專利名稱：用于評估b細胞淋巴瘤對抗cd40抗體治療的響應(yīng)性的方法和組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
一般而言，本發(fā)明涉及預(yù)測、評估、幫助評估B細胞淋巴瘤對抗CD40抗體治療的響 應(yīng)性的領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
CD40是腫瘤壞死受體超家族的I型跨膜蛋白質(zhì)。CD40是涉及B細胞增殖和分化、 免疫球蛋白同種型轉(zhuǎn)換、及細胞存活力的重要分子。受體信號傳導(dǎo)由CD40結(jié)合CD40配體 (⑶40L或⑶154)來啟動，⑶40配體主要在活化的⑶4+T細胞上表達。在正常細胞上，⑶40在具有高度增殖潛力的細胞上表達，包括造血祖細胞、上皮和 內(nèi)皮細胞，及所有抗原呈遞細胞(樹突細胞、活化的B淋巴細胞、和活化的單核細胞)。CD40 在數(shù)種類型的B細胞血液學(xué)惡性腫瘤上高度表達，包括多發(fā)性骨髓瘤、非何杰金氏淋巴瘤 (NHL)、和慢性淋巴細胞性白血病(CLL)。⑶40表達在B細胞惡性腫瘤上的高度流行使之成 為基于抗體的癌癥療法的誘人的潛在靶物。CD40還在大多數(shù)膀胱癌、顯著比例的其它實體 瘤(包括頭頸癌、腎細胞癌、卵巢和肺癌)上表達?？耿?0抗體及其用于治療B細胞血液學(xué)惡性腫瘤的用途已有記載。參見例 如美國專利 6，946，129 ；6，843，989 ；6，838，261 ；WO 2000/075348 ；US-2002-0197256 ；WO 2006/128103 ；和WO 2007/075326。已經(jīng)顯示了人源化抗CD40抗體經(jīng)由直接信號轉(zhuǎn)導(dǎo)在 血液學(xué)腫瘤細胞的一個子集中誘導(dǎo)⑶40陽性細胞的生長抑制和凋亡。WO 2006/128103 ； WO 2007/075326。另外，人源化抗⑶40抗體經(jīng)免疫效應(yīng)器功能殺死腫瘤細胞，包括抗體依 賴性細胞的細胞毒性(ADCC)和抗體依賴性細胞的吞噬(ADCP)。在體內(nèi)，使用多發(fā)性骨髓 瘤(MM)和非何杰金氏淋巴瘤(NHL)的異種移植物模型，抗⑶40抗體在重度聯(lián)合免疫缺陷 (SCID)小鼠中遏制腫瘤生長并改善存活。在數(shù)種模型中比較抗CD40抗體與利妥昔單抗 (Genentech, Inc.)揭示了抗⑶40抗體的抗腫瘤活性至少像利妥昔單抗一樣有效。Seattle Genetics在2004年在具有復(fù)發(fā)性和頑固性多發(fā)性骨髓瘤(MM)的患者中 用人源化抗CD40抗體以單藥多劑試驗啟動了 I期臨床試驗。隨后，在具有復(fù)發(fā)性非何杰金 氏淋巴瘤(NHL)和慢性淋巴細胞性淋巴瘤(CLL)的患者中啟動了 I期試驗。來自這些I期 試驗的結(jié)果顯示了在病情穩(wěn)定且M蛋白降低的骨髓瘤患者、具有部分和完全響應(yīng)的NHL患 者、和病情穩(wěn)定的CLL患者中的抗腫瘤活性的證據(jù)。與2006年12月在復(fù)發(fā)性彌漫性大B 細胞淋巴瘤(DLBCL)中啟動了抗CD40抗體的II期試驗。雖然已經(jīng)顯示了抗⑶40抗體能誘導(dǎo)⑶40陽性細胞的生長抑制和凋亡，而且在多 種類型的B細胞淋巴瘤患者中可具有抗腫瘤活性，但是并非所有B淋巴瘤細胞都對由抗 CD40抗體介導(dǎo)的細胞死亡敏感。仍然需要為B細胞淋巴瘤患者對抗CD40抗體療法的響應(yīng)性鑒定一種或多種預(yù)測標(biāo)志物。通過述及完整收錄本文中所引用的所有參考文獻(包括專利申請和出版物)。發(fā)明概述本發(fā)明提供了用于預(yù)測、評估或幫助評估具有某種類型的B細胞淋巴瘤的受試者 對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的方法和組合物。一方面，本發(fā)明提供了用于評估或幫助評估具有B細胞淋巴瘤的受試者對抗CD40 抗體治療的響應(yīng)性的方法，包括與參照水平比較來自所述受試者的B細胞淋巴瘤樣品中表 2-4、6、7和13中至少一種標(biāo)志物基因的測量表達水平。另一方面，本發(fā)明提供了用于在具有B細胞淋巴瘤的受試者中預(yù)測抗CD40抗體治 療的響應(yīng)性或監(jiān)測治療/對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的方法，包括與參照水平比較來自所 述受試者的B細胞淋巴瘤樣品中表2-4、6、7和13中至少一種標(biāo)志物基因的測量表達水平。另一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、評估或幫助評估具有B細胞淋巴瘤的受試者 對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的方法，包括下述步驟(a)測量自所述受試者獲得的包含B 淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平IFITM1、⑶40、RGS13、 VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAP1、和 PUS7 ； (b)基于來自步驟
(a)的一種或多種標(biāo)志物基因的測量表達水平預(yù)測所述受試者是否有可能響應(yīng)抗CD40抗 體治療。在一些實施方案中，測量來自該組的至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至 少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少i^一種、至少十二種、至少十三種、 或至少十四種標(biāo)志物基因的表達水平并用于預(yù)測、評估、或幫助評估。在一些實施方案中， 所述預(yù)測、評估、或幫助評估是通過與參照水平比較一種或多種標(biāo)志物基因的測量表達水 平來確定的。在一些實施方案中，參照水平是基于如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的測量表達 水平而確定的值或范圍，所述樣品包含B淋巴瘤細胞且來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積 增大或縮小的受試者。另一方面，本發(fā)明提供了為具有B細胞淋巴瘤的受試者制備個性化基因型序型 (personalized genomics profile)的方法，包括下述步驟(a)測定自所述受試者獲得的 包含B淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平IFITM1、⑶40、 RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRU UAP1、PUS7、和 BCL6 ；并
(b)生成總結(jié)步驟(a)中獲得的一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平的報告。在一些實施方 案中，測量來自該組的至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少 八種、至少九種、至少十種、至少十一種、至少十二種、至少十三種、至少十四種、或至少十五 種標(biāo)志物基因的表達水平并用于生成個性化基因組序型的報告。在一些實施方案中，所述 報告包括對所述受試者推薦抗CD40抗體治療。在一些實施方案中，所述推薦是通過與參照 水平比較標(biāo)志物基因的測量表達水平而確定的。在一些實施方案中，參照水平是基于如下 樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的測量表達水平而確定的值或范圍，所述樣品來自在抗CD40抗體 治療后腫瘤體積增大或縮小的受試者且包含B淋巴瘤細胞。另一方面，本發(fā)明提供了用于預(yù)測、評估或幫助評估具有B細胞淋巴瘤的受試者 對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的方法，包括下述步驟(a)測量自所述受試者獲得的包含B 淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的至少兩種標(biāo)志物基因的表達水平IFITM1、⑶40、RGS13、 VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPUP PUS7 ； (b)基于步驟(a)中的標(biāo)志物基因的測量表達水平通過下述方程計算敏感指數(shù)值(Si)
P X -LlSI = Jjj^L
片Vcr"其中測量表13所示至少一種具有正關(guān)聯(lián)值的標(biāo)志物基因的和至少一種具有負關(guān) 聯(lián)值的標(biāo)志物基因的表達水平；其中⑴β j是所測量的每一種標(biāo)志物基因的系數(shù)值；(ii)p是所測量的標(biāo)志物基 因的數(shù)目；GiiUi是對于來自要測量表達水平的受試者的樣品所測量的每一種標(biāo)志物的 經(jīng)過換算、標(biāo)準化的表達水平；而(iV) μ j和σ j是所測量的每一種標(biāo)志物基因的均值和標(biāo) 準偏差；其中β” μ ^和ο ^是自包含B淋巴瘤細胞的患者樣品確定的。在一些實施方案 中，敏感指數(shù)的值等于或大于零指示所述受試者有可能響應(yīng)抗CD40抗體治療，或者敏感指 數(shù)的值小于零指示所述受試者不太可能響應(yīng)抗CD40抗體治療。在一些實施方案中，測量 至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少 十一種、至少十二種、至少十三種、或至少十四種標(biāo)志物基因的表達水平并用于計算敏感指 數(shù)。在一些實施方案中，測量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl 的表 達水平并用于計算敏感指數(shù)。另一方面，本發(fā)明提供了用于治療具有B細胞淋巴瘤的受試者的方法，包括對所 述受試者施用有效量的抗CD40抗體，其中已經(jīng)通過本文所述方法評估了所述受試者中的B 細胞淋巴瘤的響應(yīng)性。另一方面，本發(fā)明提供了用于治療具有B細胞淋巴瘤的受試者的方 法，包括a)通過與參照水平比較來自受試者的B細胞淋巴瘤樣品中表2-4、6、7和13中至少 一種標(biāo)志物基因的測量表達水平以評估所述受試者中的B細胞淋巴瘤是否適合于抗CD40 抗體治療來為抗CD40抗體治療選擇受試者；并對所述受試者施用有效量的抗CD40抗體。在一些實施方案中，所述參照水平是來自所述受試者的B細胞淋巴瘤樣品中表8 或表9中一種或多種參照基因的測量表達水平。在一些實施方案中，所述參照水平是不同B細胞淋巴瘤樣品中標(biāo)志物基因的測量 表達水平。在一些實施方案中，所述不同B細胞淋巴瘤樣品包含對由抗⑶40抗體誘導(dǎo)的細 胞死亡有抗性的B淋巴瘤細胞。在一些實施方案中，標(biāo)志物基因的測量表達水平和/或參照水平是標(biāo)準化的。在一些實施方案中，與一種或多種參照水平比較來自受試者的B細胞淋巴瘤樣品 中表2-4、6、7和13中至少兩種、至少五種、至少十種、至少十五種、或至少二十種基因的測 量表達水平。在一些實施方案中，通過檢測mRNA表達(例如實時定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(qRT-PCR))和 /或檢測蛋白質(zhì)表達(例如免疫組織化學(xué)(IHC))來測量表達水平。在一些實施方案中，所測量的標(biāo)志物基因包括一種或多種⑶40配體下調(diào)基因(例 如 VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCF1、BCL6、IGJ、ELTI1902、PN0C、CSF2RBJP P0U2AF1)。在一些 實施方案中，所測量的標(biāo)志物基因包括B細胞受體信號傳導(dǎo)途徑中的一種或多種基因(例 如 CD22、RGS13JPMEF2B)。在一些實施方案中，與一種或多種參照水平比較來自受試者的B細胞淋巴瘤樣品 中選自下組的至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至 少八種、至少九種、至少十種、至少十一種、至少十二種、至少十三種、或至少十四種基因的
8表達水平VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCFl、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC, CSF2RB、P0U2AF1、 CD22、RGS13、和 MEF2B。在一些實施方案中，比較B細胞淋巴瘤樣品中選自下組的一個或多個基因?qū)Φ谋?達水平VNN2 和 EPDR1、RGS13 和 EPDR1、CD22 和 EPDR1、LRRC8A 和 PRPSAP2、CD40 和 IGF1R、 IFITMl和BTG2、SMNl和LM02、PRKCA和YIPF3。在一些實施方案中，比較B細胞淋巴瘤樣 品中選自下組的一個或多個基因?qū)Φ谋磉_水平VNN2和EPDR1、RGS13和EPDR1、⑶22和 EPDRU LRRC8A 禾口 PRPSAP2、CD40 禾口 IGF1R、IFITMl 禾口 BTG2、SMNl 禾口 LM02、PRKCA 禾口 YIPF3， 并作為使用所述基因?qū)Φ膌og2刻度表達(l0g2-SCale expression)的帶正負號的t得分 (signed t-score)之和計算的敏感指數(shù)來評估B細胞淋巴瘤對抗⑶40抗體治療的響應(yīng)性。在一些實施方案中，所述B細胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(non-Hodgkin' s lymphoma) (NHL)，包括但不限于濾泡性淋巴瘤(fol 1 icuIarlymphoma)、復(fù)發(fā)性濾泡性 淋巴瘤(relapsed follicular lymphoma)、小淋巴細胞性淋巴瘤(small lymphocytic lymphoma)、套細胞性淋巴瘤(mantle cell lymphoma)、邊緣區(qū)淋巴瘤(marginal zone lymphoma)、淋巴菜細胞性淋巴瘤(lymphoplasmacytic lymphoma)、章樣肉芽月中病(mycosis fungoides) /塞扎里綜合征(Sezary syndrome)、脾邊緣區(qū)淋巴瘤(splenic marginal zone lymphoma)、和彌漫性大B細胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma)。在一些實施 方案中，所述B細胞淋巴瘤選自下組無痛性淋巴瘤(indolent lymphoma)、攻擊性淋巴瘤 (aggressive lymphoma)、禾口高度攻擊性淋巴瘤(highly aggressive lymphoma)。又一方面，本發(fā)明提供了試劑盒，包含用于測量表2_4、6、7和13中至少一種標(biāo)志 物基因的表達水平的試劑。在一些實施方案中，所述試劑盒包含用于通過PCR擴增表2-4、 6、7和13中至少一種標(biāo)志物基因的至少一對引物。例如，可使用表10所示正向和反向引 物。所述試劑盒可進一步包含用于擴增表8中參照基因的一對引物。所述試劑盒可進一步 包含附著有用于檢測擴增基因產(chǎn)物的探針的表面，諸如微陣列，而且本發(fā)明涵蓋和包括此 類表面。在一些實施方案中，所述試劑盒包含用于通過qRT-PCR檢測表2_4、6、7和13中一 種標(biāo)志物基因的表達水平的至少一對引物和至少一種探針。所述試劑盒可進一步包含用于 通過qRT-PCR檢測表8中參照基因的表達水平的一對引物和一種探針。例如，可使用表10 所示引物和探針組來通過qRT-PCR檢測基因表達水平。在一些實施方案中，所述試劑盒包 含特異性識別由標(biāo)志物基因編碼的一種或多種蛋白質(zhì)的一種或多種抗體。所述試劑盒可進 一步包含用于實施本文所述任何方法的其它試劑和/或指令。應(yīng)當(dāng)理解，可以組合本文所述各個實施方案的一個、一些、或所有特征以形成本發(fā) 明的其它實施方案。本發(fā)明的這些和其它方面對于本領(lǐng)域技術(shù)人員會變得顯而易見的。附圖簡述

圖1。BASS0_GERMINAL_CENTER_CD40_DN基因集內(nèi)基因的富集圖。上部的圖代表來 自中等t檢驗(moderated t-test)分級基因(表T)間的富集得分分布。下部的圖展示富 集關(guān)于稱作signaUnoice (信噪比)的分級列表度量(ranked list metric)的分布。總 之，這些圖清楚顯示了該基因集在抗CD40 Ab. 1敏感性細胞中強烈富集。圖2。VNN2 ( 一種⑶40L下調(diào)基因)在對抗⑶40 Ab. 1敏感的NHL細胞中過表達， 而且在敏感的和抗性的兩類之間區(qū)分。棒圖代表mRNA表達水平，線圖代表IC25值。圖3A至3C。RGS13、CD22、和MEF2B生發(fā)中心B標(biāo)志物在對抗CD40Ab. 1敏感的和中間NHL細胞中過表達，而且能以合理的準確度在敏感的和抗性的兩類之間區(qū)分。棒圖代 表mRNA表達水平，線圖代表IC25值。圖4。NHL細胞系間的抗⑶40Ab. 1敏感指數(shù)評分?；趍RNA表達數(shù)據(jù)對每種細胞 系應(yīng)用逐步線性建模和基因?qū)υu分。針對χ軸上的NHL細胞系繪圖，第一 y軸展示抗CD40 Ab. 1敏感指數(shù)，而第二 y軸展示抗⑶40 Ab. 1 IC25值。抗⑶40 Ab. 1敏感指數(shù)高(大于_4) 代表細胞系是敏感性的概率升高。圖5。⑶40簽名基因與抗⑶40. Ab. 1敏感性的關(guān)聯(lián)。圖6-1至6-35。表7和表10所列基因的基因庫序列。編碼VNN2 (圖6_1 =SEQID NO :258)、RGS13(圖 6-2 :SEQ ID NO :259)、CD22 (圖 6-3 和 6-4 :SEQ IDNO :260)、LRRC8A (圖 6-5 =SEQ ID NO 261)、CD40 (圖 6-6 :SEQ ID NO 262)、IFITMl (圖 6-7 :SEQ ID NO 263)、 PRKCA (圖 6-8 至6-10 SEQ ID NO :264)、BCL6 (圖 6-11 和 6-12 :SEQ ID NO :265)、EPDR1 (圖 6-13 =SEQ ID NO 266)、PRPSAP2 (圖 6-14 :SEQ ID NO 267)、IGFlR (圖 6-15 至 6-18 =SEQ ID NO 268)、BTG2 (圖 6-19 和 6-20 :SEQ ID NO 269)、LM02 (圖 6-21 :SEQ ID NO 270)、 YIPF3 (圖 6-22 =SEQ ID NO :271)、SMNl (圖 6-23 :SEQ ID NO 272)、CD79B (圖 6-24 =SEQ ID NO 273)、CD44(圖 6-25 和 6-26 :SEQ ID NO 274)、CTSC(圖 6-27 :SEQ ID NO 275)、 UAPl (圖 6-28 SEQ ID NO :276)、PUS7 (圖 6-29 和 6-30 :SEQ ID NO 277)、RGS 13 (圖 6-31: SEQ ID NO :278)、CD22(圖 6-32和 6-33 :SEQ ID NO 279)、SMNl (圖 6-34 SEQ ID NO :280)、 和 YIPF3(圖 6-35 =SEQ ID NO 281)的 mRNA 的核酸序列。圖7。多變量敏感指數(shù)和臨床試驗001中21名患者腫瘤直徑乘積之和(SPD)測量 的百分比變化的關(guān)聯(lián)。SPD百分比變化是通過與基線SPD比較最小基線后SPD來確定的。 正變化指示腫瘤體積增大，而負變化指示腫瘤體積縮小。用于計算敏感指數(shù)的重量(系數(shù)) 顯示于表14。較大的多變量敏感指數(shù)值與基線后SPD降低有關(guān)(Sperman氏P = -0. 58 ； P = O. 006))。圖8。BCL6表達和26名具有DLBCL的患者的SPD測量的百分比變化的關(guān)聯(lián)。SPD 百分比變化是通過與基線SPD比較最小基線后SPD來確定的。正變化指示腫瘤體積增大， 而負變化指示腫瘤體積縮小。發(fā)明詳述本發(fā)明基于如下的發(fā)現(xiàn)，即某些基因(表2_4、6、7、和13中所顯示的基因)在對抗 CD40抗體誘導(dǎo)的細胞死亡敏感的B淋巴瘤細胞與對抗CD40誘導(dǎo)的細胞死亡有抗性的B淋 巴瘤細胞之間差異表達。來自實施例2中所描述的臨床試驗的數(shù)據(jù)指示表13中所顯示的 14種基因的表達水平與對抗⑶40 Ab. 1治療的響應(yīng)性高度有關(guān)。一些在敏感性B淋巴瘤細 胞與抗性B淋巴瘤細胞之間差異表達的基因是CD40配體下調(diào)途徑基因；而一些在B細胞受 體信號傳導(dǎo)途徑中。因而，這些差異表達基因中一種或多種的表達水平可用于評估或幫助 評估具有B細胞淋巴瘤的受試者對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性，預(yù)測受試者對抗CD40抗體 治療的響應(yīng)性，及監(jiān)測受試者中的治療/響應(yīng)性。A.通用技術(shù)除非另有說明，本發(fā)明的實施將采用分子生物學(xué)(包括重組技術(shù))、微生物學(xué)、 細胞生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)，這些都在本領(lǐng)域的技術(shù)范圍內(nèi)。這些技術(shù)在 文獻中有充分解釋，諸如 “Molecular Cloning =ALaboratory Manual”，第二版(Sambrook
10et al. ,1989) ；"OligonucleotideSynthesis" (M.J.Gait He,1984) ；"Animal Cell Culture，，(R. I. Freshney 編，1987) ；“Methods in Enzymology" (Academic Press, Inc.)； "Current Protocols inMolecular Biology" (F. M. Ausubel et al.編，1987，及其周期性 的更新)；“PCR:The Polymerase Chain Reaction”(Mullis et al.編，1994)。本發(fā)明中所使用的引物、寡核苷酸和多核苷酸可利用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準技術(shù)生 成。除非另有定義，本文中所使用的技術(shù)和科學(xué)術(shù)語與本發(fā)明所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人 員通常的理解具有相同的含義。以下文獻為本領(lǐng)域技術(shù)人員提供了本申請中所使用的許 多術(shù)語的一般性指導(dǎo):Singleton et al. , Dictionary ofMicrobiology and Molecular Biology,第 二 版，J. Wiley&Sons(New York, N. Y. 1994)，禾口 March，Advanced Organic Chemistry Reactions, Mechanisms andStructure,第四版，John Wiley&Sons (New York, N. Y. 1992)。B.定義如本文中所使用的，術(shù)語“具有B細胞淋巴瘤的受試者”和“B細胞淋巴瘤患者”指 已經(jīng)診斷為具有某類型的B細胞淋巴瘤或者已經(jīng)給予某類型的B細胞淋巴瘤的可能診斷的 受試者。如本文中所使用的，術(shù)語“生物標(biāo)志物”或“標(biāo)志物” 一般指其在哺乳動物組織或 細胞中或上的表達或分泌可以通過已知方法(或本文中所公開的方法)來檢測且預(yù)示或可 用于預(yù)測(或幫助預(yù)測)哺乳動物細胞或組織對基于抗CD40抗體的治療方案的敏感性及 在一些實施方案中預(yù)測(或幫助預(yù)測)個體對基于抗CD40抗體的治療方案的響應(yīng)性的分 子，包括基因、蛋白質(zhì)、碳水化合物結(jié)構(gòu)、或糖脂。、術(shù)語“樣品”在用于本文時指獲得自或衍生自感興趣的受試者的組合物，其包含有 待例如根據(jù)物理、生化、化學(xué)和/或生理特點來表征和/或鑒定的細胞和/或其它分子實 體。例如，短語“疾病樣品”及其各種變化形式指得自感興趣的受試者的任何樣品，預(yù)計或 已知其包含待表征的細胞和/或分子實體。“組織或細胞樣品”指從受試者或患者的組織得到的相似細胞的集合。組織或細 胞樣品的來源可以是實體組織，像來自新鮮的、冷凍的和/或保存的器官或組織樣品或活 檢樣品或穿刺樣品；血液或任何血液組分；體液，諸如腦脊液、羊膜液(羊水)、腹膜液(腹 水)、或間隙液；來自受試者的妊娠或發(fā)育任何時間的細胞。組織樣品還可以是原代的或培 養(yǎng)的細胞或細胞系。任選的是，組織或細胞樣品是從疾病組織/器官得到的。組織樣品可 能包含在自然界中天然不與組織混雜的化合物，諸如防腐劑、抗凝劑、緩沖劑、固定劑、營養(yǎng) 物、抗生素、等等。為本發(fā)明目的，組織樣品的“切片”指一塊或一片組織樣品，例如從組織樣品上切 下來的一薄片組織或細胞。應(yīng)當(dāng)了解，可以制作多片組織樣品切片并依照本發(fā)明進行分析， 前提是應(yīng)當(dāng)了解，本發(fā)明包括將組織樣品的同一切片用于形態(tài)學(xué)和分子兩個水平的分析或 者針對蛋白質(zhì)和核酸二者進行分析的方法。如本文中所使用的，“B細胞淋巴瘤樣品”或“包含B淋巴瘤細胞的樣品”指含有來 自已經(jīng)診斷為具有某類型的B細胞淋巴瘤的受試者或患者的B淋巴瘤細胞的組織或細胞樣
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如本文中所使用的，用于“幫助評估”的方法指幫助做出臨床決策的方法(例 如B細胞淋巴瘤對抗⑶40抗體治療的響應(yīng)性)，而且對于確定性評估(definitive assessment)可以是或不是結(jié)論性的。“受試者”或“個體”指哺乳動物，更優(yōu)選人。哺乳動物包括但不限于人、靈長類、家 畜、體育運動用動物、嚙齒類、和寵物(例如犬和貓)。如本文中所使用的，“參照值”可以是絕對值；相對值；具有上限和/或下限的數(shù) 值；數(shù)值范圍；平均值；中值；均值；或與特定對照或基線值比較的數(shù)值。術(shù)語“陣列”或“微陣列”在用于本文時指可雜交陣列元素，諸如多核苷酸探針(例 如寡核苷酸)和抗體在基片上的有序排列?；梢允枪腆w基片(諸如玻璃載玻片)或半 固體基片(諸如硝酸纖維素膜)。核苷酸序列可以是DNA、RNA、或其任意排列?！皵U增”在用于本文時一般指生成多拷貝的所需序列的過程。“多拷貝”指至少2個 拷貝?！翱截悺辈槐刂概c模板序列有完美的序列互補性或同一性。例如，拷貝可包括諸如脫 氧肌苷的核苷酸類似物、故意引入的序列改變(諸如通過包含能與模板雜交但不互補的序 列的引物而引入的序列改變)、和/或在擴增過程中發(fā)生的序列錯誤。若基因或生物標(biāo)志物在第一樣品中的表達水平/量是該基因或生物標(biāo)志物在第 二樣品中的表達水平/量的至少約1. 5倍、1. 75倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9 倍或10倍，則該基因或生物標(biāo)志物在第一樣品中的表達水平/量的“大于”在第二樣品中 的水平。表達水平/量可以基于本領(lǐng)域已知的任何合適標(biāo)準來測定，包括但不限于mRNA、 cDNA、蛋白質(zhì)、蛋白質(zhì)片段和/或基因拷貝。表達水平/量可以定性和/或定量測定。“多核苷酸”或“核酸”在本文中可互換使用，指任何長度的核苷酸聚合物，包括DNA 和RNA。核苷酸可以是脫氧核糖核苷酸、核糖核苷酸、經(jīng)過修飾的核苷酸或堿基、和/或其類 似物，或者是可通過DNA或RNA聚合酶摻入聚合物的任何底物。多核苷酸可包含經(jīng)過修飾 的核苷酸，諸如甲基化核苷酸及其類似物。如果有的話，對核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾可以在裝配聚 合物之前或之后進行。核苷酸序列可以由非核苷酸組分中斷。多核苷酸可以在聚合后進一 步修飾，諸如通過與標(biāo)記用組分偶聯(lián)。其它類型的修飾包括例如“帽”，將一個或多個天然存 在的核苷酸用類似物替代，核苷酸間修飾諸如例如具有不帶電荷連接(例如膦酸甲酯、磷 酸三酯、磷酰胺酯(phosphoamidate)、氨基甲酸酯等)和具有帶電荷連接(例如硫代磷酸 酯、二硫代磷酸酯等)的修飾，含有懸垂模塊(pendant moiety)諸如例如蛋白質(zhì)(例如核 酸酶、毒素、抗體、信號肽、聚L-賴氨酸等)的修飾、具有嵌入劑(例如吖啶、補骨脂素等) 的修飾、含有螯合劑(例如金屬、放射性金屬、硼、氧化性金屬等)的修飾、含有烷化劑的修 飾、具有經(jīng)修飾連接(例如α端基異構(gòu)核酸(anomeric nucleicacid)等)的修飾、以及未 修飾形式的多核苷酸。另外，通常存在于糖類中的任何羥基可以用例如膦酸(phosphonate) 基團、磷酸(phosphate)基團替換，用標(biāo)準保護基團保護，或活化以制備與別的核苷酸的別 的連接，或者可偶聯(lián)至固相支持物。5'和3'末端OH可磷酸化或者用胺或1-20個碳原子 的有機加帽基團模塊取代。其它羥基也可衍生成標(biāo)準保護基團。多核苷酸還可含有本領(lǐng) 域普遍知道的核糖或脫氧核糖糖類的類似物形式，包括例如2'-氧-甲基、2'-氧-烯 丙基、2' _氟-或2'-疊氮-核糖，碳環(huán)糖類似物，α-端基異構(gòu)糖，差向異構(gòu)糖諸如阿 拉伯糖、木糖或來蘇糖、吡喃糖、呋喃糖、景天庚酮糖，無環(huán)類似物及脫堿基核苷類似物諸如 甲基核糖核苷?？捎脗溥x連接基團替換一個或多個磷酸二酯連接。這些備選連接基團包括但不限于以下實施方案，其中磷酸酯用P(0)S( “硫代酸酯”(thioate))、P(S) S( “二硫 代酸酯”(dithioate))、(O)NR2( “酰胺酯”(amidate))、P(0)R、P(O)OR'、CO 或 CH2( “甲 縮醛”(formacetal))替代，其中R或R'各自獨立為H或者取代或未取代的烷基(1_20個 C)，任選含有醚(-0-)連接、芳基、烯基、環(huán)烷基、環(huán)烯基或芳烷基(araldyl)。并非多核苷酸 中的所有連接都必需是相同的。前述描述適用于本文中提及的所有多核苷酸，包括RNA和 DNA?！肮押塑账帷痹谟糜诒疚臅r一般指短的多核苷酸，一般是單鏈，一般是合成的，長度 一般但不是必需小于約200個核苷酸。術(shù)語“寡核苷酸”與“多核苷酸”并不互相排斥。上 文關(guān)于多核苷酸的描述同樣且完全適用于寡核苷酸?！耙铩币话闶嵌痰膯捂湺嗪塑账?，一般具有游離的3' -OH基團，其通過與靶序列 雜交而結(jié)合目的樣品中潛在存在的靶，然后促進與靶互補的多核苷酸的聚合。“引物對”指 可用于擴增特定靶基因的一部分的5’引物和3’引物。術(shù)語“3'(端)” 一般指多核苷酸或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中 某一區(qū)域或位置的3'端(下游)的另一區(qū)域或位置。術(shù)語“5'(端)”一般指多核苷酸 或寡核苷酸中位于同一多核苷酸或寡核苷酸中某一區(qū)域或位置的5'端(上游)的另一區(qū) 域或位置。短語“基因擴增”指通過它在特定細胞或細胞系中形成多個拷貝的基因或基因 片段的過程。所復(fù)制的區(qū)域(一段擴增的DNA)常常稱為“擴增子”。通常，所生成的信使 RNA(mRNA)的量，即基因表達的水平，也按所表達特定基因生成的拷貝數(shù)的比例升高?！皺z測”包括任何檢測手段，包括直接和間接檢測。術(shù)語“預(yù)測”在本文中用于指患者會對藥物或藥物集有利地或不利地響應(yīng)的可能 性。在一個實施方案中，預(yù)測涉及那些響應(yīng)的程度。在一個實施方案中，預(yù)測涉及治療(例 如用特定治療劑進行的治療)后患者是否會存活或改善且某段時間沒有疾病復(fù)發(fā)和/或患 者會這樣的概率。通過為任何特定患者選擇最適合的治療形態(tài)，本發(fā)明的預(yù)測方法可在臨 床上用于作出治療決策。本發(fā)明的預(yù)測方法在預(yù)測患者是否可能有利地響應(yīng)治療方案(諸 如給定的治療方案，包括例如施用給定的治療劑或組合、手術(shù)干預(yù)、類固醇治療等)或患者 是否可能在治療方案后長期存活中是有價值的工具。術(shù)語“長期”存活在用于本文時指治療性處理后存活至少1年、5年、8年、或10年?！盎颊唔憫?yīng)”可利用表明對患者有益處的任何終點來評估，包括但不限于(1) 一定 程度地抑制疾病進展，包括減緩和完全阻滯；(2)減少疾病事件和/或癥狀的數(shù)目；(3)縮 小損害尺寸；⑷抑制(即減輕、減緩或完全終止)疾病細胞浸潤入臨近周圍器官和/或組 織；(5)抑制(即減輕、減緩或完全終止)疾病擴散；(6) 一定程度地減輕與病癥有關(guān)的一種 或多種癥狀；(7)治療后無疾病呈現(xiàn)的長度延長；和/或(8)治療后給定時間點的死亡率降 低。術(shù)語“抗體”以最廣義使用，明確覆蓋單克隆抗體(包括全長單克隆抗體)、多特異 性抗體(例如雙特異性抗體)、及抗體片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性或功能?！翱贵w片段”包含全長抗體的一部分，通常是抗體的抗原結(jié)合區(qū)或可變區(qū)?？贵w片 段的例子包括Fab、Fab'、F(ab' )2和Fv片段；雙抗體；線性抗體；單鏈抗體分子；及由抗 體片段形成的多特異性抗體。
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“Fv”是包含完整抗原識別和結(jié)合位點的最小抗體片段。此片段由緊密、非共價結(jié) 合的一個重鏈可變區(qū)和一個輕鏈可變區(qū)的二聚體組成。從這兩個結(jié)構(gòu)域的折疊中發(fā)出六個 高變環(huán)(重鏈和輕鏈各3個環(huán))，貢獻出抗原結(jié)合的氨基酸殘基并賦予抗體以抗原結(jié)合特異 性。然而，即使是單個可變區(qū)(或只包含對抗原特異的三個CDR的半個Fv)也具有識別和 結(jié)合抗原的能力，盡管親和力低于完整結(jié)合位點。術(shù)語“單克隆抗體”在用于本文時指從一群基本上同質(zhì)的抗體獲得的抗體，即構(gòu)成 群體的各個抗體相同和/或結(jié)合相同表位，除了生產(chǎn)單克隆抗體的過程中可能產(chǎn)生的可能 變體外，此類變體一般以極小量存在。此類單克隆抗體典型的包括包含結(jié)合靶物的多肽序 列的抗體，其中靶物結(jié)合多肽序列是通過包括從眾多多肽序列中選擇單一靶物結(jié)合多肽序 列在內(nèi)的過程得到的。例如，選擇過程可以是從眾多克隆諸如雜交瘤克隆、噬菌體克隆或重 組DNA克隆的集合中選擇獨特克隆。應(yīng)當(dāng)理解，選定的靶物結(jié)合序列可進一步改變，例如為 了提高對靶物的親和力、將靶物結(jié)合序列人源化、提高其在細胞培養(yǎng)物中的產(chǎn)量、降低其在 體內(nèi)的免疫原性、創(chuàng)建多特異性抗體等，而且包含改變后的靶物結(jié)合序列的抗體也是本發(fā) 明的單克隆抗體。與典型的包含針對不同決定簇(表位)的不同抗體的多克隆抗體制備物 不同，單克隆抗體制備物的每種單克隆抗體針對抗原上的單一決定簇。在它們的特異性之 外，單克隆抗體制備物的優(yōu)勢在于它們通常未受到其它免疫球蛋白的污染。修飾語“單克 隆”指明抗體從基本上同質(zhì)的抗體群獲得的特征，不應(yīng)解釋為要求通過任何特定方法來生 產(chǎn)抗體。例如，將依照本發(fā)明使用的單克隆抗體可通過多種技術(shù)來生成，包括例如雜交瘤法 (例如Kohler et al. ,Nature 256 495(1975) ；Harlow et al. ,Antibodies :A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor LaboratoryPress, 第 2 Hjx, 1988 ；Hammer ling et al., 于Monoclonal Antibodies and T-CellHybridomas, 563-681, Elsevier, N. Y. , 1981) > 重組DNA法(參見例如美國專利No. 4，816，567)、噬菌體展示技術(shù)(參見例如Clackson et al.，Nature 352 :624_628 (1991) ；Marks et al.，J. Mol. Biol. 222 581-597 (1991)； Sidhu et al. , J. Mol. Biol. 338(2) :299_310 (2004) ；Lee et al. , J. Mol. Biol. 340(5) 1073-1093(2004) ；Fellouse, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 101(34) 12467-12472 (2004)； Lee et al. , J. Immunol. Methods 284 (1-2) 119-132 (2004))、及用于在具有部分或整 個人免疫球蛋白基因座或編碼人免疫球蛋白序列的基因的動物中生成人或人樣抗體 的技術(shù)(參見例如 WO 1998/24893 ；WO 1996/34096 ；WO 1996/33735 ；W01991/10741 ； Jakobovits et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551(1993) ；Jakobovits et al., Nature 362:255-258(1993) ；Bruggemann et al. , Year inlmmuno. 7 :33 (1993)；美國專 利 No. 5，545，806 ；5，569，825 ；5，591，669 (都屬于 GenPharm) ；5，545，807 ；WO 1997/17852 ； 美國專利 No. 5，545，807 ;5，545，806 ;5，569，825 ;5，625，126 ;5，633，425 ;5，661，016 ； Marks et al. , Bio/Technology10 779-783 (1992) ；Lonberg et al. , Nature 368 856-859(1994) ；Morrison, Nature368 812-813 (1994) ；Fishwild et al. ， Nature Biotechnology 14:845-851(1996) ；Neuberger, Nature Biotechnology 14:826(1996); Lonberg and Huszar, Intern.Rev. Immunol. 13 :65_93(1995))。單克隆抗體在本文中明確包括“嵌合”抗體。“嵌合”抗體(免疫球蛋白)中重鏈 和/或輕鏈的一部分與衍生自特定物種或?qū)儆谔囟贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列 相同或同源，而鏈的剩余部分與衍生自另一物種或?qū)儆诹硪豢贵w類別或亞類的抗體中的相應(yīng)序列相同或同源，以及此類抗體的片段，只要它們展現(xiàn)出期望的生物學(xué)活性(美國專利 No. 4, 816, 567 ；Morrison et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855(1984))。本文 中所使用的人源化抗體是嵌合抗體的一個子集。非人(例如鼠)抗體的“人源化”形式指最低限度包含衍生自非人免疫球蛋白的 序列的嵌合抗體。在極大程度上，人源化抗體指人免疫球蛋白(受體抗體)中的高變區(qū)殘 基用具有期望特異性、親和力和能力的非人物種(供體抗體)諸如小鼠、大鼠、兔或非人靈 長類動物的高變區(qū)殘基替換的免疫球蛋白。在有些情況中，將人免疫球蛋白的Fv框架區(qū) (FR)殘基用相應(yīng)的非人殘基替換。此外，人源化抗體可包含在受體抗體或供體抗體中沒 有找到的殘基。進行這些修飾是為了進一步改進抗體的性能諸如結(jié)合親和力。一般而言， 人源化抗體將包含至少一個、通常兩個基本上整個如下可變域，其中所有或基本上所有高 變環(huán)對應(yīng)于非人免疫球蛋白的高變環(huán)，且所有或基本上所有FR是人免疫球蛋白序列的FR， 盡管FR可包含一處或多處提高結(jié)合親和力的氨基酸替代。FR中這些氨基酸替代的數(shù)目 通常在重鏈中不超過6處，在輕鏈中不超過3處。人源化抗體任選還將包含至少部分免疫 球蛋白恒定區(qū)(Fe)，通常是人免疫球蛋白的恒定區(qū)。更多細節(jié)參見Jones et al. , Nature 321:522-525(1986) ；Riechmann et al. , Nature 332:323-329(1988)；和 Presta，Curr. Op. Struct. Biol. 2 :593_596(1992)。“人抗體”指擁有與由人生成的抗體的氨基酸序列對應(yīng)的氨基酸序列和/或使用用 于生成人抗體的任何已知技術(shù)生成的抗體。人抗體的這種定義明確排除包含非人抗原結(jié)合 殘基的人源化抗體。“親和力成熟的”抗體指在抗體的一個或多個CDR/HVR中具有一處或多處改變、 導(dǎo)致該抗體對抗原的親和力與沒有這些改變的親本抗體相比有所改進的抗體。優(yōu)選的親 和力成熟的抗體具有納摩爾或甚至皮摩爾量級的對靶抗原的親和力。親和力成熟的抗體 可通過本領(lǐng)域已知規(guī)程來生成。Marks etal.，Bio/Technology 10 :779_783 (1992)記載 了通過VH和VL結(jié)構(gòu)域改組進行的親和力成熟。以下文獻記載了⑶R/HVR和/或框架殘 基的隨機誘變Barbas etal.，Proc. Nat. Acad. Sci. USA 91 :3809_3813(1994) ；Schier et al.，Genel69 147-155(1995) ；Yelton et al.，J.Immunol. 155 1994-2004(1995)； Jackson etal. ， J. Immunol. 154(7) 3310-9 (1995) ；Hawkins et al. ， J. Mol. Biol. 226 889-896(1992)。術(shù)語“Fe區(qū)”用于定義免疫球蛋白重鏈的C-端區(qū)域，其可以通過用木瓜蛋白酶消 化完整抗體而產(chǎn)生。Fc區(qū)可以是天然序列Fc區(qū)或變異Fc區(qū)。雖然免疫球蛋白重鏈Fc區(qū)的 邊界可以變化，但是人IgG重鏈Fc區(qū)通常定義為自Fc區(qū)的大約Cys226位置或大約Pro230 位置的氨基酸殘基至羧基末端的區(qū)段。免疫球蛋白的Fc區(qū)一般包含兩個恒定域，即CH2結(jié) 構(gòu)域和CH3結(jié)構(gòu)域，而且任選包含CH4結(jié)構(gòu)域。“Fe區(qū)鏈”在本文中指Fc區(qū)的兩條多肽鏈 之一?？贵w“效應(yīng)器功能”指那些可歸于抗體Fc區(qū)(天然序列Fc區(qū)或氨基酸序列變體 Fc區(qū))且隨抗體同種型而變化的生物學(xué)活性?？贵w效應(yīng)器功能的例子包括Clq結(jié)合和補 體依賴性細胞毒性；Fc受體結(jié)合；抗體依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性(ADCC)；吞噬作用；細 胞表面受體(例如B細胞受體)下調(diào)；和B細胞活化?！翱贵w依賴性細胞介導(dǎo)的細胞毒性”或“ADCC”指其中結(jié)合到某些細胞毒性細胞(例如天然殺傷(NK)細胞、嗜中性粒細胞和巨噬細胞)上存在的Fc受體(FcR)上的分泌型 Ig使得這些細胞毒性效應(yīng)細胞能夠特異性結(jié)合攜帶抗原的靶細胞，隨后用細胞毒素殺死靶 細胞的細胞毒性形式。該抗體“武裝”(arm)細胞毒性細胞，而且是此類殺傷作用絕對要求 的。介導(dǎo)ADCC的主要細胞，NK細胞，只表達Fc γ RIII，而單核細胞表達Fc y RI,Fc γ RII和 FcyRIII0 Ravetchand Kinet,Annu. Rev. Immunol. 9 :457_92 (1991)第 464 頁表 3 總結(jié)了造 血細胞上的FcR表達。為了評估目的分子的ADCC活性，可進行體外ADCC測定法，諸如美國 專利No. 5，500，362或5，821，337或Presta美國專利No. 6，737，056中所記載的。可用于此 類測定法的效應(yīng)細胞包括外周血單個核細胞(PBMC)和天然殺傷(NK)細胞?；蛘?另外，可 在體內(nèi)評估目的分子的ADCC活性，例如在動物模型中，諸如Clynes et al.，PNAS (USA) 95 652-656(1998)中所披露的?！疤幚怼被颉爸委煛被颉皽p輕”指治療性處理，其中目標(biāo)是若不能治愈則減緩(減輕) 所針對的病理學(xué)疾患或病癥或者預(yù)防疾患的復(fù)發(fā)。如果在接受治療量的CD40結(jié)合抗體后， 患者在特定疾病的一項或多項體征和癥狀中顯示出可觀察和/或可測量的降低或消失，那 么受試者成功“治療” 了 B細胞惡性腫瘤。例如，顯著的癌細胞數(shù)減少或癌細胞消失；腫瘤 體積縮??；腫瘤轉(zhuǎn)移受到抑制(即一定程度的減緩，優(yōu)選停止)；腫瘤生長受到一定程度的 抑制；消退期延長；和/或與特定癌癥有關(guān)的一種或多種癥狀得到一定程度的減輕；發(fā)病率 和死亡率降低；及生命質(zhì)量提高。疾病的體征或癥狀的減輕還可以由患者感受到。治療可 實現(xiàn)完全響應(yīng)，定義為癌癥的所有體征消失，或者部分響應(yīng)，其中腫瘤體積縮小，優(yōu)選超過 50%，更優(yōu)選75%。若患者的病情得到穩(wěn)定，也認為患者得到治療。在一項標(biāo)準中，本發(fā)明 的抗體實現(xiàn)>95%的外周血B細胞消減且B細胞回到基線的25%。在一些實施方案中，抗 CD40抗體治療有效導(dǎo)致癌癥患者的癌癥在治療后3個月沒有發(fā)展，優(yōu)選治療后6個月，更優(yōu) 選1年，甚至更優(yōu)選2年或更多年。用于評估疾病的成功治療和改善的這些參數(shù)易于通過 本領(lǐng)域勝任的內(nèi)科醫(yī)師所熟悉的常規(guī)流程來測量。術(shù)語“非何杰金氏(Hodgkin)淋巴瘤”或“NHL”在用于本文時指何杰金氏淋巴瘤 以外的淋巴系統(tǒng)癌癥。通?？赏ㄟ^何杰金氏淋巴瘤中存在里-施(Reed-Sternberg)細胞 而非何杰金氏淋巴瘤中不存在所述細胞將何杰金氏淋巴瘤與非何杰金氏淋巴瘤區(qū)分開來?！坝行Я俊敝冈诒匦璧膭┝亢蜁r間上有效實現(xiàn)期望的治療或預(yù)防效果的量。治療劑 的“治療有效量”可根據(jù)諸如個體的疾病狀態(tài)、年齡、性別和體重及該抗體在個體中引發(fā)期 望應(yīng)答的能力等因素而變化。治療有效量還指該治療劑的治療有益效果勝過任何有毒或有 害后果的量?！邦A(yù)防有效量”指在必需的劑量和時間上有效實現(xiàn)期望的預(yù)防效果的量。通常 而非必然，由于預(yù)防劑量是在疾病發(fā)作之前或在疾病的早期用于受試者的，因此預(yù)防有效 量將低于治療有效量。術(shù)語“持家基因”指所編碼的蛋白質(zhì)的活性對維持細胞功能來說是至關(guān)重要的一 組基因。這些基因通常在所有細胞類型中相似表達。“關(guān)聯(lián)”或“聯(lián)系”指以任何方式將第一分析或方案的性能和/或結(jié)果與第二分析 或方案的性能和/或結(jié)果進行比較。例如，可以將第一分析或方案的結(jié)果用于實施第二分 析或方案，和/或，可以使用第一分析或方案的結(jié)果來決定是否應(yīng)當(dāng)實施第二分析或方案。 就基因表達分析或方案的實施方案而言，可以使用基因表達分析或方案的結(jié)果來決定是否 應(yīng)當(dāng)實施特定治療方案。
術(shù)語“標(biāo)記物”在用于本文時指與試劑諸如核酸探針或抗體直接或間接偶聯(lián)或融 合，以便于檢測它所偶聯(lián)或融合的試劑的化合物或組合物。標(biāo)記物可以是自身可檢測的 (例如放射性同位素標(biāo)記物或熒光標(biāo)記物)，或者在酶標(biāo)記物的情況中，可催化可檢測的底 物化合物或組合物的化學(xué)改變。如本文中所使用的，“一個”、“一種”、和“所述”、“該”可以指單數(shù)或復(fù)數(shù)(即可以 指一個/種或多個/種)，除非另有說明。C.本發(fā)明的方法本發(fā)明提供了用于評估或幫助評估具有B細胞淋巴瘤的受試者對抗CD40抗體治 療的響應(yīng)性的方法。本發(fā)明還提供了用于預(yù)測具有B細胞淋巴瘤的受試者中對抗CD40抗 體治療的響應(yīng)性或監(jiān)測具有B細胞淋巴瘤的受試者中的抗CD40抗體治療/對抗CD40抗體 治療的響應(yīng)性的方法。本發(fā)明提供了用于選擇適合于接受抗CD40抗體治療的具有B細胞 淋巴瘤的受試者及跟蹤抗CD40抗體治療的方法。在一些實施方案中，所述方法包括測量自 所述受試者獲得的包含B淋巴瘤細胞的樣品中表2-4、6、7、和13任一表中的一種或多種標(biāo) 志物基因的表達水平；并基于所述一種或多種標(biāo)志物基因的測量表達水平來預(yù)測、評估、或 幫助評估所述受試者對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性。在一些實施方案中，所述方法包括將來 自所述受試者的B細胞淋巴瘤樣品中表2-4、6、7、和13任一表中的至少一種標(biāo)志物基因的 測量表達水平與參照水平比較各自的標(biāo)志物基因。本發(fā)明的方法對于臨床醫(yī)師是有用的，即用來鑒定接受抗CD40抗體治療的具有B 細胞淋巴瘤的患者，幫助抗CD40抗體療法開發(fā)期間的患者選擇，預(yù)測用特定治療方案治療 個別患者時成功的可能性，評估和監(jiān)測疾病進展，監(jiān)測治療功效，及確定個別患者的預(yù)后。 任何這些實施方案包括在本發(fā)明內(nèi)。在一些實施方案中，所述B細胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤(NHL)，包括但不限于 濾泡性淋巴瘤、復(fù)發(fā)性濾泡性淋巴瘤、小淋巴細胞性淋巴瘤、套細胞性淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴 瘤、淋巴漿細胞性淋巴瘤、蕈樣肉芽腫病/塞扎里綜合征(Sezary Syndrome)、脾邊緣區(qū)淋 巴瘤、和彌漫性大B細胞淋巴瘤。在一些實施方案中，所述B細胞淋巴瘤是無痛性的。在一些實施方案中，所述B細 胞淋巴瘤是攻擊性的。在一些實施方案中，所述B細胞淋巴瘤是高度攻擊性的。在一些實 施方案中，所述無痛性B細胞淋巴瘤是濾泡性淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、或小淋巴細胞性淋巴 瘤。在一些實施方案中，所述無痛性B細胞淋巴瘤是濾泡性淋巴瘤。標(biāo)志物基因相對于參照水平，B細胞淋巴瘤樣品中一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平可以在 本發(fā)明的方法中使用，諸如用于預(yù)測、評估或幫助評估B細胞淋巴瘤對抗CD40抗體治療的 響應(yīng)性。表2_4、6和7中顯示了與抗性NHL細胞系相比在抗⑶40抗體敏感性NHL細胞系 中差異表達(統(tǒng)計學(xué)顯著地升高或降低)的基因?！翱笴D40抗體敏感性細胞”指如實施例 1所描述的那樣測試，在抗CD40抗體對細胞存活力的降低中具有小于0. 4μ g/ml的IC25 值的細胞?！翱笴D40抗性細胞”指如實施例1中所測試的，在細胞存活力的降低中具有大 于1 μ g/ml的IC25值的細胞。表2_4、6和7中的一些基因在⑶40配體下調(diào)途徑中(例如 VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCFl、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC、CSF2RB、和 P0U2AF1)；而這些表中的一些基因在B細胞受體信號傳導(dǎo)途徑中(例如⑶22、RGS13、和MEF2B)。另外，IFITM1、 CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPl、和 PUS7 (表 13)的表達水平的關(guān)聯(lián)得到了實施例2中所描述的臨床試驗的證實。在本發(fā)明的方法中使 用這些基因中一種或多種的表達水平。在一些實施方案中，在本發(fā)明的方法中使用至少兩 種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至 少i^一種、至少十二種、至少十三種、至少十四種、至少十五種、至少二十種、至少二十五種 或至少三十種基因的表達水平。在一些實施方案中，測量和/或使用選自下組的一種或多種基因的表達水平 VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCF1、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC、CSF2RB、P0U2AF1、CD22、RGS13、 和MEF2B。在一些實施方案中，測量和/或使用選自下組的一種或多種基因的表達水平 IFITMl、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPl、和 PUS7。在一些實施方案中，測量和/或使用這些基因中至少兩種、至少三種、至少四種、至少 五種、至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少i^一種、至少十二種、至少 十三種、或十四種基因的表達水平。在一些實施方案中，測量和/或使用⑶22、⑶40、和BCL6 的表達水平。在一些實施方案中，測量和/或使用CD40、RGS13、CD22、BTG2、IGF1RJPCD44 的表達水平。在一些實施方案中，測量和/或使用IFITM1、⑶40、RGS13、VNN2、LM02、⑶79B、 CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR1、UAP1、和PUS7的表達水平。在一些實施方案中，測量 和/或使用表7或表13中至少一種、至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、 至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少i^一種、至少十二種、至少十三種、至少十四 種、或十五種基因的表達水平。表2_4、6、7和13中所見到的基因(包括序列)是本領(lǐng)域已知的。例如，人類基 因的基因庫登錄號的例子有 VNN2 (NM_004665 ；NM_078488 ；AJ132100 ；D89974 ；BC064641 ； CR609799；BC126145 ；BC126147 ；和 AB026705) ;RGS13(NM_002927 ；NM_144766 ；BT006929 ； BC056866 ；AY562947 ；CR536532 ；CR610389 ；CR599001 ；BC016667 ；AF493935 ；BC036950 ； 禾口 AF030107) ；CD22(ΝΜ_001771 ；AK026467 ；BC109306 ；BC109307 ；AK225694 ；AK225625 ； X52785 ；和 X59350) ；LRRC8A(AY143166 ；BC051322；AK123611 ；AY358286 ；NM_019594 ； XM_026998 ；AK001199 ；AB037858 ；CR619692 ；CR619448 ；AK024649 ；BC000775 ；AK027495 ； 和 AK074723) ；CD40(NM_001250 ；NM_152854；BC064518 ；AY225405 ；CR619622 ；CR608994 ； CR605787 ；AB209660 ；AK222896 ；AJ300189 ；BT019901 ；和 BC012419) ； IFITMl (NM_003641 ； BC000897 ；BT007173 ；BT009859 ；CR456894 ；CR541874 ；CR604902 ；X57351 ；X84958 ； NM_006435 ；BC009696 ；X02490 ；禾口 J04164) ；SMNl(NM_000344 ；BC062723 ；CR611445 ； CR593735；BC000908 ；NM_022874 ；BC015308 ；和 U18423) ；PRKCA(NM_002737 ；AB209475 ； BC109274 ；BC109273 ；AF035594 ；BC053321 ；BX648954 ；AK125425 ；BC062759 ；BC071767 ； BC103691 ；BC101403 ；BC107592 ；AY633609 ；BC122530 ；BC015855 ；AF086287 ；AF035595 ； M22199 ；禾口 X52479) ；EPDRl(DQ914439 ；AY027862 ；NM_017549 ；AJ250475 ；AF202051 ； CR624676 ；CR596656 ；NM_016616 ；BC000686 ；BC018299 ；AF305596 ；禾P BC036816)； PRPSAP2(NM_002767 ；AB007851 ；BX648850 ；AK126398 ；CR457082 ；BC101672 ；BC101670 ； 和 BC106050) ； IGF1R(NM_000875 ；NM_015883 ；AY429545 ；CR624013 ；BC078157 ；BC088377 ； BC107089 ；BC111046 ；BC113610 ；BC113612 ；BC010607 ；X04434 M24599 ；禾口 U09023)；
18BTG2 (NM_006763 ；CR606002 ；CR604962 ；CR595352 ；CR591042 ；BC105948 ；BC105949 ； U72649 ；禾P Y09943) ；LM02(BC042426 ；NM_005574 ；BC073973 ；AK127915 ；CR625714 ； CR614368 ；CR604507 ；AF257211 ；BC034041 ；BC035607 ；禾口 X61118) ；YIPF3(AL050274 ； AK000946 ；CR533541 ；CR623137 ；CR622890 ；CR622532 ；CR621993 ；CR619816 ；CR619437 ； CR619054 ；CR618212 ；CR616987 ；CR616384 ；CR615623 ；CR615153 ；CR615118 ；CR612415 ； CR611748 ；CR611260 ；CR610983 ；CR610470 ；CR607768 ；CR606024 ；CR603408 ；CR603202 ； CR602267；CR601987；CR599615；CR598162；CR597677；CR596581 ；CR596249 ；CR595236 ； CR592266 ；CR590752 ；CR590349 ；NM_015388 ；AK021433 ；AK021655 ；AK022757 ；BC019297 ； 和 AF162672)；和 BCL6 (ΝΜ_001706 ；NM_138931 ；BX649185 ；UOOl 15 ；BC142705 ；BC146796 ； BC150184 ；AL713713 ；AK090890 ；AL832990 ；和 Z21943)。圖6(6-1至6-35)中顯示了表2_4、6、7和13中所提到的一些基因的核酸序列。參照水平將B細胞淋巴瘤中一種或多種標(biāo)志物基因的測量表達水平與參照水平比較。在 一些實施方案中，所述參照水平是其表達水平在不同類型的B細胞淋巴瘤間(例如在對抗 CD40抗體敏感的B細胞淋巴瘤與對抗CD40抗體有抗性的B細胞淋巴瘤之間)不變化(不 顯著變化)的基因的表達水平。在一些實施方案中，使用表8中所顯示的一種或多種持家 基因的表達水平作為參照水平。在一些實施方案中，使用表9中所顯示的一種或多種持家 基因的表達水平作為參照水平。在一些實施方案中，使用參照水平將標(biāo)志物基因的測量表達水平標(biāo)準化。在一些 實施方案中，分別在原比例尺或?qū)?shù)比例尺上，作為標(biāo)志物基因與參照表達水平之間的比 或差異來計算標(biāo)志物基因的標(biāo)準化表達水平。選擇表8和表9中的參照基因作為表4中標(biāo)志物基因的特定標(biāo)準化對應(yīng)物。參照 基因選擇在B細胞淋巴瘤樣品中具有高均值表達和低方差。另外，參照基因選擇相對于生 物學(xué)不同細胞系的表達測量間的方差，在各細胞系的復(fù)制表達測量間具有相似的方差。另 外，參照基因選擇與表4中的一種或多種標(biāo)志物具有低統(tǒng)計關(guān)聯(lián)。在一些實施方案中，參照水平是不同B細胞淋巴瘤樣品中標(biāo)志物基因的測量表達 水平。在一些實施方案中，所述不同B細胞淋巴瘤樣品包含對抗CD40抗體誘導(dǎo)的細胞死亡 有抗性的B淋巴瘤細胞。在一些實施方案中，參照水平是基于如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達水平而確 定的，所述樣品來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積增大和/或在抗CD40抗體治療后腫瘤 體積縮小的受試者且包含B淋巴瘤細胞。在一些實施方案中，所述來自用于確定參照水平 的受試者的樣品與所述來自要預(yù)測或評估對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的受試者的樣品包 含相同類型的B淋巴瘤細胞。在一些實施方案中，使用相同的方法(例如qRT-PCR)和/或 試劑(例如引物和探針)來測量樣品中標(biāo)志物基因的表達水平和測量參照樣品中相應(yīng)標(biāo)志 物基因的表達水平。
19 測量表達水平本文中所公開的方法提供了相對于參照水平，檢查淋巴瘤樣品(例如B細胞淋巴 瘤樣品)中這些標(biāo)志物基因中一種或多種的表達水平的方法。所述方法和測定法包括那些 檢查標(biāo)志物基因(諸如表2-4、6、7和13任一所列那些中的一種或多種)的表達的?？梢?在mRNA水平和/或蛋白質(zhì)水平測量表達水平。本發(fā)明提供了用于測量來自哺乳動物組織或細胞樣品(諸如與B細胞淋巴瘤有關(guān) 的細胞和/或組織)的表達水平的方法。例如，為了獲得患者樣品，進行H&E染色并用作組織宏觀解剖(macrodissection)的指導(dǎo)來富集腫瘤含量?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的多種規(guī)程 來獲得樣品，包括但不限于手術(shù)切除、抽吸或活檢。樣品可以是新鮮的或冷凍的。在一些實 施方案中，樣品是固定和包埋在石蠟或類似物中的。在所述方法中，獲取哺乳動物組織或細 胞樣品，并檢驗一種或多種生物標(biāo)志物的表達。所述方法可以以多種測定法格式進行，包括 檢測mRNA表達的測定法、檢測酶活性存在的酶測定法、和免疫組織化學(xué)測定法。在所述組 織或細胞中測出此類生物標(biāo)志物的表達則預(yù)示該組織或細胞將會對抗CD40抗體治療敏感 /有響應(yīng)。如下所述，可以通過許多方法學(xué)來分析樣品中多種生物標(biāo)志物的表達，這些方法 許多是本領(lǐng)域已知的且本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的，包括但不限于微陣列(基因和/或組織陣 列分析)、原位雜交、Northern分析、PCR分析(mRNA)、免疫組織化學(xué)和/或Western分析、 基于血液的定量測定法(例如血清ELISA)(用以檢驗例如蛋白質(zhì)表達水平)、和/或生化 酶活性測定法。用于評估基因和基因產(chǎn)物狀態(tài)的典型方案可見于例如Ausubel等編，1995， ((CurrentProtocols In Molecular Biology〉〉，單元 2 (Northern E口跡)、4 (Southern E口跡)、 15 (免疫印跡)和18 (PCR分析)。下文出于例示目的提供了關(guān)于檢測樣品中特定生物標(biāo)志 物(諸如表2-4、6、7和13所列的那些)的方案。在一些實施方案中，本發(fā)明的方法進一步包括檢驗組織或細胞樣品中mRNA (諸如 表2-4、6、7和13任一所列基因的mRNA)的存在和/或表達的方案。在一些實施方案中， 可通過檢驗或檢測組織或細胞樣品中mRNA(諸如表2-4、6、7和13任一中的mRNA)的微陣 列技術(shù)來分析樣品中各種生物標(biāo)志物的表達。使用核酸微陣列，將來自測試和對照組織樣 品的測試和對照mRNA樣品逆轉(zhuǎn)錄和標(biāo)記以生成cDNA探針。然后將所述探針雜交至在固 體支持物上固定化的核酸陣列。所述該陣列配置成陣列的每個成員的序列和位置是已知 的。例如，可以將有可能在某些疾病狀態(tài)中表達的基因選集在固體支持物上形成陣列。經(jīng) 標(biāo)記探針與特定陣列成員的雜交指示衍生該探針的樣品表達該基因。疾病組織的差異基 因表達分析可提供有價值的信息。微陣列技術(shù)利用核酸雜交技術(shù)和計算技術(shù)在單一實驗 中評估數(shù)以千計基因的mRNA表達序型(expression profile)(參見例如2001年10月 11日公布的W001/75166 ；還可參見例如美國專利5，700，637 ；5，445，934 ；和5,807, 522 ； Lockart, Nature Biotechnology,14 1675-1680(1996) ；Cheung, V.G.et al. , Nature Genetics21 (Suppl) :15_19 (1999)，關(guān)于陣列制作的討論)。DNA微陣列是包含基因片段的 微型陣列，所述基因片段或是在玻璃或其它基質(zhì)上直接合成或是點到玻璃或其它基質(zhì)上。 單一陣列中通常呈現(xiàn)數(shù)以千計的基因。一個典型的微陣列實驗牽涉以下步驟1)自分離自 樣品的RNA制備熒光標(biāo)記的靶物；2)將經(jīng)標(biāo)記的靶物雜交至微陣列；3)清洗，染色，和掃描 陣列；4)分析掃描圖像；并5)生成基因表達序型。當(dāng)前使用兩種主要類型的DNA微陣列 包含自cDNA制備的PCR產(chǎn)物的基因表達陣列和寡核苷酸(通常25-70聚物)陣列。在形 成陣列時，寡核苷酸可以是預(yù)制并點到表面上的，或者是直接在表面上合成的(原位)。Affymetrix GeneChip 系統(tǒng)是包含通過在玻璃表面上直接合成寡核苷酸而制作 的陣列的商品化微陣列系統(tǒng)。探針/基因陣列寡核苷酸(通常25聚物)通過組合基于 半導(dǎo)體的光刻和固相化學(xué)合成技術(shù)直接合成到玻璃晶片上。每個陣列包含多至400，000種 不同寡聚物，每種寡聚物以數(shù)以百萬計拷貝存在。因為寡核苷酸探針是在陣列上已知位置 合成的，所以雜交樣式和信號強度可以通過Affymetrix Microarray Suite軟件解讀成基因身份和相對表達水平。每種基因通過一系列不同寡核苷酸探針呈現(xiàn)在陣列上。每個探針 對由完全匹配寡核苷酸和錯配寡核苷酸組成。完全匹配探針具有與特定基因精確互補的序 列，因而測量該基因的表達。錯配探針因中央堿基位置的單一堿基替代而不同于完全匹配 探針，從而擾亂了靶基因轉(zhuǎn)錄物的結(jié)合。這有助于測定有助于對完全匹配寡聚物測得的信 號的背景和非特異性雜交。Microarray Suite軟件將錯配探針的雜交強度從完全匹配探 針的雜交強度中扣除，以確定每個探針集的絕對或特異強度。探針的選擇基于GenBank和 其它核苷酸庫的當(dāng)前信息。認為其序列識別基因3’末端的獨特區(qū)域。使用基因芯片雜交 爐(“電轉(zhuǎn)烤爐”)來進行多至64個陣列的同時雜交。射流站實施探針陣列的清洗和染色。 它是完全自動化的，包括四個模塊，每個模塊持有一個探針陣列。每個模塊經(jīng)由Microarray Suite軟件使用預(yù)編程射流方案獨立控制。掃描儀是共焦激光熒光掃描儀，其測量由結(jié)合至 探針陣列的經(jīng)標(biāo)記cRNA發(fā)射的熒光強度。安裝有Microarray Suite軟件的計算機工作站 控制射流站和掃描儀。Microarray Suite軟件可以控制多至八個射流站，使用探針陣列的 預(yù)編程的雜交、清洗、和染色方案。該軟件還獲取雜交強度數(shù)據(jù)并使用適宜的算法將其轉(zhuǎn)變 成每種基因的有/無呼叫(presence/absence call)。最后，該軟件通過比較分析來檢測各 實驗間基因表達的變化，并將輸出格式化為.txt文件，其可以與其它軟件程序一起用于進 一步的數(shù)據(jù)分析。在一些實施方案中，樣品中各種生物標(biāo)志物的表達還可以通過檢驗基因刪除或基 因擴增來評估。基因刪除或擴增可以通過本領(lǐng)域已知的任一種或多種方案來測量，例如常 規(guī) Southern 印跡、Northern 印跡(用以量化 mRNA 轉(zhuǎn)錄)(Thomas，Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77 :5201-5205(1980))、點印跡(DNA分析)、或原位雜交(例如FISH)，其中使用適當(dāng)標(biāo) 記的探針、細胞發(fā)生法(cytogenetic method)或比較性基因組雜交(CGH)，其中使用適當(dāng) 標(biāo)記的探針。例如，這些方法可用于檢測表2-4、6、7和13任一所列基因的刪除或擴增。在一些實施方案中，可以通過使用互補DNA探針的雜交測定法(諸如使用經(jīng)標(biāo)記 核酸探針的原位雜交、Northern印跡和相關(guān)技術(shù))和各種核酸擴增測定法(諸如使用互補 引物(諸如對表2-4、6、7和13任一所列一種或多種基因特異性的引物)的RT-PCR，及其它 擴增型檢測方法，諸如例如分支DNA、SISBA、TMA等等)。來評估樣品中各種生物標(biāo)志物的 表達。例如可以使用Northern、點印跡或PCR分析對來自哺乳動物的組織或細胞樣品 方便地測定表2-4、6、7和13任一所列基因的mRNA。在一些實施方案中，可以通過RT-PCR 來測定一種或多種生物標(biāo)志物的表達。在一些實施方案中，所述RT-PCR可以是定量 RT-PCR(qRT-PCR)。在一些實施方案中，所述RT-PCR是實時RT-PCR。在一些實施方案中， 所述RT-PCR是定量實時RT-PCR。RT-PCR測定法諸如定量PCR測定法是本領(lǐng)域公知的。在 本發(fā)明的一個例示性實施方案中，用于檢測生物學(xué)樣品中的mRNA的方法包括使用至少一 種引物通過逆轉(zhuǎn)錄自樣品生成cDNA ；使用多核苷酸作為有義和反義引物擴增如此生成的 cDNA以擴增其中的cDNA ；并檢測所擴增感興趣cDNA的存在。在一些實施方案中，所述實時 RT-PCR可以是定量RT-PCR。在一些實施方案中，所述實時RT-PCR可以使用TaqMan 化學(xué) (Applied Biosystems)來實施。在一些實施方案中，所述實時RT-PCR可以使用TaqMan 化學(xué)(AppliedBiosystems)和ABI Prism 700序列檢測系統(tǒng)(Applied Biosystems)來實 施。實時RT-PCR組合了下述原理，Taq聚合酶具有5' -3'外切核酸酶活性，及雙重標(biāo)記的熒光寡核苷酸產(chǎn)生了只在切割時發(fā)射熒光信號的問題(基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的原理)。 參見例如 Overbergh，L. et al.，J Biomolecular Techniques 14(1) :33_43 (2003)。另夕卜， 此類方法可以包括一個或多個如下步驟，其容許測定生物學(xué)樣品中mRNA(諸如表2-4、6、7 和13任一所列基因的mRNA)的水平(例如通過同時檢驗“持家”基因諸如肌動蛋白家族成 員和/或表8或表9中所列舉的一種或多種基因的比較性對照mRNA序列的水平)。表10 中提供了可用于進行qRT-PCR的引物和探針的例子。在一些實施方案中，使用免疫組織化學(xué)和染色方案來檢驗樣品中由表2_4、6、7和 13任一所列基因編碼的蛋白質(zhì)的表達。組織切片的免疫組織化學(xué)染色已經(jīng)顯示為評估或檢 測樣品中蛋白質(zhì)存在的可靠方法。免疫組織化學(xué)(“IHC”)技術(shù)利用抗體來原位探查和顯 現(xiàn)細胞抗原，一般通過顯色或熒光方法。對于樣品制備，可以使用來自哺乳動物(典型的是人類患者)的組織或細胞樣品。 樣品的例子包括但不限于組織活檢、血液、肺吸出物、痰或唾液、淋巴液等?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域 已知的多種規(guī)程來獲得樣品，包括但不限于手術(shù)切除、抽吸或活檢。組織可以是新鮮的或冷 凍的。在一些實施方案中，樣品是固定和包埋在石蠟或類似物中的?？梢酝ㄟ^常規(guī)方法來固定(即保存)組織樣品(參見例如“Manual ofHistological Staining Method of the Armed Forces Institute of Pathology,，，第3 片反(1960)Lee G. Luna, HT(ASCP) H，The Blakston Division McGraw-HillBook Company, New York ；The Armed Forces Institute of Pathology AdvancedLaboratory Methods in Histology and Pathology(1994)Ulreka V. Mikel 編，Armed Forces Institute of Pathology, American Registry of Pathology，Washington，D· C·)。本領(lǐng)域技術(shù)人員>|#領(lǐng) 會，固定劑的選擇由樣品是用于組織學(xué)染色還是其它分析的目的來決定。本領(lǐng)域技術(shù)人員 還將領(lǐng)會，固定時長取決于組織樣品的大小和所使用的固定劑。例如，可以使用中性緩沖的 福爾馬林、Bouin氏液或低聚甲醛來固定樣品。一般而言，將樣品首先固定，然后通過酒精遞增系列脫水，用石蠟或其它切片介 質(zhì)滲透和包埋使得該組織樣品可以切片?；蛘?，可以將組織進行切片并將所得切片固 定。例如，可以通過常規(guī)方法學(xué)將組織樣品在石蠟中包埋和加工(參見例如“Manual of Histological Staining Method of the Armed ForcesInstitute of Pathology“,見 上文)?？梢允褂玫氖灥睦影ǖ幌抻赑araplast、Broloid、和Tissuemay。一旦 將組織樣品包埋，就可以用切片機等等將樣品切片(參見例如“Manual of Histological Staining Method of the ArmedForces Institute of Pathology”，)。)(寸夫JS 程，例如，切片的厚度范圍可以是約3微米至約5微米。一旦切片，就可以通過數(shù)種標(biāo)準方 法將切片附著至載玻片。載玻片粘合劑的例子包括但不限于硅烷、明膠、聚L-賴氨酸等等。 例如，可以將石蠟包埋的切片附著于帶正電荷的載玻片和/或聚L-賴氨酸包被的載玻片。若使用石蠟作為包埋材料，則一般將組織切片脫石蠟和復(fù)水?？梢酝ㄟ^數(shù)種常 規(guī)標(biāo)準方法學(xué)將組織切片脫石蠟。例如，可以使用二甲苯和酒精逐漸遞減系列(參見例 如 “Manual of Histological Staining Method of the ArmedForces Institute of Pathology”，見上文)。或者，可以使用商品化的脫石蠟用非有機試劑，諸如Hem0-De7 (CMS， Houston, Texas) 0在一些實施方案中，在樣品制備后，可以使用IHC來分析組織切片。IHC可以聯(lián)合
32別的技術(shù)進行，諸如形態(tài)學(xué)染色和/或熒光原位雜交?？衫肐HC的兩種常用方法，即直接 和間接測定法。依照第一種測定法，直接測定抗體對靶抗原(例如由表1_4、6和7中所列舉 的一種或多種基因編碼的蛋白質(zhì)或其片段)的結(jié)合。此直接測定法使用經(jīng)過標(biāo)記的試劑， 諸如熒光標(biāo)簽或酶標(biāo)記的一抗，其可以在沒有進一步抗體相互作用的情況下顯現(xiàn)。在一種 典型的間接測定法中，未偶聯(lián)的一抗結(jié)合至抗原，然后經(jīng)過標(biāo)記的二抗結(jié)合至一抗。若二抗 偶聯(lián)有酶標(biāo)記物，則添加顯色或熒光底物以提供抗原顯現(xiàn)。因為數(shù)個二抗可以與一抗上的 不同表位起反應(yīng)，所以發(fā)生了信號放大。用于免疫組織化學(xué)的一抗和/或二抗通常用可檢測模塊標(biāo)記?？衫迷S多標(biāo)記 物，一般可分成以下幾類(a)放射性同位素，諸如 35S、14C、125I、3H和 1311。例如，可使用 CurrentProtocols in Immunology,卷 1 禾口 2, Coligen 等編，Wiley-Interscience, New York, New York, Pubs. 1991 中記載的技術(shù)用放射性同位素標(biāo)記抗體，并可使用閃爍計數(shù)來測量放射性。(b)膠體金顆粒。(c)熒光標(biāo)記物，包括但不限于稀士螯合物(銪螯合物)、德州紅、若丹明、熒光 素、丹酰、麗絲胺、傘形酮、藻紅蛋白、藻藍蛋白、或商品化熒光團諸如SPECTRUM 0RANGE7和 SPECTRUM GREEN7和/或上述任一種或多種的衍生物。例如，可使用Current Protocols in Immunology，見上文中披露的技術(shù)使熒光標(biāo)記物與抗體偶聯(lián)?？墒褂脽晒庥媽晒膺M行定量。(d)可利用各種酶_底物標(biāo)記物且美國專利第4，275，149號中提供了有關(guān)它們中 的一些的綜述。酶一般催化可使用多種技術(shù)測量的顯色底物的化學(xué)改變。例如，酶可以催 化可通過分光光度法測量的底物顏色改變?；蛘?，酶可以改變底物的熒光或化學(xué)發(fā)光。上 文描述了用于對熒光改變進行定量的技術(shù)。化學(xué)發(fā)光底物通過化學(xué)反應(yīng)變成電子激發(fā)態(tài)， 然后可發(fā)射可測量(例如使用化學(xué)發(fā)光計)或給熒光受體提供能量的光。酶標(biāo)記物的例子 包括螢光素酶(例如螢火蟲螢光素酶和細菌螢光素酶；美國專利No. 4，737，456)、螢光素、 2,3- 二氫酞嗪二酮類、蘋果酸脫氫酶、尿素酶、過氧化物酶諸如辣根過氧化物酶(HRPO)、堿 性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶(例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧 化酶和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶)、雜環(huán)氧化酶(諸如尿酸酶和黃嘌呤氧化酶)、乳過氧化物 酶、微過氧化物酶等。用于使酶與抗體偶聯(lián)的技術(shù)描述于0' Sullivan等，Methods for the Preparation ofEnzyme-Antibody Conjugates for use in Enzyme Immunoassay, 于:Methods inEnzym. , J. Langone 禾口 H. Van Vunakis 編，Academic Press, New York,73 147-166(1981)。酶-底物組合的例子包括例如(i)辣根過氧化物酶(HRPO)與作為底物的過氧化氫，其中過氧化氫氧化染料前體 (例如鄰苯二胺(OPD)或3，3' ,5,5' _四甲基聯(lián)苯胺鹽酸鹽(TMB))；(ii)堿性磷酸酶(AP)與作為顯色底物的對硝基苯基磷酸酯；和(iii) β -D-半乳糖苷酶(β -D-Gal)與顯色底物(例如對硝基苯基_β _D_半乳糖 苷)或熒光底物(例如4-甲基傘形基-β -D-半乳糖苷)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可利用許多其它酶-底物組合。有關(guān)它們的一般性綜述參見美國 專利No. 4，275，149和4，318，980。有時，將標(biāo)記物與抗體間接偶聯(lián)。熟練技術(shù)人員了解實現(xiàn)這一目的的多種技術(shù)。例如，可將抗體與生物素偶聯(lián)，而且可以將上述四大類標(biāo)記物中的 任一種與親合素偶聯(lián)，或反之亦然。生物素選擇性結(jié)合親合素，由此標(biāo)記物可與抗體以這種 間接方式偶聯(lián)?；蛘?，為了實現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)，將抗體與小型半抗原偶聯(lián)，并將 上述不同類型的標(biāo)記物之一與抗半抗原抗體偶聯(lián)。由此，可實現(xiàn)標(biāo)記物與抗體的間接偶聯(lián)。在上文討論的樣品制備規(guī)程外，可能還需要在IHC之前、期間或之后對組織切片 進行進一步的處理。例如，可以實施表位修復(fù)法，諸如在檸檬酸鹽緩沖液中對組織樣品進行 加熱(參見例如 Leong 等，Appl. Immunohistochem. 4 (3) 201 (1996))。在任選的封閉步驟后，將組織切片在合適條件下暴露于第一抗體足夠時間，使得 第一抗體結(jié)合至組織樣品中的靶蛋白抗原。實現(xiàn)這一目的的適宜條件可以通過常規(guī)實驗 來確定?？贵w與樣品的結(jié)合程度通過使用上文討論的任一種可檢測標(biāo)記物來測定。優(yōu)選 的是，標(biāo)記物是酶標(biāo)記物(例如HRP0)，其催化顯色底物諸如3，3' - 二氨基聯(lián)苯胺色原體 (chromogen)的化學(xué)變化。優(yōu)選的是，將酶標(biāo)記物偶聯(lián)至特異性結(jié)合第一抗體的抗體(例如 第一抗體是家兔多克隆抗體，第二抗體是山羊抗家兔抗體)。在一些實施方案中，IHC分析中用于檢測一種或多種生物標(biāo)志物表達的抗體是用 以主要結(jié)合一種或多種感興趣生物標(biāo)志物(諸如一種或多種由表2-4、6和7任一中所列舉 的基因編碼的蛋白質(zhì))而生成的抗體。在一些實施方案中，所述抗體是單克隆抗體?？贵w 在本領(lǐng)域易于獲得，包括各種商業(yè)來源，而且也可以使用本領(lǐng)域已知的常規(guī)技術(shù)生成。可以將如此制備的標(biāo)本放置好并蓋上蓋玻片。然后進行載玻片評估，例如利用顯 微鏡，并且可以采用本領(lǐng)域常規(guī)使用的染色強度標(biāo)準。例如，染色強度標(biāo)準可以如下評估表 A 在備選方法中，可以在足以使抗體_生物標(biāo)志物復(fù)合物形成的條件下使樣品接觸 對所述生物標(biāo)志物特異性的抗體，然后檢測所述復(fù)合物?？梢砸远喾N方式來檢測生物標(biāo)志 物的存在，諸如通過Western印跡和ELISA規(guī)程，其用于測定極其廣泛的組織和樣品，包括 血漿或血清?？衫枚喾N使用此類測定法的免疫測定技術(shù)，參見例如美國專利第4，016，043 號；第4，424，279號和第4，018，653號。這些包括非競爭性類型的單位點和雙位點或“三 明治/夾心式”測定法，以及傳統(tǒng)的競爭性結(jié)合測定法。這些測定法也包括經(jīng)標(biāo)記抗體對靶 生物標(biāo)志物的直接結(jié)合。三明治測定法是最有用且常用的測定法之一。三明治測定技術(shù)有許多變化形式， 本發(fā)明意圖涵蓋所有這些變化形式。簡言之，在一種典型的正向測定法(forward assay)
34中，將未標(biāo)記的抗體固定化在固體基片上，使待測試的樣品接觸所結(jié)合的分子。溫育足以容 許抗體-抗原復(fù)合物形成的合適長度的一段時間后，添加對抗原特異性的、用能夠生成可 檢測信號的報道分子標(biāo)記的第二抗體并溫育足以使另一復(fù)合物即抗體-抗原-經(jīng)標(biāo)記抗體 形成的一段時間。洗去任何未反應(yīng)的物質(zhì)，并通過由報道分子生成的信號的觀察結(jié)果來測 定抗原的存在。結(jié)果可以是定性的，即通過可見信號的簡單觀察，或者可以量化，即通過與 包含已知量的生物標(biāo)志物的對照樣品比較。正向測定法的變化形式包括同時測定法，其中將樣品和經(jīng)標(biāo)記抗體二者同時添加 至所結(jié)合的抗體。這些技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，包括任何顯而易見的微小變化。 在一種典型的正向三明治測定法中，將具有針對生物標(biāo)志物的特異性的第一抗體或是共價 的或是被動的結(jié)合至固體表面。所述固體表面典型地是玻璃或聚合物，最常用的聚合物是 纖維素、聚丙烯酰胺、尼龍、聚苯乙烯、聚氯乙稀或聚丙烯。所述固體支持物可以是管、珠、微 孔板的盤、或適于實施免疫測定法的任何其它表面的形式。結(jié)合過程是本領(lǐng)域眾所周知的， 一般由交聯(lián)、共價結(jié)合或物理吸附組成，清洗聚合物_抗體復(fù)合物，為測試樣品做好準備。 將待測樣品的等分試樣添加至固相復(fù)合物，并在合適條件(例如室溫至40°C，諸如25°C和 32°C之間，含兩端值)下溫育足夠時間(例如2-40分鐘或過夜，如果更方便的話)以容許 抗體中存在的任何亞基結(jié)合。溫育期后，將抗體亞基固相清洗并干燥并與對生物標(biāo)志物的 一部分特異性的第二抗體一起溫育。所述第二抗體連接有用于指示第二抗體對分子標(biāo)志物 結(jié)合的報道分子。在一些實施方案中，所述方法牽涉將樣品中的靶生物標(biāo)志物固定化，然后將固定 化的靶物暴露于未標(biāo)記的或用報道分子標(biāo)記的特異性抗體。根據(jù)靶物的量和報道分子信號 的強度，所結(jié)合的靶物可以是通過用抗體直接標(biāo)記而可檢測的?；蛘撸瑢⒔?jīng)標(biāo)記的、對第一 抗體特異性的第二抗體暴露于靶物_第一抗體復(fù)合物以形成靶物_第一抗體_第二抗體三 元復(fù)合物。該復(fù)合物通過報道分子發(fā)射的信號來檢測?！皥蟮婪肿印痹谟糜诒菊f明書時指通 過其化學(xué)本質(zhì)提供分析上可鑒定的信號從而容許檢測抗原所結(jié)合抗體的分子。這類測定法 中最常用的報道分子是酶、熒光團或含放射性核素的分子(即放射性同位素)和化學(xué)發(fā)光 分子。在酶免疫測定法的情況中，有酶偶聯(lián)至第二抗體，一般通過戊二醛或高碘酸鹽或 酯的手段。然而，正如易于領(lǐng)會的，有極其多種不同偶聯(lián)技術(shù)可供技術(shù)人員使用。常用的酶 包括辣根過氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶和堿性磷酸酶等等。與特定酶一起使用的 底物一般根據(jù)在被相應(yīng)的酶水解后生成可檢測的顏色變化來選擇。合適的酶的例子包括堿 性磷酸酶和過氧化物酶。也有可能采用熒光底物，其生成熒光產(chǎn)物而非上文所述顯色底物。 在所有情況中，將酶標(biāo)記的抗體添加至第一抗體_分子標(biāo)志物復(fù)合物，容許結(jié)合，然后洗去 過量的試劑。然后將含有適宜底物的溶液添加至抗體-抗原-抗體復(fù)合物。底物與第二抗 體所連接的酶起反應(yīng)，給出定性可視信號，其可以進一步量化，通常通過分光光度法，以給 出樣品中存在的生物標(biāo)志物量的指示?；蛘撸梢詫晒饣衔?諸如熒光素和羅丹明)化 學(xué)偶聯(lián)至抗體而不改變其結(jié)合能力。在被特定波長的光照射而激活后，熒光團標(biāo)記的抗體 吸收光能，在分子中誘導(dǎo)激發(fā)狀態(tài)，接著以光學(xué)顯微鏡在視覺上可檢測的特征性顏色發(fā)光。 在EIA中，容許熒光標(biāo)記的抗體結(jié)合至第一抗體_分子標(biāo)志物復(fù)合物。洗去未結(jié)合的試劑 后，將剩余的三元復(fù)合物然后暴露于適宜波長的光，所觀察到的熒光指示存在感興趣的分子標(biāo)志物。免疫熒光和EIA技術(shù)都是本領(lǐng)域已完善建立的。然而，也可以采用其它報道分 子，諸如放射性同位素、化學(xué)發(fā)光或生物發(fā)光分子。在一些實施方案中，組織或細胞樣品中選定的生物標(biāo)志物的表達還可以通過基于 功能或活性的測定法來檢驗。例如，若生物標(biāo)志物是酶，則可以實施本領(lǐng)域已知測定法來測 定或檢測組織或細胞樣品中給定酶活性的存在。在評估一種或多種生物標(biāo)志物的表達水平的任何上述方法中，包含靶分子的樣品 可通過本領(lǐng)域公知的方法獲得，而且它們適于特定類型和位置的感興趣疾病。組織活檢通 常用于獲得有代表性的疾病組織片?；蛘撸梢砸阎蛘J為包含感興趣疾病細胞的組織/ 流體的形式間接獲取細胞。例如，疾病損傷的樣品可通過切除術(shù)、支氣管鏡檢、細針抽吸、支 氣管刷檢、或從痰/唾液、胸膜液或血液中獲得?？蓮募膊〗M織或從其它身體樣品諸如尿、 痰或血清中檢測出基因或基因產(chǎn)物。上述用于檢測疾病樣品中靶基因或基因產(chǎn)物的同樣技 術(shù)可用于其它身體樣品。通過篩選這些身體樣品，可實現(xiàn)對于這些疾病的簡單早期診斷。另 外，通過對這些身體樣品測試靶基因或基因產(chǎn)物，可更容易地監(jiān)測治療的進程。對組織制備物富集疾病細胞的手段是本領(lǐng)域已知的。例如，可以從石蠟或低溫保 存的切片中分離組織。感興趣細胞也可通過流式細胞術(shù)或激光捕捉顯微解剖而與正常細胞 分開。這些以及其它從正常細胞中分離疾病細胞的技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。如果疾病組織被 正常細胞高度污染，那么檢測簽名基因表達序型可能更為困難，然而最小化污染和/或假 陽/陰性結(jié)果的技術(shù)是已知的，其中一些在下文有描述。例如，也可以對樣品評估生物標(biāo)志 物(包括突變)的存在情況，所述標(biāo)志物已知與感興趣的疾病細胞有關(guān)而與相應(yīng)的正常細 胞無關(guān)，反之亦然。在確定組織或細胞樣品表達一種或多種指示該組織或細胞樣品會對抗⑶40抗體 治療敏感的生物標(biāo)志物之后，可以對哺乳動物(諸如人)施用有效量的抗CD40抗體以治療 侵擾該哺乳動物的病癥(諸如B細胞淋巴瘤)。哺乳動物(諸如人)中本文所述各種病理 疾患的診斷可以由熟練從業(yè)人員做出。比較表達水平和預(yù)測、評估或幫助評估B細胞淋巴瘤對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性本文所述方法包含比較標(biāo)志物基因的測量表達水平與參照水平的過程。所述參照 水平可以是與標(biāo)志物基因不同的參照基因的測量表達水平或不同樣品中同一標(biāo)志物基因 的測量表達水平。在一些實施方案中，將來自受試者的B細胞淋巴瘤樣品中標(biāo)志物基因的測量表達 水平與該樣品中參照基因的測量表達水平比較。在一些實施方案中，參照基因的表達水平 在各種類型的B淋巴瘤細胞(包括抗CD40抗體敏感性和抗性細胞)間基本上不變化，例如 表8或表9中的基因。在一些實施方案中，計算標(biāo)志物基因的測量表達水平對參照的測量表 達水平的比，而且該比值可用于評估或幫助評估B細胞淋巴瘤對抗CD抗體治療的響應(yīng)性。在一些實施方案中，將來自受試者的B細胞淋巴瘤樣品中標(biāo)志物基因的測量表達 水平與參照樣品中標(biāo)志物基因的測量表達水平比較。在一些實施方案中，參照樣品包含對 抗CD40抗體有抗性或不響應(yīng)的B淋巴瘤細胞。例如，實施比較來確定來自受試者的樣品中 與參照樣品中標(biāo)志物基因的測量表達水平的差異程度(例如比較來自受試者的樣品與參 照樣品中標(biāo)志物基因的表達水平間的倍數(shù)或百分比差異)。與包含對抗CD40抗體有抗性或 不響應(yīng)的B淋巴瘤細胞的參照樣品中標(biāo)志物基因的表達相比，來自受試者的樣品中標(biāo)志物基因的表達升高或降低提示或指示B細胞淋巴瘤對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性。與抗性細 胞相比在抗CD40抗體敏感性細胞中的表達升高和降低的標(biāo)志物基因參見表4。例如，與抗 性細胞相比，抗CD40抗體敏感性細胞中一般過表達VNN2、MEF2C、LTB、KCNN3、NCFU BCL6、 IGJ、ELTI1902、PN0C、CSF2RB、P0U2AF1、CD22、RGS13、和 MEF2B。在一些實施方案中，來自受 試者的樣品的表達水平的升高倍數(shù)可以是參照樣品的表達水平的至少約1. 5倍、1. 75倍、2 倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、或10倍。在一些實施方案中，來自受試者的樣品的 表達水平的降低倍數(shù)可以是參照樣品的表達水平的不到約0. 01,0. 05,0. 1,0. 2,0. 3,0. 4、 0. 5、0· 6、0· 7 或 0. 8。在一些實施方案中，將選自下組的一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平與參照水平 比較IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR1、UAP1、 禾口 PUS7。在一些實施方案中，與參照水平相比IFITMl、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、 和PUS7中一種或多種的表達水平升高指示所述受試者不太可能響應(yīng)激動性抗CD40抗體治 療。在一些實施方案中，參照水平是通過如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達水平而確定的 值或范圍，所述樣品包含來自在激動性抗CD40抗體治療后腫瘤體積增大的受試者的B淋巴 瘤細胞。在一些實施方案中，與參照水平相比CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和UAP1 中一種或多種的表達升高指示所述受試者有可能響應(yīng)激動性抗CD40抗體治療。在一些實 施方案中，參照水平是通過如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達水平而確定的值或范圍，所 述樣品包含來自在激動性抗CD40抗體治療后腫瘤體積縮小的受試者的B淋巴瘤細胞。在一些實施方案中，測量BCL6的表達水平并與參照水平比較。使用BCL6的表達水 平來預(yù)測、評估、或幫助評估受試者對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性。如實施例2中所顯示的， BCL6表達趨向于在那些腫瘤在激動性抗⑶40抗體治療后增大的受試者中較低。在一些實 施方案中，與通過來自腫瘤體積在激動性抗CD40抗體治療后縮小的受試者的樣品中BCL6 的表達水平確定的參照水平相比BCL6表達升高可指示該受試者有可能響應(yīng)激動性抗CD40 抗體治療。在一些實施方案中，測量表7中的標(biāo)志物基因的表達水平，并確定作為表7中基 因?qū)?-8的log2刻度表達的帶正負號的t值之和計算的敏感指數(shù)，其中敏感指數(shù)大于_4 提示或指示B細胞淋巴瘤響應(yīng)抗CD40抗體治療。在一些實施方案中，敏感指數(shù)大于_3、大 于-2、大于-1、或大于0。在一些實施方案中，敏感指數(shù)介于_4和20之間。在一些實施方 案中，敏感指數(shù)介于0和20之間。在一些實施方案中，測量IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、 IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、UAPl、和PUS7中一種或多種的表達水平，并基于標(biāo)志物基因的測 量表達水平計算敏感指數(shù)。例如，可以使用下述方程來確定敏感指數(shù)(Si) 其中測量表13所示至少一種具有正關(guān)聯(lián)值的標(biāo)志物基因的和至少一種具有負關(guān) 聯(lián)值的標(biāo)志物基因的表達水平；其中(i) β j是所測量的每一種標(biāo)志物基因的系數(shù)值；( ) P是所測量的標(biāo)志物基因的數(shù)目；(iii)Xi是對于來自要測量表達水平的受試者的樣品所測
xJ-Mj量的每一種標(biāo)志物的經(jīng)過換算、標(biāo)準化的表達水平；而(iv) μ j和ο」是所測量的每一種標(biāo) 志物基因的均值和標(biāo)準偏差；其中β” μ」和％.是自來自臨床試驗的包含Β淋巴瘤細胞 的患者樣品確定的。在一些實施方案中，等于或大于零的敏感指數(shù)值指示受試者有可能響 應(yīng)抗CD40抗體治療，或其中小于零的敏感指數(shù)值指示受試者不太可能響應(yīng)抗CD40抗體治 療。實施例2詳細記載了如何為參照樣品和新樣品分析和測定參數(shù)。在一些實施方案中， 測量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRl JPUAPl 的表達水平，并用于敏感指數(shù) 計算。在一些實施方案中，測量相等數(shù)目的正關(guān)聯(lián)標(biāo)志物基因和負關(guān)聯(lián)標(biāo)志物基因，并用于 敏感指數(shù)計算。用于確定敏感指數(shù)的方法是本領(lǐng)域已知的。參見Zhou H. and Hastie Τ. (2005) Regularization and variable selection via the elastic net ；J. R. Statist. Soc. B. 67 (2).pp. 301-320 ；Friedman J. , Hastie T.and Tibshirani R. 2008.Regularization Paths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent. Technical Report, Department of Statistics, Stanford University(World ffideffeb-stat. Stanford, edu/ ~hastie/Papers/glmnet. pdf) R package glmnet ；RDevelopment Core Team(2008). R :A language and environment for statisticalcomputing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. ISBN3-900051-07-0, URL World Wide Web at R-project. org?？梢砸詫λ懻摶驑?biāo)志物的測量值和參照值的類型適宜的任何便利方式進行 比較。比較過程可以是手工的，或者它可以是自動的。在一些實施方案中，測量表達水平是 標(biāo)準化值。例如，可以基于實施例2中所描述的“經(jīng)過換算、標(biāo)準化的測定值”下的方程將 表達水平標(biāo)準化。對本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是，可以為標(biāo)志物基因和/或參照基因的 表達水平采取重復(fù)測量。在一些實施方案中，為測量值考慮重復(fù)測量?？梢酝ㄟ^使用測量 值的均值或中值作為“測量值”來考慮重復(fù)測量?？梢允褂帽绢I(lǐng)域已知的統(tǒng)計分析來證實 所比較的兩個值間差異的顯著性。抗CD40抗體治療本發(fā)明中所鑒定的標(biāo)志物基因可用于預(yù)測、評估、或幫助評估B細胞淋巴瘤對用 一種或多種抗CD40抗體進行的治療的響應(yīng)性。所述抗CD40抗體可以是一種或多種激動性 抗體(即結(jié)合并刺激CD40)。刺激性抗體可以是不同類型的，諸如(1)那些經(jīng)由CD40遞送 刺激性信號但不提高⑶40和⑶40L之間相互作用(例如抗體G28-5和自G28-5衍生的抗 體，記載于美國專利No. 5，182，368 ；和PCT WO 96/18413)或降低CD40和CD40L之間相互 作用(例如抗體HuCD40-M2和HuCD40-M3和人源化抗體，記載于美國專利No. 5，674，492) 的；和⑵那些經(jīng)由⑶40遞送刺激性信號且能提高⑶40和⑶40L之間相互作用的，例如 S2C6 (Francisco et al.，2000，Cancer Res. 60 :3225_31)和自 S2C6 衍生的抗體。激動性 抗體還記載于美國專利No. 7，288，251。所述抗⑶40抗體可以是一種或多種拮抗性抗體 (即結(jié)合CD40并抑制由CD40L誘導(dǎo)的活性)。拮抗性抗CD40抗體的例子包括美國公開文 本No. 2007/0110754中記載的人抗體CHIR-12. 12和WO 97/31025中記載的抗CD40抗體。本發(fā)明的方法可進一步包括給具有B細胞淋巴瘤的受試者施用有效量的抗CD40 抗體，這在基于本文所述測定法/方法將所述受試者鑒定為接受治療的候選人之后進行。 可以施用一種或多種抗CD40抗體。在一些實施方案中，所述抗CD40抗體是與一種或多種下列治療劑聯(lián)合施用的rituXimab、gemzar、和ICE。例如，可以與下列各項聯(lián)合地給患者 施用抗 CD40 抗體:rituximab 療法；rituximal 加 gemzar ；rituximal 加 ICE (異環(huán)磷酰胺 (ifosfamide)、卡怕(carboplatin)、依托泊昔(etoposide)) (R—ICE)；或 rituximab 力口化療。如本文中所使用的，“聯(lián)合”施用包括同時施用和/或不同時間的施用。聯(lián)合施用 還涵蓋共配制劑(即同一組合物中存在不同藥物)的施用或不同組合物的施用、不同劑量 給藥頻率或間隔的施用、和使用相同路徑或不同路徑的施用?？笴D40抗體或其功能性片段可用于治療對使用以下任一藥物的治療沒有 響應(yīng)或響應(yīng)不足或在用這些藥物治療后復(fù)發(fā)的NHL患者rituXimab (Genentech)； ocrelizumab(Genentech, Inc.) ；ibritumomab tiuxetan(Zevalin (TM), Biogen Idee)； tositumomab(Bexxar , GlaxoSmithKline) ；HuMAX_CD20 (GenMab) ；IMMU-106( 一種人 源化抗 CD20，也稱作 hA20 或 90Y-hLL2，Immunomedics) ；AME-133 (Applied Molecular Evolution/Eli Lilly) ；gentuzumab ozogamicin(Mylotarg , 一禾中人源化抗 CD33 抗體， ffyeth/PDL) ；alemtuzumab (Campath , 一 禾中抗 CD52 抗體，Schering Plough/Genzyme)； epratuzumab (IMMU-103 , 一種人源化抗 CD22 抗體，Immunomedics)。下列參考文獻記載了淋巴瘤和CLL、它們的診斷、治療和用于測量治療有效性的標(biāo) 準醫(yī)學(xué)規(guī)禾呈Canellos GP, Lister, ΤΑ, Sklar JL :The Lymphomas. W. B. Saunders Company, Philadelphia，1998 ；van Besien K and Cabanillas，F(xiàn) :Clinical Manifestations， Staging and Treatment of Non-Hodgkinr s Lymphoma，《Hematology，Basic Principles and Practice》第 3 版第 70 章第 1293-1338 頁，Hoffman et al.(編)Churchill Livingstone, Philadelphia，2000 ； 及 Rai, K andPatel，D :Chronic Lymphocytic Leukemia，《Hematology，Basic Principles andPractice》第 3 片反第 72 章第 1350-1362 頁， Hoffman et al.(編)ChurchillLivingstone，Philadelphia，2000。在治療中使用的抗CD40抗體包括嵌合抗體、人源化抗體和人抗體。可以在治 療中使用本文中所描述的或本領(lǐng)域已知的任何激動性或拮抗性抗體。例如，可以使用WO 2006/128103中記載的人源化抗⑶40抗體來進行抗⑶40抗體治療，而且通過述及將這些 抗體及其氨基酸序列收入本文。在一些實施方案中，供本文所述治療中使用的抗CD40抗體 結(jié)合B淋巴瘤細胞上表達的⑶40 (諸如人⑶40)并誘導(dǎo)B淋巴瘤細胞凋亡。所述抗⑶40 抗體還可具有在體內(nèi)經(jīng)免疫效應(yīng)器功能諸如ADCC、⑶C、和/或ADCP來殺死B淋巴瘤細胞 的特征。在一些實施方案中，所述抗⑶40抗體以不高于約1χ10_8或不高于1χ10_9的Kd值 結(jié)合⑶40。在一些實施方案中，所述抗⑶40抗體結(jié)合⑶40并刺激⑶40 (即激動性抗體)。 在一些實施方案中，所述抗⑶40抗體將⑶40配體對⑶40的結(jié)合提高例如至少45%、至少 50%、至少60%、或至少75%。測定⑶40配體對⑶40的結(jié)合增加的一種方法記載于美國 專利No. 6，838，261 (通過述及將其公開內(nèi)容收入本文)。在一些實施方案中，所述抗⑶40 是自WO 00/75348中記載的鼠單克隆抗體S2C6衍生的人源化抗體(包括W000/75348表3 和4中提供的抗體)。在一些實施方案中，所述抗⑶40抗體包含SEQ ID NO :1所示重鏈氨 基酸序列和SEQ ID NO 2所示輕鏈氨基酸序列，例如抗⑶40 Ab. 1。D.試劑盒為了在上文所描述或提議的應(yīng)用中使用，本發(fā)明還提供了試劑盒或制品。此類試
39劑盒可包含至少一種對于檢測本文中所描述的標(biāo)志物基因的表達水平特異性的試劑，而且 可進一步包括關(guān)于進行本文中所描述的方法的指令。在一些實施方案中，本發(fā)明提供了包含引物和引物對及探針的組合物和試劑盒， 所述引物和引物對容許特異性擴增本發(fā)明的多核苷酸或其任何特定部分，而所述探針選擇 性或特異性雜交本發(fā)明的核酸分子或其任何部分。探針可以用可檢測標(biāo)記物標(biāo)記，諸如例 如放射性同位素、熒光化合物、生物發(fā)光化合物、化學(xué)發(fā)光化合物、金屬螯合劑或酶。此類探 針和引物可用于檢測樣品中多核苷酸(諸如與表1_4、6、7和13中所列舉的基因?qū)?yīng)的多 核苷酸)的存在，及用作檢測表達如下蛋白質(zhì)的細胞的手段，所述蛋白質(zhì)由與表1_4、6、7和 13中所列舉的基因?qū)?yīng)的多核苷酸編碼。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的，可以基于本文中 所提供的序列制備多種不同引物和探針并有效用于擴增、克隆和/或測定mRNA的存在和/ 或水平。在一些實施方案中，所述試劑盒包含用于檢測至少兩種、至少三種、至少四種、至 少五種、至少十種、至少十五種、至少二十種標(biāo)志物基因的表達水平的試劑。試劑盒還可以 包含對于生成參照值有用的參照樣品。所述標(biāo)志物基因包括但不限于VNN2、MEF2C、LTB、 KCNN3、NCFl、BCL6、IGJ、ELTI1902、PNOC, CSF2RB、P0U2AF1、CD22、RGS13、MEF2B、LRRC8A、 CD40、IFITMl、SMNl、PRRCA、EPDRl、PRPSAP2、IGF1R、BTG2, LM02、YIPF3、CD79B、CD44、CTSC、 UAPljP PUS7。用于檢測標(biāo)志物基因的mRNA表達水平的試劑可包含對于擴增一種標(biāo)志物基 因的mRNA產(chǎn)物特異性的至少一個引物對。在一些實施方案中，所述引物對可靶向所述mRNA 序列的3'末端(例如靶向3' UTR處的mRNA，其通常是所有轉(zhuǎn)錄物變體共同分享的)。在 一些實施方案中，所述試劑盒可進一步包含用于捕捉探針的表面或基片(諸如微陣列)，所 述探針用于檢測擴增的核酸。在一些實施方案中，所述試劑盒包含對于使用qRT-PCR檢測一種標(biāo)志物基因表達 水平特異性的至少一個引物對和探針。表10中顯示了可以在qRT-PCR中使用的引物和探 針集的例子。對于檢測IFITM1，可以使用SEQ IDNO :27、28、和29、SEQ ID NO :60、61、和62、 及SEQ ID N0:93、94、和95所示引物和探針集。對于檢測CD40，可以使用SEQ ID NO :24、 25、和26、SEQ ID NO :57、58、和59、SEQ ID NO :90、91、和92所示引物和探針集。對于檢測 RGS13，可以使用 SEQ ID NO :114、115、和 116、及 SEQ ID NO 126、127、和 128 所示引物和探 針集。對于檢測 VNN2，SEQ ID NO :30、31、和 32、SEQ ID NO :63、64、和 65、及 SEQ ID NO :96、 97、和 98 所示引物和探針集。對于檢測 LM02，SEQ ID NO :12、13、禾口 14,SEQ ID NQ :45、46、 和47、及SEQ ID NO :78、79、和80所示引物和探針集。對于檢測CD79B，SEQ ID NO :141、 142、和 143、SEQ ID NO :150、151、和 152、及SEQ ID NO :159、160、和 161 所示引物和探針集。 對于檢測 CD22，SEQ ID NO :15、16、和 17、SEQID NO :48、49、和 50、及 SEQ ID NO :81、82、和 83 所示引物和探針集。對于檢測 BTG2, SEQ ID NO :9、10、禾口 11、SEQ ID NO :42、43、禾口 44、 及SEQID NO :75、76、和77所示引物和探針集。對于檢測IGF1R，SEQ ID NO :6、7、和8、SEQ ID NO :39、40、和41、及SEQ ID NO :72、73、和74所示引物和探針集。對于檢測CD44，SEQ ID NO :174、175、和 176、SEQ ID NO :180、181、和 182、及 SEQ ID NO 186、187、和 188 所示 引物和探針集。對于檢測 CTSC，SEQ ID NO 165、166、和 167、SEQ ID NO 168、169、和 170、 及SEQ ID NO :171、172、和173所示引物和探針集。對于檢測EPDR1，SEQ IDNO :21、22、禾口 23,SEQ ID NO :54、55、和 56、SEQ ID NO :87、88、和 89、SEQ ID NO 129、130、禾口 13USEQ IDNO 132、133、和 134、SEQ ID NO 135、136、和 137 所示引物和探針集。對于檢測 UAPl，SEQ ID NO :138、139、和 140、SEQ ID NO :147、148、禾口 149、及 SEQ ID NO 156、157、禾P 158 所示 引物和探針集。對于檢測 PUS7，SEQ ID NO 177、178、和 179、SEQ ID NO 183、184、和 185、 及SEQ ID NO :189、190、和191所示引物和探針集。對于檢測BCL6，SEQ ID N0:102、103、 和104、及SEQ ID NO :108、109、和110所示引物和探針集。用于檢測標(biāo)志物基因的蛋白質(zhì)表達水平的試劑可包含特異性結(jié)合由標(biāo)志物基因 編碼的蛋白質(zhì)的抗體。所述試劑盒可進一步包含載體手段，其被隔室化以緊密約束方式容納一個或多個 容器，諸如管形瓶、管等，每個容器裝有要在所述方法中使用的分開成分之一。例如，所述容 器之一可以裝有可檢測標(biāo)記或能可檢測標(biāo)記的探針。此類探針可以是對標(biāo)志物基因特異性 的抗體或多核苷酸。若試劑盒利用核酸雜交來檢測靶核酸，則所述試劑盒還可以具有裝有 用于擴增所述靶核酸序列的核苷酸的容器和/或裝有與報告分子(諸如酶標(biāo)記物、熒光標(biāo) 記物、或放射性同位素標(biāo)記物)結(jié)合的報告分子(諸如生物素結(jié)合蛋白，諸如親合素或鏈霉 親合素)的容器。典型地，本發(fā)明的試劑盒包含上文所描述的容器和一個或多個其它容器，其中裝 有從商業(yè)和使用者觀點看需要的材料，包括緩沖劑、稀釋劑、濾器、針頭、注射器、和印有使 用說明書的包裝插頁。容器上可以存在標(biāo)簽以指出所述組合物用于特定療法或非治療性應(yīng) 用，而且還可以指出體內(nèi)或體外使用的用法，諸如那些上文所描述的。所述試劑盒可進一步包含用于制備組織或細胞樣品及自樣品制備核酸(諸如 mRNA)的一套指令和材料。本發(fā)明提供了多種適用于實施本發(fā)明方法的組合物，其可以在試劑盒中使用。例 如，本發(fā)明提供了可用于這些方法中的表面，諸如陣列。在一個實施方案中，本發(fā)明的陣列 包含可用于檢測本發(fā)明突變的核酸分子個體或集合。例如，本發(fā)明的陣列可包含一系列分 開放置的核酸寡核苷酸個體或核酸寡核苷酸組合集，它們能與包含靶核酸的樣品雜交，由 此此類雜交表明存在或缺少本發(fā)明的突變。將核酸吸附至固相基片(諸如玻璃載玻片)的數(shù)種技術(shù)是本領(lǐng)域公知的。一個方 法是將修飾的堿基或類似物摻入合成的核酸分子，所述修飾的堿基或類似物包含能夠附著 于固體基片的模塊(moiety)，諸如氨基、氨基衍生物或帶正電荷的其它基團。然后將合成產(chǎn) 物與固相基片(諸如玻璃載玻片)接觸，所述固相基片包被有醛或會與擴增產(chǎn)物上的反應(yīng) 性基團形成共價連接的其它反應(yīng)性基團，并變成共價附著于玻璃載玻片。其它方法(諸如 使用氨丙基硅烷表面化學(xué)的那些)也是本領(lǐng)域已知的，其公開于萬維網(wǎng)cmt. corning, com 禾口 cmgm. Stanford, edu/pbrownl。用本領(lǐng)域已知方法也可能將基團附著于寡核苷酸，然后可轉(zhuǎn)化為反應(yīng)性基團。寡 核苷酸中核苷酸的任何附著物都將成為寡核苷酸的部分，然后其能附著于微陣列的固相表 面。如所使用的技術(shù)要求和/或允許的，可進一步修飾擴增的核酸，諸如在附著于固相基片 之前或之后，通過裂解成片段或通過附著可檢測標(biāo)記物來進行。以下內(nèi)容是本發(fā)明方法和組合物的實施例。理解的是，鑒于上文所提供的一般性 說明，可以實施各種其它實施方案。實施例實施例1 :NHL患者對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的預(yù)測性遺傳標(biāo)志物的鑒定材料 和方法細胞存活力測定法在384孔板中在50ul補充有2% FBS的RPMI 1640中以1500-5000個細胞/孔接 種NHL細胞，并用系列濃度的交聯(lián)抗⑶40 Ab. 1或?qū)φ湛贵w(抗gD 5B6)處理。為了交聯(lián)， 在添加至細胞之前，以1 4的比例將抗⑶40 Ab. 1或抗gD與山羊抗人IgG Fc γ片段特 異性抗體的 F(ab' )2 片段(Jackson ImmunoResearch, West Grove，PA) —起在培養(yǎng)基中于 室溫溫育30分鐘。溫育96小時后，使用CellTiter-Glo發(fā)光細胞存活力測定法(Promega， Madison, WI)依照制造商的指令評估細胞存活力。每個數(shù)據(jù)點以一式四份實施。使用XLfit來計算IC50、IC25和最大抑制。數(shù)據(jù)表述成三項獨立實驗的平均值。 基于IC25和IC50值將對抗CD40 Ab. 1的敏感性分成三個范疇敏感的，中間的，和抗性的?？贵w抗⑶40 Ab. 1是一種針對⑶40的人源化IgGl單抗。它是由經(jīng)遺傳工程改造的中 國倉鼠卵巢(CHO)細胞系生成和分泌的。實施例中所使用的、稱作抗⑶40 Ab. 1的抗⑶40 Ab. 1具有如下氨基酸序列重鏈(SEQ ID NO :1)。斜體、下劃線顯示的ASN 294殘基標(biāo)示碳水化合物模塊的位置。EVQLVESGGG LVQPGGSLRL SCAASGYSFT GYYIHWVRQA PGKGLEffVARVIPNAGGTSY NQKFKGRFTL SVDNSKNTAY LQMNSLRAED TAVYYCAREGIYffffGQGTLV TVSSASTKGP SVFPLAPSSK STSGGTAALG CLVKDYFPEPVTVSffNSGAL TSGVHTFPAV LQSSGLYSLS SVVTVPSSSL GTQTYICNVNHKPSNTKVDK KVEPKSCDKT HTCPPCPAPE LLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVV VDVSHEDPEV KFNWYVDGVE VHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDff LNGKEYKCKV SNKALPAPIE KTISKAKGQP REPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFY PSDIAVEffES NGQPENNYKT TPPVLDSDGSFFLYSKLTVD KSRffQQGNVF SCSVMHEALH NHYTQKSLSL SPG輕鏈(SEQID NO :2)。DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRSSQSLV HSNGNTFLHW YQQKPGKAPKLLIYTVSNRF SGVPSRFSGS GSGTDFTLTI SSLQPEDFAT YFCSQTTHVPWTFGQGTKVE IKRTVAAPSV FIFPPSDEQL KSGTASVVCL LNNFYPREAKVQffKVDNALQ SGNSQESVTE QDSKDSTYSL SSTLTLSKAD YEKHKVYACEVTHQGLSSPV TKSFNRGEC基因表達序型的生成和分析用mirVana miRNA 分離試劑盒(Ambion，Austin, TX)提取總 RNA,并使用 Affymetrix HGU 133P2全基因組表達微陣列來測定。使用AfTymetrix掃描儀提取原始數(shù) 據(jù)，并使用 R Bioconductor Package (www. bioconductor. org)中的 gcRMA 以缺省力口工所得 CEL文件。使用抗CD40 Ab. 1敏感性和存活力類別間差異的中等t檢驗鑒定顯著差異表達的 基因。使用LIMA包評估其它參數(shù)，并為每種基因計算t-統(tǒng)計學(xué)、ρ值、調(diào)整ρ值、和B-統(tǒng)計
50 100 150 200 250 300 350 400 443
50 100 150 200 219
42學(xué)。將探針定位至每種基因，并選擇1 1探針對基因定位，用于使用與敏感性測量最強烈 關(guān)聯(lián)的探針進行的下游分析。為了歸類入敏感組或中間組或抗性組，將定量逐步線性建模 與靶途徑的定量分析組合以鑒定要包括在測定法中的基因的節(jié)約集(parsimonious set)。 其它細節(jié)和結(jié)果在結(jié)果部分中提供(表7)。利用Gene Pattern (www. genepattern. org)內(nèi)的GSEA模塊來確定基因集富集 分析。當(dāng)它們的成員在表型間以一致的方式顯著差異表達時，將富集得分授予指定前 (pre-specified)的基因類別。通過獲得富集得分并根據(jù)基因集內(nèi)基因的數(shù)目調(diào)整來計算 標(biāo)準化富集得分。如下確定名義P值，即排列(permutating)敏感性和抗性標(biāo)記物，并重新 計算標(biāo)準化富集得分以給出無效分布(nulldistribution)。使用逐步線性建模鑒定的抗⑶40 Ab. 1敏感指數(shù)顯示了每種靶基因及其相應(yīng)的逆向關(guān)聯(lián)的(反_關(guān)聯(lián)的)配對基因(表7)，次序 為選擇靶基因包括在指數(shù)中的步驟。頭3種主要基因(表7中的VNN2、RGS13、⑶22)選自 表2-4(第1步)以模擬敏感的和中間的細胞系中差異過表達的主要成分。這3種基因的 表達是高度關(guān)聯(lián)的，相關(guān)系數(shù)為+0.77或更高。由于它們的相似性，自表2-4選擇一對基因 EPDRl來測量抗性細胞系中的對比過表達。在測定法中包括此類反_關(guān)聯(lián)對基因提供了自 我標(biāo)準化，即敏感性和抗性二者都與該對之一支的高表達有關(guān)。通過這種機制，測定法不依 賴于低的總體mRNA測定水平來限定任何類別，而是通過主要基因?qū)ζ浞搓P(guān)聯(lián)配對的相對 表達樣式來描述每一項(即log2刻度的帶正負號的t值之和，其中正負號對應(yīng)于倍數(shù)變化 估值)。在第2-5步中，基于作用機制自新表選擇別的基因?qū)?，該新表是那些在調(diào)整先前步 驟中所鑒定的基因的帶正負號的t值的累計之和后與IC25顯著相關(guān)的。此逐步規(guī)程要求 每個新基因?qū)o敏感指數(shù)添加另外的預(yù)測效力。在第5步后，IC25預(yù)測不再需要更多的基 因?qū)?。在?步中，添加了另外一對，因為它有能力在基于前7對基因調(diào)整累計指數(shù)后預(yù)測 最大抑制時的細胞存活力。BCL6是獨個添加的，沒有相應(yīng)的配對，這是基于作用機制基本原 理它目前沒有摻入最終的敏感指數(shù)，其通過基因?qū)?-8的log2刻度表達的帶正負號的t 值之和給出。根據(jù)臨床經(jīng)驗可以明確將其摻入指數(shù)。為了歸入敏感組或中間組或抗性組， 為敏感指數(shù)選擇初步截留，以使總體正確分類率最大化。以后為了臨床應(yīng)用可優(yōu)化基于選 定探針的備選分類規(guī)則。結(jié)果和分析為了獲得對抗⑶40抗體的作用機制的了解及鑒定NHL患者對抗⑶40抗體療法的 響應(yīng)性的一種或多種預(yù)測標(biāo)志物，我們在一組31種NHL細胞系間測試了抗CD40 Ab. 1的活 性并評估了響應(yīng)抗CD40抗體滴度的細胞存活力。來自此實驗的表1中突出顯示的IC25值 揭示了抗CD40抗體使10種細胞系敏感化，其中細胞存活力在濃度小于0. 4 μ g/ml時降低， 由此定義為“敏感性”細胞系，而13種細胞系甚至在濃度高達1 μ g/ml時都沒有實現(xiàn)細胞 存活力降低，由此定義為“抗性”細胞系。8種細胞系具有大于0. 4且小于0. 8的IC25，由 此定義為“中間”細胞系。表1提供了體外NHL細胞系間的抗⑶40 Ab. 1 IC25敏感性數(shù)據(jù)。對于每種細胞 系，給出了每種細胞系的具體淋巴瘤亞型、IC25值和分類數(shù)據(jù)。DLBCL(彌漫性大B細胞淋 巴瘤)，F(xiàn)L (濾泡性淋巴瘤)，MCL (套細胞性淋巴瘤)，ALCL (間變性大細胞淋巴瘤)。表1
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為了鑒定預(yù)示抗CD40 Ab. 1體外活性的基因，自處于細胞分裂對數(shù)期的細胞系制 備RNA并使用Affymetrix HGUl 33P2微陣列進行基因表達序型分析。通過中等t檢驗來 確定在敏感性與抗性細胞系之間差異表達的基因，并使用調(diào)整P值截留<0. 05來確定顯著 性(表2)。在表2中，用調(diào)整ρ值<0. 05(5% FDR)來過濾基因列表，得到110種獨特基因。 顯示了探針I(yè)D、基因符號和描述。另外，通過Spearman氏等級相關(guān)來確定在所有NHL細胞 系間與IC25值有關(guān)的顯著基因，并使用P值<-0.57或彡0.57來來過濾基因(表3)。在 表3中，用P值<-0.57或>0.57來過濾基因列表，得到130種獨特基因。也顯示了探針 ID、基因符號和描述。表4顯示了通過這兩種方法任一或二者鑒定得到的獨特基因的合表。 在表4中，顯示了 Log(2)倍數(shù)變化，其中關(guān)于抗CD40 Ab. 1敏感性，正的倍數(shù)變化代表敏感 性類別中的表達升高，而負的倍數(shù)變化代表抗性類別的NHL細胞系中的表達升高。基因代 表195種獨特基因。也顯示了探針I(yè)D、基因符號和描述。表2
基因符號探針描述調(diào)整P值SLC26A2205097—at溶質(zhì)載體家族26 (硫酸轉(zhuǎn)運蛋白)，成員20.042377536FCRLMl235400—atFc受體樣和粘蛋白樣10.042377536PDGFD219304—s—at血小板衍生生長因子D0.043219716
NEDD9240019—at神經(jīng)前體細胞表達的，發(fā)育下調(diào)的9-0. 573878183表 4 表4中高表達的基因可能是受到共調(diào)節(jié)的基因，可能與抗CD40活性的生物學(xué)無 關(guān)。因此，為了 了解在敏感性與抗性細胞間差異表達的基因的生物學(xué)功能，我們進行了基因 集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis) (GSEA) 0在此分析中，我們通過計算該集合 中基因的均值t統(tǒng)計，然后將該均值t統(tǒng)計與為容量相同的隨機基因集合計算的均值統(tǒng)計比較來解決問題。低P值可指示基因集與用于生成統(tǒng)計的樣品分類之間有一些關(guān)聯(lián)。如此， 基因集分析可解讀成高度差異表達的基因的特性的匯總。表5提供了抗CD40 Ab. 1敏感性 對抗性NHL細胞系的基因集富集分析。顯示了富集的基因集、每個基因集的基因數(shù)目、標(biāo)準 化的富集得分(NES)、和名義ρ值(NOM p-val)。NES越高和NOMp值越低，則發(fā)現(xiàn)越有可能 是顯著的。表 5 在GSEA鑒定得到的在生物學(xué)方面重要的基因集中，涉及B細胞受體信號傳導(dǎo) (BCR)的基因集和生發(fā)中心起源的基因(表5)得到富集。主要感興趣的是通過BASS0_ GERMINAL_CENTER_CD40_DN基因集確定的涉及⑶40信號傳導(dǎo)的基因的觀察結(jié)果(圖1)。 Basso et al.，Blood 104 :4088_96，2004。此基因集涉及據(jù)報告在Ramos細胞系中受到 ⑶40L遏制的基因。關(guān)于此基因集的表6顯示了來自差異表達基因列表的等級和調(diào)整ρ值。 在表6中，對已知受CD40L下調(diào)的基因，富集在敏感性與抗性細胞系間差異表達的基因。排 好等級的基因衍生自中等t檢驗(表2)?？偣?0種基因是此基因集的一部分，此表中顯示 了頭11種。表6中所顯示的基因在抗⑶40 Ab. 1敏感性細胞系中過表達。預(yù)期BCR基因 與⑶40L基因有部分交疊，因為這兩種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在NF- κ B轉(zhuǎn)錄軸處會聚，而且這兩種 途徑能協(xié)同來活化B細胞。接著，我們確認是否任何由CD40L誘導(dǎo)的基因能夠區(qū)分抗CD40 Ab. 1敏感性與抗性NHL細胞系。在表2和表3上差異表達基因列表內(nèi)的⑶40L基因中，VNN2 給出敏感性與抗性細胞系的最準確區(qū)分(圖2)。表6 進一步檢查差異表達基因列表還揭示了諸如CD22、RGS13、和MEF2B(表2和圖3、 圖4、圖6)等基因，它們指示生發(fā)中心B(GCB)細胞在抗⑶40Ab. 1敏感性細胞系中過表達。 圖5中顯示了與抗⑶40. Ab. 1敏感性有關(guān)的⑶40簽名基因。值得注意的是，RGS13是通過 中等t檢驗(表2)和Spearman氏等級相關(guān)(表3)在各細胞系間等級最高的基因之一，而 且作為單一基因能以高準確度區(qū)分敏感性與抗性以及中間型與抗性類別敏感性對抗性的 準確度為96 %，中間型對抗性為81 %，而敏感性/中間型對抗性為87 %。為了獲得最佳歸類準確度，有可能會需要基因簽名或metagene分類。因此，為了 鑒定可促成最準確分類的基因，我們生成了一種算法來鑒定在組合時會關(guān)于抗CD40 Ab. 1 敏感性給出細胞系間最佳可能歸類的基因?qū)?。因此，我們進行了逐步線性建模來實現(xiàn)此目 的，而且在表7中顯示了最終的基因選擇。在表7中，顯示了每種靶基因及其相應(yīng)的逆向關(guān) 聯(lián)的(反-關(guān)聯(lián)的)配對基因，次序為選擇靶基因包括在指數(shù)中的步驟，如較早所描述的。 在計算得到敏感指數(shù)(本質(zhì)上是基因?qū)?-8的log2刻度表達的帶正負號的得分之和)后， 此基因?qū)x擇揭示了關(guān)于抗CD40 Ab. 1的敏感性、中間型和抗性類別的可靠歸類(圖4)。表7 使用逐步線性建模鑒定的抗⑶40 Ab. 1敏感指數(shù)
基因?qū)?編號步驟 編號主要基 因符號主要基 因探針倍數(shù)變 化估值配對基 因符號配對基 因探針與主要基因 的相關(guān)性11VNN2205922—at+2. 63EPDRl223253—at-0. 7221RGS13210258—at+5. 18EPDRl223253—at-0. 8831CD22204581—at+2. 70EPDRl223253—at-0. 68
75 總之，⑶40L在活化B細胞中發(fā)揮至關(guān)重要的作用，導(dǎo)致B細胞的擴充和增殖以及 Ig類別轉(zhuǎn)換，而且⑶40L信號傳導(dǎo)途徑在pre-GCB細胞和post-GCB細胞(包括幼稚和記憶 B細胞)內(nèi)也是有活性的。因此，令人驚訝的是注意到展示對抗CD40 Ab. 1的敏感性的NHL 細胞與GCB細胞在起源方面是相似的(根據(jù)細胞表達序型分析)且具有高表達的CD40L下 調(diào)基因(與抗性細胞不同)，指示GCB與決定對抗CD40 Ab. 1的敏感性的CD40途徑激活狀 態(tài)之間的聯(lián)系。為了進一步確認預(yù)測性分類，使用異種移植物模型來探索療法(諸如組合療法)。 使用實時定量RT-PCR(qRT-PCR)來測量基因表達水平。在確認預(yù)測性分類之后，為一小組 選定的標(biāo)志物(例如VNN2和RGS13)開發(fā)免疫組織化學(xué)(IHC)測定法。在臨床試驗樣品中 進一步測試選定的標(biāo)志物基因。實施qRT-PCR和IHC來測量臨床試驗樣品中選定的標(biāo)志物基因的表達水平。將來 自對抗CD40治療有響應(yīng)的具有復(fù)發(fā)性彌漫性大B細胞淋巴瘤的患者的樣品中的表達水平 與來自對治療無響應(yīng)的患者的樣品中的表達水平比較。實施例2 臨床試驗中與對抗CD40Ab. 1治療的響應(yīng)性有關(guān)的標(biāo)志物的鑒定臨床試驗001 (II期)一項多中心、II期、開放標(biāo)記的研究，用于測定抗⑶40 Ab. 1在復(fù)發(fā)性DLBCL患 者中的總體響應(yīng)率和毒性譜。由中心實驗室對腫瘤樣品評估病理確認和CD40表達。符合 條件的患者在診斷時具有從頭的或轉(zhuǎn)化的DLBCL，而且若有在先的無痛性淋巴瘤史的話，則 排除在外。要求由含利妥昔單抗的組合化療和(如果符合條件的話)自體干細胞移植組 成的在先療法?；颊咴?周里接受6次IV輸注抗⑶40 Ab. 1 (周期1)，為患者內(nèi)劑量加載 (intra-patientdose loading)(第 1 天 lmg/kg ；第 4 天 2mg/kg ；第 8 天 4mg/kg)禾口此后 8mg/kg/wk0有響應(yīng)的患者和具有SD (病情穩(wěn)定)的患者符合繼續(xù)治療的條件，直至疾病有 進展或長達至多12個周期。在接受抗CD40 Ab. 1治療之前自患者采集腫瘤組織。例如，作 為例行淋巴瘤診斷的一部分來采集樣品。臨床試驗002 (I期)進行了多機構(gòu)、多劑I期研究來測試靜脈內(nèi)抗⑶40 Ab. 1在復(fù)發(fā)性NHL患者中的 安全性、藥動學(xué)特性、免疫原性、和抗腫瘤活性。具有多種NHL組織學(xué)亞型的患者登記了此 研究，包括彌漫性大B細胞(DLBCL ； 14)、濾泡(FCL ；9)、套細胞(MCL ；9)、邊緣區(qū)(MZL ；2)和 小淋巴細胞(SLL ;1)。用如下的劑量加載方案治療患者第1天和第4天lmg/kg抗⑶40 Ab. 1，隨后是第2-5周期間的患者內(nèi)劑量放大，四個小組劑量放大至最大劑量3、4、6、或8mg/kg。隨后，在一個小組中測試了快速劑量加載方案(周期1期間使用的總抗CD40 Ab. 1 增加40% )。有響應(yīng)的患者或病情穩(wěn)定的患者符合第二個周期的條件，其中第二個周期由 連續(xù)四次每周一次輸注小組特異性最大劑量的抗⑶40 Ab. 1組成。8名DLBCL患者完成了 周期1并接受了最大劑量至少3mg/kg抗⑶40 Ab. 1，客觀響應(yīng)率為37. 5% (即1名CR和 2名PR)和2名SD。在1名MCL患者(CR)和1名MZL患者(PR)中看到另外的客觀響應(yīng)。 尚未達到這5名患者的響應(yīng)持續(xù)時間中值(范圍為8-37周)。在接受抗CD40 Ab. 1治療之 前自患者采集腫瘤組織。例如，作為例行淋巴瘤診斷的一部分來采集樣品。臨床樣品制備和qRT-PCR在適宜的IRB批準和患者同意下，自臨床調(diào)查場所獲得來自上文所述I期和II期 臨床試驗的福爾馬林固定、石蠟包埋(FFPE)的檔案腫瘤組織。在玻璃載玻片上封固自腫瘤 組織得來的4-6微米切片，而且使用標(biāo)準病理學(xué)實驗室方案對每個病例的一張載玻片進行 H&E染色。一名經(jīng)過委員會驗證的病理學(xué)家對H&E載玻片標(biāo)記腫瘤含量，并作為指導(dǎo)用于宏 觀解剖剩余含腫瘤區(qū)，用于使用Ambion RecoverAll 用于FFPE組織的總核酸分離試劑盒 (產(chǎn)品目錄 No. AM1975 ；Applied Biosystems/Ambion, Austin, TX)提取 RNA。使用Applied Biosystems的高容量逆轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(產(chǎn)品目錄 No. 4368814 ；Applied Biosystems, Foster City, CA)在總反應(yīng)體積 20uL 中逆轉(zhuǎn)錄每份樣 品450ng總RNA。遵循制造商的推薦，只是縮短成37 °C 60min RT反應(yīng)。將5ng總RNA當(dāng)量 的cDNA(假設(shè)100%的cDNA合成效率)產(chǎn)物與AppliedBiosystems的2X通用大師級混合 物(無UNG)在每個PCR測定孔15uL體積中混合。所有擴增在384孔中一式三份地進行， 使用2步(95°C 15秒鐘，60°C 1分鐘)PCR擴增規(guī)程。反應(yīng)在經(jīng)過確認的ABI 7900實時 PCR系統(tǒng)上進行40個循環(huán)。表10中顯示了所使用的引物和探針的序列。
數(shù)據(jù)加工依照下文“標(biāo)準化、換算、和歸類”下的描述預(yù)加工作為結(jié)果的原始qRT-PCR，并如“敏感指數(shù)和分類”下所述計算敏感指數(shù)。將Spearman氏等級相關(guān)用于相關(guān)性估值和相應(yīng) 的P值。對于多變量敏感指數(shù)，選擇探針，并使用套索(lasso) (Li)和脊(ridge) (L2)帶 處罰的回歸(penalized regression)的彈性網(wǎng)混合(elastic net blend)來評估系數(shù)， 如 Zhou et al.，Statist. Soc. B. 67 :301_320，2005 所描述的和如 Friedman, Hastie and Tibshirani, RegularizationPaths for Generalized Linear Models via Coordinate Descent.Technical Report, Dept. of Statistics, Stanford University at www-stat. Stanford, edu/ hastie/Papers/glmnet. pdf所執(zhí)行的。使用X2檢驗來檢驗分類變量間 的關(guān)聯(lián)。標(biāo)準化、換算和歸類下文是測定數(shù)據(jù)和模型參數(shù)的定義定義測定數(shù)據(jù)1 =參照樣品集(例如NHL細胞系)N1 =樣本容量
P=探針數(shù)目(不包括標(biāo)準化者(normalize!·)) ^f6s) =對探針j檢測到的樣本容量 Ai^3) =對探針j未檢測到的樣本容量
Vij
(σ6 )=對樣品i、探針j檢測到的原始測定值
^wmAfts)=對樣品i檢測到的標(biāo)準化者的值的數(shù)目 ^fmAW =對樣品i、探針j檢測到的標(biāo)準化者的值 模型參數(shù)
Agj6i"-)=對探針j檢測到的測定值的1集均值(未標(biāo)準化的) Sf6s) =對探針j檢測到的測定值的1集標(biāo)準偏差 7f 均值以上的標(biāo)準偏差的1集數(shù)目對于參照樣品集，諸如用于擬合指數(shù)系數(shù)和分類截留的，使用參照集數(shù)據(jù)計算均 值和標(biāo)準偏差模型參數(shù)(見下文用于參照集模型參數(shù)的公式)。對于新樣品，例如要計算 指數(shù)和類別的一份新樣品，必須自參照集1取得模型參數(shù)，其選擇成對于新樣品所來源的 群體最具代表性的。例如，可以維持其中使用該測定法的每種適應(yīng)證和療法線(line of therapy)的臨床參照集。下文顯示了用于計算參照集模型參數(shù)和經(jīng)過換算、標(biāo)準化的的測 定值的公式。公式參照集模型參數(shù)中間值
經(jīng)過換算、標(biāo)準化的測定值 中間值
= -^7 sE碏“"’0^樣品標(biāo)準化因數(shù)) ρ)
經(jīng)過換算、標(biāo)準化、歸類的測定值
將完整的N1X ρ數(shù)值矩陣，
Xi
S巧
S腫
44
X廣■
敏感指數(shù)和分類
下文是測定數(shù)據(jù)和模型參數(shù)的定義 定義
測定數(shù)據(jù)
1 =參照樣品集(例如NHL細胞系) N1 =樣本容量 P=探針對數(shù)目
Xij =對樣品i、探針j經(jīng)過換算、標(biāo)準化的測定值 Xij ,=如上，對探針j具有抗相關(guān)探針對j correlated pair probe to probe j) 模型參數(shù)
βU=探針j的1集系數(shù)
iW=探針j的經(jīng)過換算、標(biāo)準化的測定值的ι集均值 略=探針j的經(jīng)過換算、標(biāo)準化的測定值的ι集均值 C1 =分類切點
下文顯示了用于計算參照集模型參數(shù)和敏感指數(shù)和分類的公式 公式
參照集模型參數(shù) 探針均值和標(biāo)準偏差
N = W1JI Zii 1 i=l
輸入至敏感指數(shù)和分類計算t
(as above with j' the 4 =瓦Σ (即-知廣指數(shù)和分類敏感指數(shù) 敏感類別 臨床試驗001結(jié)果下文表11提供了來自臨床試驗001的測定標(biāo)本和臨床樣品的樣品計數(shù)。對來自24 名DLBCL患者的29份檔案FFPE腫瘤標(biāo)本進行qRT-PCR加工。3名患者具有多份標(biāo)本，而且 所有24名患者有至少一份標(biāo)本有可使用的qRT-PCR結(jié)果。在這24人中，21人具有基線和至 少一次基線后拜訪時報告的腫瘤直徑乘積之和(sum of the product ofdiameters (SPD))測量。表11 臨床試驗001樣品計數(shù) 表12匯總了促成敏感指數(shù)的主要與配對基因之間的成對Spearman氏等級相關(guān)。 基于細胞系開發(fā)樣品，平均而言，在特定患者組中具有低表達的基因預(yù)期應(yīng)當(dāng)具有相應(yīng)配 對的相對高表達，從而提供敏感指數(shù)作為上調(diào)對下調(diào)表達途徑之比(即在log2刻度上)的 自我標(biāo)準化和解讀。此第一臨床樣品中的對之間的相關(guān)程度始終是統(tǒng)計學(xué)顯著的，并且是 突出高的，具有較低的相關(guān)估值，為-0. 67 (P = 0. 0004)。這些測試單獨構(gòu)成獨立的證實，即 在體外測定靶序列在來自此臨床群體的腫瘤樣品中表達，而且該測定法檢測檔案FFPE組 織樣品中的表達。
表12 主要和配對基因反_相關(guān)(N = 21)
。表13匯總了每種探針個別的測量與基線后腫瘤SPD最大降低(或最小升高)之 間的關(guān)聯(lián)。因為等級相關(guān)是基于基線后對基線測量的差異(或比)，所以正關(guān)聯(lián)意味著平 均而言，探針的較高表達與腫瘤增大有關(guān)；而平均而言，負關(guān)聯(lián)意味著較高的探針表達與腫 瘤縮小有關(guān)。值得注意的是，所有主要-配對探針對與SPD具有反向關(guān)聯(lián)。P值與此樣品 中有希望的趨勢一致。所有P值低于.5 (當(dāng)沒有真正的關(guān)聯(lián)時預(yù)期為50%)。所有范圍 是作為自助法(bootstrap)第95百分位置信區(qū)間計算得到的，其基于采樣時有來自DLBCL 患者樣品的置換的 5，000 份復(fù)制品，N = 21 (based upon 5,000 replicates sampledwith replacement from the DLBCL patient sample，N = 21)。隨著樣本容量±曾大，會得至Ij較窄 的范圍。由于產(chǎn)生這些結(jié)果不需要構(gòu)建或檢查模型，所以它們包含一種強趨勢，其確認了這 些qRT-PCR探針測量總體上與用抗⑶40 Ab. 1治療的患者中腫瘤SPD的縮小是相關(guān)的。表13 =SPD和各探針測量(N = 21)之間的關(guān)聯(lián) 多變量敏感指數(shù)是表12和13中的探針的加權(quán)平均值。因為預(yù)期細胞系的權(quán)重 不反映患者腫瘤標(biāo)本中的最佳權(quán)重，所以將細胞系的權(quán)重限制成1和-1，對應(yīng)于有正負號 的、相等加權(quán)的平均值，其中所述正負號匹配每種探針與細胞系對抗CD40 Ab. 1的抗性(即 IC25)之間的關(guān)聯(lián)。對于臨床群體，需要新的權(quán)重。作為僅僅基于21份樣品的初步分析，我 們選擇使用帶處罰的、多變量回歸規(guī)程來選擇和估算14種探針中最好的8種的權(quán)重。表14 中顯示了那些權(quán)重(系數(shù))，而圖7中描繪了所得敏感指數(shù)與相對于基線的SPD變化之間的 關(guān)聯(lián)。較大的多變量敏感指數(shù)值與基線后的SPD降低有關(guān)(Spearman Sp=-O. 58，P = 0. 006)。表13、14、和15中的所有范圍是作為自助法第95百分位置信區(qū)間計算得到的，其 基于采樣時有來自DLBCL患者樣品的置換的5，000份復(fù)制品，N = 21。隨著樣本容量增大， 會得到較窄的范圍。表14 多變量敏感指數(shù)的權(quán)重(N = 21) 使用來自臨床試驗001的26份樣品，表15顯示了得到的μ」和σ」值的范圍。表15 基于來自臨床試驗001的數(shù)據(jù)的μ」和ο」范圍 臨床試驗002結(jié)果為具有存檔標(biāo)本的10名患者成功生成了原始qRT-PCR結(jié)果。對于這10名患者， 表16顯示了診斷、治療組、多變量敏感指數(shù)、臨床響應(yīng)、和相對于基線的SPD變化。多變量 敏感指數(shù)權(quán)重取自21名臨床試驗001患者(表14)，所以這些患者組成很小的確認集。敏 感指數(shù)大于0的4名患者中有2人在抗⑶40Ab. 1暴露后展現(xiàn)一些腫瘤縮小，而敏感指數(shù)小 于等于0的6名患者中有4人展現(xiàn)腫瘤增大或最佳SPD響應(yīng)(2名患者的SPD不可得，但是 該患者的最佳臨床響應(yīng)結(jié)果可得)。表16 臨床試驗002中6名患者的診斷、治療組、多變量敏感指數(shù)、臨床響應(yīng)和SPD 變化的匯總。
BCL6. qRT-PCR測定法含有針對BCL6基因的第15種探針。雖然目前沒有在多變 量敏感指數(shù)中使用，但是先前將它鑒定為對抗CD40 Ab. 1的響應(yīng)的潛在預(yù)測物。如圖8所 示，雖然不是與組合DLBCL患者樣品中的SPD變化顯著相關(guān)(P = 0. 25, N = 26)，但是BCL6 在腫瘤增大的患者樣品中傾向于較低(P =_0.23)。雖然為了清楚理解，已經(jīng)經(jīng)由說明和實施例較為詳細地描述了上述發(fā)明，但是說 明和實施例不應(yīng)解釋為限制本發(fā)明的范圍。
權(quán)利要求
一種用于預(yù)測具有B細胞淋巴瘤的受試者對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的方法，包括下述步驟(a)測量自所述受試者獲得的包含B細胞淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LMO2、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR1、UAP1、和PUS7；并(b)基于來自步驟(a)的一種或多種標(biāo)志物基因的測量表達水平預(yù)測所述受試者是否有可能響應(yīng)抗CD40抗體治療。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述測量表達水平是標(biāo)準化的。
3.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗CD40抗體治療是用激動性抗CD40抗體進行的 治療,且其中IFITM1、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR^P PUS7中一項或多項的表達與參 照水平相比升高指示所述受試者不太可能響應(yīng)激動性抗CD40抗體治療。
4.權(quán)利要求3的方法，其中所述參照水平是基于如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達水 平確定的，所述樣品來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積增大的受試者且包含B淋巴瘤細 胞。
5.權(quán)利要求4的方法，其中所述來自用于確定參照水平的受試者的樣品與所述來自要 預(yù)測對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的受試者的樣品包含相同類型的B淋巴瘤細胞。
6.權(quán)利要求1或2的方法，其中所述抗CD40抗體治療是用激動性抗CD40抗體進行的 治療，且其中CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和UAPl中一項或多項的表達與參照水 平相比升高指示所述受試者有可能響應(yīng)激動性抗CD40抗體治療。
7.權(quán)利要求6的方法，其中所述參照水平是基于如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達水 平確定的，所述樣品來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積縮小的受試者且包含B淋巴瘤細 胞。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述來自用于確定參照水平的受試者的樣品與所述來自要 預(yù)測對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的受試者的樣品包含相同類型的B淋巴瘤細胞。
9.權(quán)利要求3-8任一項的方法，其中所述激動性抗⑶40抗體刺激⑶40且增強⑶40和 ⑶40配體之間的相互作用。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述激動性抗⑶40抗體包含SEQID NO :1所示重鏈氨基 酸序列和SEQ ID NO 2所示輕鏈氨基酸序列。
11.權(quán)利要求3-8任一項的方法，其中所述激動性抗CD40抗體刺激CD40且不增強或抑 制⑶40和⑶40配體之間的相互作用。
12.權(quán)利要求1-11任一項的方法，其中測量至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、 至少六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少i^一種、至少十二種、至少十三 種、或至少十四種標(biāo)志物基因的表達水平。
13.權(quán)利要求12 的方法，其中測量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl的表達水平。
14.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是彌漫性大B細胞淋巴瘤 (DLBCL)。
15.權(quán)利要求1-13任一項的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤。
16.權(quán)利要求15的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤是濾泡性淋巴瘤、套細胞性淋巴瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、或小淋巴細胞性淋巴瘤。
17.權(quán)利要求1-16任一項的方法，其中所述包含B淋巴瘤細胞的樣品是福爾馬林固定、 石蠟包埋的活檢樣品。
18.權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平是通過 所述一種或多種標(biāo)志物基因的RNA轉(zhuǎn)錄物水平測量的。
19.權(quán)利要求18的方法，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物是通過qRT-PCR測量的。
20.權(quán)利要求1-17任一項的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平是通過 所述一種或多種標(biāo)志物基因的蛋白質(zhì)表達水平測量的。
21.權(quán)利要求1-20任一項的方法，進一步包括測量BCL6的表達水平，其中BCL6的表達 水平與參照水平相比更高指示所述受試者有可能響應(yīng)抗CD40抗體治療。
22.權(quán)利要求21的方法，其中所述參照水平是基于如下樣品中BCL6的表達水平確定 的，所述樣品來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積縮小的受試者且包含B淋巴瘤細胞。
23.一種為具有B細胞淋巴瘤的受試者制備個性化基因型序型的方法，包括下述步驟(a)測定自所述受試者獲得的包含B淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的一種或多種標(biāo)志 物基因的表達水平IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2、IGF1R、CD44、CTSC、 EPDR1、UAP1、PUS7、和 BCL6 ；并(b)生成總結(jié)步驟(a)中獲得的一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平的報告。
24.權(quán)利要求23的方法，其中所述表達水平是標(biāo)準化的。
25.權(quán)利要求23或24的方法，其中測量至少兩種、至少三種、至少四種、至少五種、至少 六種、至少七種、至少八種、至少九種、至少十種、至少十一種、至少十二種、至少十三種、至 少十四種、或至少十五種標(biāo)志物基因的表達水平。
26.權(quán)利要求25 的方法，其中測量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl的表達水平。
27.權(quán)利要求23-26任一項的方法，其中所述報告包括對所述受試者推薦抗CD40抗體治療。
28.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗CD40抗體治療是用激動性抗CD40抗體進行的治 療,且其中IFITM1、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDR^P PUS7中一項或多項的表達與參照 水平相比升高指示所述受試者不太可能響應(yīng)激動性抗CD40抗體治療。
29.權(quán)利要求28的方法，其中所述參照水平是基于如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達 水平確定的，所述樣品來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積增大的受試者且包含B淋巴瘤細 胞。
30.權(quán)利要求29的方法，其中所述來自用于確定參照水平的受試者的樣品與所述來自 要制備個性化基因組序型的受試者的樣品包含相同類型的B淋巴瘤細胞。
31.權(quán)利要求27的方法，其中所述抗CD40抗體治療是用激動性抗CD40抗體進行的治 療,且其中CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和UAPl中一項或多項的表達與參照水平 相比升高指示所述受試者有可能響應(yīng)激動性抗CD40抗體治療。
32.權(quán)利要求31的方法，其中所述參照水平是基于如下樣品中相應(yīng)標(biāo)志物基因的表達 水平確定的，所述樣品來自在抗CD40抗體治療后腫瘤體積縮小的受試者且包含B淋巴瘤細 胞。
33.權(quán)利要求32的方法，其中所述來自用于確定參照水平的受試者的樣品與所述來自 要制備個性化基因組序型的受試者的樣品包含相同類型的B淋巴瘤細胞。
34.權(quán)利要求28-33任一項的方法，其中所述激動性抗⑶40抗體刺激⑶40且增強⑶40 和⑶40配體之間的相互作用。
35.權(quán)利要求34的方法，其中所述激動性抗⑶40抗體包含SEQID NO :1所示重鏈氨 基酸序列和SEQ ID NO :2所示輕鏈氨基酸序列。
36.權(quán)利要求28-33任一項的方法，其中所述激動性抗CD40抗體刺激CD40且不增強或 抑制⑶40和⑶40配體之間的相互作用。
37.權(quán)利要求23-36任一項的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是彌漫性大B細胞淋巴瘤 (DLBCL)。
38.權(quán)利要求23-36任一項的方法，其中所述B細胞淋巴瘤是非何杰金氏淋巴瘤。
39.權(quán)利要求38的方法，其中所述非何杰金氏淋巴瘤是濾泡性淋巴瘤、套細胞性淋巴 瘤、邊緣區(qū)淋巴瘤、或小淋巴細胞性淋巴瘤。
40.權(quán)利要求23-39任一項的方法，其中所述包含B淋巴瘤細胞的樣品是福爾馬林固 定、石蠟包埋的活檢樣品。
41.權(quán)利要求23-40任一項的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平是通 過所述一種或多種標(biāo)志物基因的RNA轉(zhuǎn)錄物水平測量的。
42.權(quán)利要求41的方法，其中所述RNA轉(zhuǎn)錄物是通過qRT-PCR測量的。
43.權(quán)利要求23-40任一項的方法，其中所述一種或多種標(biāo)志物基因的表達水平是通 過所述一種或多種標(biāo)志物基因的蛋白質(zhì)表達水平測量的。
44.一種用于預(yù)測具有B細胞淋巴瘤的受試者對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性的方法，包 括下述步驟(a)測量自所述受試者獲得的包含B淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的至少兩種標(biāo)志物 基因的表達水平IFITM1、CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD79B、CD22、BTG2, IGF1R、CD44、CTSC、 EPDRl、UAPl、和 PUS7 ；(b)基于步驟(a)中的標(biāo)志物基因的測量表達水平通過下述方程計算敏感指數(shù)值 (Si) 其中測量表13所示至少一種具有正關(guān)聯(lián)值的標(biāo)志物基因的和至少一種具有負關(guān)聯(lián)值 的標(biāo)志物基因的表達水平；其中(i) h是所測量的每一種標(biāo)志物基因的系數(shù)值；(ii)p是 所測量的標(biāo)志物基因的數(shù)目；(iii)Xi是對于來自要測量表達水平的受試者的樣品所測量 的每一種標(biāo)志物的經(jīng)過換算、標(biāo)準化的表達水平；而(iv) μ」和ο」是所測量的每一種標(biāo)志 物基因的均值和標(biāo)準偏差；其中βρ μ ^和％.是自包含B淋巴瘤細胞的、來自臨床實驗的 患者樣品確定的；且其中敏感指數(shù)的值等于或大于零指示所述受試者有可能響應(yīng)抗CD40 抗體治療，或者其中敏感指數(shù)的值小于零指示所述受試者不太可能響應(yīng)抗CD40抗體治療。
45.權(quán)利要求44的方法，其中測量至少三種、至少四種、至少五種、至少六種、至少七 種、至少八種、至少九種、至少十種、至少十一種、至少十二種、至少十三種、或至少十四種標(biāo) 志物基因的表達水平并用于計算敏感指數(shù)。
46.權(quán)利要求44 的方法，其中測量 IFITMl、RGS13、CD79B、CD22、BTG2、CD44、EPDRUP UAPl的表達水平并用于計算敏感指數(shù)。
47.權(quán)利要求44的方法，其中β、μ和σ是自與要預(yù)測對抗CD40治療的響應(yīng)性的受 試者的樣品具有相同類型B淋巴瘤細胞的患者樣品確定的。
48.
49.一種試劑盒，包括用于測量來自受試者的包含B淋巴瘤細胞的樣品中選自下組的 至少一種標(biāo)志物基因的表達水平的試劑IFITMl、CD79B、IGF1R、CD44、CTSC、EPDRl、PUS7、 CD40、RGS13、VNN2、LM02、CD22、BTG2、和 UAP1。
50.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述試劑包括用于通過qRT-PCR檢測每一種標(biāo)志物基 因的表達水平的至少一對引物和至少一種探針。
51.權(quán)利要求49或50的試劑盒，進一步包括關(guān)于基于所測量的一種或多種標(biāo)志物基因 的表達水平評估具有B細胞淋巴瘤的人類受試者是否有可能響應(yīng)抗CD40抗體治療的指令。
52.權(quán)利要求50的試劑盒，其中所述引物對和探針選自下組SEQID N0:27、28和29; SEQ ID NO :60、61、和 62 ;SEQ ID NO :93、94、和 95 ;SEQ ID NO :24、25、和 ·26 ;SEQ ID NO: 57、58、和 59 ;SEQ ID NO :90、91 和 92 ;SEQ ID NO :114、115、和 116 ;SEQ ID N0:126、127、 ^P 128 ；SEQ ID NO :30、31、和32 ;SEQ ID NO :63、·64、和65 ;SEQ ID NO :96、97、和98 ;SEQ ID NO :12、13、和 14 ;SEQ ID NO :45、46、和 47 ;SEQID NO :78、79、和 80 ;SEQ ID N0:141、142、 ^P 143 ；SEQ ID NO :150、151、和 152 ;SEQ ID NO 159、160、和 161 ;SEQ ID NO 15、16、和 17 ； SEQ ID NO :48、49、和50 ;SEQ ID NO :81、82、和83 ;SEQ ID NO :9、10、和 ·11 ;SEQ ID NO :42、 43、和 44;SEQ ID NO :75、76、和 77 ;SEQ ID NO :6、7、和 8 ;SEQ ID NO :39、40、和 41 ;SEQ ID NO :72、73、和 74 ;SEQ ID NO :174、175、和 ·176 ;SEQ ID NO :180、181、和 182 ;SEQ ID NO 186、 187、和188;SEQ ID NO 165、166、禾口167 ；SEQ ID NO 168、169、禾口170 ;SEQ ID N0:171、172、 和 ·173 ；SEQ IDNO :21、22、禾口 23 ；SEQ ID NO :54、55、禾口 56 ；SEQ ID NO :87、88、和 89 ；SEQ ID NO :129、130、禾口131 ;SEQ ID NO 132、133、和134 ;SEQ ID NO 135、136、和137 ;SEQ ID NO: 138、139、和140 ;SEQ IDNO :147、148、和149 ;SEQ ID NO :156、157、和158 ;SEQ ID N0:177、 178、和 179 ；SEQ ID NO :183、·184、和 185 ；及 SEQ ID NO :189、190、和 191。
53.權(quán)利要求49-52任一項的試劑盒，進一步包括用于測量來自受試者的包含B淋巴瘤 細胞的樣品中BCL6的表達水平的試劑。
54.權(quán)利要求53的試劑盒，其中所述試劑包括用于通過qRT-PCR測量BCL6的表達水平 的至少一對引物和至少一種探針。
55.權(quán)利要求54的試劑盒，其中所述引物對和探針是SEQID NO 102、103和104，或者 是 SEQ ID NO :108、109 和 110。
全文摘要
本發(fā)明提供了對于預(yù)測或評估B細胞淋巴瘤對抗CD40抗體治療的響應(yīng)性有用的方法和試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101910414SQ200880124201
公開日2010年12月8日 申請日期2008年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2007年11月7日
發(fā)明者巴特·布林頓, 戴維·多南 申請人:健泰科生物技術(shù)公司