專利名稱：用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的scar分子標記方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因分子標記方法，特別是涉及一種用于蘋果枝干輪紋病抗性基 因的分子標記方法、脫氧核糖核酸(DNA)片段的序列以及作為檢測蘋果枝干輪紋病抗性基 因的PCR探針(寡聚核苷酸引物序列)，屬于植物基因工程領域。
背景技術：
蘋果為世界性重要的水果，且在我國栽培面積和產(chǎn)量均處于首位。蘋果枝干輪紋 病是目前我國蘋果生產(chǎn)上危害嚴重、發(fā)生普遍的病害之一，是由輪紋病菌(Botryosphaeria berengerianaf. sp. piricola)侵染蘋果枝干而引起的。其主要癥狀是在枝干表面形成許 多瘤狀突起，突起邊緣產(chǎn)生裂縫，似馬鞍狀，造成樹皮粗糙。輪紋病主要危害主干、主枝，嚴 重時也可危害側(cè)枝及小枝。輪紋病斑一般較淺，多造成樹勢衰弱。在弱樹及弱枝上，有時病 斑也可深達木質(zhì)部，導致枝干枯死。近年來，隨著主栽品種的更迭，質(zhì)優(yōu)但感病的品種栽培 面積不斷擴大，該病的發(fā)生與危害日趨嚴重，成為蘋果生產(chǎn)上的突出問題。目前該病還沒 有有效的防治辦法，另外，化學防治還會影響到使用者的身體健康，并導致一系列的環(huán)境問 題。因此，利用蘋果資源自身的抗性基因，通過雜交育種來培育抗病新品種是解決該問題的 根本途徑。但通過雜交育種的方法，選育出抗輪紋病新品種的周期較長，因為雜種樹的田間 發(fā)病癥狀一般要等到盛果期才能觀察到明顯的癥狀。這就造成人力、物力、時間上的大量耗 費而育種效率低的結(jié)果。然而，DNA分子標記技術不僅可以作為性狀早期選擇的手段，而且 也可以作為種質(zhì)鑒定的輔助手段，大大提高育種效率。我們通過田間雜交群體對蘋果枝干 輪紋病的抗性分離情況分析表明，該抗病性是受兩對隱性基因控制的質(zhì)量性狀。隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)是一項分子標記技術，具有快速、簡便、成本低、多態(tài) 性檢測豐富、不需同位素示蹤和安全可靠的特點，在分子生物學研究領域及植物育種方面 得到廣泛的應用，并取得明顯成效。將RAPD標記轉(zhuǎn)換成SCAR標記，是解決其穩(wěn)定性，并適 應大規(guī)模樣品分析的理想途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方 法，它能解決傳統(tǒng)雜交育種中周期長、效率低的問題。采用隨機擴增多態(tài)性DNA(RAPD)技 術，對蘋果品種間雜交&代雜種樹進行研究，尋找與蘋果枝干輪紋病抗性基因連鎖的DNA 分子標記，研究它的DNA序列組成，合成寡聚核苷酸引物，發(fā)展應用成檢測蘋果枝干輪紋病 抗性基因的探針，用于抗枝干輪紋病育種的早期篩選與鑒定。為了解決背景技術所存在的問題，本發(fā)明是采用以下技術方案a.以蘋果品種舞 姿、短枝富士及其&代雜種88株，其中抗病11株，感病77株為試材，分離提取并純化基因 組DNA ；b.采用RAPD技術，用多個隨機引物在F1代雜種及親本DNA上進行擴增，篩選與抗 病/感病性狀相關的多態(tài)性標記，分析標記的分離特點及其與性狀遺傳規(guī)律相吻合情況。 c.用玻璃珠DNA膠回收試劑盒，從瓊脂糖凝膠中回收目標DNA片段；d.用美國Promega公司的pGEM-T載體連接回收的DNA片段；e.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 a，提取質(zhì)粒，用酶切鑒定法判 斷克隆片段是否正確；f.將陽性克隆的菌液送測序公司測序；g.獲得目標DNA片段即RAPD 標記片段實際長度及其序列；h.根據(jù)序列的堿基組成，人工設計并合成一對該序列的特異 寡核苷酸引物；i.對原雜交組合雙親及F1代雜種的基因組DNA進行PCR特異擴增；j.獲得 特異擴增的多態(tài)性DNA片段，即SCAR標記，可用于檢測與蘋果枝干輪紋病抗性基因相關的 基因型。


圖1是本發(fā)明獲得的目標DNA片段即RAPD標記序列示意圖；圖2是本發(fā)明依據(jù)的親本與后代之間的遺傳模式示意圖；圖3是本發(fā)明的實驗結(jié)果圖。
具體實施例方式本具體實施方式
采用以下技術方案a.以蘋果品種舞姿、短枝富士及其&代雜種 (88株，其中抗病11株，感病77株)為試材，分離提取并純化基因組DNA;b.采用RAPD技 術，用上海Sangon公司的隨機引物180個，進行F1代雜種及親本DNA的擴增。其中，引物 S389(5’ TGCGAGAGTC 3’ )擴增出的大小約為1700堿基對的片段在11株抗病個體中均表 現(xiàn)為缺失，而在77株感病個體中有34株也表現(xiàn)為缺失(即缺失個體約占感病個體總數(shù)的 3/7)，這與受兩對獨立分配基因控制的性狀遺傳規(guī)律相吻合。即這是一個與其中一對基因 位點相關的基因標記。由于該片段也在親本品種短枝富士上出現(xiàn)，而在舞姿上表現(xiàn)缺失， 因此，可推測出親本及其后代的基因型；c.用玻璃珠DNA膠回收試劑盒(上海Sangon公 司)，按照試劑盒說明書的指導，從瓊脂糖凝膠中回收目標DNA片段；d.用美國Promega公 司的pGEM-T載體連接回收的DNA片段，具體操作根據(jù)說明書的指示進行；e.轉(zhuǎn)化大腸桿菌 DH5 a (采用熱擊法)，提取質(zhì)粒DNA(堿裂解法)，于37°C電熱恒溫箱中保溫3小時，進行 酶切，然后將酶切產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳法進行檢測；f.對鑒定為陽性克隆的菌液 送測序公司測序；g.獲得目標DNA片段實際長度為1679堿基對的全部堿基組成及其序列； h.根據(jù)序列的堿基組成，人工設計并合成一對該序列的特異寡核苷酸引物5’TGC GAG AGT CAA TGT ACA ATA G 3，禾口 5，TGC GAG AGT CGA TGA AGT TGA A 3，；i.對原雜交組合雙親 及F1代雜種的基因組DNA進行PCR特異擴增；j.獲得特異擴增的多態(tài)性DNA片段，即SCAR 標記在感病基因型Rlrl的個體中出現(xiàn)，而在抗病基因型rlrl的個體中缺失，可用于檢測與 與蘋果枝干輪紋病抗性基因之一 rl相關的基因型Rlrl (感病)與rlrl (抗病)，從而達到 鑒別隱性純合基因型rlrl個體的目的。1.本發(fā)明中所用的RAPD-PCR擴增及產(chǎn)物鑒定方法a.PCR反應體系總反應體積為25 ii L，其中DNA模板50ng ；10堿基隨機引物0. 4 i mol/L ；Taq酶 1. 0U ； dNTPs 0. 2mmol/L ；MgCl22. 5mmol/L。反應混合物用 15u L 礦物油覆蓋。b. PCR擴增程序PCR儀為PTC-200型。先在94°C預變性4min，然后按照94°C變性30s — 37°C退火 35s — 72°C延伸90s的程序進行40個循環(huán)，最后在72°C延伸5min。
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c.產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 3%瓊脂糖凝膠(含溴化乙錠0. 5微克/毫升)電泳檢測，電泳緩沖 液為1XTAE，電壓為4-5V/cm，電泳時間為1. 5小時，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相。2.本發(fā)明中所用的SCAR-PCR擴增及產(chǎn)物鑒定方法a.PCR反應體系總反應體積為25 ii L，其中DNA模板50ng ；引物各0. 2 ii mol/L ；Taq酶1. 0U ； dNTPs 0. 2讓。1/L ;MgCl2 2. 5mmol/L。反應混合物用15 y L礦物油覆蓋。b. PCR擴增程序PCR儀為PTC-200型。先在94°C預變性4min，然后按照94°C變性30s — 64°C退火 30s — 72°C延伸lmin的程序進行25個循環(huán)，最后在72°C延伸5min。c.產(chǎn)物檢測擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 3%瓊脂糖凝膠(加入溴化乙錠0. 5微克/毫升)電泳檢測，電泳緩 沖液為1XTAE，電壓為4-5V/cm，電泳時間為50min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相。本具體實施方式
不僅可以用來對蘋果親本材料的抗輪紋病遺傳基礎進行鑒別，也 可以對雜交后代進行早期的選擇，從而加速蘋果抗輪紋病育種的進程。例如，對本研究的雜 交組合來說，可淘汰1/2非rlrl基因型的個體，這也極大地降低了人力物力的消耗。另外， 該標記還可為進一步克隆抗輪紋病基因和基因轉(zhuǎn)移提供方法和物質(zhì)基礎，也可為蘋果抗輪 紋病的遺傳規(guī)律研究和分子標記遺傳連鎖圖的構(gòu)建提供科學依據(jù)。
權(quán)利要求
用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，其特征在于a.以蘋果品種舞姿、短枝富士及其F1代雜種(88株，其中抗病11株，感病77株)為試材，分離提取并純化基因組DNA；b.采用RAPD技術，用上海Sangon公司的隨機引物180個，進行F1代雜種及親本DNA的擴增。其中，引物S389(5’TGCGAGAGTC 3’)擴增出的大小約為1700堿基對的片段在11株抗病個體中均表現(xiàn)為缺失，而在77株感病個體中有34株也表現(xiàn)為缺失(即缺失個體約占感病個體總數(shù)的3/7)，這與受兩對獨立分配基因控制的性狀遺傳規(guī)律相吻合。即這是一個與其中一對基因位點相關的基因標記。由于該片段也在親本品種短枝富士上出現(xiàn)，而在舞姿上表現(xiàn)缺失，因此，可推測出親本及其后代的基因型；c.用玻璃珠DNA膠回收試劑盒(上海Sangon公司)從瓊脂糖凝膠中回收目標DNA片段；d.用美國Promega公司的pGEM-T載體連接回收的DNA片段；e.轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，提取質(zhì)粒DNA，并于37℃電熱恒溫箱中保溫3小時，進行酶切；f.對鑒定為陽性克隆的菌液送測序公司測序；g.獲得目標DNA片段即RAPD標記片段實際長度為1679堿基對的全部堿基組成及其序列；h.根據(jù)序列的堿基組成，人工設計并合成一對該序列的特異寡核苷酸引物；i.對原雜交組合雙親及F1代雜種的基因組DNA進行SCAR-PCR特異擴增；j.獲得特異擴增的多態(tài)性DNA片段，即SCAR標記，可用于檢測與與蘋果枝干輪紋病抗性基因之一r1相關的基因型R1r1(感病)與r1r1(抗病)，從而達到鑒別隱性純合基因型r1r1個體的目的。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，其 特征在于獲得RAPD標記片段實際長度為1679堿基對的DNA序列TGCGAGAGTCAATGTACAATAGGGATTGATGTATGCTAACTTGAGTCAATGTCCCTAGAATAGAGA.TTCAATGTTCTCATAAACAGTAAAGGGACATTGTGTTGCAGTGCCTGAATCCAAATGCAAAAATCATGAGTTGCACGAGGTGTGAAGCATAGGAGGCGTGTGAGTGATAAAAAAATTGAACCAGAAAACAAATACTGCAACAAAGCGTCTAAATCCGATAAAACCAAATCAGAAAGAGGCATTGCAATGCAATGTCTGAATCTATATTAACCTATTCCAAAATATATAAAAAATATGAGAAGGGAGTGTCATTTAAAGTGGGTGTCAGCTATAATGATAGATTTTGTAATTTTTGTTTATTTTAAATGCATTTAAGTATCCCGATACATAATTGACCTATTTACAATTAATATAAATATTATTAATATTGTAACTTTTTATTGATTCTGTTTGTACCATACTTAGGGCATCCATATTTAGATCTCGTATAAATACTCGGATGACTCAAATGTAATTATGTAATAAATGAAGGGGCAAATATGTAAAAATGGGAGGAGCCCTTAGTCTATAAAAGGGCCTCCTCACCCTCACAATCCTCAAGCTCTGAGATTCAGAGCAAAGCCTCACTCTCACATTACAAAGCTCTCATCCTCACAATCCTCTCACAAACAGAAAAATACAATATCAGTGTGGACGTAGCCCAAACATTGGGGTGAACCACAATACATCTTGTGTTCTTTACTTTCTTGCAGATTCACGATCGGATTTACGTTGTTCCAAGACCCCTCCAGTTTTGTGCATCAACAGATTCTTTACCAAATCACCCTTTAAATCTACATAAAATATTTTTTTTCTTTCTAAACAAATAGTATTATTTACAAGTGAGAGAGTGGCTAAGTCTCACAATGTGCTAACAATAATGTGGAATCGAACTTAAGATCTCTCATTTATTAAATGACACATAAAATAACTATTAATTTATTCAATTTGACAGTACTTGGAAATTCAGAAATTACTTTACACTATGTTTGGATGAAGAAATTTAAGATTACCAAATAATTTTAAAAATGAAAGTAATTGAAATAACGAGATTTTATTTTCTAGAATTTATGAATTTTCTTGTTTGGTTAACCTAAAAGAACAATAGAATTAAATATGAAATTTGTTATTTTTAAATTGTCAATCATAGAAATTGGGAAATGACATCTATTTACATAGAATTTAAACTTGGGAATTGGAGATCCCAAATTCCAAGTTTTTTTCTATGCAAAAATTCTAAATTTCTATGTTTATGAAGCCAAATAAAGGAATTAGTGAATTTCAATTTGTAAATTCCGACTTTTATCCAAATTCCAAGTTTATTTCCTTCGTCTAAACATAATGTTAAATCACTTTTCTTTTGATAATTATTAACTTTTTGGTAAATAATTGAAGCTAGAACTATTACACGATGTAGTCTTTGTCCTGTTTAAACAGAAATTCCGTTGTTTGGGAAGAGGTTAGGTCTCTCGGTATCCTGCGCCGCAGA CATGGCGGCAAAGTTCGCTTTAGGGTCGGAACCGGTGGTGGGTTCGCTCGCACCCTCAAAGAAGAAA GAGTACAGAGTCACCAACAGGCTCCAAGAGGGCAAGCGGCCCCTATACGCCATCGTTTTCAACTTCAT CGACTCTCGCA
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，其 特征在于根據(jù)RAPD標記片段DNA序列的堿基組成，人工設計并合成的特異寡核苷酸引物 5' TGC GAG AGT CAA TGTACA ATA G 3'禾口 5' TGC GAG AGT CGA TGA AGT TGA A 3，。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法， 其特征在于SCAR-PCR擴增的反應體系、擴增程序及產(chǎn)物檢測a. PCR反應體系總反應體 積為 25 μ L，其中=DNA 模板 50ng ；引物各 0. 2 μ mol/L ；Taq 酶 1. OU ；dNTPs 0. 2mmol/L ； MgCl22. 5mmol/L。b. PCR擴增程序先在94°C預變性4min，然后按照94°C變性30s — 64°C 退火30s — 72°C延伸Imin的程序進行25個循環(huán)，最后在72°C延伸5min。c.產(chǎn)物檢測 擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 3%瓊脂糖凝膠(加入溴化乙錠0. 5微克/毫升)電泳檢測，電泳緩沖液為 IXTAE,電壓為4-5V/cm，電泳時間為50min，于凝膠成像系統(tǒng)中觀察照相。
全文摘要
用于蘋果枝干輪紋病抗性基因檢測的SCAR分子標記方法，它涉及一種基因分子標記方法。不僅可以用來對親本材料的抗輪紋病遺傳基礎進行鑒別，也可以對雜交后代進行早期的選擇，從而加速蘋果抗輪紋病育種的進程。例如，對本研究的雜交組合來說，可淘汰1/2非r1r1基因型的個體，這也極大地降低了人力物力的消耗。另外，該標記還可為進一步克隆抗輪紋病基因和基因轉(zhuǎn)移提供方法和物質(zhì)基礎，也可為蘋果抗輪紋病的遺傳規(guī)律研究和分子標記遺傳連鎖圖的構(gòu)建提供科學依據(jù)。
文檔編號C12Q1/68GK101864481SQ20091017729
公開日2010年10月20日 申請日期2009年9月29日 優(yōu)先權(quán)日2009年9月29日
發(fā)明者殷豪, 王彩虹, 田義軻 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學