專利名稱：提高生物輻射抗性的基因及其應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可提高生物輻射抗性的基因，本發(fā)明還涉及所述基因在抵抗電離
輻射及紫外線輻射方面的應用。
背景技術：
耐輻射球菌屬(Deinococcus)是迄今為止地球上發(fā)現(xiàn)的輻射抗性最強的生物之一，對電離輻射、紫外線、干燥及一些DNA損傷試劑顯示超強的抗性，一直備受生物、醫(yī)學界和環(huán)境工程界的關注和重視。 Deinococcus gobiensis是2007年分離自中國新疆戈壁沙漠的一株耐輻射球菌屬新種。在戈壁沙漠中，該菌暴露于伴有紫外線輻射、干燥和營養(yǎng)限制的嚴酷環(huán)境。這使得Deinococcus gobiensis擁有的輻射抗性高于本屬其他菌株。其對于電離輻射(> 15kGy)和紫外線輻射(> 600J/m2)具有超強的抗性。 當前，輻射生物學已成為與人類健康、生存密切相關的新興科學。因此，發(fā)現(xiàn)并鑒定抗輻射菌株中參與營養(yǎng)運輸和DNA修復的基因，對于探索生物在缺少營養(yǎng)，干旱和紫外線暴露的極端環(huán)境的適應和生存是十分重要的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是發(fā)現(xiàn)一段提高細胞電離輻射和紫外線輻射抗性的DNA序列。本發(fā)明人通過對Deinococcus gobiensis (CGMCC 2358)菌株的全基因組測序和基
因注釋分析，發(fā)現(xiàn)如序列SEQ ID N0:1所示的DNA序列。 SEQ ID NO :1所示的DNA序列編碼的氨基酸序列為SEQ ID NO :2。 將此DNA序列構建表達載體，轉化進入大腸桿菌宿主細胞中表達，得到重組菌株。 對該重組菌株及其對照組進行紫外線輻射實驗和Y輻射實驗。實驗結果顯示，本
發(fā)明所述的基因具有提高細胞抗電離輻射和紫外線輻射能力的功能。


附圖1含有SEQ ID NO :1表達載體圖； 附圖2含有SEQ ID NO:l表達載體的大腸桿菌紫外線輻射生存率的分析圖。pRADIE-transl09為表達SEQ ID N0:1序列的重組菌株；pRADZ3-trans109為含有空質粒的對照組菌株。 附圖3含有SEQ ID N0:1表達載體的大腸桿菌電離輻射生存率的分析圖。pRADIE-transl09為表達SEQ ID N0:1序列的重組菌株；pRADZ3-trans109為含有空質粒的對照組菌株。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于舉例說明本發(fā)明的方法，而不用于限制本發(fā)明的范圍。凡未注明具體實驗條件的，均為按照本領域技術人員熟知的常規(guī)條件。 實施例1核苷酸序列SEQ ID NO :1的克隆 根據(jù)Deinococcus gobiensis菌株的基因組序列測序結果，設計一對PCR特異性引物。從Deinococcus gobiensis基因組DNA中擴增出完整的核苷酸序列SEQ IDNO:l。
其中，Deinococcus gobiensis菌株來源于發(fā)明人實驗室，該菌株在三處有保藏，其保藏編號分別為DSM 21396T、CGMCC 1. 7299T和CGMCC 2358。
實施例2構建大腸桿菌表達載體及分子驗證 用將上述克隆片段用SpeI和NdeI雙酶切消化，與含E. coli通用groE啟動子的載體pRADZ3連接，取代其lacZ基因構建成表達此基因的大腸桿菌表達載體，如附圖1所示。
利用氯化鈣轉化法，將重組載體轉化E.coli transl09感受態(tài)細胞中，涂布于含氨芐青霉素的LB固體培養(yǎng)基上，37。C培養(yǎng)12小時。
轉化方法如下 1)取lOiiL過夜連接產物加到一管感受態(tài)細胞中，輕輕旋轉以混勻內容物，冰上放置30min ; 2)將離心管置于42t:水浴中熱激90s，不要晃動離心管；
3)迅速將離心管置于冰上，冷卻2min ;4)加入800 ii LLB液體培養(yǎng)基，37°C ， 150rmp搖床培養(yǎng)45min ;
5)取200 L培養(yǎng)液涂布于相應的抗生素平板篩選轉化子。 挑取白色菌落，堿裂解法提取質粒DNA篩選不同的重組子，SpeI和Ndel雙酶切及測序驗證，得到一株含該核苷酸序列表達載體的重組菌株pRADIE-trans109。
實施例3含SEQ ID NO :1的重組載體提高細胞抗紫外線輻射的功能驗證
1、方法 將含有SEQ ID NO :l核苷酸序列表達載體的重組菌株pRADIE-transl09和含有對照載體pRADZ3的對照組菌株pRADZ3-transl09分別以1%的接菌量分別接種于含有氨芐青霉素抗生素LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度50i!g/mL)中，37。C振蕩培養(yǎng)10個小時，培養(yǎng)到穩(wěn)定初期用于紫外線輻射生存率的測定。 取20mL菌液，離心，用磷酸緩沖液(10mM， pH 7. 0)洗滌兩次，重懸于20mL磷酸緩沖液中，將細胞懸液置于直徑為9cm滅菌的培養(yǎng)皿中，在室溫條件下，于紫外線輻射裝置中，進行紫外光輻照，照射劑量分別為0， 100， 300， 500， 700和800J/m2。輻照過程中，將培養(yǎng)皿置于電動旋轉的平臺上，轉速為每分鐘20-30轉，確保紫外光能均勻照射到菌液上。
經(jīng)紫外線輻射處理的細胞用lOmM磷酸緩沖液進行一系列倍比稀釋(10—1到10—6)。取100 ii L稀釋液涂布含LB的固體培養(yǎng)基上，每個處理3次重復。經(jīng)37t:培養(yǎng)1_2天，計算單菌落數(shù)。進行紫外線輻射生存率的分析。
2、結果 對含有SEQ ID NO : 1核苷酸序列表達載體的pRADIE-trans109重組菌株和對照菌株pRADZ3-trans109進行了不同劑量的紫外線輻射處理，從附圖2的生存率變化曲線中可看出pRADZ3-trans109菌株紫外線輻射抗性與對照菌株相比顯著提高。
實施例4含SEQ ID NO :1的重組載體提高細胞抗電離輻射的功能驗證
1、方法 將含有SEQ ID NO :l核苷酸序列表達載體的重組菌株pRADIE-transl09和含有對照載體pRADZ3的對照組菌株pRADZ3-transl09分別以1%的接菌量分別接種于含有氨芐青霉素抗生素LB液體培養(yǎng)基(氨芐青霉素濃度50i!g/mL)中，37。C振蕩培養(yǎng)10個小時，培養(yǎng)到穩(wěn)定初期用于電離輻射生存率的測定。 取菌液，離心，用磷酸緩沖液(10mM， pH 7.0)洗滌兩次，重懸于磷酸緩沖液中，將細胞懸液置于^Co-Y輻射裝置中，進行電離輻照，照射劑量分別為0Gy，50Gy，100Gy，200Gy，300Gy。 經(jīng)電離輻射處理的細胞用lOmM磷酸緩沖液進行一系列倍比稀釋(10—1到10—6)。取100 ii L稀釋液涂布含LB的固體培養(yǎng)基上，每個處理3次重復。經(jīng)37t:培養(yǎng)1_2天，計算單菌落數(shù)。進行電離輻射生存率分析。
2、結果 為了比較含有SEQ ID NO :l核苷酸序列表達載體的pRADIE-transl09重組菌株和含有空白載體的對照菌株pRADZ3-transl09對電離輻射抗性的差異，我們觀察了菌株在不同輻射下的細胞生存率。如附圖3所示，重組菌株pRADIE-trans109生存率曲線呈現(xiàn)明顯的肩形，表明其電離輻射抗性明顯高于對照菌株。SEQUENCE LISTING〈110〉中國農業(yè)科學院生物技術研究所〈120〉提高生物輻射抗性的基因及其應用〈130>09-11〈160>2〈170>PatentIn version3. 3〈210>1〈211>834〈212>DNA〈213>deinococcus gobiensis〈400>1GTGAGCGATCAGGCAGCGGGCCTTCCCGAA CCTCAGGGTGAGACGGCGTCGGCCAAGCGG60CGCATGCGCGAGCTGGCGGCGGCGTACGCG GCCCGTGTGCCCAGCCTGGACGCCCATGGG120CTGATGGACGGCCTGGACGGCGTCCAACTG CGTTTCATGCCCATGGGCCAGCGTGACGGG180GCCTACGATC CCGAACATCACGTCATCCTG ATCAACAGCCAGGTGCGTCCCGAGCGTCAG240CGCTTCACGCTCGCCCACGAGATCAGCCAC GCGCTTCTGCTGGGTGACGACGACCTCCTG300AGTGACCTGCACGATAGCTTCGAGGGCGAG CGGCTTGAGCAGGTGATCGAAACGCTGTGC360
AACGTGGGCGCGGCGGCGCTGCTCATGCCG GATGCCCTGATCGCCGAACTCCTGGAGCGC420TTCGGGGCGACTGGCCGCGCCCTGGCCGAG TTGTCGCGCCGCGCCGACGTGAGTGCCTCG■ACCGCGCTCTATGCCCTGGCCGAGCGCACC CCCGGCGCCGTGCTGTATGCCGTCTGCACC540CGCTCGCGGCTGGAGACGGAAACCGACGAT GAAGATGGCGGCGCCGCTTCCGGGACGGCC600CTCACCGTGCGGGTGAGCGGCGGCTCGGCA GGCATGAAGTACACCCTGCGGCCGGGAACG660CCCATTCCGGCCGACCATCCGGTCCAGGCG GCATTCGAGTCAAACCTTCCCCTGACCGGG720CCGAGTTATGTTCCCTTCCGCTCCGGACGC AAGATGCCGGCGGAGGTGGACGCCTTTCCG780GTGCGGGGTCGCGTGATGGTCAGTTTCGAC CTGAATGGACGCGGCGGAAC GTGA
834〈210>2〈211>277〈212>PRT〈213>deinococcus gobiensis〈400>2Val Ser AspGin Ala Ala Gly Leu Pro Glu ProGin Gly GluThrAla151015Ser Ala LysArg Arg MET Arg Glu Leu Ala AlaAla Tyr AlaAlaArg202530Val Pro SerLeu Asp Ala His Gly Leu MET AspGly Leu AspGlyVal354045Gin Leu Arg'Phe MET Pro MET Gly Gin Arg AspGly Ala TyrAspPro505560Glu His HisVal lie Leu lie Asn Ser Gin ValArg Pro GluArgGin6570 7580Arg Phe ThrLeu Ala His Glu lie Ser His AlaLeu Leu LeuGlyAsp
859095AspAspLeuLeuSerAspLeuHisAspSerPheGluGlyGluArgLeu100105110GluGinVallieGluThrLeuCysAsnValGlyAlaAlaAlaLeuLeu115120125 [o川]MET ThrProAspAlaLeulieAlaGluLeuLeuGluArgPheGlyAla130135140GlyArgAlaLeuAlaGluLeuSerArgArgAlaAspValSerAlaSer145150155160ThrAlaLeuTyrAlaLeuAlaGluArgThrProGlyAlaValLeuTyr165170175AlaValCysThrArgSerArgLeuGluThrGluThrAspAspGluAsp180185190GlyGlyAlaAlaSerGlyThrAlaLeuThrValArgValSerGlyGly195200205SerAlaGlyMETLysTyrThrLeuArgProGlyThrProlieProAla210215220AspHisProValGinAlaAlaPheGluSerAsnLeuProLeuThrGly225230235240ProSerTyrValProPheArgSerGlyArgLysMETProAlaGluVal245250255AspAlaPheProValArgGlyArgValMETValSerPheAspLeuAsn260265270GlyArgGlyGlyThr27權利要求
一種提高生物電離輻射及紫外線輻射抗性的基因，其DNA序列如SEQ ID NO1所示。
2. 權利要求1所述DNA序列編碼的氨基酸序列，如SEQ ID NO :2所示。
3. 包含SEQ ID NO :1所述DNA的重組載體。
4. 用權利要求3所述的重組載體轉化的宿主細胞，包括原核細胞和真核細胞。
全文摘要
本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了可提高生物抵抗電離輻射及紫外線輻射能力的一種核苷酸編碼序列。將本發(fā)明構建的包含上述基因的重組載體轉化至原核宿主細胞。所獲得的重組菌株增強了對電離輻射、紫外線輻射的抗性。
文檔編號C12R1/19GK101696414SQ20091021057
公開日2010年4月21日 申請日期2009年11月10日 優(yōu)先權日2009年11月10日
發(fā)明者周正富, 張維, 林敏 , 袁夢龍, 陳明 申請人:中國農業(yè)科學院生物技術研究所;