專利名稱：乳酸脫氫酶表達(dá)盒、轉(zhuǎn)化酵母和乳酸的制造方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及乳酸脫氫酶表達(dá)盒、具有該盒的轉(zhuǎn)化酵母和包括培養(yǎng)該酵母的乳酸的 制造方法，更具體的是，涉及高乳酸生產(chǎn)能力的乳酸脫氫酶表達(dá)盒、具有該盒的轉(zhuǎn)化酵母和 包括培養(yǎng)該酵母的乳酸的制造方法。
背景技術(shù)：
近年來，在向資源循環(huán)型社會(huì)構(gòu)建的趨勢下，以植物等的生物量作為原料的聚合 物備受關(guān)注。這其中，已經(jīng)清楚了，聚乳酸(以下有時(shí)簡稱為“PLA”)作為生物量原料的聚 合物具有優(yōu)異的性質(zhì)。PLA的原料乳酸，通過培養(yǎng)以乳桿菌屬(Lactobacillus)和乳球菌屬 (Lactococcus)為代表的總稱為所謂乳酸菌的微生物來制造。使用乳酸菌的乳酸的生產(chǎn)，其 由糖產(chǎn)生的乳酸收率和乳酸生產(chǎn)速度優(yōu)異。但是，獲得的乳酸為L-乳酸和D-乳酸的混合 物。因此，在光學(xué)純度上存在問題。在PLA生產(chǎn)中使用的乳酸需要高光學(xué)純度。人們嘗試制造光學(xué)純度高的乳酸。例如，人們嘗試了采用轉(zhuǎn)化酵母，生產(chǎn)L-乳酸 和D-乳酸(例如，專利文獻(xiàn)1-3，非專利文獻(xiàn)1)。酵母原本不具有生產(chǎn)乳酸的能力。在這 些文獻(xiàn)中報(bào)道了，通過基因重組技術(shù)，將編碼將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乳酸的乳酸脫氫酶的基因?qū)?入酵母，獲得了光學(xué)純度非常高的乳酸。另一方面，在通過酵母進(jìn)行的乳酸生產(chǎn)中，乳酸收 率、乳酸生產(chǎn)速度都比乳酸菌要差。因此，為了使用酵母以低成本生產(chǎn)乳酸，需要同時(shí)提高 乳酸收率、乳酸生產(chǎn)速度。為了使乳酸收率、乳酸生產(chǎn)速度一起提高，開發(fā)了一邊用分離膜過濾具有乳酸生 產(chǎn)能力的酵母，一邊進(jìn)行培養(yǎng)的技術(shù)(參照例如專利文獻(xiàn)4)。但是，即使采用這種技術(shù)，也 存在在培養(yǎng)過程中乳酸收率、乳酸生產(chǎn)速度都逐漸降低的問題。專利文獻(xiàn)1 特表2001-516584號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 特開2003-93060號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)3 特開2005-137306號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 國際公開第2007/97260號(hào)小冊(cè)子非專利文獻(xiàn)1 Jshida, Takahashi 等人，J. Biosci. Bioeng, 101 (2)，p. 172-177， (2006)

發(fā)明內(nèi)容
發(fā)明要解決的問題本發(fā)明鑒于上述問題，其目的在于提供使得同時(shí)實(shí)現(xiàn)高的光學(xué)純度、乳酸收率和 乳酸生產(chǎn)速度成為可能的、在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培 養(yǎng)中為了防止乳酸收率和乳酸生產(chǎn)速度降低所必要的編碼乳酸脫氫酶的基因表達(dá)盒、具有 該盒的酵母和培養(yǎng)該酵母而制造乳酸的方法。用于解決問題的方法
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本發(fā)明人為了解決上述問題，進(jìn)行了積極的研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在一邊用分離膜過濾 具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)中，通過一邊用分離膜過濾具有乳酸脫氫酶表 達(dá)盒的酵母，其中所述乳酸脫氫酶表達(dá)盒含有培養(yǎng)開始后50小時(shí)以后基因表達(dá)量為全部 基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因的啟動(dòng)子，一邊進(jìn)行培養(yǎng)，能夠不導(dǎo)致乳酸收率和 乳酸生產(chǎn)速度降低，穩(wěn)定地長時(shí)間連續(xù)培養(yǎng)，從而完成了本發(fā)明。也就是說，本發(fā)明為一種在啟動(dòng)子的下游連接了編碼乳酸脫氫酶的基因的乳酸脫 氫酶表達(dá)盒，其特征在于該啟動(dòng)子是在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn) 行連續(xù)培養(yǎng)中，培養(yǎng)開始后50小時(shí)之后基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以 上的基因的啟動(dòng)子。優(yōu)選前述啟動(dòng)子為指數(shù)缺陷的抑制(suppression of exponential defect) 1基因(SED1基因)、細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)2基因(CWP2基因)或烯醇化酶1基因 (EN01基因)的啟動(dòng)子，更優(yōu)選地為包含選自以下(a) (c)的堿基序列的啟動(dòng)子。(a)包含序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列的啟動(dòng)子；(b)包含與含有序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列在嚴(yán) 格條件下雜交的堿基序列的啟動(dòng)子；(c)包含在序列號(hào)1 3任一項(xiàng)記載的堿基序列中，缺失、替代和/或添加了 1個(gè) 或多個(gè)堿基的堿基序列的啟動(dòng)子。根據(jù)本發(fā)明的其它優(yōu)選方式為含有以下的選自(a)組的啟動(dòng)子和選自(b)組的編 碼乳酸脫氫酶的基因的乳酸脫氫酶表達(dá)盒。(a)(1)包含序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列的啟動(dòng)子；(2)包含與含有序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列在嚴(yán) 格條件下雜交的堿基序列的啟動(dòng)子；(3)包含在序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了 1個(gè)或 多個(gè)堿基的堿基序列的啟動(dòng)子；(b)(1)包含序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因；(2)包含與含有序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列在嚴(yán) 格條件下雜交的堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因；(3)包含在序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了 1個(gè)或 多個(gè)堿基的堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因。本發(fā)明的其它優(yōu)選方式為在染色體中具有至少一個(gè)上述任一乳酸脫氫酶表達(dá)盒 的轉(zhuǎn)化酵母。優(yōu)選地，選自指數(shù)缺陷的抑制1基因(SED1基因)、細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)2基因 (CWP2基因)或烯醇化酶1基因(EN01基因)的至少一個(gè)基因被上述乳酸脫氫酶表達(dá)盒替 代的酵母。上述轉(zhuǎn)化酵母優(yōu)選屬于酵母屬(Genus Saccharomyces)。上述轉(zhuǎn)化酵母如果是釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae),貝Ij更為優(yōu)選。此外，本發(fā)明還提供了包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化酵母的培養(yǎng)步驟的乳酸的制造方法。優(yōu) 選地，前述培養(yǎng)步驟為用分離膜過濾培養(yǎng)液、從濾液中回收乳酸、再將未濾過液保持在或返 流到培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)液中追加培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)。
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發(fā)明的效果本發(fā)明中，一邊用分離膜過濾具有乳酸脫氫酶表達(dá)盒的酵母一邊進(jìn)行培養(yǎng)，其中 所述乳酸脫氫酶表達(dá)盒包含在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù) 培養(yǎng)中，培養(yǎng)開始后50小時(shí)之后基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因 的啟動(dòng)子。其結(jié)果是，能夠以高收率、高生產(chǎn)速度、長時(shí)間穩(wěn)定地進(jìn)行高光學(xué)純度的乳酸的 生產(chǎn)。附圖的簡要說明[

圖1]圖1是用于說明本發(fā)明中使用的膜分離型的連續(xù)發(fā)酵裝置的一個(gè)實(shí)施方式 的概要側(cè)面圖。[圖2]圖2是用于說明能夠在本發(fā)明中使用的其它膜分離型連續(xù)發(fā)酵裝置的一個(gè) 實(shí)施方式的概要側(cè)面圖。[圖3]圖3是用于說明本發(fā)明中使用的分離膜元件的一個(gè)實(shí)施方式的概要斜視 圖。[圖4]圖4是用于說明本發(fā)明中使用的其它分離膜元件的其它實(shí)施方式的概要斜 視圖。[圖5]圖5是用于說明表達(dá)載體pTRSll的圖。符號(hào)的說明1發(fā)酵反應(yīng)槽2分離膜元件23水位差控制裝置4第2標(biāo)簽序列5攪拌機(jī)6液位傳感器7培養(yǎng)基供給泵8 pH調(diào)整溶液供給泵9 pH傳感器·控制裝置10溫度調(diào)節(jié)器11發(fā)酵培養(yǎng)液循環(huán)泵12膜分離槽13支持板14流路材料15分離膜16 凹部17集水管18分離膜束19上部樹脂密封層20下部樹脂密封層21支持框22集水管
用于實(shí)施發(fā)明的最佳方式[乳酸脫氫酶表達(dá)盒]本發(fā)明的乳酸脫氫酶表達(dá)盒是編碼乳酸脫氫酶的基因(Idh基因)連接在啟動(dòng)子 下游的乳酸脫氫酶(LDH 乳酸脫氫酶，以下稱為“LDH”)表達(dá)盒，在一邊用分離膜過濾具有 乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)中，前述啟動(dòng)子為培養(yǎng)開始后50小時(shí)之后基因表 達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因的啟動(dòng)子的乳酸脫氫酶表達(dá)盒。 本說明書中所謂“l(fā)dh基因”是指編碼具有將還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸 (NADH)和丙酮酸轉(zhuǎn)化為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)和L-乳酸或NAD+和D-乳酸 的活性的LDH的基因。作為本發(fā)明中使用的Idh基因，只要是編碼具有上述活性的LDH的Idh基因， 可以使用任意一種，但優(yōu)選是乳酸菌和枯草桿菌等細(xì)菌來源的Idh基因和人、牛、青蛙、 瘧原蟲等真核生物來源的Idh基因。這其中，作為細(xì)菌來源，可以適當(dāng)使用干酪乳桿 菌(Lactobacillus casei),植物乳桿菌(Lactobacillus plantarum),保力口利亞乳桿 胃(Lactobacillus bulgaricus), Lactobacillus sasei,德 Εξ If lif (Lactobacillus delbrueckii)，約氏乳桿菌(Lactobacillus johnsonii)，瑞士乳桿菌(Lactobacillus helveticus),彎曲乳桿菌(Lactobacillus curvatus),嗜酸乳桿菌(Lactobacillus acidophilus)，腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)、乳明串珠菌(Leuconostoc lactis)、乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)，戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)， 乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)，枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，嗜熱 脂肪芽孢桿菌(Bacillus stcarothermophilus)來源的Idh基因。此外作為真核生物 來源，可以適當(dāng)使用米根霉(Rhizopus oryzae)，人(Homo sapiens)，牛(Bos taurus)， 非洲爪蟾(Xenopus laevis)，家犬(Canis familiaris)、密西西比短吻鍔(Alligator mississippiensis)、灰色短尾負(fù)鼠(Monodelphis domestica)、中華鱉(Pelodiscus smensi s)、白斑角鯊(Squalus acanthias)、惡性瘧原蟲(Plamodium falciparum)、間日 皰原蟲(Plamodium vivax)、三日皰原蟲(Plamodium marariae)、蛋形皰原蟲(Plamodium ovale)來源的Idh基因。本發(fā)明中使用的Idh基因中還包括由于遺傳多態(tài)性和誘變等產(chǎn)生的變異型基 因。這里所謂的遺傳多態(tài)性，是由于基因上的自然突變導(dǎo)致基因的堿基序列部分發(fā)生變 化。此外，所謂誘變，是指通過人工在基因中導(dǎo)入變異，例如，使用定點(diǎn)誘變導(dǎo)入用試劑盒 (Mutan-K(TakaraBio公司制))的方法、使用隨機(jī)突變導(dǎo)入用試劑盒(BD Diversify PCR Random Mutagenesis (CL0NTECH 公司制))的方法等進(jìn)行。作為本發(fā)明中使用的克隆Idh基因的方法，沒有特別的限制，可以使用已知的方 法。例如，基于已知的基因信息，可以列舉使用PCR(聚合酶鏈反應(yīng))法擴(kuò)增取得必需的遺傳 區(qū)域的方法，以同源性和酶活性為指標(biāo)從基因組文庫或cDNA文庫中克隆的方法等。此外， 還可以是基于已知的蛋白質(zhì)信息化學(xué)合成或基因工程合成的方法。作為本發(fā)明中使用的乳酸脫氫酶(LDH)表達(dá)盒，只要是在具有該LDH表達(dá)盒的細(xì) 胞內(nèi)，由Idh基因經(jīng)mRNA能夠表達(dá)LDH的堿基序列即可，并沒有特別限定。優(yōu)選為連續(xù)具 有啟動(dòng)子、Idh基因和終止子的堿基序列。這里，所謂終止子，是指使由基因向mRNA轉(zhuǎn)錄終 止的序列，通常是指存在于染色體中的基因的3末端側(cè)的下游序列。
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本發(fā)明中使用的“具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母”，是可以通過同化葡萄糖、蔗糖、果糖 等糖來生產(chǎn)乳酸的酵母，優(yōu)選是通過基因重組導(dǎo)入了 Idh基因的酵母。這里，對(duì)向酵母導(dǎo)入Idh基因的方法進(jìn)行說明。作為向酵母導(dǎo)入Idh基因的方法， 可以列舉在表達(dá)載體中整合有Idh基因的Idh基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母的方法、在染色體上 的目標(biāo)位置通過同源重組插入Idh基因的方法、或通過非同源重組在染色體中隨機(jī)插入 Idh基因的方法等。作為整合Idh基因的表達(dá)載體，可以使用廣泛應(yīng)用于酵母的表達(dá)載體。廣泛應(yīng)用 于酵母的表達(dá)載體是指具有酵母細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制所必需的序列、大腸桿菌細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制 所必需的序列、酵母選擇標(biāo)記和大腸桿菌選擇標(biāo)記，而且為了使整合的Idh基因表達(dá)，理想 的是還具有調(diào)節(jié)其表達(dá)的操縱基因、啟動(dòng)子、終止子或增強(qiáng)子等所謂的調(diào)節(jié)序列。這里，所謂酵母細(xì)胞內(nèi)自主復(fù)制所必需的序列，是指例如酵母的自主復(fù)制起始點(diǎn) (ARSl)和著絲粒序列的組合、或酵母的2μπι質(zhì)粒的復(fù)制起始點(diǎn)的序列。所謂大腸桿菌內(nèi) 自主復(fù)制所必需的序列，是例如大腸桿菌的ColEl復(fù)制起始點(diǎn)的序列。此外，作為酵母選 擇標(biāo)記，可以列舉URA3或TRPl等營養(yǎng)需求性互補(bǔ)基因或G418抗性基因或新霉素抗性基 因等耐藥基因。大腸桿菌的選擇標(biāo)記可以列舉氨芐青霉素抗性基因或卡那霉素抗性基因等 抗生素抗性基因。作為調(diào)節(jié)序列，只要是可以表達(dá)Idh基因的調(diào)節(jié)序列，則沒有特別限制， 作為一個(gè)例子，可以列舉酸性磷酸酶基因(ΡΗ05)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因(TDH1，2，3)、 醇脫氫酶基因(ADH1，2，3，4，5，6，7)基因、半乳糖代謝類基因(GAL1，7，10)、細(xì)胞色素c基 因(CYCl)、磷酸丙糖異構(gòu)酶基因(TPIl)、磷酸甘油酸激酶基因(PGKl)、磷酸果糖激酶基因 (ΡΠ(1)、丙酮酸脫羧酶基因(PDC1，5，6)等的啟動(dòng)子序列和TDH3基因等的終止子序列。然 而，表達(dá)載體并不限于此。通過在上述表達(dá)載體的啟動(dòng)子下游導(dǎo)入Idh基因，可以獲得能夠表達(dá)Idh基因的 載體。通過用后述的方法將獲得的Idh基因表達(dá)載體轉(zhuǎn)化酵母，可以在酵母中導(dǎo)入Idh基 因。此外，通過在染色體中插入Idh基因，能夠在酵母中導(dǎo)入Idh基因。在染色體中插 入Idh基因的方法沒有特別限制，有以下方法，如通過后述的方法將含有Idh基因的DNA轉(zhuǎn) 化酵母，通過非同源重組將Idh基因插入到染色體中隨機(jī)的位置處的方法，通過同源重組 將含有Idh基因的DNA導(dǎo)入到目標(biāo)位置的方法等。優(yōu)選的是通過同源重組的方法。作為將含有Idh基因的DNA通過同源重組插入染色體中目的位置的方法，可以列 舉使用被設(shè)計(jì)成在含有Idh基因的DNA的上游和下游添加與導(dǎo)入目的位置同源的部分的引 物進(jìn)行PCR，用后述方法將獲得的PCR片段轉(zhuǎn)化酵母的方法，但不限于此。此外，為了容易地 進(jìn)行轉(zhuǎn)化株選擇，優(yōu)選在上述PCR片段中含有酵母選擇標(biāo)記。這里使用的調(diào)整PCR片段的方法，可以通過例如下述(1) (3)的步驟1 3的 步驟進(jìn)行。而且，這里，對(duì)于在丙酮酸脫羧酶1基因(PDC1基因)啟動(dòng)子下游導(dǎo)入Idh基因 的方法進(jìn)行例示。(1)步驟1 以在Idh基因的下游連接了終止子的質(zhì)粒作為模板，以引物1，2作為 引物對(duì)，通過PCR擴(kuò)增含有Idh基因和終止子的片段。這里，引物1被設(shè)計(jì)成添加40bp以 上與PDCl基因的上游側(cè)同源的序列，基于來源于質(zhì)粒中終止子下游的序列來設(shè)計(jì)引物2。(2)步驟2 以具有酵母選擇標(biāo)記的質(zhì)粒例如pRS424、pRS426等作為模板，以引物
73，4作為引物對(duì)，通過PCR擴(kuò)增含有酵母選擇標(biāo)記的片段。這里，引物3被設(shè)計(jì)成添加30bp 以上與步驟1的PCR片段的終止子下游序列具有同源性的序列，引物4被設(shè)計(jì)成添加40bp 以上與PDCl基因的下游側(cè)同源的序列。(3)步驟3 通過以步驟1，2中獲得的PCR片段的混合物作為模板，以引物1，4作 為引物對(duì)，進(jìn)行PCR，獲得了在兩末端添加了對(duì)應(yīng)于PDCl基因的上游側(cè)和下游側(cè)的序列的 含有Idh基因、終止子和酵母選擇標(biāo)記的PCR片段。此外，在作為LDH表達(dá)盒導(dǎo)入染色體時(shí)，上述步驟1中使用的PCR模板質(zhì)粒，采用 攜帶了任意啟動(dòng)子、Idh基因和終止子的質(zhì)粒，引物1只要被設(shè)計(jì)成在導(dǎo)入目的位置添加 40bp以上的同源序列，且能夠擴(kuò)增啟動(dòng)子、Idh基因、終止子即可。在酵母中導(dǎo)入上述獲得的Idh基因表達(dá)載體或PCR片段時(shí)，可以使用轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)導(dǎo)、 轉(zhuǎn)染、共轉(zhuǎn)染或電穿孔等方法。具體有例如，采用醋酸鋰的方法和原生質(zhì)體法等。作為獲得的轉(zhuǎn)化株的培養(yǎng)方法，可以使用例如，記載于M. D. Rose等人，"Methods In Yeast Genetics，，，Cold Spring Harbor Laboratory Press (1990)等中的己知的方法。 導(dǎo)入了 Idh基因表達(dá)載體或PCR片段的酵母，可以根據(jù)表達(dá)載體或PCR片段具有的酵母選 擇標(biāo)記，通過在營養(yǎng)非添加培養(yǎng)基或藥劑添加培養(yǎng)基中培養(yǎng)進(jìn)行選擇。本發(fā)明的所謂“一邊用分離膜過濾一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)”是指，用分離膜過濾培養(yǎng) 液，從濾液中回收生產(chǎn)物，與此同時(shí)將未濾過液保持在或返流到前述培養(yǎng)液中，并且在前述 培養(yǎng)液中追加發(fā)酵原料的連續(xù)培養(yǎng)。使用的分離膜優(yōu)選為多孔性膜，并希望其不容易發(fā)生 培養(yǎng)時(shí)使用的酵母導(dǎo)致的堵塞，而且過濾性能具有長期間穩(wěn)定持續(xù)的性能。本發(fā)明中使用 的分離膜的材質(zhì)為陶瓷或有機(jī)高分子，優(yōu)選為有機(jī)高分子。接著，就本發(fā)明中的“基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因” 進(jìn)行說明。本發(fā)明中所謂基因表達(dá)量，是指由基因轉(zhuǎn)錄的信使RNA(mRNA)量，所謂全部基因 的平均相對(duì)表達(dá)量，優(yōu)選登錄在酵母屬基因組數(shù)據(jù)庫(http://Vww.yeastgenome.org/)的 全部基因的平均表達(dá)量，即使缺少1個(gè)或多個(gè)基因也沒關(guān)系。也就是說，所謂“基因表達(dá)量 為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因”是指mRNA量為全部基因的平均mRNA量的 5倍以上的基因。此外，本發(fā)明的本質(zhì)在于使用基因表達(dá)量更多的基因的啟動(dòng)子，因此優(yōu)選 基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的7倍以上、更優(yōu)選10倍以上的基因。本發(fā)明中，作為測定全部基因的平均相對(duì)表達(dá)量的方法，可以列舉Northern印跡 法、qPCR(定量PCR)法、實(shí)時(shí)PCR法或DNA微陣列法等。前面3種方法是通常測定各個(gè)基 因表達(dá)量的方法，而DNA微陣列法中，進(jìn)行固定在陣列上的探針和預(yù)先用熒光標(biāo)識(shí)的mRNA之間的 雜交，通過用專用掃描儀測定熒光強(qiáng)度，可以同時(shí)測定攜帶在陣列上的全部基因的表達(dá)量， 因此優(yōu)選DNA微陣列法。在用掃描儀進(jìn)行的熒光強(qiáng)度的測定中，理想的是用發(fā)生熒光強(qiáng)度 的飽和度的斑點(diǎn)數(shù)盡可能少，而且全體熒光強(qiáng)度提高的激光強(qiáng)度進(jìn)行測定。這種激光強(qiáng)度 在每份測定樣本都不同，可以通過簡單的研究來測定。作為本發(fā)明中使用的DNA微陣列，只要是攜帶了酵母全部基因的微陣列即可，沒 有特別的限制，可以合適地使用Affymetrix公司制造的“GeneChip”或東麗公司制造的 “ 3D-Gene ” 等。優(yōu)選 “ 3D_Gene ”。這里，將“基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因”定義為，使用DNA微陣列測定全部基因的熒光強(qiáng)度，顯示比這些基因的平均值大5倍以上的值的基因。 而且，將“基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的7倍以上的基因”定義為顯示出大7倍 以上的值的基因。此外，還將基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的10倍以上的基因” 定義為顯示出大10倍以上的值的基因。本發(fā)明中，所謂在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng) 中，培養(yǎng)開始后50小時(shí)之后基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因的啟 動(dòng)子是指，在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)中，培養(yǎng)開始 后50小時(shí)之后的某個(gè)時(shí)間點(diǎn)，取樣酵母，使用從該酵母提取的全RNA，通過用上述DNA微陣 列進(jìn)行測定能夠確定的基因的啟動(dòng)子。本發(fā)明中所謂“啟動(dòng)子”，是指與由基因向mRNA的轉(zhuǎn)錄開始相關(guān)的堿基序列，通常 是指存在于染色體中的基因的5末端側(cè)的上游序列。作為啟動(dòng)子的堿基序列長度，優(yōu)選為 1 3000bp、更優(yōu)選1 lOOObp，只要是能夠起始存在于下游的基因的mRNA轉(zhuǎn)錄的堿基序 列即可，沒有特別限定。此外，使啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性提高的變異和操作是已知的，本發(fā)明中 還包括通過已知方法改變的啟動(dòng)子。本發(fā)明中，作為在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng) 中，培養(yǎng)開始后50小時(shí)后基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上、優(yōu)選7倍以 上、更優(yōu)選10倍以上的基因的啟動(dòng)子，可以列舉CDC19(細(xì)胞分裂周期19)基因，IPPl (無機(jī) 焦磷酸酶1)基因、ARFl (ADP-核糖基化因子1)基因，CUP5基因、RPL28(核糖體蛋白L28) 基因、TRX2(硫氧還蛋白2)基因，HSP104(熱休克蛋白104)基因，AHPl (烷基過氧化氫還原 酶1)基因，YMR122W-A，CIT1 (檸檬酸合酶1)基因，RPS15 (核糖體蛋白S15)基因，ALD4(醛 脫氫酶4)基因，YPL225W，HSP26(熱休克激蛋白26)基因，PGKl (磷酸甘油酸激酶1)基因， SEDl (指數(shù)缺陷的抑制1)基因，MFAl (交配因子1)基因，HYP2 (含hypusine的蛋白質(zhì)2)基 因，HSP12(熱休克蛋白12)基因，QCR6(泛醇細(xì)胞色素C還原酶復(fù)合物6)基因，HXKl (己糖 激酶1)基因，TDH3(甘油醛3磷酸脫氫酶3)基因，ENOl (烯醇化酶1)基因，BGL2(i3葡聚糖 酶2)基因，YJL133C-A，QCR8(泛醇細(xì)胞色素C還原酶復(fù)合物8)基因，F(xiàn)BAl (果糖1，6-二磷 酸醛縮酶1)基因，CWP2(細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)2)基因，CCW12(細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)12)基因， TMAlO (翻譯機(jī)制相關(guān)蛋白10)基因，SIP18基因，H0R7 (高滲透壓應(yīng)答7)基因，CCW14(細(xì) 胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)14)基因，PIR3(含內(nèi)部重復(fù)的蛋白13)基因，CYS3(胱硫醚酶3)基因， CDC48(細(xì)胞分裂周期48)基因，LYS20(高檸檬酸合酶20)基因，HSP31 (熱休克蛋白31)基 因，ARG5，6(乙酰谷氨酸激酶5，6)基因，RPS24A(40S核糖體蛋白S24)基因，RPL29(核糖體 蛋白L29)基因，RPL24A (核糖體蛋白L24)基因，ADH4(醇脫氫酶4)基因，MUPl (蛋氨酸吸 收1)基因，RPLl IB (核糖體蛋白Ll 1B)基因，THI4 (硫胺生合成4基因)基因，RPL24B (核糖 體蛋白L24B)基因，RPSOA (40S核糖體蛋白質(zhì)SA)基因，RPL27A(核糖體蛋白質(zhì)L27A)基因， RPL16A(核糖體蛋白質(zhì)L16A)基因，RPS21B (40S核糖體蛋白質(zhì)S21B)基因，RPS5 (40S核糖 體蛋白質(zhì)S5)基因，H0M6(高絲氨酸脫氫酶6)基因，PDC5(丙酮酸脫羧酶5)基因，THI7(硫 胺生合成7)基因，MET17(半胱氨酸合酶17)基因，ECM40(氨基酸N-乙?；D(zhuǎn)移酶40)基 因，ARGl (精氨酸酶1)基因、ZPSl (鋅· pH/調(diào)控的表層蛋白質(zhì)1)基因，IDH2 (異檸檬酸脫 氫酶2)基因的啟動(dòng)子，尤為優(yōu)選SEDl基因、CWP2基因或ENOl基因的啟動(dòng)子。更優(yōu)選為包含選自以下(a) (C)的堿基序列的啟動(dòng)子，
(a)包含下述序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列的啟動(dòng)子；(b)包含與含有下述序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列 在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列的啟動(dòng)子；(c)包含在下述序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了 1 個(gè)或多個(gè)堿基的堿基序列的啟動(dòng)子。
0097]序列號(hào)1 : (SED1基因釀酒酵母來源)0098]aggattttaatctgttggagttaaggtgaatacgtttttccatattggggtatgcagctc0099]gaacctaaagtggtatgtacacatcccctcaagcacacccattacccttataggattaat0100]gtaagcaacagcttacacggaattggaaatactattcaacgatccatgcatctgccagat0101]tcggacatgcatattccccaattggatatagaaaattaacgtaaggcagtatcttttcac0102]aatgtacttgcaacgcggcgacttaaagttgaagtacaacctgcagcagcggctttttgt0103]acggtacgccaaactgtcaatggataatattgcgtagaccgaaaaaggtaatcctcaaca0104]ctacccgtggtggatgacctaaagcagtaatattggttggaattatctcccagacggcac0105]cgtctccccgagaaagcttagccccgaggtctaccttccatacaccactgattgctccac0106]gtcatgcggccttctttcgaggacaaaaaggcatatatcgctaaaattagccatcagaac0107]cgttattgttattatattttcattacgaaagaggagagggcccagcgcgccagagcacac0108]acggtcattgattactttatttggctaaagatccatcccttctcgatgtcatctctttcc0109]attcttgtgtatttttgattgaaaatgattttttgtccactaatttctaaaaataagaca0110]aaaagcctttaagcagtttttcatccattttactacggtaaaatgaattagtacggtatg0111]gctcccagtcgcattatttttagattggccgtaggggctggggtagaactagagtaagga0112]acattgctctgccctcttttgaactgtcatataaatacctgacctattttattctccatt0113]atcgtattatctcacctctctttttctattctcttgtaattattgatttatagtcgtaac0114]tacaaagacaagcaaaataaaatacgttcgctctattaag0115]序列號(hào)2 (CWP2基因釀酒酵母來源)0116]ctaatagacaaggtgctatgagtgaattgctagcctcccctttttattttgtgcggtcac0117]cgcaagggacaaagcttttcttagaaaaccgtctgagaagcataacgtacgccatcccct0118]agacatattaataatgctacagatactatgctgctcgtctttttttgacgacccttttat0119]tgcaatgtgcaactaatggc3.3.3. C 3.3. C C 3. Catagtatcacagtattacattgcctccacc0120]gatgcggatgttagggcgccaagtctgtcatgaagcatgttcctgtcataatcttgtatg0121]caaaataccgcgttctgcgccactgatatgctaggcagcagcaacctatgcagaagattg0122]cttttcccacgcctgttttacgtctccagggcacttgaaacaatgcagcgatcgccgcca0123]caacacgccaaagagaagcgaaagtgggcctgggcggcctcagtttcggcagaggtaaac0124]aacacgaactgaactgccttagctccgaagggcaattccacaggcactccgcggggcccg0125]gccaaggcccaaaaggcgtggaatatgcgcgttttggggccataacacccagtaccacgg0126]ccggaacgggccatataataagtttttcactctcaagaatggtaaacgtaaataggaaca0127]tcccactaccctagaaattgcggaaatttcgcgcttatcattagaaaatctggaaccgtc0128]ctttttcctctttcttgcatttccctttccgtattattgccattctttaactgcatttgg0129]ggaaccgtagaccaaaagccaaacagagaaatgtaacgttC 3.3.3.3.3.3.3.3.aacaacgaaa0130]aaattgaaaaataagatacaataatcgtatataaatcaggcttcttgttcatcattttca0131]attctcttcttgccatcccttttcctatctttgttcttttcttctcataatcaagaataa0132]ataacttcatcacattcgct3. C 3. C 3. C 3.3. C0133]序列號(hào)3 (EN01基因釀酒酵母來源)0134]tagaaagcatactatactattcgacacttcctttcaatcctggaattaacagtcactttt0135]aaaaaagacatctaccgtgaaggtgccgtagagtatcgcgttaccatatcgccaaaaact0136]gatatacgccgcggaaaccaggcaaacaattgaaaagaaaaattttgaggaactctctgc0137]atcgaagccgtctagagttaccactagtcagatgccgcgggcacttgagcacctcatgca0138]cagcaataac3. C 3.3. C 3. C 3.3. ggttagtagcaacctgaattcggtcattgatgcatgcatg0139]tgccgtgaagcgggacaaccagaaaagtcgtctataaatgccggcacgtgcgatcatcgt0140]ggcggggttttaagagtgcatatcacaaattgtcgcattaccgcggaaccgccagatatt0141]cattacttgacgcaaaagcgtttgaaataatgacgaaaaagaaggaagaa0142]aaataccgcttctaggcgggttatctactgatccgagcttccactaggatagcacccaaa0143]cacctgcatatttggacgacctttacttac3. C C 3. C C 3.3.3.3.accactttcgcctctcccgc0144]ccctgataacgtccactaattgagcgattacctgagcggtcctcttttgtttgcagcatg0145]agacttgcatactgcaaatcgtaagtagcaacgtctcaaggtcaaaactgtatggaaacc0146]ttgtcacctcacttaattctagctagcctaccctgcaagtcaagaggtctccgtgattcc0147]tagccacctcaaggtatgcctctccccggaaactgtggccttttctggcacacatgatct0148]ccacgatttc3.3. C 3. 3. 3.3.3.tagcttttgataatggcaatattaatcaaatttattttac0149]ttctttcttgtaacatctctcttgtaatcccttattccttctagctatttttcataaaaa0150]accaagcaactgcttatcaaC 3. C 3. C 3.3.3. C 3.C 3.3.3. C 3.3.3.0151]而且，本說明書中，所謂“嚴(yán)格條件”，是指與其它序列相比較而言探針以更大的程
度(例如比背景大至少2倍)與其目標(biāo)序列雜交的條件。嚴(yán)格條件為序列依存性，根據(jù)進(jìn) 行雜交的環(huán)境而不同。這里，作為嚴(yán)格條件，是在50%甲酰胺存在下，雜交溫度為37°C，更 嚴(yán)格的條件為約42°C。進(jìn)一步嚴(yán)格條件為在甲酰胺存在下，雜交溫度為約65°C。本發(fā)明為含有上述任一啟動(dòng)子的乳酸脫氫酶表達(dá)盒。此外，本發(fā)明為含有以下的選自(a)組的啟動(dòng)子和選自(b)組的編碼乳酸脫氫酶 的基因的乳酸脫氫酶表達(dá)盒，(a)(1)包含上述序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列的啟動(dòng)子，(2)包含與上述含有序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列 在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列的啟動(dòng)子，(3)包含在上述序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了 1 個(gè)或多個(gè)堿基的堿基序列的啟動(dòng)子，(b)(1)包含下述序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因，(2)包含與含有下述序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列 在嚴(yán)格條件下雜交的堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因，(3)包含在下述序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了 1 個(gè)或多個(gè)堿基的堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因。0162]序列號(hào)4 非洲爪蟾(Xenopus laevis)來源0163]atggcaactgtgaaggataaactcatccacaatgtggtcaaggaggagtcgctcccccag0164]aacaaggtcaccattgtgggtgtgggggccgtgggcatggcctgtgccatcagtgtcctg0165]cagaaggatttggcagatgagcttgcacttgttgatgtgatagaagacaaactgaagggg0166]gaaatgatggatctccagcatggcagtctgttccttcgtacccccaagattgtctcaggg0167]aaagattacagcgtcactgcaaactccaagctggtagttgtgacggccggggcccgtcag0168]caggagggagagagtcgcctgaatctggttcagcgcaatgtcaacatcttcaaattcatc0169]attcccaacattgtcaagtacagccccaactgcaccctgctcatcgtctccaacccagtg0170]gacattctgacatatgtggcctggaagatcagtggattccccaaaaaccgtgtcattggc0171]agcggctgcaatttggactctgcccgtttccgttacctcatggggcagaagtttgggatc0172]cacacccagagctgccacggttgggtcattggggaacacggagactcgagtgtgccagtg0173]tggagtggggtgaatgtggctggcgtgtccctgaaaaccctgcaccccgatattgggagt0174]gacgcagacaaggagaactggaaggaggtgcacaagcaggttgtggacagcgcctatgaa0175]gtgatcaagctgaagggctacacctcctgggctattggcctgtccgtagctgacctgtct0176]gagagtatcctgaagaacctccgccgagtccatcccatttccacaatggtcaagggcatg0177]tacggcgtgaataatgatgttttcctcagtgtcccctgtgtgttgggcaacttgggcatc0178]acagacgtggttaacatgacgctgaaggcagatgaagaggatcgcttacgcaagagcgca0179]gacaccctgtgggccatccagaaggagctgcagttctag0180]序列號(hào)5 人(Homo sapiens)來源0181]atggcaactctaaaggatcagctgatttataatcttctaaaggaagaacagaccccccag0182]aataagattacagttgttggggttggtgctgttggcatggcctgtgccatcagtatctta0183]atgaaggacttggcagatgaacttgctcttgttgatgtcatcgaagacaaattgaaggga0184]gagatgatggatctccaacatggcagccttttccttagaacaccaaagattgtctctggc0185]aaagactataatgtaactgcaaactccaagctggtcattatcacggctggggcacgtcag0186]caagagggagaaagccgtcttaatttggtccagcgtaacgtgaacatatttaaattcatc0187]attcctaatgttgtaaaatacagcccgaactgcaagttgcttattgtttcaaatccagtg0188]gatatcttgacctacgtggcttggaagataagtggttttcccaaaaaccgtgttattgga0189]agtggttgcaatctggattcagcccgattccgttacctgatgggggaaaggctgggagtt0190]cacccattaagctgtcatgggtgggtccttggggaacatggagattccagtgtgcctgta0191]tggagtggaatgaatgttgctggtgtctctctgaagactctgcacccagatttagggact0192]gataaagataaggaacagtggaaagaggttcacaagcaggtggttgagagtgcttatgag0193]gtgatcaaactcaaaggctacacatcctgggctattggactctctgtagcagatttggca0194]gagagtataatgaagaatcttaggcgggtgcacccagtttccaccatgattaagggtctt0195]tacggaataaaggatgatgtcttccttagtgttccttgcattttgggacagaatggaatc0196]tcagaccttgtgaaggtgactctgacttctgaggaagaggcccgtttgaagaagagtgca0197]gatacactttgggggatccaaaaggagctgcaattttaa0198]序列號(hào)6:腸膜明串珠菌(Leuconostoc mesenteroides)來源0199]atgaagatttttgcttacggcattcgtgatgatgaaaagccatcacttgaagaatggaaa0200]gcggctaacccagagattgaagtggactacacacaagaattattgacacctgaaacagct
aagttggctg agggatcaga ttcagctgtt gtttatcaac aattggacta tacacgtgaaacattgacag ctttagctaa cgttggtgtt actaacttgt cattgcgtaa cgttggtacagataacattg attttgatgc agcacgtgaa tttaacttta acatttcaaa tgttcctgtttattcaccaa atgctattgc agaacactca atgcttcaat tatctcgttt gctacgtcgcacgaaagcat tggatgccaa aattgctaag cgagacttgc gttgggcacc aacaactggacgtgaaatgc gtatgcaaac agttggtgtt attggtacag gtcatattgg ccgtgttgctattaacattt tgaaaggctt tggggccaag gttattgctt atgacaagta cccaaatgctgaattacaag cagaaggttt gtacgttgac acattagacg aattatatgc acaagctgatgcaatttcat tgtatgttcc tggtgtacct gaaaaccatc atctaatcaa tgcagatgctattgctaaga tgaaggatgg tgtggttatc atgaacgctg cgcgtggtaa tttgatggacattgacgcta ttattgatgg tttgaattct ggtaagattt cagacttcgg tatggacgtttatgaaaatg aagttgcttg ttcaatgaag attggtctgg taaagaattc cccagatgctaagattgctg acttgattgc acgcgaaaat gttatgatca ccccacacac ggctttctatacaactaaag ctgttctaga aatggttcac caatcatttg atgcagcagt tgctttcgccaagggtgaga agccagctat tgctgttgaa tattaa[轉(zhuǎn)化酵母]本發(fā)明為在染色體中含有至少一個(gè)上述乳酸脫氫酶表達(dá)盒的轉(zhuǎn)化酵母。本發(fā)明中 的轉(zhuǎn)化酵母可以在能夠由乳酸脫氫酶表達(dá)盒表達(dá)LDH的染色體中的任意位置上導(dǎo)入該乳 酸脫氫酶表達(dá)盒。優(yōu)選為選自SEDl基因、CWP2基因或ENOl基因中的至少一個(gè)基因被上述 乳酸脫氫酶表達(dá)盒替代的酵母。本發(fā)明中使用的酵母如果是能夠?qū)肴樗崦摎涿副磉_(dá)盒的酵母，就可以 合適地使用。作為其中一例，可以列舉屬于酵母屬(Saccharomyces)、裂殖酵母 屬(Schizosaccharomyces)、接合酵母屬(Zygosaccharomyces)、克魯維酵母屬 (Kluyveromyces)或假絲酵母屬(Candida)的酵母。優(yōu)選屬于酵母屬的酵母。更優(yōu)選為釀 酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。[乳酸的制造方法]本發(fā)明為包括培養(yǎng)上述轉(zhuǎn)化酵母的乳酸的制造方法。培養(yǎng)時(shí)可以采用分批培養(yǎng)、 流加培養(yǎng)(補(bǔ)料分批培養(yǎng))、恒化器培養(yǎng)或連續(xù)培養(yǎng)中的任一種方式。優(yōu)選連續(xù)培養(yǎng)。更 優(yōu)選的是，用分離膜過濾培養(yǎng)液，從濾液中回收乳酸，再將未濾過液保持在或返流到培養(yǎng)液 中，且在培養(yǎng)液中追加培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)。作為本發(fā)明中使用的酵母的發(fā)酵原料，可以是促進(jìn)發(fā)酵培養(yǎng)的酵母的生長，能夠 使作為目的發(fā)酵生產(chǎn)物的乳酸良好生產(chǎn)的原料。作為發(fā)酵原料，可以優(yōu)選使用例如合適地 含有碳源、氮源、無機(jī)鹽類以及根據(jù)需要添加的氨基酸和維生素等有機(jī)微量營養(yǎng)素的液體
培養(yǎng)基。作為上述碳源，可使用例如葡萄糖、蔗糖、果糖、半乳糖、乳糖等糖類、含有這些糖 類的淀粉糖化液、甘薯糖蜜、甜菜糖蜜、高級(jí)糖蜜(High Test Molasses)、甘蔗汁、以及醋 酸、延胡索酸等有機(jī)酸、乙醇等醇類和甘油等。這里所謂糖類是指多元醇的最初氧化生成 物，具有一個(gè)醛基或酮基，且具有醛基的糖被分類為醛糖、具有酮基的糖被分類為酮糖的碳 水化合物。
此外，作為上述氮源，可以使用例如氨氣、氨水、銨鹽類、尿素、硝酸鹽類、其它輔助 使用的有機(jī)氮源例如油粕類、大豆加水分解液、酪蛋白分解物、其它氨基酸、維生素類、玉米 漿、酵母或酵母提取物、肉膏、蛋白胨等的肽類、各種發(fā)酵菌體及其加水分解物等。此外，作為上述無機(jī)鹽類，可以適當(dāng)添加例如磷酸鹽，鎂鹽、鈣鹽、鐵鹽、和錳鹽等。在為了本發(fā)明使用的酵母的生長而需要特定營養(yǎng)素的情形時(shí)，可以添加作為制品 的營養(yǎng)物，或者含有該營養(yǎng)物的天然物。而且，根據(jù)需要還可以添加使用消泡劑。本發(fā)明中，所謂發(fā)酵培養(yǎng)液是指在發(fā)酵原料中能夠獲得酵母增殖的結(jié)果的液體。 追加的發(fā)酵原料的組成還可以根據(jù)培養(yǎng)開始時(shí)發(fā)酵原料組成適當(dāng)改變。在發(fā)酵原料組成變 化成追加的發(fā)酵原料的組成時(shí)，優(yōu)選目的乳酸的生產(chǎn)性變高的變化。例如，通過使氮源、無 機(jī)鹽類、氨基酸和維生素等有機(jī)微量營養(yǎng)素相對(duì)于上述碳源的重量比率降低，就有可能可 以實(shí)現(xiàn)乳酸的生產(chǎn)成本降低、即廣義的乳酸的生產(chǎn)性提高。另一方面，通過使氮源、無機(jī)鹽 類、氨基酸和維生素等有機(jī)微量營養(yǎng)素相對(duì)于上述碳源的重量比率增加，就有可能使乳酸 的生產(chǎn)性提高。本發(fā)明中，發(fā)酵培養(yǎng)液中糖類等發(fā)酵原料的濃度優(yōu)選保持在5g/L以下。更優(yōu)選在 3g/L以下，更為優(yōu)選在lg/L以下。其理由是，使發(fā)酵培養(yǎng)液的抽取導(dǎo)致的發(fā)酵原料的流失 降到最小限。因此，理想的是發(fā)酵培養(yǎng)液中發(fā)酵原料的濃度盡可能小。酵母的發(fā)酵培養(yǎng)通常多在pH為3-8，溫度為20-40°C的范圍進(jìn)行。由于生產(chǎn)物質(zhì) 乳酸為酸性物質(zhì)，因此用堿性物質(zhì)、以及尿素、碳酸鈣和氨氣等將發(fā)酵培養(yǎng)液的PH調(diào)節(jié)到 上述范圍內(nèi)的預(yù)先確定的值。在酵母的發(fā)酵培養(yǎng)中，如果需要提高氧的供給速度，可以采用在空氣中添加氧，將 氧濃度保持在21 %以上，加壓發(fā)酵培養(yǎng)液，提高攪拌速度或者提高通氣量等手段，提高氧的 供給速度。相反，在需要降低氧的供給速度時(shí)，也可以在空氣中混合二氧化碳?xì)怏w、氮和氬 等不含氧的氣體再進(jìn)行供給。本發(fā)明中，可以在培養(yǎng)初期進(jìn)行分批培養(yǎng)或補(bǔ)料分批培養(yǎng)，在酵母濃度提高后開 始連續(xù)培養(yǎng)(抽取)，也可以接種高濃度的酵母菌體，在培養(yǎng)開始的同時(shí)進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)。從 適當(dāng)時(shí)期開始，可以進(jìn)行發(fā)酵原料液的供給和培養(yǎng)物的抽取。發(fā)酵原料液供給和培養(yǎng)物的 抽取開始時(shí)間不一定需要相同。此外，發(fā)酵原料液的供給和培養(yǎng)物的抽取可以是連續(xù)的，也 可以是間歇的?？梢栽诎l(fā)酵原料液中添加如上所示的對(duì)菌體增殖所必需的營養(yǎng)素，使得菌 體增殖得以連續(xù)進(jìn)行。為了獲得有效的生產(chǎn)性，發(fā)酵培養(yǎng)液中酵母的濃度優(yōu)選在發(fā)酵培養(yǎng)液的環(huán)境變得 不適于酵母增殖且死亡率不升高的范圍下，以高濃度狀態(tài)維持。作為其中一例，通過將酵母 濃度，作為干燥重量維持在5g/L以上，可以獲得更好的生產(chǎn)效率。此外，只要不導(dǎo)致連續(xù)發(fā) 酵裝置運(yùn)作上的不方便或生產(chǎn)效率降低，酵母濃度的上限值就沒有特別限定。使具有發(fā)酵生產(chǎn)能力的新鮮菌體增殖的同時(shí)進(jìn)行的連續(xù)培養(yǎng)操作，在培養(yǎng)管理 上，通常優(yōu)選在單一的發(fā)酵反應(yīng)槽中進(jìn)行。然而，如果是菌體增殖的同時(shí)生成乳酸的連續(xù)培 養(yǎng)法，則發(fā)酵反應(yīng)槽的數(shù)目是任意的。由于發(fā)酵反應(yīng)槽的容量小等原因，也可以使用多個(gè)發(fā) 酵反應(yīng)槽。這種情況下，即使用配管并列或串聯(lián)地連接多個(gè)發(fā)酵反應(yīng)槽進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)，也可 以獲得發(fā)酵生產(chǎn)物的高生產(chǎn)性。由本發(fā)明的乳酸的制造方法制造的包含于培養(yǎng)液中的乳酸的分離·純化，還可以
14通過組合已知的離子交換、濃縮、蒸餾和晶析等方法來進(jìn)行。本發(fā)明的乳酸的制造方法中使用的發(fā)酵裝置的1個(gè)例子，其主要由用于制造乳酸 的容納本發(fā)明的轉(zhuǎn)化酵母的發(fā)酵反應(yīng)槽，以及用于過濾分離轉(zhuǎn)化酵母和培養(yǎng)液的含有多孔 性膜的分離膜元件構(gòu)成。分離膜元件可以設(shè)置在發(fā)酵反應(yīng)槽的內(nèi)部或外部。在通過用分離膜過濾本發(fā)明的培養(yǎng)液，從濾液中回收乳酸，再將未濾過液保持在 或返流到培養(yǎng)液中，并在培養(yǎng)液中追加培養(yǎng)基的連續(xù)培養(yǎng)所進(jìn)行的乳酸的制造方法中，優(yōu) 選使用平均細(xì)孔徑為0. 01 μ m以上且不到1 μ m的多孔性膜作為分離膜，在作為過濾壓力的 膜間差壓在0. 1至20kPa的范圍內(nèi)進(jìn)行過濾處理。因此，尤其是，由于不需要使發(fā)酵反應(yīng)槽 內(nèi)保持在加壓狀態(tài)，因此不需要使發(fā)酵培養(yǎng)液在過濾分離裝置和發(fā)酵反應(yīng)槽間循環(huán)的動(dòng)力 手段，也可以通過在發(fā)酵反應(yīng)槽內(nèi)部設(shè)置分離膜元件使發(fā)酵培養(yǎng)裝置緊湊。下面就本發(fā)明中作為分離膜優(yōu)選使用的多孔性膜的結(jié)構(gòu)進(jìn)行說明。本發(fā)明中的 多孔性膜具有適應(yīng)被處理水的水質(zhì)和用途的分離性能和透水性能，從阻止性能和透水性能 和耐污性這些分離性能方面來看，優(yōu)選含有多孔質(zhì)樹脂層的多孔性膜。這樣的多孔性膜在 多孔質(zhì)基材的表面具有起分離功能層作用的多孔質(zhì)樹脂層。多孔質(zhì)基材是支持多孔質(zhì)樹脂 層、給予分離膜強(qiáng)度的物質(zhì)。多孔質(zhì)基材的材質(zhì)為有機(jī)材料和無機(jī)材料等，并沒有特殊限定，但理想的是使用 有機(jī)纖維。優(yōu)選的多孔質(zhì)基材為使用纖維素纖維、三乙酸纖維素纖維、聚酯纖維、聚丙烯纖 維和聚乙烯纖維等有機(jī)纖維構(gòu)成的織布或無紡布，這其中，優(yōu)選使用密度控制比較容易、制 造也容易的便宜的無紡布。另外，多孔質(zhì)樹脂層起到上述這種分離功能層的作用，可以優(yōu)選使用有機(jī)高分子 膜。作為有機(jī)高分子膜的材質(zhì)，可以列舉，例如聚乙烯類樹脂、聚丙烯類樹脂、聚氯乙烯類樹 脂、聚偏氟乙烯類樹脂、聚砜類樹脂、聚醚砜類樹脂、聚丙烯腈類樹脂、纖維素類樹脂和三乙 酸纖維素類樹脂等。有機(jī)高分子膜也可以是以這些樹脂作為主要成分的樹脂混合物。這其 中，作為主要成分，是指其成分含有50重量％以上、優(yōu)選60重量％以上。其中，作為構(gòu)成多 孔質(zhì)樹脂層的材料，優(yōu)選通過溶液進(jìn)行的制膜容易、且物理的耐久性和耐藥性優(yōu)異的聚氯 乙烯類樹脂、聚偏氟乙烯類樹脂、聚砜類樹脂、聚醚砜類樹脂和聚丙烯腈類樹脂，最優(yōu)選聚 偏氟乙烯類樹脂或以其作為主要成分的樹脂。這里，作為聚偏氟乙烯類樹脂，優(yōu)選使用偏氟乙烯的均聚物，其它還優(yōu)選使用與可 以與偏氟乙烯共聚的乙烯類單體的共聚體。作為可以與偏氟乙烯共聚的乙烯類單體，可以 列舉四氟乙烯、六氟丙烯和三氯一氟乙烯等。本發(fā)明中使用的分離膜可以是平膜，也可以是中空纖維膜。如果是平膜，其平均厚 度根據(jù)其用途來選擇，但優(yōu)選在20 μ m以上5000 μ m以下，更優(yōu)選在50 μ m以上2000 μ m以 下的范圍內(nèi)選擇。如上所述，本發(fā)明中使用的分離膜，理想的是由多孔質(zhì)基材和多孔質(zhì)樹脂層形成 的多孔性膜。此時(shí)，多孔質(zhì)樹脂層可以浸透在多孔質(zhì)基材中，多孔質(zhì)樹脂層也可以不浸透在 多孔質(zhì)基材中，這根據(jù)用途進(jìn)行選擇。多孔質(zhì)基材的平均厚度優(yōu)選在50 μ m以上3000 μ m 以下的范圍內(nèi)選擇。此外，多孔性膜為中空纖維膜時(shí)，中空纖維的內(nèi)徑優(yōu)選在200 μ m以上 5000 μ m以下的范圍選擇，膜厚優(yōu)選在20 μ m以上2000 μ m以下的范圍內(nèi)選擇。此外，在中 空纖維的內(nèi)部還可以含有由有機(jī)纖維或無機(jī)纖維制成筒狀的織物或編物。
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首先，就多孔性膜中的平膜的制作法進(jìn)行簡要說明。在多孔質(zhì)基材的表面上形成含有前述樹脂和溶劑的原液的被膜，同時(shí)使該原液浸 漬于多孔質(zhì)基材中。然后，只使具有被膜的多孔質(zhì)基材的被膜側(cè)表面與含有非溶劑的凝固 浴接觸，使樹脂凝固，同時(shí)在多孔質(zhì)基材的表面上形成多孔質(zhì)樹脂層。原液通過使樹脂溶解 于溶劑中來制備。原液中還可以含有非溶劑。從制膜性的角度考慮，原液溫度通常優(yōu)選在 15 120°C的范圍內(nèi)選擇。這里，還可以在原液中添加開孔劑。開孔劑具有在浸漬于凝固浴時(shí)被提取，使樹脂 層成為多孔質(zhì)的作用。通過添加開孔劑，可以控制平均細(xì)孔徑的大小。開孔劑具有在浸漬 于凝固浴時(shí)被提取，使樹脂層成為多孔質(zhì)的作用。開孔劑優(yōu)選在凝固浴的溶解性高。作為 開孔劑，可以使用例如氯化鈣或碳酸鈣等無機(jī)鹽。此外，作為開孔劑，可以使用聚乙二醇和 聚丙二醇等聚氧化烯類、聚乙烯醇、聚乙烯醇縮丁醛和聚丙烯酸等水溶性高分子化合物和 甘油。此外，溶劑為溶解樹脂的溶劑。溶劑作用于樹脂和開孔劑，促進(jìn)它們形成多孔質(zhì)樹 脂層。作為這樣的溶劑，可以使用N-甲基吡咯烷酮(NMP)、N, N- 二甲基乙酰胺(DMAc)、N， N-二甲基甲酰胺(DMF)、二甲亞砜(DMSO)、N-甲基-2-吡咯烷酮、甲基乙基酮、四氫呋喃、四 甲基脲、磷酸三甲酯、環(huán)己酮、異佛爾酮、Y-丁內(nèi)酯、甲基異戊基酮、鄰苯二甲酸二甲酯、丙 二醇甲基醚、碳酸異丙烯酯、雙丙酮醇、甘油三乙酸酯、丙酮和甲基乙基酮等。這其中，優(yōu)選 使用樹脂溶解性高的NMP、DMAc, DMF和DMS0。這些溶劑可以單獨(dú)使用，也可以兩種以上混 合使用。原液可以以優(yōu)選5重量％以上60重量％以下濃度，使前述樹脂溶解于上述溶劑中 來制備。此外，還可以在溶劑中添加例如聚乙二醇、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮和甘油等溶 劑以外的成分。非溶劑為不溶解樹脂的液體。非溶劑起到控制樹脂凝固的速度，從而控制 細(xì)孔大小的作用。作為非溶劑，可以使用水、甲醇和乙醇等醇類。其中，從價(jià)格方面考慮，優(yōu) 選水或甲醇。非溶劑也可以是這些物質(zhì)的混合物。下面，就多孔性膜中的中空纖維膜的制作方法簡要說明。中空纖維膜可以通過從二重管式金屬口外側(cè)的管吐出包含樹脂和溶劑的原液，并 從二重管式金屬口內(nèi)側(cè)的管吐出中空部形成用流體，然后在冷卻浴中冷卻固化的方式制 作。原液可以通過使上述平膜的制造方法中所述的樹脂以優(yōu)選20重量％以上60重 量％以下的濃度溶解于上述平膜的制造方法中所述的溶劑中來制備。此外，通?？梢允?用氣體或液體作為中空部形成用流體。此外，在獲得的中空纖維膜的外表面上還可以涂覆 (層疊)新的多孔性樹脂層。層疊可以是為了使中空纖維膜的性質(zhì)例如親水性 疏水性或 細(xì)孔徑等變化成所希望的性質(zhì)而進(jìn)行的。層疊的新的多孔性樹脂層可以通過以下方式制 造，即通過使樹脂溶解于溶劑的原液與含有非溶劑的凝固浴接觸，使樹脂凝固。該樹脂的材 質(zhì)優(yōu)選使用例如與上述有機(jī)高分子膜的材質(zhì)同樣的材質(zhì)。此外，作為層疊方法，可以將中空 纖維膜浸漬于原液中，也可以在中空纖維膜的表面上涂布原液，層疊后，擠出付著的原液的 一部分，用氣刀吹掉，調(diào)整疊層量。本發(fā)明中使用的分離膜還可以通過與支持體組合，形成分離膜元件。使用支持板 作為支持體，該支持板的至少一面上配備本發(fā)明中使用的分離膜的分離膜元件是本發(fā)明使用的具有分離膜的分離膜元件的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方式。該實(shí)施方式中，膜面積難以變大時(shí)， 為了擴(kuò)大透水量，優(yōu)選在支持板的兩面配置分離膜。作為分離膜的多孔性膜的平均細(xì)孔徑，如果在如上所述的0. 01 μ m以上不到1 μ m 的范圍內(nèi)，則此膜兼具菌體和污泥等不泄漏的高排除率，以及高透水性，而且還可以不容易 堵塞地長時(shí)間保持透水性，而且能夠以更高的精度和再現(xiàn)性的實(shí)施。在使用細(xì)菌類時(shí)，多孔 性膜的平均細(xì)孔徑優(yōu)選在0. 4μπι以下，平均細(xì)孔徑如果不到0. 2 μ m，可以更合適的實(shí)施。 平均細(xì)孔徑如果過小，透水量可能降低，因此本發(fā)明中，平均細(xì)孔徑為0. Olym以上，優(yōu)選 為0. 02 μ m以上，更優(yōu)選為0. 04 μ m以上。這里，可以通過測定在倍率10，000倍的掃描型電子顯微鏡觀察下，在 9. 2 μ mX 10. 4μ m的范圍內(nèi)可以觀察到的所有細(xì)孔的直徑，進(jìn)行平均后求得平均細(xì)孔徑。上述平均細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差σ優(yōu)選在0. 1 μ m以下。而且，平均細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏 差小，即細(xì)孔徑的大小一致，能夠獲得均勻的透過液。為了使發(fā)酵運(yùn)轉(zhuǎn)管理變得容易，理想 的是平均細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差越小越好。平均細(xì)孔徑的標(biāo)準(zhǔn)偏差ο可以通過下述(式1)計(jì)算得出，其中以在上述 9. 2 μ mX 10. 4 μ m范圍內(nèi)能夠觀察到的細(xì)孔數(shù)作為N，以測定的各個(gè)直徑作為Xk，以細(xì)孔直 徑的平均值作為X(ave)。
權(quán)利要求
乳酸脫氫酶表達(dá)盒，所述乳酸脫氫酶表達(dá)盒是在啟動(dòng)子下游連接了編碼乳酸脫氫酶的基因的乳酸脫氫酶表達(dá)盒，所述啟動(dòng)子是在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)中，培養(yǎng)開始后50小時(shí)之后基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因的啟動(dòng)子。
2.權(quán)利要求1所述的乳酸脫氫酶表達(dá)盒，所述啟動(dòng)子是指數(shù)缺陷的抑制1基因(SED1 基因)、細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)2基因(CWP2基因)或烯醇化酶1基因(EN01基因)的啟動(dòng)子。
3.權(quán)利要求1所述的乳酸脫氫酶表達(dá)盒，所述啟動(dòng)子為包含選自以下(a) (c)的堿 基序列的啟動(dòng)子，(a)包含序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列的啟動(dòng)子；(b)包含與含有序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列在嚴(yán)格條 件下雜交的堿基序列的啟動(dòng)子；(c)包含在序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了1個(gè)或多個(gè) 堿基的堿基序列的啟動(dòng)子。
4.乳酸脫氫酶表達(dá)盒，其包含選自以下(a)組的啟動(dòng)子和選自以下(b)組的編碼乳酸 脫氫酶的基因，(a)(1)包含序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列的啟動(dòng)子；(2)包含與含有序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列在嚴(yán)格條 件下雜交的堿基序列的啟動(dòng)子；(3)包含在序列號(hào)1 3任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了1個(gè)或多個(gè) 堿基的堿基序列的啟動(dòng)子；(b)(1)包含序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因；(2)包含與含有序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示的堿基序列或其一部分的堿基序列在嚴(yán)格條 件下雜交的堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因；(3)包含在序列號(hào)4 6任一項(xiàng)所示的堿基序列中缺失、替代和/或添加了1個(gè)或多個(gè) 堿基的堿基序列的編碼乳酸脫氫酶的基因。
5.轉(zhuǎn)化酵母，在染色體中具有至少一個(gè)權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)中所述的乳酸脫氫酶表 達(dá)盒。
6.權(quán)利要求5所述的轉(zhuǎn)化酵母，所述轉(zhuǎn)化酵母的選自指數(shù)缺陷的抑制1基因(SED1基 因)、細(xì)胞壁關(guān)聯(lián)蛋白質(zhì)2基因(CWP2基因)和烯醇化酶1基因(EN01基因)的至少一個(gè)基 因被權(quán)利要求1 4任一項(xiàng)中所述的乳酸脫氫酶表達(dá)盒替代。
7.權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化酵母，所述轉(zhuǎn)化酵母屬于酵母屬(Genus Saccharomyces)0
8.權(quán)利要求5或6所述的轉(zhuǎn)化酵母，所述轉(zhuǎn)化酵母為釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)0
9.乳酸的制造方法，包括培養(yǎng)權(quán)利要求5 8任一項(xiàng)中所述的轉(zhuǎn)化酵母的培養(yǎng)步驟。
10.權(quán)利要求9所述的乳酸的制造方法，所述培養(yǎng)步驟是用分離膜過濾培養(yǎng)液、從濾液中 回收乳酸、再將未濾過液保持在或返流到培養(yǎng)液中，并且在培養(yǎng)液中追加培養(yǎng)基的連續(xù)發(fā)酵。
全文摘要
提供了可以同時(shí)達(dá)到高光學(xué)純度、乳酸收率和乳酸生產(chǎn)速度的、在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)中為了防止乳酸收率和乳酸生產(chǎn)速度降低所必需的編碼乳酸脫氫酶的基因表達(dá)盒、具有該盒的酵母和通過培養(yǎng)該酵母實(shí)施的乳酸的制造方法。本發(fā)明的乳酸脫氫酶表達(dá)盒是在啟動(dòng)子下游連接了編碼乳酸脫氫酶的基因的乳酸脫氫酶表達(dá)盒，在一邊用分離膜過濾具有乳酸生產(chǎn)能力的酵母一邊進(jìn)行連續(xù)培養(yǎng)中，所述啟動(dòng)子是培養(yǎng)開始后50小時(shí)之后基因表達(dá)量為全部基因平均相對(duì)表達(dá)量的5倍以上的基因的啟動(dòng)子。
文檔編號(hào)C12N15/09GK101939426SQ20088012635
公開日2011年1月5日 申請(qǐng)日期2008年12月5日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月7日
發(fā)明者澤井健司, 澤井秀樹 申請(qǐng)人:東麗株式會(huì)社