送至鱗癌細(xì)胞(Myers,EPO0273085)。在其它實(shí)施方案中，遞送媒介物可包含配體和脂質(zhì)體。例如，Nicolau等(1987)采用摻入脂質(zhì)體中的乳糖基-神經(jīng)酰胺(一種末端為半乳糖的脫唾液酸的神經(jīng)節(jié)苷脂)，并觀察到肝細(xì)胞對胰島素基因的攝取增加。如此，可行的是也可以通過多種受體-配體系統(tǒng)在有或無脂質(zhì)體的情況中將編碼特定基因的核酸特異性遞送入某細(xì)胞類型中。例如，表皮生長因子(EGF)可用作受體，用于介導(dǎo)將核酸遞送入展現(xiàn)出EGF受體上調(diào)的細(xì)胞中。甘露糖可用于靶向肝細(xì)胞上的甘露糖受體。而且，針對⑶5(CLL)、⑶22(淋巴瘤)、⑶25(T細(xì)胞白血病)和MAA(黑素瘤)的抗體能類似地用作靶向模塊。在一個(gè)具體的例子中，可以與陽離子脂質(zhì)組合地施用寡核苷酸。陽離子脂質(zhì)的例子包括但不限于Lipofectin、DOTMA,DOPE、和DOTAP。W0/0071096(通過述及明確收入本文)的公開文本記載了不同配制劑，諸如能有效用于基因療法的DOTAP膽固醇或膽固醇衍生物配制劑。其它公開文本也討論了不同脂質(zhì)或脂質(zhì)體配制劑，包括納米顆粒和施用方法；這些包括但不限于美國專利公開文本20030203865，20020150626，20030032615，和20040048787，通過述及明確收入本文，其程度為它們公開了施用和遞送核酸的配制劑和其它相關(guān)方面。用于形成顆粒的方法還記載于美國專利5，844，107，5，877，302，6，008，336，6，077，835，5，972，901，6，200，801，和5，972，900，那些方面通過述及而收入本文。在某些實(shí)施方案中，可以在回體(exvivo)條件下更容易地實(shí)施基因轉(zhuǎn)移。回體基因療法指自動(dòng)物分離細(xì)胞，在體外將核酸遞送入細(xì)胞中，然后將經(jīng)修飾的細(xì)胞返還入動(dòng)物中。這可涉及自動(dòng)物手術(shù)取出組織/器官或細(xì)胞和組織的原代培養(yǎng)。在本發(fā)明的一些實(shí)施方案中，希望抑制miR-29a-c的表達(dá)或活性以提高膠原沉積。例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)組織中的膠原沉積的方法，包括使所述組織接觸miR-29a-c的拮抗劑。miR-29a-c功能的拮抗劑或抑制劑可以是針對miR_29a、miR-29b和/或miR_29c。miRNA的功能可通過小RNA拮抗劑的施用來抑制。最初由Krutzfeldt及其同事(Krutzfeldt等，2005)記載，“小RNA拮抗劑”指單鏈的、經(jīng)化學(xué)修飾的、至少部分與miRNA序列互補(bǔ)的核糖核苷酸。小RNA拮抗劑會(huì)含有一個(gè)或多個(gè)經(jīng)修飾的核苷酸，諸如2'-0-甲基_糖修飾。在一些實(shí)施方案中，小RNA拮抗劑僅包含經(jīng)修飾的核苷酸。小RNA拮抗劑也可包含一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯連接，導(dǎo)致部分或完全是硫代磷酸酯的主鏈。為了促進(jìn)體內(nèi)遞送和穩(wěn)定性，可以在其3'端將小RNA拮抗劑連接至膽固醇模塊。適合于抑制miRNA的小RNA拮抗劑可以長約15個(gè)至約50個(gè)核苷酸，更優(yōu)選長約18個(gè)至約30個(gè)核苷酸，且最優(yōu)選長約20個(gè)至約25個(gè)核苷酸?！安糠只パa(bǔ)”指某序列與靶多核苷酸序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)。小RNA拮抗劑可以與成熟miRNA序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，小RNA拮抗劑可以與成熟miRNA序列基本上互補(bǔ)，也就是與靶多核苷酸序列至少約95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)。在其它實(shí)施方案中，小RNA拮抗劑與成熟miRNA序列100%互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-29a-c拮抗劑是小RNA拮抗劑。小RNA拮抗劑可包含與miR-29a、miR-29b、或miR-29c的成熟miRNA序列至少部分互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小RNA拮抗劑包含與序列SEQIDNO18,SEQIDN0:19、或SEQIDN0:20至少部分互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，小RNA拮抗劑包含與SEQIDNO18、SEQIDNo:19、或SEQIDNO:20100%互補(bǔ)的序列。對微小RNA功能的抑制也可以通過施用靶向成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列的反義寡核苷酸來實(shí)現(xiàn)。所述反義寡核苷酸可以是核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。優(yōu)選的是，所述反義寡核苷酸具有至少一處化學(xué)修飾。反義寡核苷酸可以包含一個(gè)或多個(gè)“鎖定核酸(lockednucleicacid)”。“鎖定核酸”(LNA)指經(jīng)修飾核糖核苷酸，它在核糖糖模塊的2'和4'碳之間含有額外橋接，導(dǎo)致賦予含有LNA的寡核苷酸以增強(qiáng)的熱穩(wěn)定性的“鎖定”構(gòu)象?；蛘?，所述反義寡核苷酸可包含肽核酸(PNA)，其含有基于肽的主鏈，而非糖-磷酸酯主鏈。反義寡核苷酸可含有的其它化學(xué)修飾包括但不限于糖修飾，諸如2'-0-烴基(alkyl)(例如2'_0_甲基、2'-0-甲氧乙基)、2'-氟、和4'-硫修飾，及主鏈修飾，諸如一個(gè)或多個(gè)硫代磷酸酯、嗎啉代、或膦羧酸酯(phosphonocarboxylate)連接(參加例如美國專利No.6，693，187和7，067，641，通過述及而完整收入本文)。在一些實(shí)施方案中，合適的反義寡核苷酸是2'-0-甲氧乙基“缺口聚物”(gapmer)，其在5'和3'端都含有2'-0-甲氧乙基修飾的核糖核苷酸，且中央有至少十個(gè)脫氧核糖核苷酸。這些“缺口聚物”能夠觸發(fā)RNA酶H依賴性的對RNA靶物的降解機(jī)制。增強(qiáng)穩(wěn)定性和提高功效的對反義寡核苷酸的其它修飾(諸如美國專利No.6，838，283中記載的那些，通過述及而完整收入本文)是本領(lǐng)域已知的，而且適合于在本發(fā)明的方法中使用。對抑制微小RNA的活性有用的優(yōu)選反義寡核苷酸長約19個(gè)至約25個(gè)核苷酸。反義寡核苷酸可包含至少部分與成熟miRNA序列互補(bǔ)的序列，例如與成熟miRNA序列至少約75%,80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%、或99%互補(bǔ)。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸可以與成熟miRNA序列基本上互補(bǔ)，也就是與靶多核苷酸序列至少約95%、96%、97%、98%、或99%互補(bǔ)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸包含與成熟miRNA序列100%互補(bǔ)的序列。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，miR-29a-c拮抗劑是經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸。所述經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸可包含與miR-29a、miR-29b、或miR-29c的成熟miRNA序列至少部分互補(bǔ)的序列。在又一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸包含與序列SEQIDNO18,SEQIDN0:19、或SEQIDNO:20至少部分互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述經(jīng)化學(xué)修飾的反義寡核苷酸包含與SEQIDN0:18、SEQIDN0:19、或SEQIDNO:20100%互補(bǔ)的序列。反義寡核苷酸可包含與miR-29a_c的前體miRNA序列(pre_miRNA)基本上互補(bǔ)的序列。在一些實(shí)施方案中，所述反義寡核苷酸包含與位于pre-miR-29a、pre-miR-29b、或pre-miR-29c序列的莖環(huán)區(qū)以外的序列基本上互補(bǔ)的序列。用于抑制miR-29a-c的功能的另一種辦法是施用與成熟miR_29a、miR_29b和miR-29c序列具有至少部分序列同一性的抑制性RNA分子。所述抑制性RNA分子可以是雙鏈小干擾RNA(siRNA)或包含莖環(huán)結(jié)構(gòu)的短發(fā)夾RNA分子(shRNA)。所述抑制性RNA分子的雙鏈區(qū)可包含與成熟miRNA序列至少部分相同，例如約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同的序列。在一些實(shí)施方案中，所述抑制性RNA的雙鏈區(qū)包含與成熟miRNA序列至少基本上相同的序列?！盎旧舷嗤敝改承蛄信c靶多核苷酸序列至少約95%、96%、97%、98%、或99%相同。在其它實(shí)施方案中，所述抑制性RNA分子的雙鏈區(qū)可以與靶miRNA序列100%相同。在一個(gè)實(shí)施方案中，miR-29a-c的拮抗劑是包含雙鏈區(qū)的抑制性RNA分子，其中所述雙鏈區(qū)包含與成熟miR-29a(SEQIDNO:18)、miR_29b(SEQIDNO:19)、或miR_29c(SEQIDNO20)序列具有100%同一性的序列。在一些實(shí)施方案中，miR-29a-c的拮抗劑是包含雙鏈區(qū)的抑制性RNA分子，其中所述雙鏈區(qū)包含與成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列具有至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%同一性的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，抑制性RNA分子可以是核酶。核酶指水解RNA分子之磷酸二酯鍵的催化性RNA。核酶可以設(shè)計(jì)成靶向miR-29a、miR_29b、和miR_29c中的一種或多種，導(dǎo)致它們的水解。在某些實(shí)施方案中，采用表達(dá)載體來表達(dá)miR-29a-c的拮抗劑(例如小RNA拮抗劑、反義寡核苷酸、和抑制性RNA分子)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)miR-29a-c拮抗劑的表達(dá)載體包含與編碼反義寡核苷酸的多核苷酸可操作連接的啟動(dòng)子，其中所表達(dá)的反義寡核苷酸的序列與成熟miR-29a、miR_29b、或miR-29c序列至少部分互補(bǔ)。在又一個(gè)實(shí)施方案中，用于表達(dá)miR-29a-c抑制劑的表達(dá)載體包含與編碼shRNA或siRNA的多核苷酸可操作連接的一個(gè)或多個(gè)啟動(dòng)子，其中所表達(dá)的shRNA或siRNA包含與成熟miR-29a、miR-29b、或miR-29c序列相同、部分相同、或基本上相同的序列?！安糠窒嗤敝改承蛄信c靶多核苷酸序列至少約75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、或99%相同?！盎旧舷嗤敝改承蛄信c靶多核苷酸序列至少約95%、96%、97%、98%、或99%相同。心血管病癥背景中的心臟肥大的當(dāng)前醫(yī)學(xué)管理包括使用至少兩種類型的藥物腎素-血管緊張素系統(tǒng)的抑制劑，和β_腎上腺素能阻斷劑(Bristow，1999)。用于治療心力衰竭背景中的病理性肥大的治療劑包括血管緊張素II轉(zhuǎn)化酶(ACE)抑制劑和腎上腺素能受體阻斷劑(Eichhom和Bristow，1996)。已經(jīng)公開的用于治療心臟肥大的其它藥劑包括血管緊張素II受體拮抗劑(美國專利5，604，251)和神經(jīng)肽Y拮抗劑(W098/33791)。不管當(dāng)前可得的藥用化合物，對心臟肥大和后續(xù)心力衰竭的預(yù)防和治療繼續(xù)呈現(xiàn)治療考驗(yàn)。非藥理學(xué)治療主要作為藥理學(xué)治療的輔助方法使用。非藥理學(xué)治療的一種手段涉及減少飲食中的鈉。另外，非藥理學(xué)治療還需要消除某些沉淀性藥物，包括負(fù)性肌力藥(例如某些鈣通道阻滯劑和抗心率不齊藥像丙吡胺(disopyramide))、心臟毒素(例如安非他明(amphetamine)、和血容量擴(kuò)充藥(plasmavolumeexpander)(例如非類固醇抗炎藥和糖皮質(zhì)激素)。本發(fā)明提供了在有所需要的受試者中治療心臟纖維化、心臟肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定具有心臟纖維化、心臟肥大或心力衰竭的受試者；并對所述受試者施用miR-29表達(dá)或功能的激動(dòng)劑。優(yōu)選的是，miR-29激動(dòng)劑的施用導(dǎo)致受試者中病理性心臟纖維化、肥大或心力衰竭的一種或多種癥狀的改善，或心臟肥大轉(zhuǎn)變成心力衰竭延遲。所述一種或多種得到改善的癥狀可以是提高的運(yùn)動(dòng)能力、升高的心臟射血體積、降低的左心室舒張末期壓、降低的肺毛細(xì)血管楔壓、升高的心輸出量或心指數(shù)、降低的肺動(dòng)脈壓、降低的左心室收縮和舒張末期內(nèi)徑、降低的心臟纖維化、降低的膠原在心臟肌肉中的沉積、降低的左和右心室壁壓、降低的壁張力、提高的生命質(zhì)量、和降低的疾病相關(guān)發(fā)病率或死亡率。另外，miR-29a-c激動(dòng)劑的使用可直接或間接預(yù)防心臟肥大及其相關(guān)癥狀發(fā)生。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在有所需要的受試者中預(yù)防病理性肥大或心力衰竭的方法，包括鑒定有風(fēng)險(xiǎn)發(fā)生病理性心臟肥大或心力衰竭的受試者；并提高所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。心臟細(xì)胞包括心臟肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、和任何其它在正常情況中在心臟組織中找到的細(xì)胞類型。miR-29a-c激動(dòng)劑可以是miR-29a、miR-29b和/或miR-29c的激動(dòng)劑。有風(fēng)險(xiǎn)的受試者可展現(xiàn)出風(fēng)險(xiǎn)因素列表中的一種或多種，包括心臟纖維化、低miR-29表達(dá)、長期存在的不受控制的高血壓、未矯正的瓣膜病、慢性心絞痛、近期的心肌梗死、對心臟病的先天性素因和/或病理性肥大、和/或可以診斷為具有對心臟肥大的遺傳素因和/或可具有心臟肥大的家族史。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了在有所需要的受試者中治療心肌梗死的方法，包括提高所述受試者心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在有所需要的受試者中預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張性心肌病的方法，包括提高所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在有所需要的受試者中抑制心臟肥大進(jìn)展的方法，包括提高所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。另一個(gè)實(shí)施方案是在具有心力衰竭或心臟肥大的受試者中提高運(yùn)動(dòng)耐量的方法，包括提高所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。另一個(gè)實(shí)施方案是在具有心力衰竭或心臟肥大的受試者中減少住院治療的方法，包括提高所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了在具有心力衰竭或心臟肥大的受試者中提高生命質(zhì)量和降低發(fā)病率或死亡率的方法，包括提高所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。治療方案會(huì)隨臨床情形而變化。然而，長期維持在大多數(shù)情形中會(huì)是適宜的。可能還希望間歇地用miR-29a-c的激動(dòng)劑治療肥大，諸如在疾病進(jìn)展期間的短暫窗口內(nèi)。另外，miR-29家族涉及對心臟纖維化的調(diào)節(jié)。由于此miR家族在成纖維細(xì)胞中與在肌細(xì)胞中相比更富集，因此有可能的是肌細(xì)胞分泌一種因子，可能是BNP，其上調(diào)成纖維細(xì)胞中的miR-29家族，并如此針對心臟纖維化的形成提供保護(hù)。此因子在miR-208K0小鼠中很高，與miR-29a-c的上調(diào)和纖維化的遏制有關(guān)聯(lián)。miR-29a-c水平在普通心臟病中升高，這有可能是限制膠原沉積的一種保護(hù)效應(yīng)。如此，涵蓋miR-29a-c及其激動(dòng)劑在遏制心臟纖維化和心臟組織中的膠原沉積中的具體用途。同樣，激活miR-29家族的相應(yīng)機(jī)制可應(yīng)用于骨骼肌纖維化。miR-29a-c調(diào)節(jié)多種細(xì)胞外基質(zhì)基因的表達(dá)，諸如微纖維蛋白1(FBNl)、膠原I型α1(COLlAl)、膠原I型α2(C0L1A2)、和膠原III型α1(C0L3A1)(見實(shí)施例4)。因而，本發(fā)明還提供了調(diào)節(jié)細(xì)胞中的一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)基因的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使細(xì)胞接觸miR-29a-c的激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使細(xì)胞接觸miR-29a-c的拮抗劑。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)基因包括微纖維蛋白1(FBm)、膠原I型α1(COLlAl)、膠原I型a2(C0LlA2)、和膠原III型a1(C0L3A1)。在一些實(shí)施方案中，所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)基因在細(xì)胞接觸miR-29a-c拮抗劑后上調(diào)。在其它實(shí)施方案中，所述一種或多種細(xì)胞外基質(zhì)基因在細(xì)胞接觸miR-29a-c激動(dòng)劑后下調(diào)。發(fā)明人證明了miR-29a-c表達(dá)在暴露于TGF0的心臟成纖維細(xì)胞中降低，提示心肌梗死后的miR-29a-c降低可能受TGFii調(diào)節(jié)(實(shí)施例5)。有趣的是，利鈉肽(像B型利鈉肽(BNP))顯示出抑制與纖維化和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變有關(guān)的受TGFβ調(diào)節(jié)的基因表達(dá)(Kapoun等，2004)。在這點(diǎn)上，發(fā)明人先前報(bào)告了心臟特異性miRNAmiR-208缺失的小鼠對心臟纖維化和重塑有抗性且在基線時(shí)展現(xiàn)出升高的BNP表達(dá)(vanRooij等，2007)。由于已知BNP拮抗TGFβ的效果，因此發(fā)明人提出這些小鼠中升高的BNP水平可能增強(qiáng)miR-29a-c的表達(dá)。確實(shí)，在消除miR-208后觀察到miR-29a-c表達(dá)的劑量依賴性升高，與BNP表達(dá)水平升高一致(實(shí)施例5)。這些數(shù)據(jù)指示TGFii誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞中膠原相關(guān)基因的表達(dá)，這至少部分經(jīng)由降低miR-29a-c水平來進(jìn)行，而miR-29a_c能通過由心肌細(xì)胞分泌的BNP來抑制。如此，本發(fā)明提供了通過施用至少一種TGFii抑制劑在受試者中提高miR-29a-c表達(dá)和/或活性的方法。TGFii抑制劑可包括抑制TGFβ活性的抗TGFβ抗體、TGFβ反義分CN101883576A說明書22/55頁子、和小分子，如美國專利No.6，509，318中所記載的，通過述及完整收入本文。TGFi^抑制劑還可與miR-29a-c激動(dòng)劑聯(lián)合使用，作為組合療法用于在受試者中治療心臟纖維化、心臟肥大、或心力衰竭。TGFii抑制劑還可與miR-29a-c激動(dòng)劑共施用，用以在受試者中治療或預(yù)防組織纖維化。除了在控制心臟中的纖維化中發(fā)揮重要作用之外，miR-29家族的遍在表達(dá)提示它還可能在其它纖維變性適應(yīng)癥中發(fā)揮作用，諸如那些涉及腎、肝和肺的。還觀察到糖尿病繼發(fā)的纖維化。1型和2型糖尿病患者處于升高的心肌病風(fēng)險(xiǎn)。糖尿病中的心肌病與一簇特征有關(guān)，包括降低的舒張順應(yīng)(diastoliccompliance)、間質(zhì)纖維化、和肌細(xì)胞肥大。本發(fā)明還提供了在受試者治療或預(yù)防組織纖維化的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括鑒定具有組織纖維化或有組織纖維化風(fēng)險(xiǎn)的受試者；并提高所述受試者的骨骼肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中的miR-29a-c的表達(dá)和/或活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織纖維化是心臟纖維化、硬皮病(局限性的或系統(tǒng)性的)、骨骼肌纖維化、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、或糖尿病纖維化。在一些實(shí)施方案中，提高miR-29a-c的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用miR-29a-c的激動(dòng)劑。在其它實(shí)施方案中，提高miR-29a-c的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用編碼miR-29a-c的表達(dá)載體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括給所述受試者施用非miR-29a-c纖維變性療法。本發(fā)明涵蓋在有所需要的受試者中治療與一種或多種疾患或病癥有關(guān)的組織纖維化的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給所述受試者施用miR-29a-c的激動(dòng)劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括給所述受試者施用編碼miR-29a-c的表達(dá)載體。所述與組織纖維化有關(guān)的一種或多種疾患或病癥可包括但不限于先天性肝纖維化(CHF)；腎小管間質(zhì)性纖維化；與自身免疫性病癥(例如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、狼瘡和結(jié)節(jié)病)有關(guān)的肺纖維化；與糖尿病心肌病有關(guān)的間質(zhì)纖維化；與肌肉營養(yǎng)不良(例如貝克肌營養(yǎng)不良和迪謝內(nèi)肌營養(yǎng)不良)有關(guān)的骨骼肌纖維化、去神經(jīng)萎縮、和神經(jīng)肌肉疾病(例如急性多神經(jīng)炎、脊髓灰質(zhì)炎、Werdig/Hoffman病、肌萎縮側(cè)索硬化、和進(jìn)行性延髓萎縮疾病)。本發(fā)明還涵蓋治療以膠原流失、缺失、或生成不足為特征的病理/缺陷的方法。使用miR-29a-c的拮抗劑，能提高膠原的表達(dá)用以在有需要的部位替換流失的膠原或補(bǔ)充現(xiàn)有的膠原。如此，本發(fā)明提供了誘導(dǎo)組織中的膠原沉積的方法，包括使所述組織接觸miR-29a-c的拮抗劑。所述拮抗劑可以針對miR_29a、miR_29b和/或miR_29c。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述拮抗劑包含與SEQIDNO:18互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述拮抗劑包含與SEQIDN0:19互補(bǔ)的序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述拮抗劑包含與SEQIDNO:20互補(bǔ)的序列。所述拮抗劑可以是miR-29a-c的小RNA拮抗劑、靶向成熟miR-29a-c序列的反義寡核苷酸、或包含與成熟miR-29a-c序列相同的序列的抑制性RNA分子(諸如siRNA或shRNA)、核酶或任何其它抑制性核酸。所述拮抗劑可以連接或偶聯(lián)有促進(jìn)所述拮抗劑進(jìn)入細(xì)胞或組織的藥劑。提高膠原沉積會(huì)是有益的且能通過施用miR-29a-c拮抗劑來治療的各種疾患和病癥包括但不限于埃勒斯-當(dāng)洛綜合征(EDS)；維生素C缺乏病(也稱作壞血病)；皮膚老化(例如自然老化和由于曬傷的光老化)；和拉伸紋(stretchmark)(細(xì)溝(striae))0埃勒斯-當(dāng)洛綜合征(EDS)是一組由膠原合成缺陷引起的、影響人類和家畜的罕見遺傳病癥。根據(jù)個(gè)體突變，疾病的嚴(yán)重程度可以自輕度至危及生命而變化。ADAMTS2、COLIA1、C0L1A2、C0L3A1、C0L5A1、C0L5A2、PLOD1和TNXB基因中的突變引起EDS。這些基因中的突變通常改變膠原的或與膠原相互作用的蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)、生成、或加工。膠原缺陷能削弱皮膚、骨骼、血管、和器官中的結(jié)締組織，導(dǎo)致病癥的特征。如此，由本發(fā)明的miR-29a-c拮抗劑誘導(dǎo)的膠原沉積會(huì)起補(bǔ)充EDS患者中的正常膠原水平和減輕疾病癥狀的作用。類似地，施用miR-29a-c的拮抗劑會(huì)有益于罹患維生素C缺乏病或壞血病的受試者。維生素C缺乏病是一種源自維生素C攝取不足的疾病，而維生素C是人類中正常膠原合成所需要的。組織中源自miR-29a-c拮抗劑施用的膠原沉積還會(huì)在各種化妝品應(yīng)用中有用。由自然老化過程或過度暴露于陽光所致光損傷產(chǎn)生的皮膚老化的效果能通過給有所需要的受試者施用miR-29a-c拮抗劑來降低。施用miR-29a-c拮抗劑還可促進(jìn)拉伸紋的消失。拉伸紋是皮膚上由真皮撕裂引起的一種瘢痕形成形式。拉伸紋是與快速生長(青春期常見)或體重增加(例如妊娠)有關(guān)的皮膚快速拉伸的結(jié)果。本發(fā)明的方法可應(yīng)用的組織包括面部組織，諸如額組織、唇、頰、頦、眉、眼瞼、眼下、或口附近、手組織、頸組織、臂組織、腿組織、胃組織或乳房組織。在一些實(shí)施方案中，所述組織可包含傷口、皮膚移植物、瘢痕組織、皺紋、皮膚松垂、曬傷、化學(xué)損傷、燙傷、凍傷、和/或拉伸紋。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，使組織接觸miR-29a-c拮抗劑包括注射入所述組織中、注射入供應(yīng)所述組織的脈管系統(tǒng)中、或局部應(yīng)用。局部應(yīng)用可以是軟膏劑、乳膏、凝膠、油膏劑、或香膏。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使用壓迫繃帶或裹覆物(dressing)0可以使miR-29a-c拮抗劑接觸所述組織超過一次。在一些實(shí)施方案中，拮抗劑接觸所述組織2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100次。在其它實(shí)施方案中，拮抗劑接觸所述組織超過2、3、4、5、或6天，1、2、3、或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)月，或1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25年。在還有一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括使所述組織接觸第二藥劑。所述第二藥劑可包括但不限于局部維生素A、局部維生素C、或維生素E。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括對所述組織進(jìn)行第二處理。所述第二處理可包括化學(xué)脫皮、激光處理、皮膚整平、或皮膚磨削術(shù)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述組織在罹患埃勒斯-當(dāng)洛綜合征或維生素C缺乏病的受試者中。本發(fā)明還涵蓋miR-29a-c拮抗劑作為促纖維變性劑用于將脈管系統(tǒng)中的軟斑轉(zhuǎn)變成纖維變性組織以預(yù)防心肌梗死的用途。軟斑是位于動(dòng)脈壁的內(nèi)皮襯里下面、主要含有膽固醇的脂質(zhì)的構(gòu)造。最近，認(rèn)識(shí)到這些軟斑傾向于破裂，導(dǎo)致血凝塊的形成，其能潛在地阻斷通過該動(dòng)脈的血流并引起心臟病發(fā)作(即心肌梗死)。正是這些軟斑常常負(fù)責(zé)引起沒有癥狀的健康受試者遭受表面上出乎意料的心臟病發(fā)作。軟斑破裂后，血管壁愈合而軟斑變成硬斑，這罕見地引起進(jìn)一步的問題。如此，使軟斑轉(zhuǎn)變成纖維變性組織的策略會(huì)預(yù)防軟斑破裂且可能誘發(fā)的心肌梗死。正如上文詳細(xì)描述的，對miR-29a-c的抑制導(dǎo)致膠原沉積的和纖維變性組織形成的增加。因而，本發(fā)明提供了用于增加血管壁中的纖維變性組織形成的方法，包括將miR-29a-c的拮抗劑遞送至血管壁中的一個(gè)或多個(gè)軟斑部位，其中在遞送所述miR-29a-c拮抗劑后，所述軟斑轉(zhuǎn)變成纖維變性組織。軟斑可以通過本領(lǐng)域已知方法來鑒定，包括但不限于血管內(nèi)超聲和計(jì)算機(jī)斷層照相術(shù)(Sahara等(2004)EuropeanHeartJournal,Vol.252026-2033；Budhoff(2006)J.Am.Coll.Cardiol,Vol.48:319_321；Hausleiter等(2006)J.Am.Coll.Cardiol,Vol.48:312_318)。本文所述任何miR-29a_c拮抗劑適合于在所述方法中使用?？梢酝ㄟ^直接注射或通過使用導(dǎo)管或分離冠狀循環(huán)的裝置將miR-29a-c拮抗劑遞送至一個(gè)或多個(gè)軟斑部位。在一個(gè)實(shí)施方案中，通過血管手術(shù)中使用的醫(yī)學(xué)裝置(諸如支架或球囊)將miR-29a-c拮抗劑遞送至一個(gè)或多個(gè)軟斑部位。可以將miR-29拮抗劑包被在金屬支架上以形成藥物洗脫支架。藥物洗脫支架是保持變窄的或患病的動(dòng)脈開放并釋放化合物以預(yù)防細(xì)胞增殖和/或炎癥的支架?？梢詫iR-29a-c拮抗劑應(yīng)用至埋藏在薄聚合物中的金屬支架以隨時(shí)間釋放miR-29a-c。用治療性化合物包被支架的方法是本領(lǐng)域已知的。參加例如美國專利No.7，144，422；美國專利No.7，055，237；和WO2004/004602，通過述及完整收入本文。在一些實(shí)施方案中，miR-29a-c可以與其它抗再狹窄化合物組合使用以生成用于摻入藥物洗脫支架和球囊中的配制劑。適合與miR-29a-c拮抗劑組合使用的化合物包括但不限于帕利他塞(paclitaxel)、雷帕霉素(rapamycin)(西羅莫司(sirolimus))、他克莫司(tacrolimus)、唑他莫司(zotarolimus)、依維莫司(everolimus)、多西他塞(docetaxel)、吡美莫司(pimecrolimus)、及其衍生物。本發(fā)明還涵蓋用于在治療后清除或消除miR-29a-c激動(dòng)劑的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述方法包括使用成纖維細(xì)胞特異性啟動(dòng)子在成纖維細(xì)胞中過表達(dá)miR-29a-c的結(jié)合位點(diǎn)區(qū)。所述結(jié)合位點(diǎn)區(qū)優(yōu)選含有miR-29a-c的種子區(qū)的序列。在一些實(shí)施方案中，所述結(jié)合位點(diǎn)可含有來自miR-29a-c的一種或多種靶物3'UTR的序列，諸如C0L1A1、C0L1A2、C0L1A3和/或FBm。在另一個(gè)實(shí)施方案中，可以在miR-29a-c激動(dòng)劑之后施用miR-29a_c拮抗劑以削弱或終止微小RNA的功能。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了用于在治療后清除或消除miR-29a-c拮抗劑的方法。所述方法可包括在施用了miR-29a-c拮抗劑的成纖維細(xì)胞或其它組織中過表達(dá)miR-20a-c拮抗劑的結(jié)合位點(diǎn)。組合療法在另一個(gè)實(shí)施方案中，與其它用于治療心臟肥大、心力衰竭和心肌梗死的治療形態(tài)組合地使用miR-29a-c的激動(dòng)劑。如此，還可以給受試者提供與miR-29a-c激動(dòng)劑組合的更多“標(biāo)準(zhǔn)”制藥學(xué)心臟療法。其它療法的例子包括但不限于所謂的“β"阻滯劑”、抗高血壓藥、強(qiáng)心藥、抗血栓藥、血管擴(kuò)張藥、激素拮抗劑、肌力藥(iontrope)、利尿藥、內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑、鈣通道阻滯劑、磷酸二酯酶抑制劑、ACE抑制劑、血管緊張素2型拮抗劑和細(xì)胞因子阻滯劑/抑制劑、和HDAC抑制劑?？梢匀缦聦?shí)現(xiàn)組合，即使心臟細(xì)胞接觸包括miR-29a-c的激動(dòng)劑和標(biāo)準(zhǔn)藥劑的單一組合物或藥理學(xué)配制劑，或者使細(xì)胞同時(shí)接觸兩種不同組合物或配制劑，其中一種組合物包括miR-29a-c的激動(dòng)劑，而另一種包括標(biāo)準(zhǔn)藥劑?；蛘撸鍪褂胢iR-29a-c激動(dòng)劑的療法可以在另一藥劑的施用之前或之后，間隔范圍為數(shù)分鐘至數(shù)周。在分開對細(xì)胞應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)藥劑和miR-29a-c激動(dòng)劑的實(shí)施方案中，一般會(huì)確保每次遞送的時(shí)間之間沒有經(jīng)過顯著的一段時(shí)間，使得所述藥劑和miR-29a-c激動(dòng)劑會(huì)仍然能夠有利地對細(xì)胞發(fā)揮組合效應(yīng)。在此類情況中，通常會(huì)使細(xì)胞在相距約12-24小時(shí)、更優(yōu)選在相距約6-12小時(shí)內(nèi)接觸兩種形態(tài)，延遲時(shí)間最優(yōu)選只有約12小時(shí)。然而，在一些情況中，可能希望顯著延長治療時(shí)間段，其中各施用間經(jīng)過數(shù)天(2、3、4、5、6或7)至數(shù)周(1、2、3、4、5、6、7或8)。也想得到的是會(huì)希望超過一次地施用miR-29a-c激動(dòng)劑、或另一藥劑。在這點(diǎn)上，可以采用各種組合。舉例而言，在miR-29a-c激動(dòng)劑為“A”而另一藥劑為“B”的情況中，下列基于總共3次和4次施用的排列是例示性的Α/Β/ΑΒ/Α/ΒΒ/Β/ΑΑ/Α/ΒΒ/Α/ΑΑ/Β/ΒΒ/Β/Β/ΑB/B/A/BΑ/Α/Β/ΒΑ/Β/Α/ΒΑ/Β/Β/ΑΒ/Β/Α/ΑΒ/Α/Β/ΑΒ/Α/Α/ΒB/B/B/AΑ/Α/Α/ΒΒ/Α/Α/ΑΑ/Β/Α/ΑΑ/Α/Β/ΑΑ/Β/Β/ΒΒ/Α/Β/ΒB/B/A/B同樣涵蓋其它組口O藥理學(xué)治療劑和施用方法、劑量、等是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(參加例如((PhysiciansDeskReference〉〉、Klaassen的((ThePharmacologicalBasisofTherapeutics》、《Remington'sPharmaceuticalSciences》、禾口《TheMerckIndex》第11版，通過述及將相關(guān)部分收入本文)，而且可以根據(jù)本文中的公開內(nèi)容與本發(fā)明組合。取決于所治療的受試者的狀況，劑量必然會(huì)發(fā)生一些變化。在任何情況中負(fù)責(zé)施用的人會(huì)為各受試者決定適宜的劑量，而且此類個(gè)體決定在本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的技術(shù)范圍內(nèi)?？梢栽诒景l(fā)明中使用的藥理學(xué)治療劑的非限制性例子包括抗高脂蛋白藥、抗動(dòng)脈硬化藥、抗血栓藥/溶纖維蛋白藥、凝血藥、抗心率不齊藥、抗高血壓藥、血管加壓藥、用于充血性心力衰竭的治療劑、抗心絞痛藥、抗菌劑或其組合。另外，應(yīng)當(dāng)注意，可以使用任何下述各項(xiàng)來開發(fā)心臟療法靶基因的新集合，正如本例中使用阻滯劑(見下文)。雖然預(yù)期這些基因中許多可能有交疊，但是有可能能開發(fā)出新的基因靶。在某些實(shí)施方案中，可以將降低一種或多種血脂和/或脂蛋白的濃度的藥劑(在本文中稱作“抗高脂蛋白藥”)的施用與依照本發(fā)明的心血管療法組合，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化和血管組織的增厚或阻斷的治療中。在某些實(shí)施方案中，抗高脂蛋白藥可包含芳氧鏈烷酸/纖維酸衍生物、樹脂/膽汁酸隱蔽劑(sequesterant)、HMGCoA還原酶抑制劑、煙酸衍生物、甲狀腺激素或甲狀腺激素類似物、混雜劑或其組合。芳氧鏈烷酸/纖維酸衍生物的非限制性例子包括芐氯貝特(beclobrate)、enzafibrate、比尼貝特(binifibrate)、環(huán)丙貝特(ciprofibrate)、克禾Ij貝特(clinofibrate)、氯貝特(clofibrate)(安妥明(atromide)-S)、氯貝酸(clofibricacid)、依托貝特(etofibrate)、非諾貝特(fenofibrate)、吉非貝齊(gemfibrozil)(Iobid)、尼可貝特(nicofibrate)、卩比貝特(pirifibrate)、氯煙貝特(ronifibrate)、雙貝特(simfibrate)和益多酯(theofibrate)。樹脂/膽汁酸隱蔽劑的非限制性例子包括考來烯胺(cholestyramine)(cholybar、questran)、考來替泊(colestipol)(colestid)禾口降膽葡胺(polidexide)。HMGCoA還原酶抑制劑的非限制性例子包括洛伐他汀(lovastatin)(美降脂(mevacor))、普伐他汀(pravastatin)(pravochol)或辛伐他汀(simvastatin)(zocor)。煙酸衍生物的非限制性例子包括煙酸、ac印imox、戊四煙酯(niceritrol)、尼可氯酉旨(nicoclonate)、尼可莫爾(nicomol)禾口氧煙酸(oxiniacicacid)。甲狀腺激素及其類似物的非限制性例子包括etoroxate、甲狀丙酸和甲狀腺素?；祀s抗高脂蛋白藥的非限制性例子包括阿昔呋喃(acifran)、阿扎膽醇(azacosterol)、苯氟雷司(benfluorex)、β-節(jié)丁酉先胺(β-benzalbutyramide)、卡尼汀(carnitine)、硫酸軟骨素(chondroitinsulfate)、氯雌酮甲醚(clomestrone)、detaxtran、右旋HΡilt酸內(nèi)(dextransulfatesodium)>5,8,11,14,17-二十碳五烯酸、赤酮嘌啉(eritadenine)、夫拉扎勃(furazabol)、美格魯托(meglutol)、甲亞油酰胺(melinamide)、雙甲雌三醇(mytatrienediol)、鳥氨酸(ornithine)、Y-谷維素(Y-oryzanol)、泛硫乙胺(pantethine)、四乙酸季戊四醇酯(pentaerythritoltetraacetate)、α_苯基丁酉先胺(α-phenylbutyramide)、口比扎地爾(pirozadil)、普羅布考(probucol)(Iorelco)、β-谷留醇(β-sitosterol)、磺托酸-哌P秦鹽(sultosilicacid-piperazinesalt)、硫地酉享(tiadenol)、曲中白拉酉享(triparanol)和聯(lián)苯丁酸(xenbucin)?？箘?dòng)脈硬化藥的非限制性例子包括氨基甲酸吡啶酚酯(pyridinolcarbamate)0在某些實(shí)施方案中，可以將有助于消除或預(yù)防血液凝塊的藥劑的施用與調(diào)控物的施用組合，特別是在動(dòng)脈粥樣硬化和脈管系統(tǒng)(例如動(dòng)脈)阻斷的治療中?？寡ㄋ幒?或溶纖維蛋白藥的非限制性例子包括抗凝血藥、抗凝血藥拮抗劑、抗血小板藥、溶血栓藥、溶血栓藥拮抗劑或其組合。在某些實(shí)施方案中，優(yōu)選口服施用的抗血栓藥，諸如例如阿司匹林(aspirin)和華法林(wafarin)(Coumadin)。抗凝血藥的非限制性例子包括醋硝香豆素(acenocoumarol)、安克洛酶(ancrod)、茴弗二酮(anisindione)、溴弗二酮(bromindione)、氯弗二酮(clorindione)、庫美香豆素(coumetarol)、環(huán)香豆素(cyclocumarol)、右方寵糖苷硫酸鈉(dextransulfatesodium)、雙香豆素(dicumarol)、二苯弗酮(diphenadione)、雙香豆素乙酉旨(ethylbiscoumacetate)、乙撐雙香豆素(ethylidenedicoumarol)、氟弗二酮(fluindione)、肝素(heparin)>/K蛭素(hirudin)、阿樸酸鈉(lyapolatesodium)、奧沙二酮(oxazidione)、戊聚糖多硫酸(pentosanpolysulfate)、苯弗二麗(phenindione)、苯丙香豆酉享(phenprocoumon)、卵黃高磷蛋白(phosvitin)、吡考他胺(picotamide)、噻氯香豆素(tioclomarol)和華法林(warfarin)?？寡“逅幍姆窍拗菩岳影ò⑺酒チ?aspirin)、右旋糖苷(dextran)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)(潘生丁(persantin))、月干素(heparin)、石黃口比酮(sulfmpyranone)(安特靈(anturane))和噻氯匹定(ticlopidine)(力抗栓(ticlid))。溶血栓藥的非限制性例子包括組織纖溶酶原激活物(activase)、纖溶酶、尿激酶原、尿激酶(abbokinase)鏈激酶(str印tase)、阿尼普酶(anistr印lase)/APSAC(依米那酶(eminase))。在其中受試者罹患出血或出血可能性升高的某些實(shí)施方案中，可以使用可增強(qiáng)血液凝結(jié)的藥劑。血液凝結(jié)促進(jìn)劑的非限制性例子包括溶血栓藥拮抗劑和抗凝血藥拮抗劑。抗凝血藥拮抗劑的非限制性例子包括精蛋白(protamine)和維生素K1。溶血栓藥拮抗劑的非限制性例子包括氨基己酸(amiocaproicacid)(amicar)和氨甲環(huán)酸(tranexamicacid)(amstat)0抗血栓藥的非限制性例子包括阿那格雷(anagrelide)、阿力口曲班(argatroban)、西魯唾琳(cilstazol)、達(dá)曲班(daltroban)、去纖苷(defibrotide)、依諾肝素(enoxaparin)、速避凝(fraxiparine)、吲哚布芬(indobufen)、Iamoparan>奧扎格雷(ozagrel)、吡考他胺(picotamide)、普拉貝脲(plafibride)、替地肝素(tedelparin)、噻氯匹定(ticlopidine)和三氟柳(triflusal)。抗心率不齊藥的非限制性例子包括I類抗心率不齊藥(鈉通道阻滯劑)、II類抗心率不齊藥(β-腎上腺素能阻滯劑)、III類抗心率不齊藥(復(fù)極化延長藥)、IV類抗心率不齊藥(鈣通道阻滯劑)和混雜型抗心率不齊藥。鈉通道阻滯劑的非限制性例子包括IA類、IB類和IC類抗心率不齊藥。IA類抗心率不齊藥的非限制性例子包括丙吡胺(disppyramide)(norpace)、普魯卡因胺(procainamide)(pronestyl)禾口奎尼丁(quinidine)(quinidex)。IB類抗心率不齊藥的非限制性例子包括利多卡因(Iidocaine)(xylocaine)、妥卡尼(tocainide)(tonocard)和美西律(mexiletine)(mexitil)。IC類抗心率不齊藥的非限制性例子包括恩卡尼(encainide)(enkaid)禾口氟卡尼(flecainide)(tambocor)。β-阻滯劑(也稱作腎上腺素能阻滯劑、腎上腺素能拮抗劑或II類抗心率不齊藥)的非限制性例子包括醋丁洛爾(acebutolol)(sectral)、阿普洛爾(alprenolol)、氨磺洛爾(amosulalol)、阿羅洛爾(arotinolol)、阿替洛爾(atenolol)、苯呋洛爾(befunolol)、倍他洛爾(betaxolol)、貝凡洛爾(bevantolol)、比索洛爾(bisoprolol)、波吲洛爾(bopindolol)、布庫洛爾(bucumolol)、布非洛爾(bufetolol)、丁呋洛爾(bufuralol)、布尼洛爾(bunitrolol)、布拉洛爾(bupranolol)、鹽酸布替君(butidrinehydrochloride)、丁非洛爾(butofilolol)、卡拉洛爾(carazolol)、卡替洛爾(carteolol)、卡維地洛(carvedilol)、塞利洛爾(celiprolol)、塞他洛爾(cetamolol)、氯拉洛爾(cloranolol)、地來洛爾(dilevalol)、依泮洛爾(印anolol)、艾司洛爾(esmolol)(brevibloc)、茚諾洛爾(indenolol)、拉貝洛爾(Iabetalol)、左布諾洛爾(Ievobunolol)、甲吲洛爾(m印indolol)、美替洛爾(metipranolol)、美托洛爾(metoprolol)、莫普洛爾(moprolol)、納多洛爾(nadolol)、萘肟洛爾(nadoxolol)、硝苯洛爾(nifenalol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、吲哚洛爾(pindolol)、普拉洛爾(practolol)、丙萘洛爾(pronethalol)、普萘洛爾(propanolol)(inderal)、索他洛爾(sotalol)(betapace)、硫氧洛爾(sulfinalol)、他林洛爾(talinolol)、特他洛爾(tertatolol)、噻嗎洛爾(timolol)、托利洛爾(toliprolol)和希波酚(xibinolol)。在某些實(shí)施方案中，阻滯劑包含芳氧丙醇胺衍生物。芳氧丙醇胺衍生物的非限制性例子包括醋丁洛爾(acebutolol)、阿普洛爾(alprenolol)、阿羅洛爾(arotinolol)、阿替洛爾(atenolol)、倍他洛爾(betaxolol)、貝凡洛爾(bevantolol)、比索洛爾(bisoprolol)、波吲洛爾(bopindolol)、布尼洛爾(bunitrolol)、丁非洛爾(butofilolol)、卡拉洛爾(carazolol)、卡替洛爾(carteolol)、卡維地洛(carvedilol)、塞利洛爾(celiprolol)、塞他洛爾(cetamolol)、依泮洛爾(印anolol)、茚諾洛爾(indenolol)、甲吲洛爾(m印indolol)、美替洛爾(metipranolol)、美托洛爾(metoprolol)、莫普洛爾(moprolol)、納多洛爾(nadolol)、尼普地洛(nipradilol)、氧烯洛爾(oxprenolol)、噴布洛爾(penbutolol)、吲哚洛爾(pindolol)、普萘洛爾(propanolol)、他林洛爾(talinolol)、特他洛爾(tertatolol)、噻嗎洛爾(timolol)和托利洛爾(toliprolol)。延長復(fù)極化的藥劑(也稱作III類抗心率不齊藥)的非限制性例子包括胺碘酮(amiodarone)(可達(dá)龍(cordarone))禾口索他洛爾(sotalol)(betapace)。鈣通道阻滯劑(也稱作IV類抗心率不齊藥)的非限制性例子包括芳基烴基胺(例如b印ridile、地爾硫卓(diltiazem)、芬地林(fendiline)、戈洛帕米(galIopami1),普尼拉明(prenylamine)、特羅地林(terodiline)、維拉帕米(verapamil))、二氫吡啶衍生物(非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼莫地平(nimodipine)、尼索地平(nisoldipine)、尼群地平(nitrendipine))、哌嗪衍生物(例如桂利嗪(cinnarizine)、氟桂利嗪(flunarizine)、利多氟嗪(lidoflazine))或混雜型鈣通道阻滯劑(諸如芐環(huán)烷(bencyclane)、依他苯酮(etafenone)、鎂(magnesium)、米貝拉地爾(mibefradil)或哌克昔林(perhexiline))。在某些實(shí)施方案中，鈣通道阻滯劑包含長效二氫吡啶(硝苯地平型)鈣拮抗劑?；祀s型抗心率不齊藥的非限制性例子包括阿糖腺苷(adenosine)(adenocard),地高辛(digoxin)(拉諾辛(Ianoxin))、乙?？?acecainide)、阿義馬林(ajmaline)、克冠嗎啉(amoproxan)、阿普林定(aprindine)、甲苯磺酸溴芐胺(bretyliumtosylate)、丁蔡夫汀(bunaftine)、布托苯定(butobendine)、卡泊酸(capobenicacid)、西苯唑啉(cifenline)、口比二丙胺(disopyranide)、二fi奎尼丁(hydroquinidine)、英地卡尼(indecainide)、異丙托溴胺(ipatropiumbromide)、禾丨J多卡因(Iidocaine)、勞拉義明(Iorajmine)、勞卡尼(Iorcainide)、甲氧苯汀(meobentine)、莫雷西嗪(moricizine)、吡美諾(pirmenol)、丙緩脈靈(prajmaline)、普羅帕酮(propafenone)、吡諾林(pyrinoline)、聚半乳糖醛酸奎尼丁(quinidin印olygalacturonate)、硫酸奎尼丁(quinidinesulfae)和維喹地爾(viquidil)?？垢哐獕核幍姆窍拗菩岳影菇桓猩窠?jīng)藥、α/β阻滯劑、α阻滯劑、抗血管緊張素II藥、β阻滯劑、鈣通道阻滯劑、血管擴(kuò)張藥和混雜型抗高血壓藥。α阻滯劑(也稱作α-腎上腺素能阻滯劑或α-腎上腺素能拮抗劑)的非限制性例子包括氨磺洛爾(amosulalol)、阿羅洛爾(arotinolol)、達(dá)哌唑(dapiprazole)、多沙唑嗪(doxazosin)、甲磺酸雙氫麥角堿(ergoloidmesylate)、芬司匹利(fenspiride)、吲哚拉明(indoramin)、拉貝洛爾(Iabetalol)、麥角溴煙酯(nicergoline)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)、妥拉唑林(tolazoline)、曲馬唑嗪(trimazosin)和育亨賓(yohimbine)。在某些實(shí)施方案中，α阻滯劑可以包含喹唑啉衍生物。喹唑啉衍生物的非限制性例子包括阿夫唑嗪(alfuzosin)、布那唑嗪(bunazosin)、多沙唑嗪(doxazosin)、哌唑嗪(prazosin)、特拉唑嗪(terazosin)和曲馬唑嗪(trimazosin)。在某些實(shí)施方案中，抗高血壓藥既是α腎上腺素能拮抗劑又是β腎上腺素能拮抗劑。α/β阻滯劑的非限制性例子包含拉貝洛爾(Iabetalol)(normodymtrandate)?？寡芫o張素II藥的非限制性例子包括血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑和血管緊張素II受體拮抗劑。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑(ACE抑制劑)的非限制性例子包括阿拉普利(alac印ril)、依那普利(enalapril)(Vasotec)、卡托普利(captopril)、西拉普禾IJ(cilazapril)、地拉普利(delapril)、依那普拉利(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、賴諾普利(Iisinopril)、moveltopril、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。血管緊張素II受體阻滯劑(也稱作血管緊張素II受體拮抗劑、ANG受體阻滯劑或ANG-II1型受體阻滯劑(ARBS))的非限制性例子包括血管坎地沙坦(angiocandesartan)、依普羅沙坦(印rosartan)、厄貝沙坦(irbesartan)、氯沙坦(Iosartan)和纈沙坦(valsartan)?？菇桓猩窠?jīng)藥的非限制性例子包括作用于中樞的抗交感神經(jīng)藥或作用于周圍的抗交感神經(jīng)藥。作用于中樞的抗交感神經(jīng)藥(也稱作中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)抗交感神經(jīng)藥)的非限制性例子包括可樂定(clonidine)(catapres)、胍那芐(guanabenz)(wytensin)胍法辛(guanfacine)(tenex)和甲基多巴(methyldopa)(aldomet)。作用于周圍的抗交感神經(jīng)藥的非限制性例子包括神經(jīng)節(jié)阻斷劑、腎上腺素能神經(jīng)元阻斷劑、β“腎上腺素能阻斷劑或α-腎上腺素能阻斷劑。神經(jīng)節(jié)阻斷劑的非限制性例子包括美卡拉明(mecamylamine)(inversine)和曲美芬(trimethaphan)(arfonad)。腎上腺素能神經(jīng)元阻斷劑的非限制性例子包括胍乙啶(guanethidine)(ismelin)和利舍平(reserpine)(serpasil)。β-腎上腺素能阻滯劑的非限制性例子包括醋丁洛爾(acenitolol)(sectral)、阿替洛爾(atenolol)(天諾敏(tenormin))、倍他洛爾(betaxolol)(卡爾侖(kerlone))、卡替洛爾(carteolol)(cartrol)、拉貝洛爾(Iabetalol)(normodyne、trandate)、美托洛爾(metoprolol)(Iopressor)、納多洛爾(nadanol)(corgard)、噴布洛爾(penbutolol)(Ievatol)、吲哚洛爾(pindolol)(心得靜(visken))、普萘洛爾(propranolol)(心得安(inderal))和噻嗎洛爾(timolol)(blocadren)。α1-腎上腺素能阻滯劑的非限制性例子包括哌唑嗪(prazosin)(脈寧平(minipress))、多沙唑嗪(doxazocin)(卡杜雷(Cardura))和特拉唑嗪(terazosin)(高特靈(hytrin))。在某些實(shí)施方案中，心血管治療劑可以包含血管擴(kuò)張藥(例如腦血管擴(kuò)張藥、冠狀動(dòng)脈血管擴(kuò)張藥或外周血管擴(kuò)張藥)。在某些優(yōu)選的實(shí)施方案中，血管擴(kuò)張藥包含冠狀動(dòng)脈血管擴(kuò)張藥。冠狀動(dòng)脈血管擴(kuò)張藥的非限制性例子包括胺氧三苯(amotriphene)、jftC(bendazol)、Sl白SlSl白口i(benfurodilhemisuccinate)、苯碘達(dá)隆(benziodarone)、氯酚嗪(chloracizine)、乙胺香豆素(chromonar)、氯苯呋醇(clobenfurol)、氯硝甘油(clonitrate)、地拉卓(dilaz印)、雙嘧達(dá)莫(dipyridamole)、氫普拉明(droprenilamine)、乙氧黃If(efloxate)、戊四石肖酉旨(erythrityltetranitrane)>依他苯酮(etafenone)、芬地林(fendiline)、夫洛地爾(floredil)、更利芬(ganglefene)、己烷雌酚二(β-二乙基氨基乙基醚)(herestrolbis(β-diethylaminoethylether))、海索苯定(hexobendine)、甲苯磺酸硝乙醇胺(itramintosylate)、凱林(khellin)、利多氟嗪(Iidoflanine)、六硝酸甘露醇酯(mannitolhexanitrane)、美地巴嗪(medibazine)、nicorglycerin、四硝酸季戊四酉享酉旨(pentaerythritoltetranitrate)、戊硝醇(pentrinitrol)、哌克昔林(perhexiline)、匹美茶堿(pimefylline)、曲匹地爾(trapidil)、3_甲色酮(tricromyl)、曲美他嗪(trimetazidine)、磷酸三乙硝胺(trolnitratephosphate)禾口維斯定(visnadine)。在某些實(shí)施方案中，血管擴(kuò)張藥可包含長期療法血管擴(kuò)張藥或高血壓突發(fā)血管擴(kuò)張藥。長期療法血管擴(kuò)張藥的非限制性例子包括胼屈嗪(hydralazine)(apresoline)和米諾地爾(minoxidil)(Ioniten)。高血壓突發(fā)血管擴(kuò)張藥的非限制性例子包括硝普鹽(nitroprusside)(nipride)、二氮嗪(diazoxide)(hyperstatIV)、餅屈嗪(hydralazine)(apresoline)、米諾地爾(minoxidil)(Ioniten)和維拉帕米(verapamil)0混雜型抗高血壓藥的非限制性例子包括阿義馬林(ajmaline)、Y-氨基丁酸(γ-aminobutyricacid)、丁苯碘氨(bufeniode)、西氯他寧(cicletainine)、環(huán)西多明(ciclosidomine)、革柔酸綠藜胺(cryptenaminetannate)、非諾多泮(fenoldopam)、氟司喹南(flosequinan)、酮色林(ketanserin)、美布氨酉旨(mebutamate)、美卡拉明(mecamylamine)、甲基多巴(methyldopa)、甲基4-吡啶基酮氨硫脲(methyl4_pyridylketonethiosemicarbazone)、莫P坐胺(muzolimine)、中白吉林(pargyline)>潘必口定(pempidine)、口比那地爾(pinacidil)、喊羅克生(piperoxan)、普立喊隆(primaperone)、原藜聲堿(protoveratrine)、羅巴新(raubasine)、瑞西美托(rescimetol)、利美尼定(rilmenidene)、沙拉新(saralasin)、硝普鈉(sodiumnitrorusside)、替尼酸(ticrynafen)、樟腦磺酸曲美芬(trimethaphancamsylate)、酪氨酸酶(tyrosinase)禾口烏拉地爾(urapidil)。在某些實(shí)施方案中，抗高血壓藥可包含芳基乙醇胺衍生物、苯并噻二嗪衍生物、N-羧基烴基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物、二氫吡啶衍生物、胍衍生物、胼/酞嗪、咪唑衍生物、季銨化合物、利舍平衍生物或磺磷酰胺衍生物。芳基乙醇胺的非限制性例子包括氨磺洛爾(amosulalol)、丁呋洛爾(bufuralol)、地來洛爾(dilevalol)、拉貝洛爾(Iabetalol)、丙萘洛爾(pronethalol)、索他洛爾(sotalol)和硫氧洛爾(sulfinalol)。苯并噻二嗪衍生物的非限制性例子包括阿爾噻嗪(althizide)、芐氟噻嗪(bendroflumethiazide)、芐噻嗪(benzthiazide)、芐氫氯噻嗪(benzylhydrochlorothiazide)、布@P秦(buthiazide)、氣@P秦(chlorothiazide)、氣噻酮(chlorthalidone)、環(huán)戊噻嗪(cyclopenthiazide)、環(huán)噻嗪(cyclothiazide)、二氮嗪(diazoxide)、依匹噻嗪(印ithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬噻嗪(fenquizone)、氧氯噻嗪(hydrochlorothizide)、氧氟噻嗪(hydroflumethizide)>甲氯噻嗪(methyclothiazide)、美替克倉(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、對氟噻嗪(paraflutizide)、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪(tetrachlormethiazide)和三氯噻嗪(trichlormethiazide)。N-羧基烴基(肽/內(nèi)酰胺)衍生物的非限制性例子包括阿拉普利(alac印ril)、卡托普禾Ij(captopril)、西拉普利(ciIazapri1)、地拉普利(delapril)、依那普利(enalapril)、依那普利拉(enalaprilat)、福辛普利(fosinopril)、賴諾普利(Iisinopril)、莫維普利(moveltipril)、培哚普利(perindopril)、喹那普利(quinapril)和雷米普利(ramipril)。二氫吡啶衍生物的非限制性例子包括氨氯地平(amlodipine)、非洛地平(felodipine)、伊拉地平(isradipine)、尼卡地平(nicardipine)、硝苯地平(nifedipine)、尼伐地平(nilvadipine)、尼索地平(nisoldipine)和尼群地平(nitrendipine)。胍衍生物的非限制性例子包括倍他尼定(bethanidine)、異喹胍(debrisoquin)、胍那芐(guanabenz)、胍那克林(guanacline)、胍那決爾(guanadrel)、胍那佐定(guanazodine)>@jiZiPjI(guanethidine)(guanfacine)(guanochlor)i若^izW(guanoxabenz)禾口Ι(guanoxan)。胼/酞嗪的非限制性例子包括布屈嗪(budralazine)、卡屈嗪(cadralazine),雙13井屈P秦(dihydralazine)、M屈(endralazine)、月井+ELP秦(hydracarbazine)、月井屈嗪(hydralazine)、苯異丙胼(pheniprazine)、匹爾屈嗪(pildralazine)禾口托屈嗪(todralazine)。咪唑衍生物的非限制性例子包括可樂定(clonidine)、洛非西定(lofexidine)、酚妥拉明(phentolamine)、噻美尼定(tiamenidine)和托洛尼定(tolonidine)。季銨化合物的非限制性例子包括溴化氮戊銨(azamethoniumbromide)、松達(dá)氯銨(chlorisondaminechloride)、六甲季銨(hexamethonium)、二甲硫酸氰戊嗎啉(pentacyniumbis(methylsulfate))、五甲溴銨(pentamethoniumbromide)、酒石酸噴托銨(pentoliniumtartrate)、芬托氯銨(phenactropiniumchloride)禾口甲硫曲美替定(trimethidiniummethosulfate)。利舍平衍生物的非限制性例子包括比他舍平(bietaserpine)、地舍平(deserpidine)、瑞西那明(rescinnamine)、利舍平(reserpine)和昔洛舍平(syrosingopine)?；前费苌锏姆窍拗菩岳影ò膊假愄?ambuside)、氯帕胺(clopamide)、呋塞米(furosemide)、吲達(dá)帕胺(indapamide)、喹乙宗(quinethazone)、曲帕胺(tripamide)和希帕胺(xipamide)。血管加壓藥一般用來在手術(shù)期間可能發(fā)生的休克期間提高血壓。血管加壓藥(也稱作抗低血壓藥)的非限制性例子包括氨甲氧苯嗪甲基硫酸鹽(ameziniummethylsulfate)、血管緊張素酰胺(angiotensinamide)、二甲福林(dimetofrine)、多巴胺(dopamine)、依替非明(etifelmin)、依替福林(etilefrin)、吉培福林(gepefrine)、間羥胺(metaraminol)、米多君(midodrine)、去甲腎上腺素(nor印in印hrine)、福來君(pholedrine)禾口昔奈福林(synephrine)。用于治療充血性心力衰竭的藥劑的非限制性例子包括抗血管緊張素II藥、后負(fù)荷一前負(fù)荷減輕處理(afterload-preloadreductiontreatment)、利尿藥禾口肌力藥(inotropicagent)。在某些實(shí)施方案中，可以用組合療法來治療不能耐受血管緊張素拮抗劑的動(dòng)物受試者。此類療法可組合胼屈嗪(hydralazine)(阿比西林(apresoline))和二硝酸異山梨酉享(isosorbidedinitrate)(isordil、sorbitrate)的施用。利尿藥的非限制性例子包括噻嗪或苯并噻二嗪衍生物(例如阿爾噻嗪(althiazide)、芐氟噻嗪(bendroflumethazide)、芐噻嗪(benzthiazide)、芐氫氯噻P秦(benzylhydrochlorothiazide)>布@d秦(buthiazide)>氣@d秦(chlorothiazide)>氯噻嗪(chlorothiazide)、氯噻酮(chlorthalidone)、環(huán)戊噻嗪(cyclopenthiazide)、依匹噻嗪(印ithiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、乙噻嗪(ethiazide)、芬喹唑(fenquizone)>M1Mβ^(hydrochlorothiazide)>M1Mβ^(hydroflumethiazide)>甲氯噻嗪(methyclothiazide)、美替克倉(meticrane)、美托拉宗(metolazone)、對氟噻嗪(paraflutizide)、泊利噻嗪(polythizide)、四氯噻嗪(tetrachloromethiazide)、三氯噻嗪(trichlormethiazide))、有機(jī)汞(例如氯汞君(chlormerodrin)、美拉魯禾丨J(meralluride)、萊羅茶喊(mercamphamide)、硫萊林鈉(mercaptomerinsodium)、萊香豆酸(mercumallylicacid)、萊香豆林鈉(mercumatilindodium)、氯化亞萊(mercurouschloride)、汞撒利(mersalyl))、蝶啶(例如呋氨蝶啶(furterene)、氨苯蝶啶(triamterene))、口票吟(例如acefylline、7_嗎琳甲茶喊(7-morpho1inomethy1theophy11ine)、pamobrom、丙可可堿(protheobromine)、可可堿(theobromine))、類固酉享包括酸甾酮拮抗劑(例如坎利酮(canrenone)、夾竹桃苷(oleandrin)、螺內(nèi)酯(spironolactone))、磺胺衍生物(例如乙酰唑胺(acetazolamide)、安布賽特(ambuside)、阿佐塞米(azosemide)、布美他尼(bumetanide)、布他唑胺(butazolamide)、氯米非那胺(chloraminophenamide)、氯非那胺(clofenamide)、氯帕胺(clopamide)、氯索隆(clorexolone)、二苯甲烷_4，4'-二磺胺(diphenylmethane-4,4‘-disulfonamide)、二磺法胺(disulfamide)、依索唑胺(ethoxzolamide)、呋塞米(furosemide)、口引達(dá)中白胺(indapamide)、美夫西特(mefruside)、醋甲唑胺(methazolamide)、吡咯他尼(piretanide)、喹乙宗(quinethazone)、托拉塞米(torasemide)、曲帕胺(tripamide)、希帕胺(xipamide))、尿嘧啶(例如氨美啶(aminometradine)、阿米美唆(amisometradine))、保鉀拮抗劑(potassiumsparingantagonist)(例如阿米洛利(amiloride)、氨苯蝶啶(triamterene))或混雜利尿藥(諸如aminozine、熊果昔(arbutin)、氣拉扎尼(chlorazanil)、依地尼酸(ethacrynicacid)、依托唑啉(etozolin)、胼卡巴嗪(hydracarbazine)、異山梨醇(isosorbide)、甘露醇(mannitol)、美托查酮(metochalcone)、莫唑胺(muzolimine)、哌克昔林(perhexiline)、替尼酸(ticrnafen)和尿素)。正性肌力藥(也稱作強(qiáng)心劑)的非限制性例子包括acefylline、醋洋地黃毒苷(acetyldigitoxin)、2_氛基~4~皮考琳(2-amino-4-picoline)、氛力農(nóng)(amrinone)、玻白苯呋地爾(benfurodilhemisuccinate)、布拉地新(bucladesine)、cerberosine、樟口比他胺(camphotamide)、鈴蘭毒昔(convallatoxin)、石茲麻昔(cymarin)、地諾中白明(denopamine)、去乙酰毛花苷(deslanoside)、吉他林(digitalin)、洋地黃(digitalis)、洋地黃毒苷(digitoxin)、地高辛(digoxin)、多巴酚丁胺(dobutamine)、多巴胺(dopamine)、多培沙、明(dopexamine)、依諾昔麗(enoximone)、紅皮索(erythrophleine)>#J|3nj明(fenalcomine)、吉他林(gitalin)、菱毒素(gitoxin)、胍基乙酸(glycocyamine)、辛胺醇O^ptaminol)、白毛茛分堿(hydrastinine)、異波帕胺(ibopamine)、毛花苷(Ianatoside)、甲氧酚酰胺(metamivam)、米力農(nóng)(milrinone)、黃花夾竹桃次苷B(nerifolin)、夾竹桃苷(oleandrin)、烏巴音(ouabain)、奧昔非君(oxyfedrine)、普瑞特羅(prenalterol)、proscillaridine、殘余蟾蜍配基(resibufogenin)、海蔥苷(scillaren)、海蔥苷(scillarenin)、strphanthin、硫馬唑(sulmazole)、可可堿(theobromine)禾口扎莫特羅(xamoterol)。在具體的實(shí)施方案中，肌力藥是心臟糖苷、腎上腺素能激動(dòng)劑或磷酸二酯酶抑制劑。心臟糖苷的非限制性例子包括地高辛(digoxin)(拉諾辛(lanoxin))和洋地黃毒苷(digitoxin)(crystodigin)。β-腎上腺素能激動(dòng)劑的非限制性例子包括沙丁胺醇(albuterol)、班布特羅(bambuterol)、比托特羅(bitolterol)、卡布特羅(carbuterol)、克倉特羅(clenbuterol)、氯丙那林(clorprenaline)、地諾帕明(denopamine)、雙羥乙麻黃堿(dioxethedrine)、多巴酚丁胺(dobutamine)(獨(dú)步催(dobutrex))、多巴胺(dopamine)(intropin)、多培沙明(dopexamine)、麻黃堿(ephedrine)、乙非君(etafedrine)、乙基去甲腎上腺素(ethylnor印in印hrine)、非諾特羅(fenoterol)、福莫特羅(formoterol)、海索那林(hexoprenaline)、異波帕胺(ibopamine)、乙基異丙腎上腺素(isoetharine)、異丙腎上腺素(isoproterenol)、馬布特羅(mabuterol)、奧37西β林(metaproterenol)、甲氧曰月(methoxyphenamine)、奧昔__君(oxyfedrine)、吡布特羅(pirbuterol)、丙卡特羅(procaterol)、普羅托醇(protokylol)、瑞普特羅(r印roterol)、利米特羅(rimiterol)、利托君(ritodrine)、索特瑞醇(soterenol)、特布他林(terbutaline)、曲托喹酚(tretoquinol)、妥洛特羅(tulobuterol)和扎莫特羅(xamoterol)。磷酸二酯酶抑制劑的非限制性例子包括氨力農(nóng)(amrinone)(inocor)。抗心絞痛藥可包括有機(jī)硝酸鹽(organonitrate)、鈣通道阻滯劑、β-阻滯劑及其組合。有機(jī)硝酸鹽(也稱作硝酸血管擴(kuò)張藥)的非限制性例子包括硝酸甘油(nitro-bid、nitrostat)、二硝酸異山梨醇(isordil、sorbitrate)和亞硝酸異戊酯(amylnitrate)(aspirol>vaporole)。內(nèi)皮縮血管肽(ET)是一種21個(gè)氨基酸的肽，其具有有力的生理學(xué)和病理生理學(xué)效應(yīng)，它們似乎涉及心力衰竭的形成。ET的效果經(jīng)由與兩類細(xì)胞表面受體的相互作用來介導(dǎo)。A型受體(ET-A)與血管收縮和細(xì)胞生長有關(guān)，而B型受體(ET-B)與內(nèi)皮細(xì)胞介導(dǎo)的血管舒張和其它神經(jīng)激素(諸如醛留酮)的釋放有關(guān)。能抑制ET的生成或其刺激有關(guān)細(xì)胞的能力的藥理學(xué)藥劑是本領(lǐng)域已知的。抑制ET的生成涉及使用阻斷稱作內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶的酶的藥劑，內(nèi)皮縮血管肽轉(zhuǎn)化酶涉及自前體加工有活性的肽。抑制ET刺激細(xì)胞的能力涉及使用阻斷ET與其受體相互作用的藥劑。內(nèi)皮縮血管肽受體拮抗劑(ERA)的非限制性例子包括波生坦(Bosentan)、恩拉生坦(Enrasentan)、Ambrisentan、達(dá)盧生坦(Darusentan)、替唑生坦(Tezosentan)、阿曲生坦(Atrasentan)、Avosentan、Clazosentan>Edonentan>sitaxsentan>TBC3711>BQ123、禾口BQ788。在某些實(shí)施方案中，第二治療劑可包括一些類型的手術(shù)，這包括例如預(yù)防性的、診斷性的或分期的、治療性的(curative)和治標(biāo)性的手術(shù)。手術(shù)(特別是治療性手術(shù))可以與其它療法(諸如本發(fā)明和一種或多種其它藥劑)聯(lián)合。此類用于血管和心血管疾病和病癥的手術(shù)治療劑是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的，而且可以包括但不限于對生物體實(shí)施手術(shù)、提供心血管機(jī)械假體、血管成形術(shù)、冠狀動(dòng)脈再灌注、導(dǎo)管消融、給受試者提供埋藏式復(fù)率除顫器、機(jī)械循環(huán)支持或其組合。本發(fā)明中可使用的機(jī)械循環(huán)支持的非限制性例子包括主動(dòng)脈內(nèi)球囊反搏、左心室輔助裝置或其組合。用于對受試者施用的藥物配制劑和路徑本發(fā)明還提供了包含miR-29a-c激動(dòng)劑或拮抗劑的藥物組合物。激動(dòng)劑可以是包含編碼miR-29a-c的核酸區(qū)段的表達(dá)載體、或包含成熟miR-29a-c序列或其有效部分的多核苷酸。激動(dòng)劑可以包含在脂質(zhì)遞送媒介物中。拮抗劑可以是與miR-29a-c或其靶物雜交的多核苷酸。在臨床應(yīng)用的情況中，藥物組合物會(huì)以對于預(yù)定應(yīng)用適宜的形式制備。一般而言，這會(huì)需要制備基本上不含熱原以及其它對人類或動(dòng)物會(huì)有害的雜質(zhì)的組合物?？梢允褂媚z狀分散系統(tǒng)(諸如大分子復(fù)合物、納米膠囊、微球體、珠、和基于脂質(zhì)的系統(tǒng)，包括水包油乳劑、膠束(micelle)、混合膠束、和脂質(zhì)體)作為微小RNA功能的寡核苷酸抑制劑(例如拮抗劑)或表達(dá)特定微小RNA的構(gòu)建體的遞送媒介物。對于將本發(fā)明的核酸遞送至心肌和骨骼肌組織合適地商品化脂肪乳劑包括Intralipid、Liposyn、Liposyn11、Liposynπι、Nutrilipid、和其它類似的脂質(zhì)乳劑。一種作為體內(nèi)遞送媒介物使用的優(yōu)選的膠狀系統(tǒng)是脂質(zhì)體(即人工膜囊泡)。此類系統(tǒng)的制備和使用是本領(lǐng)域公知的。例示性的配制劑還披露于US5,981,505；US6,217,900；US6,383,512；US5,783,565；US7,202,227；US6,379,965；US6，127，170；US5，837，533；US6,747，014；和W003/093449,通過述及完整收入本文。一般會(huì)希望采用適宜的鹽和緩沖劑來使得遞送媒介物穩(wěn)定且容許被靶細(xì)胞攝取。當(dāng)將重組細(xì)胞導(dǎo)入受試者中時(shí)，也會(huì)采用緩沖液。本發(fā)明的水性組合物包含有效量的遞送媒介物，其包含溶解或分散在藥學(xué)可接受載體或水性介質(zhì)中的抑制劑多核苷酸或miRNA多核苷酸序列(例如脂質(zhì)體或其它復(fù)合物或表達(dá)載體)或細(xì)胞。短語“藥學(xué)可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”指在對動(dòng)物或人類施用時(shí)不產(chǎn)生不利的、變應(yīng)性的、或其它不想要的反應(yīng)的分子實(shí)體和組合物。如本文中所使用的，“藥學(xué)可接受載體”包括溶劑、緩沖劑、溶液、分散介質(zhì)、涂層、抗細(xì)菌劑和抗真菌劑、等滲劑和吸收延遲劑等等可接受用于配制藥物(諸如適合對人施用的藥物)的。此類介質(zhì)和試劑用于藥學(xué)活性物質(zhì)的使用是本領(lǐng)域公知的。除非任何常規(guī)介質(zhì)或試劑與本發(fā)明的活性成分不相容，否則就涵蓋它在治療性組合物中的使用。還可以將補(bǔ)充性活性成分摻入組合物中，只要它們不滅活所述組合物的載體或細(xì)胞。本發(fā)明的活性組合物可包括經(jīng)典的藥學(xué)制備物。依照本發(fā)明的這些組合物的施用可以經(jīng)由任何常用路徑，只要靶組織經(jīng)由該路徑可及。這包括口服、鼻、或含服?；蛘?，施用可以是經(jīng)過皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)注射，或者通過直接注射入心臟組織。包含miRNA拮抗劑的藥物組合物或包含miRNA序列的表達(dá)構(gòu)建體也可以通過導(dǎo)管系統(tǒng)或?yàn)閷⒅委焺┻f送至心臟而分離冠狀循環(huán)的系統(tǒng)來施用。本領(lǐng)域知道用于將治療劑遞送至心臟和冠狀脈管系統(tǒng)的多種導(dǎo)管系統(tǒng)。美國專利No.6，416，510；美國專利No.6，716，196；美國專利No.6，953，466；WO2005/082440；WO2006/089340；美國專利公開文本No.2007/0203445；美國專利公開文本No.2006/0148742；和美國專利公開文本No.2007/0060907(通過述及完整收入本文)中披露了適用于本發(fā)明的基于導(dǎo)管的遞送方法或冠狀動(dòng)脈分離方法的一些非限制性例子。此類組合物通常會(huì)作為如上所述的藥學(xué)可接受組合物來施用?；钚曰衔镆部梢晕改c外或腹膜內(nèi)施用。舉例而言，可以在與表面活性劑(諸如羥丙基纖維素)適當(dāng)混合的水中制備游離堿或藥理學(xué)可接受鹽形式的活性化合物的溶液。也可以在甘油、液體聚乙二醇、及其混合物中及在油中制備分散體。在普通貯存和使用條件下，這些制備物一般含有防腐劑以防止微生物生長。對于注射使用或?qū)Ч苓f送合適的藥物形式包括例如無菌水溶液或分散體及用于臨場制備無菌注射液或分散體的無菌粉劑。一般而言，這些制備物是無菌的，而且以存在易于注射性的程度流動(dòng)。制備物在制造和貯存條件下應(yīng)當(dāng)是穩(wěn)定的，而且應(yīng)當(dāng)針對微生物(諸如細(xì)菌和真菌)的污染作用進(jìn)行防腐。適宜的溶劑或分散介質(zhì)可含有例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液體聚乙二醇、等等)、它們的合適混合物、及植物油?？梢酝ㄟ^例如使用涂層(諸如卵磷脂)、通過維持所需粒度(在分散體的情況中)和通過使用表面活性劑來維持適當(dāng)?shù)牧鲃?dòng)性?？梢酝ㄟ^各種抗細(xì)菌劑和抗真菌劑來實(shí)現(xiàn)對微生物作用的預(yù)防，例如paraben、氯丁醇、酚、山梨酸、硫柳汞、等等。在許多情況中，會(huì)優(yōu)選包括等滲劑，例如糖或氯化鈉?？梢酝ㄟ^在組合物中使用延遲吸收的藥劑來實(shí)現(xiàn)可注射組合物的吸收的延長，例如單硬脂酸鋁和明膠。可如下制備無菌注射液，即以適宜的量將活性化合物摻入根據(jù)需要含有任何其它成分(例如上文所列)的溶劑中，接著過濾除菌。一般而言，如下制備分散體，即將各種經(jīng)滅菌的活性成分摻入含有基本分散介質(zhì)和想要的其它成分(例如上文所列)的無菌媒介物中。在用于制備無菌注射液的無菌粉劑的情況中，優(yōu)選的制備方法包括真空干燥和冷凍干燥技術(shù)，它們自先前無菌過濾的溶液產(chǎn)生其活性成分加任何別的想要的成分的粉末。本發(fā)明的組合物一般可配制成中性或鹽形式。藥學(xué)可接受鹽包括例如自無機(jī)酸(例如鹽酸或磷酸)或自有機(jī)酸(例如乙酸、草酸、酒石酸、扁桃酸、等等)衍生的酸加成鹽(與蛋白質(zhì)的游離氨基形成的)。也可以自無機(jī)堿(例如氫氧化鈉、鉀、銨、鈣、或鐵)或自有機(jī)堿(例如異丙胺、三甲胺、組氨酸、普魯卡因等等)衍生與蛋白質(zhì)的游離羧基形成的鹽。配制后，優(yōu)選以與劑型相容的方式和以治療上有效的量施用溶液。所述配制劑可以容易地以多種劑量形式來施用，諸如注射液、藥物釋放膠囊等等。例如，為了以水溶液形式胃腸外施用，一般將溶液適當(dāng)緩沖，并且首先例如用足夠的鹽或葡萄糖使得液體稀釋劑等滲。此類水溶液可用于例如靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、皮下和腹膜內(nèi)施用。優(yōu)選的是，采用無菌水介質(zhì)，正如本領(lǐng)域技術(shù)人員知道的，特別是根據(jù)本公開內(nèi)容。舉例而言，可以將單個(gè)劑量溶解在Iml等滲NaCl溶液中，并且或是添加至IOOOml皮下輸液或是在建議的輸注部位注射(參加例如((Remington'sPharmaceuticalSciences))第15版，第1035-1038頁和第1570-1580頁)。取決于所治療的受試者的狀況，劑量必然會(huì)發(fā)生一些變化。在任何情況中，負(fù)責(zé)施用的人會(huì)為各受試者決定適宜的劑量。此外，對于人類施用，制備物應(yīng)當(dāng)達(dá)到FDA生物制劑標(biāo)準(zhǔn)室要求的無菌度、熱原度、一般安全和純度標(biāo)準(zhǔn)。用于提高組織中的膠原沉積的化妝品配制劑可包含至少一種miR-29a-c拮抗劑。所述拮抗劑可以是miR-29a、miR-29b、miR-29C、或其組合的拮抗劑。在一些實(shí)施方案中，所述miR-29a-c拮抗劑是小RNA拮抗劑。所述拮抗劑可以連接或偶聯(lián)有促進(jìn)所述拮抗劑進(jìn)入細(xì)胞或組織的藥劑。此類藥劑可包括細(xì)胞內(nèi)化轉(zhuǎn)運(yùn)物，諸如穿膜肽(antermapedia)、TAT、BuforinII、Transportan、模型兩親性肽、K-FGF、Ku70、Prion、pVEC、P印-1、SynBl、SynB3、5又1^5、？印-7、而-1、雙-胍鹽-亞精胺-膽固醇、雙-胍鹽-Tren-膽固醇、和聚精氨酸。所述藥劑可以連接至miR-29a-c拮抗劑的氨基或羧基端。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述藥劑通過在進(jìn)入細(xì)胞后受到切割的序列連接至拮抗劑。此類序列通常包含本領(lǐng)域已知的蛋白酶的共有序列?；瘖y品組合物可配制到所有類型的媒介物中。合適的媒介物的非限制性例子包括乳液(例如油包水、水包油包水、水包油、油包水包油、硅酮包水包油乳液)、乳膏、洗劑、溶液(水的和含水酒精的二者)、無水基質(zhì)(諸如唇膏(lipstick)和粉)、凝膠、和軟膏劑或通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員會(huì)知道的其它方法或上述任何組合(Remington's,1990)。各種和其它適宜的媒介物對熟練技術(shù)人員會(huì)是顯而易見的，而且適宜在本發(fā)明中使用。在某些實(shí)施方案中，各組分的濃度和組合是以所述組合化學(xué)相容且不形成自成品沉淀的復(fù)合物的方式而選擇的。還涵蓋可以封裝芳香的皮膚活性組分和貫穿本說明書鑒定的別的組分來遞送至靶區(qū)域，諸如皮膚。封裝技術(shù)的非限制性例子包括能作為遞送媒介物用于將此類組分遞送至皮膚的脂質(zhì)體、媒介物、和/或納米顆粒(例如生物可降解的和非生物可降解的膠狀顆粒，其包含其中包裹、封裝、和/或吸收有所述組分的聚合材料，例子包括納米球體和納米膠囊)的使用(參加例如美國專利6，387，398；美國專利6，203，802；美國專利5，411，744；及Kreuter1998，通過述及完整收入本文)。還涵蓋藥學(xué)可接受的或藥理學(xué)可接受的組合物。短語“藥學(xué)可接受的”或“藥理學(xué)可接受的”包括在對人類施用時(shí)不產(chǎn)生變應(yīng)性的或相似的不利反應(yīng)的組合物。通常，此類組合物制備成局部組合物、液體溶液或懸浮液，也可以制備適合在使用前在液體中溶解或懸浮的固體形式。施用路徑可以隨要治療的疾患的位置和性質(zhì)而變化，而且包括例如局部、吸入、皮內(nèi)、經(jīng)皮(transdermal)、胃腸外、靜脈內(nèi)、肌肉內(nèi)、鼻內(nèi)、皮下、經(jīng)皮(percutaneous)、氣管內(nèi)、腹膜內(nèi)、腫瘤內(nèi)、灌注、灌洗、直接注射、和口服施用和配制?？梢詫⒈景l(fā)明的組合物摻入產(chǎn)品中。產(chǎn)品的非限制性例子包括包括化妝品產(chǎn)品、基于食品的產(chǎn)品、藥物產(chǎn)品等。僅僅是舉例而言，非限制性的化妝品產(chǎn)品包括遮光劑產(chǎn)品(sunscreenproducts)、無日照皮膚曬黑產(chǎn)品(sunlessskintanningproducts)、美發(fā)產(chǎn)品(hairproducts)、美甲產(chǎn)品(fingernailproducts)、JHiSff(moisturizingcreams)>皮膚護(hù)理霜和皮膚護(hù)理液(skinbenefitcreamsandlotions)、柔軟劑(softeners)、日霜(daylotions)、凝膠、軟膏齊[J、粉底(foundations)、晚霜(nightcreams)、唇膏(lipsticks)、睫毛膏(mascaras)、目艮影(eyeshadows)、目艮線(eyeliners)、頰彩(cheekcolors)、清潔劑(cleansers)、調(diào)色劑(toners)、面膜(masks)、或其它已知的化妝品產(chǎn)品或應(yīng)用。另外，化妝品產(chǎn)品可以配制成保留著的(leave-on)或沖洗掉的(rinse-off)的產(chǎn)PΡΠO本發(fā)明的組合物可包括別的組分。別的組分的非限制性例子包括化妝品組分(有活性和無活性的二者)和藥物組分(有活性的和無活性的二者)。CTFA國際化妝品組分字典和手冊(2004)記載了極其多種能在本發(fā)明的背景中使用的非限制性化妝品組分。這些組分類別的例子包括香料(人造的和天然的)、染料和顏色組分(例如藍(lán)1、湖藍(lán)1、紅40、二氧化鈦、D&C4號(hào)藍(lán)、D&C5號(hào)綠、D&C4號(hào)橙、D&C17號(hào)紅、D&C33號(hào)紅、D&C2號(hào)紫羅蘭、D&C10號(hào)黃、和D&C11號(hào)黃)、吸附劑、乳化劑、穩(wěn)定劑、潤滑劑、溶劑、增濕劑(包括例如潤膚劑、保溫劑、成膜劑、吸留劑、和影響皮膚天然增濕機(jī)制的藥劑)、防水劑、UV吸收劑(物理的和化學(xué)的吸收劑，諸如對氨基苯甲酸(PABA)和相應(yīng)的PABA衍生物、二氧化鈦、氧化鋅、等)、精油(essentialoil)、維生素(例如A、B、C、D、E、和K)、痕量金屬(例如鋅、鈣和硒)、抗刺激劑(例如類固醇和非類固醇抗炎藥)、植物提取物(例如真蘆薈、甘菊、黃瓜提取物、白果、人參、和迷迭香)、抗微生物劑、抗氧化劑(例如BHT和生育酚)、螯合劑(例如EDTA二鈉和EDTA四鈉)、防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯和對羥基苯甲酸丙酯)、pH調(diào)節(jié)劑(例如氫氧化鈉和檸檬酸)、吸收劑(例如鋁淀粉辛烯基琥珀酸酯、高嶺土、玉米淀粉、燕麥淀粉、環(huán)式糊精、滑石、和沸石)、皮膚漂白和提亮劑(lighteningagent)(例如氫醌和煙酰胺乳酸酯)、保濕劑(例如甘油、丙二醇、丁二醇、戊二醇、山梨醇、尿素、和甘露醇)、去角質(zhì)劑(exfoliant)(例如α-羥基酸和β_羥基酸諸如乳酸、乙醇酸、和水楊酸；及其鹽)防水劑(例如氫氧化鎂/鋁硬脂酸鹽)、皮膚調(diào)理劑(例如蘆薈提取物、尿囊素、甜沒藥醇、神經(jīng)酰胺、二甲基硅油、透明質(zhì)酸、和甘草酸二鉀)、增稠劑(例如能提高組合物的粘度的物質(zhì)，諸如羧酸聚合物、交聯(lián)聚丙烯酸酯聚合物、聚丙烯酰胺聚合物、多糖、和膠質(zhì))、和含硅酮的化合物(例如硅油和聚有機(jī)硅氧烷)。還涵蓋對本發(fā)明的乳劑組合物有用的藥學(xué)組分。藥學(xué)組分的非限制性例子包括抗痤瘡藥、用于治療酒糟鼻的藥劑、鎮(zhèn)痛藥、麻醉藥、肛門直腸藥、抗組胺藥、抗炎藥(包括非41類固醇抗炎藥)、抗生素、抗真菌藥、抗病毒藥、抗微生物藥、抗癌活性劑、殺芥螨藥、滅虱藥、抗腫瘤藥、止汗藥、止癢藥、抗銀屑病藥、抗脂溢藥、生物學(xué)活性蛋白質(zhì)和肽、燒傷處理藥、燒灼劑、脫色劑、脫毛藥、尿布濕疹處理藥、酶、毛發(fā)生長刺激劑、毛發(fā)生長延緩劑(包括DFMO及其鹽和類似物)、止血藥、角質(zhì)層分離劑(kerotolytics)、口瘡處理藥、感冒瘡處理藥、牙齒和牙周處理藥、光敏化活性劑、保護(hù)劑/屏障劑、類固醇(包括激素和皮質(zhì)類固醇)、曬傷處理藥、遮光劑、經(jīng)皮活性劑、鼻活性劑、陰道活性劑、疣處理藥、傷口處理藥、傷口愈合藥寸。本文所述任何成分可以包含在試劑盒中。在一個(gè)非限制性的例子中，各miRNA包括在試劑盒中。所述試劑盒可進(jìn)一步包括水和雜交緩沖液以便于所述miRNA的兩條鏈的雜交。在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可包括一種或多種用于抑制靶miRNA功能的寡核苷酸。所述試劑盒還可包括一種或多種轉(zhuǎn)染試劑以便于將miRNA或miRNA拮抗劑遞送至細(xì)胞。試劑盒的成分可以在水介質(zhì)中或以凍于形式包裝。試劑盒的容器手段一般包括至少一個(gè)管形瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器或其它容器手段，其中裝有(優(yōu)選合適地分配)成分。在試劑盒中有超過一種成分的情況中(標(biāo)記用試劑和標(biāo)記物可以包裝在一起)，試劑盒一般還會(huì)包含第二、第三或其它別的容器，其中可以分開裝納別的成分。然而，可以在管形瓶中裝納各種成分組合。本發(fā)明的試劑盒一般還會(huì)包括為了銷售而牢固地安置核酸，和任何其它試劑容器的手段。此類容器可包括用于安放所需管形瓶的注射或吹塑成形的塑料容ο當(dāng)所述試劑盒的成分在一種和/或多種液體溶液中提供時(shí)，所述液體溶液是水溶液，特別優(yōu)選無菌的水溶液。然而，試劑盒的成分可以以干粉形式提供。當(dāng)試劑和/或成分以干粉形式提供時(shí)，可以通過添加合適的溶劑來將所述粉劑重建。所述溶劑也可以在另一容器手段中提供。容器手段一般會(huì)包括至少一個(gè)管形瓶、試管、燒瓶、瓶、注射器和/或其它容器手段，其中裝有(優(yōu)選合適地分配)核酸配制劑。所述試劑盒還可包含第二容器手段，用于裝納無菌的藥學(xué)可接受緩沖劑和/或其它稀釋劑。本發(fā)明的試劑盒通常還會(huì)包括為了銷售而牢固地安置管形瓶的手段，諸如例如用于安放所需管形瓶的注射和/或吹塑成形的塑料容器。此類試劑盒還可包括保存或維持miRNA或miRNA抑制性寡核苷酸或者保護(hù)它們免于降解的成分。此類成分可以不含RNA酶或針對RNA酶提供保護(hù)。此類試劑盒一般會(huì)以合適的手段為每種試劑或溶液包含獨(dú)特的容器。試劑盒還會(huì)包括關(guān)于采用試劑盒成分以及使用試劑盒中沒有包括的任何其它試劑的說明書。說明書可包括能執(zhí)行的變化形式。試劑盒還可包括通過各種施用路徑(諸如胃腸外或?qū)Ч苁┯?施用miRNA激動(dòng)劑或拮抗劑的器具或裝置。此類試劑是本發(fā)明試劑盒的實(shí)施方案。然而，此類試劑盒不限于上文鑒定的具體項(xiàng)，而且可包括任何用于miRNA操作或表征的試劑。用于鑒定調(diào)控物的方法本發(fā)明進(jìn)一步包含用于鑒定miR-29a-c的激動(dòng)劑的方法，miR-29a-c的激動(dòng)劑在心臟纖維化、心臟肥大或心力衰竭的預(yù)防或治療或逆轉(zhuǎn)中是有用的。這些測定法可包含隨機(jī)篩選候選化合物的大型文庫；或者，所述測定法可用于聚焦于特定類別的化合物，它們是以針對認(rèn)為使得化合物更有可能提升miR-29a-c表達(dá)和/或功能的結(jié)構(gòu)屬性的視角選擇的。為了鑒定miR-29a-c的調(diào)控物，一般會(huì)在存在和不存在候選化合物的情況中測定miR-29a-c的功能。例如，所述方法一般包含(a)提供候選化合物；(b)將所述候選化合物與miR-29混合；(c)測量miR-29a_c活性；并(d)比較步驟(c)中的活性與不存在所述候選化合物時(shí)的miR-29a-c活性，其中測量得到的miR-29a-c活性間的差異指示所述候選化合物確實(shí)是miR-29a-c的調(diào)控物。也可以在分離的細(xì)胞、器官、或活的生物體中進(jìn)行測定法。當(dāng)然要理解，本發(fā)明的所有篩選方法自身就是有用的，盡管事實(shí)上可能沒有找到有效的候選物。本發(fā)明提供了用于篩選此類候選物的方法，不僅僅是找到它們的方法。如本文中所使用的，“候選化合物”指任何可潛在調(diào)控miR-29a-c的纖維化或膠原調(diào)節(jié)方面的分子。通常會(huì)從各種商業(yè)來源獲得認(rèn)為達(dá)到有用藥物基本標(biāo)準(zhǔn)的分子文庫，從而試圖“推動(dòng)”有用化合物的鑒定。對此類文庫(包括通過組合產(chǎn)生的文庫，例如小RNA拮抗劑文庫)的篩選是對大量相關(guān)(和無關(guān))化合物篩選活性的一種快速且有效的方式。通過在有活性但其它方面不合適的化合物的原型上創(chuàng)建第二代、第三代、和第四代化合物，組合法還將它們自身用于潛在藥物的快速進(jìn)化。體外測定法是一種快速、便宜且容易的測定法。此類測定法一般使用分離的分子，能快速且大量運(yùn)行，由此提高一小段時(shí)間里可獲得的信息量?？墒褂枚喾N容器來運(yùn)行此類測定法，包括試管、板、盤和其它表面，諸如量桿(dipstick)或珠。WO84/03564(通過述及完整收入本文)中記載了一種用于高通量篩選化合物的技術(shù)?？梢栽诠腆w基底(諸如塑料針或一些其它表面)上合成大量小的小RNA拮抗劑(antogomir)化合物。可以對此類分子快速篩選它們抑制miR-29a-c的能力。本發(fā)明還涵蓋，對化合物篩選它們調(diào)控細(xì)胞中miR-29a-c活性和表達(dá)的能力。此類篩選測定法可利用各種細(xì)胞系，包括自骨骼肌細(xì)胞衍生的那些，包括專門為此目的而改造的細(xì)胞。也可以使用原代心臟細(xì)胞，正如H9C2細(xì)胞系。體內(nèi)測定法涉及心臟病或肌肉骨骼疾病、纖維化、或膠原丟失的各種動(dòng)物模型的使用，包括轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，它們已經(jīng)進(jìn)行改造以具有特定缺陷或攜帶可用于測量候選物質(zhì)到達(dá)和影響生物體內(nèi)不同細(xì)胞的能力的標(biāo)志物。由于它們的體型、易于操作、及關(guān)于它們生理學(xué)和遺傳構(gòu)成的信息，小鼠是一種優(yōu)選的實(shí)施方案，尤其對于轉(zhuǎn)基因的。然而，其它動(dòng)物也是合適的，包括大鼠、家兔、倉鼠、豚鼠、沙鼠、旱獺、貓、犬、綿羊、山羊、豬、牛、馬和猴(包括黑猩猩、長臂猿和狒狒)?？梢允褂米匀魏芜@些物種衍生的動(dòng)物模型來進(jìn)行對抑制劑的測定法。用測試化合物治療動(dòng)物會(huì)涉及對動(dòng)物施用適宜形式的化合物。施用會(huì)是任何可用于臨床目的的路徑。在體內(nèi)測定化合物的有效性可涉及多種不同標(biāo)準(zhǔn)，包括但不限于肥大信號(hào)傳導(dǎo)途徑和肥大身體癥狀的改變。而且，可以以比體內(nèi)或細(xì)胞內(nèi)測定法更有意義的方式在動(dòng)物中實(shí)施對毒性和劑量響應(yīng)的測量。轉(zhuǎn)基因動(dòng)物本發(fā)明的一個(gè)具體實(shí)施方案提供了缺少兩個(gè)功能性miR_29a、miR_29b、和/或miR-29c等位基因中的一個(gè)或兩個(gè)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。而且，在誘導(dǎo)型的、組織選擇性的或組成型的啟動(dòng)子控制下表達(dá)miR-29a-c的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物，自此類動(dòng)物衍生的重組細(xì)胞系，及轉(zhuǎn)基因胚在確定miR-29a-c在對纖維化的控制中和在病理性心臟肥大和心力衰竭的發(fā)生中發(fā)揮的確切作用中可能是有用的。另外，這些轉(zhuǎn)基因動(dòng)物可洞察心臟發(fā)育?？烧T導(dǎo)的或可遏制的miR-29a-c編碼核酸的使用為過度調(diào)節(jié)的或不受調(diào)節(jié)的表達(dá)提供了模型。而且，涵蓋“敲除”了miR-29a-c的兩個(gè)等位基因中一個(gè)或兩個(gè)的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。而且，涵蓋“敲除”了一個(gè)或兩個(gè)簇的一個(gè)或兩個(gè)等位基因中的miR-29a-c的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。在一個(gè)一般的實(shí)施方案中，通過以容許轉(zhuǎn)基因表達(dá)的方式使給定的轉(zhuǎn)基因整合入基因組中生成了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。用于生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的方法一般性記載于Wagner和Hoppe(美國專利4，873，191；通過述及收入本文)；及Brinster等(1985；通過述及收入本文)。典型的是，通過顯微注射將側(cè)翼為基因組序到的基因轉(zhuǎn)移入受精卵。將顯微注射后的卵植入宿主雌獸，并對后代篩選轉(zhuǎn)基因表達(dá)?？梢宰詠碜栽S多動(dòng)物(包括但不限于爬行類、兩棲類、鳥類、哺乳類、和魚類)的受精卵生成轉(zhuǎn)基因動(dòng)物?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任何手段來制備用于顯微注射的DNA克隆。例如，可以用適宜于清除細(xì)菌質(zhì)粒序列的酶切割用于顯微注射的DNA克隆，并使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在TBE緩沖液中在瓊脂糖凝膠上對DNA片段電泳。通過溴化乙錠染色來顯現(xiàn)DNA條帶，并切出含有表達(dá)序列的條帶。然后將切出的條帶置于裝有0.3M乙酸鈉，pH7.O的透析袋中。將DNA電洗脫入透析袋中，用11酚氯仿溶液抽提，并用兩倍體積的乙醇沉淀。將DNA在Iml低鹽緩沖液(0.2MNaCl,20mMTris，pH7.4，和ImMEDTA)中重新溶解，并在Elutip-D柱上純化。首先用3ml高鹽緩沖液(1MNaCl,20mMTris，pH7.4，和ImMEDTA)預(yù)先準(zhǔn)備柱，接著用5ml低鹽緩沖液清洗。使DNA溶液穿過柱三次以使DNA結(jié)合至柱基質(zhì)。用3ml低鹽緩沖液清洗一次后，用0.4ml高鹽緩沖液洗脫DNA，并用兩倍體積的乙醇沉淀。在UV分光光度計(jì)中通過260nm吸收來測量DNA濃度。為了顯微注射，將DNA濃度在5mMTris,pH7.4和0.ImMEDTA中調(diào)節(jié)至3μg/ml。用于純化用于顯微注射的DNA的其它方法記載于Palmiter等(1982)；及Sambrook等(2001)。在一種例示性的顯微注射規(guī)程中，通過5IU注射(0.lcc,ip)懷孕母馬血清促性腺激素(PMSG；Sigma)，接著48小時(shí)后5IU注射(0.lcc,ip)人絨毛膜促性腺激素(hCG；Sigma)，誘導(dǎo)六周齡雌性小鼠超排卵。hCG注射后立即將雌性與雄性放在一起。hCG注射后21小時(shí)，通過CO2窒息或頸脫位法處死交配后的雌性，并自切開的輸卵管取出胚，放在含0.5%牛血清清蛋白(BSA;Sigma)的Dulbecco氏磷酸鹽緩沖鹽水中。用透明質(zhì)酸酶(lmg/ml)清除周圍的丘細(xì)胞。然后在含0.5%BSA的Earle氏平衡鹽溶液(EBSS)中清洗前核胚并放置在具有5%C02、95%空氣的增濕大氣的37.5°C溫箱中，直至注射時(shí)間?？梢栽趦杉?xì)胞階段進(jìn)行胚的植入。將隨機(jī)循環(huán)的成年雌性小鼠與切除了輸精管的雄性配對。為此目的可使用C57BL/6或Swiss小鼠或其它相當(dāng)?shù)钠废?。使受體雌性在與供體雌性相同的時(shí)間交配。在轉(zhuǎn)移胚時(shí)，通過腹膜內(nèi)注射0.015ml2.5%阿佛丁每克體重來麻醉受體雌性。通過一個(gè)中線背部切口來暴露輸卵管。然后穿過剛好在輸卵管上方的體壁做一個(gè)切口。然后用制表鑷撕44裂卵巢囊。將要轉(zhuǎn)移的胚放在DPBS(DulbeCC0氏磷酸鹽緩沖鹽水)中且在轉(zhuǎn)移移液管的尖端中(約10-12個(gè)胚)。將移液管尖端插入漏斗中并轉(zhuǎn)移胚。轉(zhuǎn)移后，通過兩次縫合來關(guān)閉切口。定義如本文中所使用的，術(shù)語“心力衰竭”廣泛用于表示降低心臟泵血能力的任何疾患。結(jié)果是，在組織中發(fā)生充血和水腫。最常見的是，心力衰竭是由源自冠狀動(dòng)脈血流降低的心肌收縮性降低引起的；然而，許多其它因素可導(dǎo)致心力衰竭，包括對心臟瓣膜的損害、維生素缺乏、和原發(fā)性心臟肌肉疾病。雖然尚未完全了解心力衰竭的精確生理機(jī)制，但是一般認(rèn)為心力衰竭涉及數(shù)項(xiàng)心臟自主特性(包括交感神經(jīng)的、副交感神經(jīng)的、和壓力感受器應(yīng)答)中的病癥。短語“心力衰竭的表現(xiàn)”廣泛用于涵蓋與心力衰竭有關(guān)的所有后遺癥，諸如呼吸短促、壓凹性水腫、肝腫大且觸痛、頸部靜脈充血、肺部羅音等等，包括與心力衰竭有關(guān)的實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)。術(shù)語“治療”或“處理”或語法等同形式涵蓋心力衰竭癥狀的改善和/或逆轉(zhuǎn)(即心臟泵血的能力)?？梢允褂帽疚乃鋈魏味攘?例如測量射血分?jǐn)?shù)、縮短分?jǐn)?shù)、左心室內(nèi)徑、心率等)以及對動(dòng)物存活的任何效果來評估心臟“生理功能的改善”。在使用動(dòng)物模型時(shí)，使用本文所述任何測定法比較接受治療的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物和不接受治療的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的響應(yīng)(另外，可以包括經(jīng)接受治療的和不接受治療的非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物作為對照)。在本發(fā)明的篩選方法中使用的、引起與心力衰竭有關(guān)的任何參數(shù)改善的化合物可由此鑒定為治療性化合物。術(shù)語“擴(kuò)張性心肌病”指以存在收縮期收縮功能差的對稱性擴(kuò)張左心室為特征且另外常常涉及右心室的一種心力衰竭類型。術(shù)語“化合物”指可用于治療或預(yù)防身體功能的疾病(disease)、病(illness)、不適(sickness)、或病癥(disorder)的任何化學(xué)實(shí)體、藥劑、藥物等等?；衔锇阎暮蜐撛诘闹委熜曰衔?。可以通過使用本發(fā)明的篩選方法進(jìn)行的篩選來確定化合物是治療性的?！耙阎闹委熜曰衔铩敝敢呀?jīng)顯示出(例如經(jīng)由動(dòng)物試驗(yàn)或?qū)θ祟愂┯玫脑谙冉?jīng)驗(yàn))在此類治療中有效的治療性化合物。換言之，已知的治療性化合物不限于在心力衰竭的治療中有效的化合物。如本文中所使用的，術(shù)語“心臟肥大”指其中成年心臟肌細(xì)胞經(jīng)由肥大性生長來響應(yīng)壓力的過程。此類生長的特征在于細(xì)胞大小增大細(xì)胞而在沒有細(xì)胞分裂，在細(xì)胞內(nèi)裝配另外的肌節(jié)以使力量生成最大化，及胎心基因程序的激活。心臟肥大常常與升高的發(fā)病和死亡風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，因此致力于了解心臟肥大的分子機(jī)制的研究會(huì)對人類健康具有重大影響。如本文中所使用的，術(shù)語“調(diào)控”指生物性活性的變化或改變。調(diào)控可以是蛋白質(zhì)活性的升高或降低、激酶活性的變化、結(jié)合特征的變化、或與蛋白質(zhì)或其它感興趣結(jié)構(gòu)的活性有關(guān)的生物學(xué)、功能、或免疫學(xué)特性的任何其它變化。術(shù)語“調(diào)控物”指如上所述能夠變化或改變生物學(xué)活性的任何分子或化合物。術(shù)語“β-腎上腺素能受體拮抗劑”指能夠阻斷(部分地或完全地)貝塔(β)型腎上腺素受體(即響應(yīng)兒茶酚胺(尤其是去甲腎上腺素)的腎上腺素能系統(tǒng)受體)的化學(xué)化合物或?qū)嶓w。有些腎上腺素能受體拮抗劑展現(xiàn)出一定程度的對一種受體亞型(一般是βi)的特異性；此類拮抗劑叫作“β！特異性腎上腺素能受體拮抗劑”和“β2特異性腎上腺素能受體拮抗劑”。術(shù)語“β"腎上腺素能受體拮抗劑”指作為選擇性和非選擇性拮抗劑的化學(xué)化合物。腎上腺素能受體拮抗劑的例子包括但不限于醋丁洛爾(acebutolol)、阿替洛爾(atenolol)、丁氧胺(butoxamine)、卡替洛爾(carteolol)、艾司洛爾(esmolol)、拉貝洛爾(Iabetolol)、美托洛爾(metoprolol)、納多洛爾(nadolol)、噴布洛爾(penbutolol)、普萘洛爾(propanolol)、和噻嗎洛爾(timolol)。本發(fā)明的方法涵蓋已知的β-腎上腺素能受體拮抗劑的衍生物的使用。事實(shí)上，本發(fā)明的方法涵蓋在功能上表現(xiàn)像腎上腺素能受體拮抗劑的任何化合物。術(shù)語“血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑”或“ACE抑制劑”指能夠抑制(部分地或完全地)腎素_血管緊張素系統(tǒng)中相對無活性的血管緊張素I轉(zhuǎn)化成有活性的血管緊張素II所涉及的酶的化學(xué)化合物或?qū)嶓w。另外，ACE抑制劑伴隨地抑制緩激肽的降解，這有可能顯著增強(qiáng)ACE抑制劑的抗高血壓效果。ACE抑制劑的例子包括但不限于貝那普利(benazepril)、卡托普利(captopril)、依那普利(enalopril)、福辛普利(fosinopril)、賴諾普禾IJ(Iisinopril)、喹那普利(quiapril)和雷米普利(ramipril)。本發(fā)明的方法涵蓋已知的ACE抑制劑的衍生物的使用。事實(shí)上，本發(fā)明的方法涵蓋在功能上表現(xiàn)像ACE抑制劑的任何化合物。如本文中所使用的，術(shù)語“基因型”指生物體的實(shí)際遺傳組成，而“表型”指個(gè)體所展示的身體性狀。另外，“表型”是基國組選擇性表達(dá)的結(jié)果(即它是細(xì)胞歷史的表達(dá)及其對細(xì)胞外環(huán)境的響應(yīng))。事實(shí)上，人類基因組含有估計(jì)30，000-35，000個(gè)基因。在每種細(xì)胞類型中，這些基因只有一小部分(即10-15%)表達(dá)。在權(quán)利要求書和/或說明書中與術(shù)語“包含”聯(lián)合使用時(shí)，詞語“一個(gè)/種”的使用可以表示“一個(gè)/種”，但是也與“一個(gè)/種或多個(gè)/種”、“至少一個(gè)/種”、和“一個(gè)/種或超過一個(gè)/種”的含義一致。本文中討論的任何實(shí)施方案可以用本發(fā)明的任何方法或組合物來執(zhí)行，反之亦然。另外，本發(fā)明的組合物和試劑盒可用于實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的方法。貫穿本申請，術(shù)語“約”用于表示某數(shù)值包括用于測定該數(shù)值的裝置或方法的誤差的標(biāo)準(zhǔn)偏差。權(quán)利要求書中術(shù)語“或”的使用用于表示“和/或”，除非明確指明指只選一項(xiàng)或各備選項(xiàng)相互排斥，即使公開文本支持只選一項(xiàng)的定義和“和/或”。如本說明書和權(quán)利要求書中所使用的，詞語“包含”(及其任何變形)、“具有”(及其任何變形)、“包括”(及其任何變形)或“含有”(及其任何變形)是包含性/包括性的或開放式的，不排除別的未述及的成分或方法步驟。雖然已經(jīng)在本申請中插入了章節(jié)標(biāo)題以便于閱讀，但是此類標(biāo)題不應(yīng)解釋為對實(shí)施方案的分割。包括下列實(shí)施例來進(jìn)一步例示本發(fā)明的各個(gè)方面。本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)領(lǐng)會(huì)，下文實(shí)施例中公開的技術(shù)代表了發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在實(shí)施本發(fā)明時(shí)運(yùn)轉(zhuǎn)良好且因此能視為構(gòu)成實(shí)施本發(fā)明的優(yōu)選模式的技術(shù)和/或組合物。然而，根據(jù)本公開內(nèi)容，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)領(lǐng)會(huì)可以在所公開的具體實(shí)施方案中進(jìn)行許多改變且仍然獲得類似或相似的結(jié)果而不背離本發(fā)明的精神和范圍。實(shí)施例46miR-208在α-MHC基因的內(nèi)含子內(nèi)編碼(圖1Α)。像α-MHC一樣，miR-208在心臟中特異性表達(dá)，在肺中有痕量表達(dá)(圖IB)。miR-208是自α-MHCpre-mRNA加工出來的，而不是作為分開的轉(zhuǎn)錄物轉(zhuǎn)錄得到的。然而，有趣的是，miR-208展現(xiàn)出長得引人注目的、至少14天的半衰期，而且由此甚至能在Ci-MHCmRNA表達(dá)已經(jīng)下調(diào)時(shí)發(fā)揮功能。雖然小鼠中的miR-208遺傳缺失未能誘發(fā)明顯表型，但是對來自2月齡野生型和miR-208+動(dòng)物的心臟進(jìn)行的微陣列分析揭示了miR-208的消除導(dǎo)致眾多快速骨骼肌收縮蛋白質(zhì)基因的顯著表達(dá)，它們在正常情況中在心臟中不表達(dá)。如此，這些結(jié)果提示在正常條件下，miR-208與唯一的心臟特異性MHC基因共表達(dá)，通過遏制骨骼肌基因在心臟中的表達(dá)來維持心肌細(xì)胞身份。miR-208無效(null)小鼠對心臟壓力的異常響應(yīng)揭示了miR-208的最顯著功能(vanRooij等，2007)。在對通過胸主動(dòng)脈收縮超載的壓力或?qū)︹}依賴磷酸酶(一種驅(qū)動(dòng)心臟病理性重塑的鈣/鈣調(diào)蛋白依賴性磷酸酶)的信號(hào)傳導(dǎo)的響應(yīng)中，miR-208無效小鼠實(shí)際上不顯示心肌細(xì)胞肥大或纖維化，而且沒有能力上調(diào)β-MHC表達(dá)(圖6-8)。相反，其它壓力響應(yīng)性基因(諸如那些編碼ANF和BNP的)在miR-208突變動(dòng)物中被強(qiáng)烈誘導(dǎo)，證明了miR-208專門從事對β-MHC表達(dá)的控制，它能與心臟壓力應(yīng)答的其它方面脫鉤。β-MHC表達(dá)受甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)遏制，且在甲狀腺功能減退狀態(tài)中上調(diào)(Leung等，2006)。miR-208+動(dòng)物還對T3抑制劑丙基硫尿嘧啶(PTU)(它誘發(fā)甲狀腺功能減退)處理后的β-MHC表達(dá)上調(diào)有抗性。然而，有趣的是，miR-208突變小鼠中出生前的β-MHC表達(dá)是正常的，指示miR-208專門從事對β-MHC表達(dá)的出生后調(diào)節(jié)，這與β-MHC基因的甲狀腺激素響應(yīng)性的獲得一致(圖5)。miR-208作用機(jī)制的一條線索來自miR-208+心臟與甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)心臟的類似，二者都展示出對β-MHC表達(dá)的阻斷、壓力響應(yīng)基因的上調(diào)和針對病理性肥大和纖維化的保護(hù)(圖6-10)。miR-208+心臟中快速骨骼肌基因的上調(diào)也模仿甲狀腺機(jī)能亢進(jìn)狀態(tài)中快速骨骼肌纖維的誘導(dǎo)(Wei等，2005)。這些發(fā)現(xiàn)提示miR-208(至少部分)通過遏制心臟中壓力應(yīng)答與甲狀腺激素信號(hào)傳導(dǎo)途徑的一個(gè)共同成分的表達(dá)來起作用。miR-208的最強(qiáng)的預(yù)測靶物是甲狀腺激素受體(TR)輔調(diào)節(jié)物THRAPl，它能對轉(zhuǎn)錄發(fā)揮積極和消極效果(Pantos等，2006；Yao和Eghbali，1992；圖12)。TR經(jīng)消極甲狀腺激素響應(yīng)元件(TRE)起作用來遏制成年心臟中的β-MHC表達(dá)(Zhao等，2005)。如此，在miR-208缺失的情況中THRAPl表達(dá)的升高預(yù)測會(huì)增強(qiáng)TR對β-MHC表達(dá)的遏制活性，與miR-208+心臟中對β-MHC表達(dá)的阻斷一致。然而，雖然THRAPl表現(xiàn)為miR-208的真(bonefide)靶物，但是這些數(shù)據(jù)不排除別的靶物可能參與對β-MHC表達(dá)的調(diào)節(jié)。由于對β-MHC的甚至細(xì)微變化降低成年心臟的機(jī)械性能和功效，因此探索miR-208調(diào)節(jié)對于在心臟病期間阻止β-MHC表達(dá)升高會(huì)有治療價(jià)值。miR-208對心臟壓力應(yīng)答(而非正常心臟發(fā)育)的心臟特異性和專注性使得miR-208(及其下游效應(yīng)物(effector))成為操作β-MHC水平的誘人治療靶(圖13)。材料和方法Northern印跡分析。自GileadColorado(Westminster，C0)獲得診斷為具有非衰竭或衰竭心臟的匿名人士的左心室的心臟組織樣品。獲得診斷為罹患心肌梗死的匿名人士的緣帶區(qū)域的心臟組織樣品。使用Trizol試劑(Gibco/BRL)，自細(xì)胞、小鼠、大鼠和人類心臟組織樣品或分離的肌細(xì)胞分離總RNA。通過用溴化乙啶染色Northern凝膠來證實(shí)相等的加載。如先前所述(vanrooij等，2006)實(shí)施Northern印跡來檢測微小RNA。TO探針充當(dāng)加載對照。為了檢測α-MHC表達(dá)，用覆蓋第一外顯子和5'UTR區(qū)一部分的α-MHCcDNA片段探查含有10μg來自成年野生型和miR-208突變型動(dòng)物二者心臟組織的RNA的Northern印跡。PTU處理。通過用補(bǔ)充有0.15%PTU(購自HarlanTekladCo.，TD97061，Madison,WI)的無碘食物喂養(yǎng)動(dòng)物指定持續(xù)時(shí)間來誘發(fā)甲狀腺激素缺乏。微陣列和實(shí)時(shí)PCR分析。使用Trizol(Invitrogen)自心臟組織分離總RNA。使用小鼠基因組4302.O陣列(Affymetrix)實(shí)施微陣列分析。為了檢測miRNA水平，使用Taqman微小RNA逆轉(zhuǎn)錄酶試劑盒(AppliedBiosystems,ABI)依照制造商的推薦實(shí)施RT-PCR。用miRNA特異性引物使用5ngRNA來生成cDNA，之后用miRNA特異性Taqman探針來檢測感興趣miRNA的表達(dá)水平。用隨機(jī)六聚物引物(Invitrogen)對RNA樣品進(jìn)行RT-PCR后，使用購自ABI的Taqman探針通過PCR或定量實(shí)時(shí)PCR分析一個(gè)基因子集的表達(dá)。miR-208突變小鼠的生成。為了生成miR-208靶向載體，將向miR-208編碼區(qū)上游延伸的0.4kb片段(5'臂)用SacII和NotI消化并連接入pGKne0F2L2dta靶向質(zhì)粒，在IoxP位點(diǎn)和側(cè)翼為Frt的新霉素盒的上游。將3.3kb片段(3'臂)用SalI和HindIII消化并連接入載體，在新霉素抗性與和Dta負(fù)選擇盒之間。用5'和3'探針通過Southern印跡分析來鑒定攜帶被破壞的等位基因的靶定ES細(xì)胞。鑒定出三個(gè)miR-208靶定ES克隆并用于胚泡注射。將所得嵌合小鼠與C57BL/6交配以獲得突變等位基因的種系傳遞。轉(zhuǎn)基因小鼠的生成。將感興趣miRNA側(cè)翼的小鼠基因組片段亞克隆入含有α-MHC和人GHpoly(A)+信號(hào)的心臟特異性表達(dá)質(zhì)粒(Kiriazis和Kranias，2000)。自小鼠尾部活檢分離基因組DNA，并使用對人GHpoly(A)+信號(hào)特異性的引物通過PCR來分析。Western印跡。如文獻(xiàn)所述(Morkin，2000)自心臟組織提取肌球蛋白。通過SDSPAGE將MHC同等型分開，并用小鼠單克隆a-MHC(BA-G5)(ATCC，Rockville，MD)和小鼠單克隆抗肌球蛋白(慢速，骨骼M8421)(Sigma,M0)(它是對β-MHC高度特異性的)實(shí)施Western印跡。為了檢測所有成紋的肌球蛋白，使用泛特異性抗體(panspecificantibody)(小鼠單克隆3-48；AccurateChemical&ScientificCorporation,NY)通過來自400μg心臟蛋白質(zhì)溶胞物的免疫沉淀來檢測THRAP1。將樣品于4°C預(yù)澄清1小時(shí)后，將上清液與1μ1家兔多克隆抗THRAPl(由RockefellerUniversity的R.Roeder饋贈(zèng))和15μ1蛋白質(zhì)A珠一起于4°C溫育過夜。將珠用裂解緩沖液清洗三次并在SDS樣品緩沖液中煮沸。通過SDS-PAGE解析免疫沉淀的THRAPl蛋白質(zhì)，并使用13000稀釋的家兔多克隆抗THRAPl和15000稀釋的偶聯(lián)有辣根過氧化物酶的抗家兔IgG分析，其中通過魯米諾試劑(SantaCruz)來檢測。組織學(xué)分析和RNA原位雜交。將用于組織學(xué)的組織在Krebs-Henselheit溶液中溫育，在4%低聚甲醛中固定，切片，并為蘇木精和曙紅(H&E)加工，及Masson氏三色染色或通過標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)進(jìn)行的原位雜交(Krenz和Robbins，2004)。使用Maxiscript試劑盒(Amersham)生成35S標(biāo)記的RNA探針。使用AdobePhotoshop將信號(hào)假著色成紅色。經(jīng)胸超聲心動(dòng)圖顯象。使用VingmedSystem(GEVingmedUltrasound，Horten，48Norway)和11.5MHz線性陣列轉(zhuǎn)換器，通過有意識(shí)的小鼠中的二維超聲心動(dòng)圖顯象來評估心臟功能和心臟尺度。使用M模式描記來測量心舒末期和心縮末期的前后壁厚。作為心舒期(LVIDd)或心縮期(LVIDs)的最大前后徑，測量左心室(LV)內(nèi)徑(LVID)。由一名對小鼠基因型不知情的觀察員分析了數(shù)據(jù)。依照下式計(jì)算了LV縮短分?jǐn)?shù)(FS):FS(%)=[(LVIDd-LVIDs)/LVIDd]X100。質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染測定法。通過PCR擴(kuò)增涵蓋miR-208編碼區(qū)的305bp基因組片段并連接入pCMV6。PCR擴(kuò)增涵蓋整個(gè)鼠THRAP1-UTR的Ikb片段并連接入帶HA標(biāo)簽的pCMV6表達(dá)構(gòu)建體和螢火蟲螢光素酶(f-luc)報(bào)告構(gòu)建體(pMIR-REPORT，Ambion)。經(jīng)由基于PCR的誘變構(gòu)建了UCGUCUUAmiR-208種子結(jié)合序列的一種突變形式。細(xì)胞培養(yǎng)、轉(zhuǎn)染和螢光素酶測定法。通過PCR擴(kuò)增涵蓋miR-29b-l和miR-29a編碼區(qū)的1793bp基因組片段并連接入pCMV6。PCR擴(kuò)增涵蓋miR-29a-c結(jié)合位點(diǎn)的鼠3'UTR的基因組片段并連接入螢火蟲螢光素酶(f-luc)報(bào)告構(gòu)建體(pMIR-REPORT，Ambion)。用Fugene6(Stratagene)依照制造商的指令轉(zhuǎn)染COS細(xì)胞。通過添加相應(yīng)量的不含cDNA插入物的表達(dá)載體，保持每個(gè)孔的DNA總量恒定。轉(zhuǎn)染后48小時(shí)，使用螢光素酶測定法試劑盒(Promega)測定細(xì)胞提取物的螢光素酶表達(dá)。相對啟動(dòng)子活性表述成相對于細(xì)胞提取物中半乳糖苷酶表達(dá)標(biāo)準(zhǔn)化的發(fā)光相對單位。如先前所述(Simpson和Savion，1982)分離心臟成纖維細(xì)胞(CF)。簡言之，自麻醉的新生1-2日齡Sprague-Dawley大鼠(HarlanSpragueDawley,Indianapolis,IN)切出心臟，切碎，并用0.1%胰酶制劑消化。將細(xì)胞鋪涂在primaria板上2小時(shí)，并清除含有經(jīng)消化組織的心肌細(xì)胞級(jí)分的培養(yǎng)基。心臟成纖維細(xì)胞比心臟肌細(xì)胞快得多地附著和增殖；這實(shí)際上在第一次傳代后生成純的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物，這通過反復(fù)的分化鋪板(differentialplating)和顯微鏡評估得到證實(shí)。為了傳代用0.05%胰蛋白酶使細(xì)胞脫離，并在第2-4代實(shí)施培養(yǎng)物研究。在含有10%熱滅活FBS和抗生素(青霉素和鏈霉素)的高葡萄糖(4.5gm/It)的Dulbecco氏改良Eagle氏培養(yǎng)基(DMEM)中培養(yǎng)細(xì)胞。通過將培養(yǎng)物變成低血清(2%FBS)及L-抗壞血酸(10μg/μ1)并施用lOng/mlTGFβ148小時(shí)來誘導(dǎo)肌成纖維細(xì)胞分化。通過反miR處理進(jìn)行的體內(nèi)miR_29b沉默。使用經(jīng)過化學(xué)修飾的、包含與miR_29b互補(bǔ)的序列的反義寡核苷酸(反miR-29b)來抑制miR-29b表達(dá)。所有堿基都是2'-OMe修飾的，頭兩個(gè)和最后四個(gè)堿基含有硫代磷酸酯核苷間鍵，且該寡核苷酸的3'端偶聯(lián)有膽固醇。八周齡C57BL/6雄性小鼠經(jīng)尾部靜脈注射以80mg/kg體重的劑量接受反miR_29b(AsAsCACUGAUUUCAAAUG⑶sGsCsUsAs-膽固醇)或錯(cuò)配miR_29b(AsAsAACUGAU⑶CACAUG⑶sGsAsUsAs-膽固醇)或體積相當(dāng)?shù)柠}水。處理后3天或3周收集組織。實(shí)施例1壓力響應(yīng)性miRNA對心臟肥大和心力衰竭的調(diào)節(jié)根據(jù)它們在調(diào)控細(xì)胞表型中的參與，發(fā)明人假設(shè)miRNA在調(diào)節(jié)心臟對心臟壓力的響應(yīng)中發(fā)揮作用，已知這導(dǎo)致基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄和翻譯變化。為了調(diào)查miRNA在心臟肥大中可能的參與，他們使用代表186種不同miRNA的微陣列(Babak等，2004)在2種已建立的小鼠心臟肥大模型中實(shí)施了并行(Side-by-Side)miRNA微陣列分析。將進(jìn)行胸主動(dòng)脈繃扎(這通過提高心臟的后負(fù)荷而誘發(fā)肥大)的小鼠(TAB)(Hill等，2000)與進(jìn)行假手術(shù)的動(dòng)物進(jìn)行比較。在第二種模型中，將在心臟中表達(dá)激活的鈣依賴磷酸酶(CnA)(這導(dǎo)致嚴(yán)重49的、已表征形式的肥大)的轉(zhuǎn)基因小鼠(Molkentin等，1998)與野生型同窩幼仔進(jìn)行比較(圖14A)。自進(jìn)行TAB的小鼠的心臟分離的RNA顯示出與進(jìn)行假手術(shù)的對照相比升高的27種miRNA表達(dá)，而CnATg小鼠顯示出與非轉(zhuǎn)基因同窩幼仔對照相比升高的33種miRNA表達(dá)，其中21種在這兩種模型中都上調(diào)。類似地，TAB和CnA誘發(fā)的肥大分別伴有降低的15種和14種miRNA表達(dá)，其中7種miRNA共同下調(diào)(圖14B)。對這些miRNA的Northern分析(未公開的數(shù)據(jù))和先前的微陣列分析(Barad等，2004；Sempere等，2004；Shingara等，2005;Liu等，2004)指出了它們在廣泛的組織中表達(dá)?；谒鼈兊南鄬Ρ磉_(dá)水平，人類、大鼠和小鼠序列的保守性，及肥大期間的表達(dá)水平，發(fā)明人聚焦于11種上調(diào)的miRNA和5種下調(diào)的miRNA(圖14C)。對來自WT和CnATg動(dòng)物的心臟RNA的Northern印跡分析證實(shí)了升高的miR-21、-23、-24、-125b、-195、-199a、和-214表達(dá)及降低的miR-29、-93、_150和-181b表達(dá)(圖14C和圖15)?？傊?，這些數(shù)據(jù)指示獨(dú)特的miRNA在心臟肥大期間上調(diào)，提示它們發(fā)揮此過程調(diào)控物的功能的可能性。實(shí)施例2:miR-29家族作為miR-208調(diào)節(jié)的下游靶物的發(fā)現(xiàn)在鑒定可能介導(dǎo)miR-208的作用的下游miRNA的努力中，本發(fā)明人對來自野生型和miR-208無效小鼠的心臟實(shí)施了miRNA微陣列(圖16)。他們發(fā)現(xiàn)miR-29家族的多個(gè)成員在miR-208無效小鼠中上調(diào)(圖17)。靶物預(yù)測指示miR-29家族成員靶向編碼多種膠原和細(xì)胞外基質(zhì)其它成分的mRNA(圖18)。如此，miR-208無效小鼠中miR-29家族成員的上調(diào)有可能說明在這些動(dòng)物中看到的對纖維化的阻斷(圖19)。miR-29a-c在患病心臟中下調(diào)并靶向編碼膠原和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)的mRNA的發(fā)現(xiàn)提示增強(qiáng)miR-29a-c表達(dá)或其與靶物mRNA的結(jié)合的策略會(huì)對病理性心臟重塑和纖維化背景中的心臟具有有益效果。此外，miR-29a-c表達(dá)或功能的升高可阻止組織(諸如骨骼肌、肝、肺、腎和其它)中與許多疾病有關(guān)的纖維化。另外，miR-208遏制miR-29a-c表達(dá)及miR-208的丟失上調(diào)miR-29a-c表達(dá)的發(fā)現(xiàn)指示miR-29a_c是miR-208對心臟的作用的下游介導(dǎo)物。實(shí)施例3:miR-29a-c調(diào)節(jié)纖維變性基因的表達(dá)為了開始限定MI后心臟中miR-29a-c可能的功能，發(fā)明人利用計(jì)算預(yù)測來鑒定可能的miR-29a-c靶物。Targetscan預(yù)測萬維網(wǎng)站指出了數(shù)目出乎意料高的編碼膠原、金屬肽酶、和整聯(lián)蛋白的纖維化相關(guān)mRNA作為可能的miR-29a-c靶物(萬維網(wǎng)網(wǎng)站位于targetscan.org)。為了確定miR-29a-c下調(diào)可能調(diào)節(jié)心臟纖維化，發(fā)明人聚焦于涉及心臟中ECM生成的預(yù)測靶物。彈性蛋白(ELN)、微纖維蛋白1(FBm)、I型膠原α1和α2(C0L1A1、C0L1A2)及III型膠原α1(C0L3A1)都含有miR-29a-c的一種或多種保守的潛在種子序列(圖20A)。因?yàn)閙iRNA下調(diào)其靶mRNA的穩(wěn)態(tài)水平以及翻譯，發(fā)明人分析了預(yù)測miR-29a_CmRNA靶的表達(dá)。對MI后3天心臟樣品中心臟纖維化的這些關(guān)鍵調(diào)節(jié)性基因的實(shí)時(shí)RT-PCR分析指示梗死區(qū)域中miR-29a-c的特異性下調(diào)與COLlAl、C0L1A2、C0L3A1、和FBm表達(dá)升高有關(guān)。相反，ELN表現(xiàn)出在緣帶中無變化，而且甚至顯示出在遠(yuǎn)端心肌中升高(圖20B)。使用CMV驅(qū)動(dòng)的表達(dá)質(zhì)粒，發(fā)明人用含有預(yù)測miR-29a-c靶物3‘-UTR的螢光素酶表達(dá)質(zhì)粒在COS細(xì)胞中過表達(dá)miR-29b-l和miR_29a(圖20C)。提高CMV驅(qū)動(dòng)的miR-29b-l/miR-29a的量導(dǎo)致螢光素酶活性的劑量依賴性降低，但是相當(dāng)量的miR_206(作為對照)沒有效果(圖20C-D)，證明了這些mRNA是受miR-29a-c遏制的靶物。實(shí)施例4心臟成纖維細(xì)胞中對miR-29a_c的調(diào)節(jié)心臟纖維化是在衰竭心臟中通?？吹降闹厮苓^程的一個(gè)重要方面。成纖維細(xì)胞的增殖和ECM成分的沉積增加導(dǎo)致心肌僵硬和舒張功能障礙。轉(zhuǎn)化生長因子β(TGFβ)已經(jīng)顯示出在心臟中膠原的生成和沉積方面發(fā)揮支配性作用，并誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變成肌成纖維細(xì)胞(Border和Noble，1994)。對暴露于TGFβ的心臟成纖維細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)時(shí)PCR分析揭示了miR-29a-c表達(dá)的降低，提示MI后的miR-29a-c降低可能受TGFβ調(diào)節(jié)(圖21Α)。有趣的是，利鈉肽(像B型利鈉肽(BNP))已經(jīng)顯示出抑制與纖維化和肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)變有關(guān)的、受TGEβ調(diào)節(jié)的基因表達(dá)(Kapoim等，2004)。在這點(diǎn)上，發(fā)明人先前報(bào)告了缺乏心臟特異性miRNAmiR-208的小鼠對心臟纖維化和重塑有抗性，而且在基線時(shí)展現(xiàn)出升高的BNP表達(dá)(vanRooij等，2007)。由于已知BNP拮抗TGFβ的效果，因此本發(fā)明人推測這些小鼠中升高的BNP水平可能增強(qiáng)miR-29a-c的表達(dá)。事實(shí)上，Northern分析顯示了清除miR-208后miR-29a-c表達(dá)的劑量依賴性升高，這與越來越高的BNP表達(dá)水平相符(圖21B)。這些數(shù)據(jù)指示TGFii在成纖維細(xì)胞中誘導(dǎo)膠原相關(guān)基因表達(dá)，至少部分經(jīng)由降低miR-29a-c水平來實(shí)現(xiàn)，它們可以被由心肌細(xì)胞分泌的BNP抑制。實(shí)施例5:miR-29a-c體內(nèi)敲低誘導(dǎo)纖維化和膠原基因表達(dá)為了進(jìn)一步探索miR-29a-c作為膠原表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)物的潛在作用，發(fā)明人使用與miR-29b的成熟miRNA序列互補(bǔ)的膽固醇修飾寡核苷酸(反miR-29b)在體內(nèi)敲低miR_29b，以鹽水或包含四堿基錯(cuò)配的寡核苷酸(mmmiR-29b)作為陰性對照(圖22A)。單次尾部靜脈注射反miR-29b(80mg/kg)后三天，發(fā)明人觀察到所檢查的所有組織中miR_29b表達(dá)的顯著降低(圖22B)。相反，與鹽水對照相比，相當(dāng)劑量的mmmiR_29b反義寡核苷酸對miR_29b的表達(dá)水平?jīng)]有影響。通過反miR-29b實(shí)現(xiàn)的敲低表現(xiàn)出是對成熟miRNA特異性的，因?yàn)閜re-miRNA的水平在反miR和mm處理的動(dòng)物間仍然相當(dāng)。雖然肝和腎中的敲低表現(xiàn)出是完全的，但是在心和肺中仍然可檢測到低水平的miR-29b(圖22B)。由于其它miR-29成員與miR_29b共享高序列同源性，因此還檢查了響應(yīng)反miR-29b的miR-29a和-C表達(dá)。雖然在肝和腎中檢測到顯著的敲低(尤其是miR_29c)，但是心臟表達(dá)沒有表現(xiàn)出變化(圖23)。實(shí)時(shí)PCR分析指示miR-29b敲低足以在肝中特異性誘導(dǎo)膠原基因表達(dá)，但是錯(cuò)配對照中沒有這種效果(圖22C)。為了增強(qiáng)miR-29b的心臟敲低，發(fā)明人連續(xù)兩天靜脈內(nèi)注射80mg/kg寡核苷酸，并在3周后收集材料。與mmmiR-29b注射后看到的表達(dá)水平相比，Northern分析指示腎和肝中響應(yīng)反miR-29b的miR-29b完全敲低。miR_29b的心臟水平也顯著降低，但是肺中的miR-29b表達(dá)表現(xiàn)出不受反miR-29b影響(圖22D)。心中的膠原表達(dá)響應(yīng)miR_29b抑制而升高(圖22E)?？傊@些數(shù)據(jù)指示miR-29b在體內(nèi)發(fā)揮膠原基因表達(dá)的負(fù)調(diào)節(jié)物的功能，并由此影響心和肝中的膠原沉積和纖維化。實(shí)施例6用miR-29a-c模擬物下調(diào)膠原表達(dá)為了確定miR-29a-c過表達(dá)是否能夠降低膠原表達(dá)，本發(fā)明將成纖維細(xì)胞暴露于miR-29b模擬物。暴露于miR-29b模擬物3天后，成纖維細(xì)胞培養(yǎng)物中的miR_29b表達(dá)水平升高了多達(dá)400倍(圖22F)。miR-29a表達(dá)不受影響，而miR_29c表達(dá)只被miR_29b模擬51物輕微升高(圖22F)。實(shí)時(shí)PCR分析指示膠原基因的表達(dá)響應(yīng)miR-29b模擬物而降低(圖22G)。然而，膠原表達(dá)的降低程度與miR-29b表達(dá)的升高相比是中等的，指示miR-29a-c水平不是膠原水平的唯一決定子。通過述及將本文中所討論和引用的所有出版物、專利和專利申請完整收入本文。根據(jù)本公開文本，無需過度實(shí)驗(yàn)就能做出和執(zhí)行本文中所公開的和要求保護(hù)的所有組合物和方法。雖然已經(jīng)在優(yōu)選實(shí)施方案方面描述了本發(fā)明的組合物和方法，但是對本領(lǐng)域技術(shù)人員會(huì)顯而易見的是，可以對本文所述組合物和方法，及所述方法的各步驟或各步驟的順序進(jìn)行改變而不背離本發(fā)明的概念、精神和范圍。更具體的說，會(huì)顯而易見的是，在化學(xué)和生理學(xué)這兩方面相關(guān)的某些試劑可以替代本文所述藥劑，而會(huì)實(shí)現(xiàn)相同或相似的結(jié)果。認(rèn)為對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的所有此類相似替代和修改在本發(fā)明的精神、范圍和概念內(nèi)，它們由所附權(quán)利要求限定。參考文獻(xiàn)通過述及明確將下列參考文獻(xiàn)收入本文，其程度為它們提供例示性的規(guī)程或其它詳情來補(bǔ)充本文所列的那些。U.S.Patent4，873，191U.S.Patent5，604，251U.S.Patent5，844，107U.S.Patent5，877，302U.S.Patent5，972，900U.S.Patent5，972，901U.S.Patent6，008，336U.S.Patent6，077，835U.S.Patent6，200，801U.S.Publn.20020150626U.S.Publn.20030032615U.S.Publn.20030203865U.S.Publn.20040048787Abrahametal.，Mol.Med.，8:750_760，2002.Ambros,Cell,113(6):673_676，2003.Angeletal,Cell,49729,1987b.Angeletal,Mol.Cell.Biol,7-.2256,1987a.AtchisonandPerry,Cell,46:253，1986.AtchisonandPerry,Cell,48:121，1987.Babaketal.，RNA10:1813-1819，2004.BaichwalandSugden,In:GeneTransfer,Kucherlapati(Ed.),PlenumPress,NY,117-148，1986.Banerjietal,Cell,27(2Pt1)=299-308,1981.Banerjietal,Cell,33(3):729_740，1983.Baradetal,GenomeRes.14=2486-2494,1997.Barnesetal,J.Biol.Chem.,272(17):11510_11517，1997.Bavtd,Cell,116:281_297，2004.BenvenistyandNeshif,Proc.NatlAcad.Sd.USA,83(24):9551-9555,1986.Berketal.，J.Clin.Invest.117:568_575，2007.Berkhoutetal.，Cell,59:273_282，1989.Bhavsaretah,Genomics,35(1):11-23,1996.Blanavetal.,EMBOJ.,8:1139,1989.BodineandLey,EMBOJ,6-.2997,1987.BorderandNoble,N.Engl.J.Med.，331:1286-1292，1994.Boshartetal.,Cell,41:521,1985.Boszeetal.，M50J.,5(7):1615_1623，1986.Braddocketal.,Cell,58-.269,1989.Brenneckeetal，Cell，113:25_36，2003.Brinsteretal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82(13):4438-4442,1985.Bristow,Cardiology,92:3_6，1999.BullaandSiddiqui,J.Virol,62:1437,1986.Calinetal,Proc.Natl.Acd.Sci.USA,9915524-15529,2002.CampbellandVillarreal,MolCell.Biol,8:1993,1988.CampereandTilghman,GenesandDev.,3:537,1989.Campoetal,Nature,303-.77,1983.Careetal，Nat.Med.13:613_618，2007.CarringtonetalScience,301(5631):336-338,2003.CelanderandHaseltine,J.Virology,61-.269,1987.Celanderetal.,J.Virology,62:1314,1988.Chandleretal,Cell,33:489,1983.ChangandKarin，Nature，410(6824):37_40，200LChangetal,Biochim.Biophys.Acta,1092(2):153—160，1991·Changetal,MolCell.Biol,9:2153，1989.Changetal,Nature,430(7001):785_789，2004.Chatterjeeetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,86:9114,1989.ChenandOkayama,MolCellBiol,7(8):2745-2752,1987.Chenetal,Science,303(5654):83_86，2004.Choietal,Cell,53:519，1988.Coffin,In=Virology,Fieldsetal(Eds.),RavenPress,NY,1437-1500,1990.Cohenetal,J.Cell.Physiol,5-.75,1987.Costaetal,MolCell.Biol,8:81,1988.Couchetal,Am.Rev.Resp.Dis.,88394-403,1963.Couparetal.,Gene,68:1_10,1988.Cripeetal，EMB0J.，6:3745，1987.CulottaandHamer，MolCell.Biol,9:1376,1989.Oandoloetal.，J.Virology,47:55_64，1983.DeVilliersetal,Nature,312(5991):242_246，1984.Deschampsetal,Science,2301174-1177,1985.Dubenskyetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,817529-7533,1984.Durandetal,Ann.Med.,27311-317,1995.Edbrookeetal,MolCell.Biol,9:1908，1989.EdgertonandRoy,J.ApplPhysiol,89:1224—1231，2000.Edlundetal，Science,230:912_916，1985.EichhornandBristow,Circulation,94:2285_2296，1996.EPO0273085Fatkinetal,J.Clin.Invest.,106(11):1351—1359，2000.Fechheimer,etal,ProcNatl.Acad.Sci.USA,84:8463-8467,1987.FengandHolland,Nature,334:6178，1988.Ferkoletal,FASEBJ.，7:1081_1091，1993.FirakandSubramanian,MolCell.Biol,6:3667，1986.FoeckingandHofstetter,Gene,45(1):101-105，1986.Fraleyetal,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,76:3348_3352，1979.Franzetal,Cardioscience,5(4):235-43,1994.Freyetal,Circulation109:1580-1589,2004·Friedmanetal,GenesDevel,3:1314,1989.Fujitaetal,Cell,49:357,1987.GhoshandBachhawat,In:LiverDiseases,TargetedDiagnosisandTherapyUsingSpecificReceptorsandLigands,Wuetal(Eds.),MarcelDekker,NY,87-104，1991.Ghosh-Choudhuryetal,EMBOJ.，6:1733-1739，1987.Gillesetal,Cell,33:717,1983.Glossetal,EMBOJ.,6:3735,1987.Godboutetal,MolCell.Biol,8:1169,1988.Gomez-Foixetal，J.Biol.Chem.，267:25129_25134，1992.GoodbournandManiatis,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85:1447,1988.Goodbournetal,Cell,45:601,1986.GopaLMo1.CellBiol,5:1188_1190，1985.Gopal-Srivastavaetal.，J.MolCellBiol.15(12):7081_7090，1995.GrahamandPrevec,In:MethodsinMolecularBiology:GeneTransferandExpressionProtocol,Murray(Ed.),HumanaPress,Clifton,NJ,7109-128,1991.GrahamandVanDerEb,Virology,52:456_467，1973.Grahametah,J.Gen.Virl，36(1):59_74，1977.Greeneetal,ImmunologyToday,10:272,1989Grishoketal，Cell，106:23_34，2001.54GrosschedlandBaltimore,Cell,41885,1985.GrunhausandHorwitz,SeminarinVirology,3237-252,1992.Harlandandffeintraub,J.Cel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要求14的方法，其中所述有風(fēng)險(xiǎn)的受試者已經(jīng)診斷為具有對心臟肥大的遺傳素因。20.權(quán)利要求14的方法，其中所述有風(fēng)險(xiǎn)的受試者具有心臟肥大的家族史。21.—種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞未能表達(dá)功能性miR-29a、miR29b、和/或miR29c。22.權(quán)利要求21的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物是小鼠。23.一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物，其細(xì)胞包含在異源啟動(dòng)子控制下的miR-29a-c編碼區(qū)，所述異源啟動(dòng)子在所述非人哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中有活性。24.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其中所述哺乳動(dòng)物是小鼠。25.權(quán)利要求23的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其中所述啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子。26.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是肌肉特異性啟動(dòng)子或成纖維細(xì)胞特異性啟動(dòng)子。27.權(quán)利要求25的轉(zhuǎn)基因哺乳動(dòng)物，其中所述組織特異性啟動(dòng)子是心肌特異性啟動(dòng)子。28.一種轉(zhuǎn)基因的非人哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其缺少miR-29a、miR_29b、和/或miR_29c的兩個(gè)天然等位基因之一或二者。29.權(quán)利要求28的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞缺少所有所述天然miR-29a-c等位基因。30.一種在有所需要的受試者中治療心肌梗死的方法，包括提升所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。31.一種在有所需要的受試者中預(yù)防心臟肥大和擴(kuò)張性心肌病的方法，包括提升所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。32.—種在有所需要的受試者中抑制心臟肥大進(jìn)展的方法，包括提升所述受試者的心臟細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)或活性。33.一種在受試者中治療或預(yù)防組織纖維化的方法，包括(a)鑒定具有組織纖維化或有組織纖維化風(fēng)險(xiǎn)的受試者；并(b)提高所述受試者的骨骼肌細(xì)胞或成纖維細(xì)胞中miR-29a-c的表達(dá)和/或活性。34.權(quán)利要求33的方法，其中所述組織纖維化是心臟纖維化、硬皮病、骨骼肌纖維化、肝纖維化、腎纖維化、肺纖維化、或糖尿病纖維化。35.權(quán)利要求33的方法，其中提高miR-29a-c的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用miR-29a-c的激動(dòng)劑。36.權(quán)利要求35的方法，其中所述miR-29a-c激動(dòng)劑是包含序列SEQIDNO18、SEQIDNO:19、或SEQIDNO20的多核苷酸。37.權(quán)利要求33的方法，其中提高miR-29a-c的表達(dá)和/或活性包括給所述受試者施用編碼miR-29a-c的表達(dá)載體。38.權(quán)利要求37的方法，其中所述表達(dá)載體是病毒表達(dá)載體。39.權(quán)利要求38的方法，其中所述病毒表達(dá)載體是腺病毒表達(dá)載體。40.權(quán)利要求37的方法，其中所述表達(dá)載體是非病毒表達(dá)載體。41.權(quán)利要求40的方法，其中所述非病毒表達(dá)載體包含在脂質(zhì)媒介物內(nèi)。42.權(quán)利要求35的方法，其中所述miR-29a-c激動(dòng)劑包含在脂質(zhì)媒介物內(nèi)。43.權(quán)利要求33的方法，進(jìn)一步包括給所述受試者施用非miR-29a-c抗纖維變性療法。44.一種用于鑒定miR-29a-c調(diào)控物的方法，包括(a)使細(xì)胞接觸候選化合物；(b)評估m(xù)iR-29a-c活性或表達(dá)；并(c)比較步驟(b)中的活性或表達(dá)與不存在所述候選化合物時(shí)miR-29a-c的活性或表達(dá)，其中測量得到的miR-29a-c活性或表達(dá)間的差異指示所述候選化合物是miR-29的調(diào)控物。45.權(quán)利要求44的方法，其中在體外使所述細(xì)胞與所述候選化合物接觸。46.權(quán)利要求44的方法，其中在體內(nèi)使所述細(xì)胞與所述候選化合物接觸。47.權(quán)利要求44的方法，其中所述miR-29a-c調(diào)控物是miR-29a-c的激動(dòng)劑。48.權(quán)利要求44的方法，其中所述miR-29a-c調(diào)控物是miR-29a-c的拮抗劑。49.權(quán)利要求44的方法，其中所述候選化合物是蛋白質(zhì)、肽、多肽、多核苷酸、寡核苷酸或小分子。50.權(quán)利要求44的方法，其中評估m(xù)iR-29a-c活性或表達(dá)包括評估m(xù)iR-29a-c的表達(dá)。51.權(quán)利要求50的方法，其中評估m(xù)iR-29a-c的表達(dá)包括Northern印跡或RT-PCR。52.權(quán)利要求44的方法，其中評估m(xù)iR-29a-c活性或表達(dá)包括評估m(xù)iR-29a-c的活性。53.權(quán)利要求52的方法，其中評估m(xù)iR-29a-c的活性包括評估受miR-29a-c調(diào)節(jié)的基因的表達(dá)或活性。54.權(quán)利要求53的方法，其中所述受miR-29a-c調(diào)節(jié)的基因是COLlAl、C0L1A2、C0L1A3和/或FBNl。55.一種藥物組合物，其包含miR-29a-c的激動(dòng)劑。56.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述激動(dòng)劑是編碼miR-29a-c的表達(dá)載體。57.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述激動(dòng)劑是包含miR-29a、miR-29b、miR-29C的成熟序列的多核苷酸。58.權(quán)利要求57的藥物組合物，其中所述多核苷酸包含序列SEQIDNO18,SEQIDNO19、或SEQIDNO:20。59.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述激動(dòng)劑包含在脂質(zhì)遞送媒介物中。60.權(quán)利要求55的藥物組合物，其中所述組合物是為注射而配制的。61.權(quán)利要求55的藥物組合物，其與用于胃腸外施用的試劑盒組合。62.權(quán)利要求61的藥物組合物，其中所述胃腸外施用是靜脈內(nèi)或皮下的。63.權(quán)利要求55的藥物組合物，其與供導(dǎo)管施用用的試劑盒組合。64.一種藥物組合物，其包含miR-29a-c的拮抗劑。65.權(quán)利要求64的藥物組合物，其中所述miR-29a-c拮抗劑是miR-29a-c的小RNA拮ifi^Ll(antagomir)。66.權(quán)利要求64的藥物組合物，其中所述miR-29a-c拮抗劑包含與miR-29a、miR-29b、miR-29c、或其組合的成熟序列互補(bǔ)的序列。67.權(quán)利要求64藥物組合物，其中所述組合物是為局部施用而配制的。68.權(quán)利要求67的藥物組合物，其中所述組合物是凝膠、乳膏、洗劑、或軟膏劑。69.一種在組織中誘導(dǎo)膠原沉積的方法，包括使所述組織接觸miR-29a-c的拮抗劑。70.權(quán)利要求69的方法，其中所述拮抗劑是miR-29a、miR-29b、或miR-29c的拮抗劑。71.權(quán)利要求69的方法，其中所述拮抗劑是miR-29a-c的小RNA拮抗劑。72.權(quán)利要求69的方法，其中所述拮抗劑包含與miR-29a、miR-29b、miR-29C、或其組合的成熟序列互補(bǔ)的序列。73.權(quán)利要求69的方法，其中所述拮抗劑包含與SEQIDNO18,SEQIDN0:19、或SEQIDNO20互補(bǔ)的序列。74.權(quán)利要求69的方法，其中所述組織是面部組織。75.權(quán)利要求74的方法，其中所述面部組織是額組織、唇、頰、頦、眉、眼瞼、眼的下面、或口的附近。76.權(quán)利要求69的方法，其中所述組織是手組織、頸組織、臂組織、腿組織、胃組織、或乳房組織。77.權(quán)利要求69的方法，其中所述組織包括傷口、皮膚移植物、瘢痕組織、皺紋、皮膚松垂、曬傷、化學(xué)損傷、燙傷、凍傷、和/或拉伸紋。78.權(quán)利要求69的方法，其中接觸包括注射入所述組織中、注射入供給所述組織的脈管系統(tǒng)中、或局部應(yīng)用。79.權(quán)利要求78的方法，其中局部應(yīng)用包括軟膏劑、乳膏、凝膠、油膏劑、或香膏的使用。80.權(quán)利要求78的方法，進(jìn)一步包括壓迫繃帶或裹覆物的使用。81.權(quán)利要求69的方法，其中所述拮抗劑接觸所述組織超過一次。82.權(quán)利要求81的方法，其中所述拮抗劑接觸所述組織2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90或100次。83.權(quán)利要求81的方法，其中所述拮抗劑與所述組織接觸超過2、3、4、5、或6天，1、2、3、或4周，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或11個(gè)月，或1、2、3、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、或25年。84.權(quán)利要求69的方法，進(jìn)一步包括使所述組織接觸第二藥劑。85.權(quán)利要求84的方法，其中所述第二藥劑是局部維生素A、局部維生素C、或維生素86.權(quán)利要求69的方法，進(jìn)一步包括對所述組織進(jìn)行第二處理。87.權(quán)利要求86的方法，其中所述第二處理包括化學(xué)脫皮、激光處理、皮膚整平、或皮膚磨削術(shù)。88.權(quán)利要求69的方法，其中所述組織在罹患埃勒斯_當(dāng)洛綜合征或維生素C缺乏病的受試者中。全文摘要本發(fā)明涉及作為心臟組織中纖維化的關(guān)鍵調(diào)節(jié)物的稱作miR-29a-c的微小RNA家族的鑒定。發(fā)明人顯示了miR-29家族的成員在心臟組織中響應(yīng)壓力而下調(diào)，且在對壓力和纖維化都有抗性的小鼠的心臟組織中上調(diào)。還提供了調(diào)控miR-29miRNA家族的表達(dá)和活性的方法，作為對纖維變性疾病，包括心臟肥大、骨骼肌纖維化、其它纖維化相關(guān)疾病和膠原丟失相關(guān)疾病的治療。文檔編號(hào)C12N15/113GK101883576SQ200880109703公開日2010年11月10日申請日期2008年7月31日優(yōu)先權(quán)日2007年7月31日發(fā)明者伊娃·范魯伊杰,埃里克·奧爾森申請人:得克薩斯系統(tǒng)大學(xué)董事會(huì)