專利名稱：培養(yǎng)鏈球菌的發(fā)酵工藝以及從中提取cps的純化工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于細(xì)菌培養(yǎng)領(lǐng)域，尤其涉及培養(yǎng)條件的優(yōu)化以及提高細(xì)菌莢膜多糖產(chǎn)率 的方法。莢膜多糖(cps)是位于細(xì)菌表面的參與多種細(xì)菌性疾病的重要免疫原。這一特征 使其成為疫苗設(shè)計的重要成分。試驗證明它們可用于刺激免疫反應(yīng)，尤其是與載體蛋白相 連時(參考文獻(xiàn)1)。一般來說，生產(chǎn)莢膜多糖的方法包括在復(fù)合培養(yǎng)基中分批培養(yǎng)(B型鏈球菌，金黃 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，月市炎鏈球菌(streptococcuspneumoniae)禾口流感 嗜血菌(Haemophilus influenzae))、補(bǔ)料分批培養(yǎng)(流感嗜血菌)或連續(xù)培養(yǎng)(B型鏈球 菌和鼠李糖乳桿菌(lactobacillus rhamnosus))(參考文獻(xiàn)2_7)。大多數(shù)研究使用分批培 養(yǎng)系統(tǒng)，其中生長速率、營養(yǎng)水平和代謝物濃度在培養(yǎng)期間是變化的。在這種系統(tǒng)中，一種 因素的改變往往會導(dǎo)致與生長相關(guān)的其他因素的改變，對產(chǎn)率產(chǎn)生不可預(yù)測的影響。連續(xù) 培養(yǎng)可以使研究人員在分批培養(yǎng)期間相互獨立地分離和定義參數(shù)，如生長速率、營養(yǎng)物和 產(chǎn)物濃度以及細(xì)胞密度。在連續(xù)培養(yǎng)期間，新鮮培養(yǎng)基以固定的速率添加到培養(yǎng)物內(nèi)，細(xì)胞 和培養(yǎng)基以一定的速率被去除，從而可使培養(yǎng)體積保持恒定。當(dāng)莢膜多糖的生產(chǎn)被證明依 賴于培養(yǎng)條件時優(yōu)選用連續(xù)培養(yǎng)方法生產(chǎn)(參考文獻(xiàn)8)。對于B型鏈球菌來說(GBS，無乳鏈球菌(S. agalactiae))，據(jù)報道細(xì)胞生長速率是 調(diào)節(jié)莢膜多糖產(chǎn)率的主要因素)。另外，研究顯示III型莢膜多糖的產(chǎn)率與生長限制營養(yǎng) 物無關(guān)。細(xì)胞的質(zhì)量倍增時間(td)較快(0. 8，1. 4或1. 6h)時的單位產(chǎn)率(高達(dá)約90mg/ gCDw)要高于質(zhì)量倍增時間較短(td = 2. 6或Ilh)時(參考文獻(xiàn)8-10)。但是，連續(xù)培養(yǎng)容 易產(chǎn)生菌株穩(wěn)定性的問題和污染，并且因為需要連續(xù)進(jìn)料培養(yǎng)基和營養(yǎng)物，也比較昂貴。因 此需要找到能獲得高莢膜多糖產(chǎn)率的連續(xù)培養(yǎng)的替代方法，從而可以解決上述連續(xù)培養(yǎng)所 遇到的問題。W02007/052168描述了一種克服連續(xù)培養(yǎng)的缺點的方法?，F(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出了一種 復(fù)合分批發(fā)酵工藝，該工藝可維持有利于cps生成的營養(yǎng)環(huán)境和生長速率。這種工藝結(jié)合 了分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點，可得到很高的細(xì)胞密度，因為指數(shù)生長期延長以及在 發(fā)酵期間可控制底物進(jìn)料的條件。然而，復(fù)合分配發(fā)酵技術(shù)需要使用帶有復(fù)雜算法的軟件 來控制發(fā)酵。另外，生產(chǎn)可支持臨床試驗的材料需要符合《藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范》的高 效而經(jīng)濟(jì)的生產(chǎn)工藝。因此，急需簡化分批發(fā)酵工藝以便于用于大規(guī)模生產(chǎn)。除了需要簡化發(fā)酵方法以外，還需要找到適用于發(fā)酵后大規(guī)模生產(chǎn)莢膜多糖的簡 化純化方法。WO 2007/052168所描述的方法是基于WO 2006/082527公開的方法，該方法 包括提取、醇沉淀、透析過濾、陽離子去污劑處理以及再增溶。這種方法的效率很高，一般來說生產(chǎn)出的莢膜多糖制備物純度約為80%。但是，陽離子去污劑處理的步驟會導(dǎo)致莢膜多 糖沉淀。隨后從上清中分離沉淀物(例如，通過離心)和再增溶的過程是十分費(fèi)力的，并且 會導(dǎo)致莢膜多糖的丟失，因此會降低產(chǎn)率。陽離子去污劑處理的效率也取決于莢膜多糖的 初始純度。莢膜多糖的初始純度越低，陽離子去污劑處理的效率越低，從而進(jìn)一步降低了產(chǎn) 率。因此，需要有一種簡化的純化方法，復(fù)雜的和/或昂貴的純化步驟更少，但是得到的純 度卻更高。另外還需要一種無論多糖的初始純度多少都能獲得較高莢膜多糖產(chǎn)率的純化方 法。公開的實施方式概述發(fā)明者通過提供從鏈球菌規(guī)模生產(chǎn)莢膜多糖(cps)的方法滿足了簡化發(fā)酵工藝 的需求。在某些實施方式中，去除了線性添加碳源期間維持PH平衡的算法，在其他實施方 式中，刪除了培養(yǎng)基中的不必要組分。優(yōu)選的鏈球菌種是無乳鏈球菌，也被稱作蘭斯菲爾德 B型鏈球菌(Lancefield' s Group BStr印tococcus)或GBS，尤其是菌株090、H36b、CBJlll 或 M781。本發(fā)明的一個方面提供了表達(dá)CPS的鏈球菌菌株接種物。在一個實施方式中，接 種物的最佳密度(OD)優(yōu)選0. 6-1. 8，該密度是接種物的指數(shù)生長中期。雖然報告的OD值是 在590nm處測得的，但是也可以根據(jù)給定試驗的吸光度波長轉(zhuǎn)化成0D。本發(fā)明的另一方面提供了通過發(fā)酵培養(yǎng)鏈球菌菌株的方法。在一個實施方式中， 培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的PH在6. 0-7. 5之間，優(yōu)選約7. 3。在另一實施方式中，培養(yǎng)期間培養(yǎng)基的 溫度在34-38°C之間，優(yōu)選約36°C。本發(fā)明的另一方面提供了培養(yǎng)鏈球菌菌株的方法，其中培養(yǎng)包括兩次瞬時添加酵 母提取物，然后線性添加碳源。線性添加的碳源優(yōu)選葡萄糖。每一次添加都在指定的OD水 平時開始，該時間點是經(jīng)過選擇的，通過調(diào)節(jié)細(xì)菌的生長速率可以達(dá)到較高的cps體積產(chǎn) 量，使微生物適應(yīng)生成最大血清型特異性的cps。在一個實施方式中，第一次瞬時添加酵母提取物是從2. 8-3. 2的OD水平開始的， 優(yōu)選約3. 0。在另一實施方式中，第二次瞬時添加酵母提取物是從4. 3-4. 7的OD水平開始 的，優(yōu)選約4. 5。在另一實施方式中，線性添加碳源是從9. 8-10. 0的OD水平開始的，優(yōu)選約 10?？傊?，無需算法的線性添加碳源與以前復(fù)雜的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝相比是一個進(jìn) 步，因為后者需要利用算法通過監(jiān)測培養(yǎng)基的PH來控制培養(yǎng)。本發(fā)明的另一方面提供了培養(yǎng)基，其中包括確定成分培養(yǎng)基或復(fù)合培養(yǎng)基。用于 培養(yǎng)鏈球菌的確定成分培養(yǎng)基包含磷酸鹽源、礦物質(zhì)源、碳源、維生素源和氨基酸源。維生 素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素構(gòu)成生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、 鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙酰胺。用于培養(yǎng)鏈球菌的復(fù)合培養(yǎng)基包含復(fù)合提取物(優(yōu)選酵母提取物)、磷酸鹽源、碳 源、維生素源以及可選的氨基酸源。維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生 素構(gòu)成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中一種維生素必須是生物素 (即，培養(yǎng)基中包含5種維生素中的4種，第5種不是添加的，而是復(fù)合提取物中的天然成 分)。在優(yōu)選實施方式中，維生素源包含3種或更少、兩種或更少，或者只有生物素。本發(fā)明還提供了組合物，其中包括培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是確定成分培養(yǎng)基，由用于培養(yǎng)鏈球菌的磷酸鹽源、礦物質(zhì)源、碳源、維生素源和氨基酸源組成。再次重申，鏈球菌優(yōu)選菌 株是無乳鏈球菌，尤其是菌株090、H36b、CBJlll或M781。在一個實施方式中，磷酸鹽源由 K2HP04、KH2PO4、Na2HPO4. H20、NaH2P04. H2O或NaCl組成。在一個實施方式中，優(yōu)選碳源是葡萄糖。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素組成 生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙酰胺。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的5種或更少的維生素組成 生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙酰胺。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的4種或更少的維生素組成 生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙酰胺。在另一實施方式中，維生素源由選自如下7種維生素的3種或更少的維生素組成 生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須 是泛酸鈣和煙酰胺。在另一實施方式中，維生素源由泛酸鈣和煙酰胺組成。在另一實施方式中，氨基酸源由選自如下19種氨基酸的19種或更少的氨基酸組 成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，氨基酸源由選自如下19種氨基酸的18種或更少的氨基酸組 成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，氨基酸源由選自如下19種氨基酸的17種或更少的氨基酸組 成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，氨基酸源由選自如下19種氨基酸的16種或更少的氨基酸組 成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙 氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸， 其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸。在另一實施方式中，氨基酸源由精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸組成。本發(fā)明的另一方面提供了組合物，其中包括培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基是復(fù)合培養(yǎng)基，由用 于培養(yǎng)鏈球菌的復(fù)合提取物(優(yōu)選酵母提取物)、磷酸鹽源、碳源、維生素源以及可選的氨 基酸源。再次重申，鏈球菌優(yōu)選菌株是無乳鏈球菌，尤其是菌株090、H36b、CBJlll或M781。在一個實施方式中，維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生素組成 生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中的一種維生素必須是生物素。在另一個實施方式中，維生素源由選自如下5種維生素的3種或更少的維生素組 成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中的一種維生素必須是生物素。在另一個實施方式中，維生素源由選自如下5種維生素的2種或更少的維生素組 成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中的一種維生素必須是生物素。在另一個實施方式中，維生素源是生物素。上述方面和實施方式并不意味著著彼此排除，可以彼此組合或與本說明書公開的 除互相排除之外的其他任何方面或?qū)嵤┓绞浇M合。本發(fā)明還提供了純化莢膜多糖的方法，通常是從無乳鏈球菌中純化，該方法包括 使用附著濾器過濾的步驟。附著濾器是能夠結(jié)合莢膜多糖內(nèi)可能存在的污染物而允許莢膜 多糖通過的濾器，例如蛋白質(zhì)和/或核酸。本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)附著濾器可用于純化莢膜 多糖，替代WO 2007/052168和WO 2006/082527所描述的陽離子去污劑處理。使用附著濾 器以后就無需再用陽離子去污劑，這意味著無需分離這個階段產(chǎn)生的莢膜多糖沉淀，因此 無需從上清中分離沉淀，簡化了方法，防止了分離期間可能發(fā)生的莢膜多糖丟失。因而附著 濾器的使用可提供純化方法產(chǎn)率。附著濾器的效率也不依賴于莢膜多糖的初始純度。本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定適用于本發(fā)明的合適附著濾器。一般來說，莢膜多糖 內(nèi)的主要污染物是蛋白質(zhì)，因此附著濾器是蛋白質(zhì)附著濾器。發(fā)明者發(fā)現(xiàn)碳濾器尤其合適。 它們通常包含活性炭(例如，以顆粒性碳床或壓縮或排出碳塊的形式)，可用作純化樣品的
濾器O本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠確定合適的碳濾器。一般而言，可用于本發(fā)明的碳濾器包 含固定在基質(zhì)上的活性炭?；|(zhì)可以是可滲透樣品的任何有孔濾器?；|(zhì)可包含支持材料 和/或結(jié)合材料。支持材料可以是合成的聚合物或天然聚合物。合適的合成聚合物包括聚 苯乙烯、聚丙烯酰胺和聚甲基丙烯酸甲酯，天然聚合物包括纖維素、多糖和葡聚糖、瓊脂糖。 一般來說，聚合物支持材料是以纖維網(wǎng)絡(luò)的形式提供機(jī)械剛性。結(jié)合材料可以是樹脂?；?質(zhì)可以是膜紙的形式。固定在基質(zhì)上的活性炭一般采用柱體的形式。柱體是一種自含式實 體，其中包含粉末狀活性炭，活性炭被固定在基質(zhì)上，制成膜紙的形式。膜紙可被捕獲在可 滲透塑料支持物上形成盤。另外，膜紙可以是螺旋狀損傷的。為了增加濾器的表面積，幾個 盤彼此疊加在一起。更具體地說，彼此疊加在一起的盤形成一個中央核心管道，用于從濾器 中收集和去除碳處理的樣品。疊加在一起的盤的形狀可以是透鏡狀。碳濾器內(nèi)的活性炭可 取自不同的原材料，例如，泥炭、褐煤、木頭或椰殼。本領(lǐng)域熟知的任何工藝，如蒸汽或化學(xué) 處理，都可用于制備活性炭。在本發(fā)明中，固定在基質(zhì)上的活性炭可以被放置在罩內(nèi)形成獨 立的濾器單位。每一個濾器單位都有自己的入口和出口，便于待純化樣品的出入?？捎糜?本發(fā)明的濾器單位的例子是庫諾股份有限公司(莫瑞頓，美國)(Cimo Inc. (Meriden,USA) 或派爾公司(東山，美國)(Pall Corporation (East Hill, USA))的碳柱。
更特別的是，本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)庫諾ζ碳濾器(CUNO zetacarbon filters)適 用于本發(fā)明。這些碳濾器包含纖維素基質(zhì)，活性炭粉末被摻入其中并且和樹脂原位結(jié)合。本發(fā)明這個方面的方法所用的起始材料可以是下文“起始材料”部分所描述的起 始材料中的一種。另外，方法還可以包含下文“醇沉淀和陽離子交換”、“透析過濾”、“再N乙 ?；?、“進(jìn)一步透析過濾”、“結(jié)合物制備”和/或“其他步驟”部分所描述的一個或多個步驟。 因此，步驟的順序一般如下i) “醇沉淀和陽離子交換”部分所描述的步驟；ii) “透析過濾” 部分所描述的步驟；iii)使用上述附著濾器過濾的步驟；iv) “再N乙酰化”部分所描述的 步驟；以及ν) “進(jìn)一步透析過濾”部分所描述的步驟。這個過程之后是“結(jié)合物制備”部分 所描述的步驟。最后，這個過程是“其他步驟”部分所描述的步驟。另外，方法還可以包含下文“陽離子去污劑處理”和“再增溶”部分所描述的一個或 多個步驟，盡管在本發(fā)明的方法中使用附著濾器進(jìn)行過濾時通常不再需要通過陽離子去污 劑處理來沉淀莢膜多糖以及隨后再增溶多糖，因而常常省卻這些步驟。相應(yīng)的，本發(fā)明特別 優(yōu)選的純化莢膜多糖，一般是從無乳鏈球菌中，的方法包括使用附著濾器過濾的步驟，其中 方法不包括陽離子去污劑處理以沉淀莢膜多糖的步驟以及隨后的再增溶莢膜多糖的步驟。本發(fā)明還提供了從鏈球菌中純化莢膜多糖(cps)的方法，也是生產(chǎn)規(guī)模的。優(yōu)選 的鏈球菌菌種是無乳鏈球菌，也被稱作蘭斯菲爾德B型鏈球菌(Lancefield' s Group B Streptococcus)或 GBS，尤其是菌株 090、H36b、CBJlll 或 M781。在一個優(yōu)選實施方式中，生產(chǎn)純化的莢膜多糖的方法包括如下步驟中的一個或多 個(a)提供包含莢膜多糖的粗分離物；(b)去除因粗分離物與醇溶液接觸而形成的醇沉淀 物；(c)過濾去除小分子化合物而保留莢膜多糖；以及(d)利用蛋白質(zhì)附著濾器去除蛋白質(zhì) 污染物，生產(chǎn)出純化的莢膜多糖。在一個優(yōu)選實施方式中，方法包括上述所有步驟。在一個 更優(yōu)選的實施方式中，方法省卻了去污劑沉淀。在某些實施方式中，可以執(zhí)行一個或多個附加步驟，其中包括(e)再N乙?；兓?的莢膜多糖，(f)沉淀純化的莢膜多糖；和/或(g)以莢膜多糖為一種組分制備疫苗。在某些實施方式中，醇溶液添加的濃度到足以沉淀核酸污染物而不沉淀莢膜多糖 的程度。在一個優(yōu)選實施方式中，醇是酒精，添加的濃度優(yōu)選在約10%到50%酒精之間，更 優(yōu)選的濃度是約30%酒精?？蛇x的是，醇溶液可包含陽離子，優(yōu)選金屬陽離子，更優(yōu)選的是 二價陽離子，最優(yōu)選的是鈣。在某些實施方式中，蛋白質(zhì)附著濾器是活性炭濾器。附圖簡述

圖1顯示的是作為潛在GBS疫苗靶位的莢膜多糖。圖2是連接莢膜多糖(cps)與GBS B型糖類的推薦模式的示意圖。圖3A顯示的是來自于Ia型和Ib型的GBS血清型特異性cps的分子結(jié)構(gòu)。圖3B顯示的是來自于III型和V型的GBS血清型特異性cps的分子結(jié)構(gòu)。圖4顯示的是抗GBS的糖結(jié)合疫苗的生產(chǎn)工藝。圖5A-D顯示的是(A)菌株090、(B)H36b菌株、(C)M781菌株和(D) CJBlll菌株的 生長曲線和培養(yǎng)基PH。比生長速率用OD值計算，范圍在0. 1-2. 4之間。圖6顯示的是(A)090菌株的生長曲線，(B)090菌株的cps濃度，以及(C)每克細(xì) 胞干重所產(chǎn)生的CPS產(chǎn)量，其中確定了氫氧化鈉和甲醇中含生物素和四種維生素；水中含生物素和三種維生素，不含核黃素；只含生物素；以及不含維生素條件下的生長速率。圖7顯示的是(A)H36b菌株的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，以及(C)每克 細(xì)胞干重所產(chǎn)生的CPS產(chǎn)量，其中確定了氫氧化鈉和甲醇中含生物素和四種維生素；水中 含生物素和三種維生素，不含核黃素；以及只含生物素條件下的生長速率。圖8顯示的是(A)M781菌株的生長曲線，(B)M781菌株的cps濃度，以及(C)每克 細(xì)胞干重所產(chǎn)生的CPS產(chǎn)量，其中確定了氫氧化鈉和甲醇中含生物素和四種維生素；水中 含生物素和三種維生素，不含核黃素；以及只含生物素條件下的生長速率。圖9顯示的是CJBlll菌株的生長曲線，CJBlll菌株的cps濃度，以及每克細(xì)胞干 重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量，其中確定了只含生物素條件下的生長速率。圖10顯示的是(A)090菌株的生長曲線，(B)090菌株的cps濃度，以及(C)每克 細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量，其中確定了分批進(jìn)料技術(shù)；在OD水平為3和5時瞬時添加酵 母提取物，然后線性添加葡萄糖；以及在一批培養(yǎng)基中添加上全部酵母提取物，然后線性添 加葡萄糖條件下的生長速率。圖11顯示的是㈧H36b菌株的生長曲線，⑶H36b菌株的cps濃度，以及(C)每 克細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量，其中確定了分批進(jìn)料技術(shù)；在OD水平為3和5時瞬時添加 酵母提取物，然后線性添加葡萄糖；以及在一批培養(yǎng)基中添加上全部酵母提取物，然后線性 添加葡萄糖條件下的生長速率。圖12顯示的是(A)M781菌株的生長曲線，(B)M781菌株的cps濃度，以及(C)每 克細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量，其中確定了分批進(jìn)料技術(shù)；在OD水平為3和5時瞬時添加 酵母提取物，然后線性添加葡萄糖；以及在一批培養(yǎng)基中添加上全部酵母提取物，然后線性 添加葡萄糖條件下的生長速率。圖13顯示的是CJBlll菌株的生長曲線，CJBlll菌株的cps濃度，以及每克細(xì)胞 干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量，其中確定了在OD水平為3和5時瞬時添加酵母提取物，然后線性 添加葡萄糖時的生長速率。圖14提供的是DOT試驗的結(jié)果，該結(jié)果顯示仏)15%、30%和60%的!13613菌株的 生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量以及(D)H36b菌 株的平均生產(chǎn)力。圖15提供的是溫度試驗的結(jié)果，該結(jié)果顯示(A)H36b菌株在34°C、36°C和38°C條 件下的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量以及(D) H36b菌株的平均生產(chǎn)力。圖16提供的是pH試驗的結(jié)果，該結(jié)果顯示(A) H36b菌株在7.0、73和7. 5條件下 的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量以及(D)H36b 菌株的平均生產(chǎn)力。圖17提供的是壓力試驗的結(jié)果，該結(jié)果顯示(A)H36b菌株在0. 2和0. 5巴條件下 的生長曲線，(B)H36b菌株的cps濃度，(C)每克細(xì)胞干重所產(chǎn)生的cps產(chǎn)量以及(D)H36b 菌株的平均生產(chǎn)力。圖18顯示的是M781菌株在(A)內(nèi)含IOOml化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(0. Iml w. s.) 的500ml錐形瓶，以及(B) 2L發(fā)酵罐中的生長曲線。比生長速率用OD值計算，范圍為 0. 1-0. 7。
11
圖19顯示的是如下條件下M781點圖形式的生長曲線以及柱圖形式的葡萄糖消耗 量標(biāo)準(zhǔn)批培養(yǎng)基；10倍量的維生素；10倍量的氨基酸和維生素；以及10倍量的維生素、氨 基酸和鈣。圖20顯示的是確定成分培養(yǎng)基中去除丙氨酸、天冬氨酸和脯氨酸對菌株M781的 GBS生長的影響。圖21顯示的是確定成分培養(yǎng)基中去除生物素、鹽酸吡哆醇、核黃素和硫胺素對菌 株M781的GBS生長的影響。圖22顯示的是3株細(xì)菌M781、H36b和090在第一輪實驗室規(guī)模的預(yù)發(fā)酵試驗中 的OD59tlnm模式。圖23顯示的是4株細(xì)菌M781、H36b、090和CJBlll在使用簡化工藝的第二輪預(yù)發(fā)
酵試驗中的OD59tlnm模式。第一次簡化是從維生素溶液中去除硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇和 煙酰胺。第二次簡化是調(diào)整發(fā)酵期間進(jìn)料相的參數(shù)。圖24顯示的是4株細(xì)菌M781、H36b、090和CJBlll在實驗性發(fā)酵輪次中的OD59tlnm 模式。圖25顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS Ia型多糖的1H NMR光譜。光譜中鑒 定了某些氫鍵。圖26顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS Ib型多糖的1H NMR光譜。光譜中鑒 定了某些氫鍵。圖27顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS III型多糖的1H NMR光譜。光譜中鑒 定了某些氫鍵。圖28顯示的是在25°C下記錄的純化的GBS V型多糖的1H匪R光譜。光譜中鑒定 了某些氫鍵。圖29顯示的是多糖樣品和0. 5 μ g/ml的唾液酸標(biāo)準(zhǔn)品(灰線)洗脫模式的重疊。圖30顯示的是多糖樣品和添加鼠李糖的多糖樣品(灰線)洗脫模式的重疊。優(yōu)選實施方式詳述本發(fā)明的發(fā)明者發(fā)現(xiàn)利用補(bǔ)料分批培養(yǎng)任何鏈球菌菌株都可以獲得生產(chǎn)規(guī)模的 高cps產(chǎn)率，這種培養(yǎng)方式是首先將細(xì)胞接種到有限體積的新鮮培養(yǎng)基內(nèi)，細(xì)胞生長以后 一次性收獲培養(yǎng)物來終止培養(yǎng)，最初添加的營養(yǎng)素在耗竭以后再額外添加營養(yǎng)素。如此高 的產(chǎn)率與利用連續(xù)培養(yǎng)所得的產(chǎn)率相當(dāng)，甚至更高。另外，本文所公開的方法不容易出現(xiàn)連 續(xù)培養(yǎng)所產(chǎn)生的穩(wěn)定性和污染問題。發(fā)明者還開發(fā)出了一種優(yōu)化純化方法，該方法在使過 程簡化和降低生產(chǎn)規(guī)模的成本的同時還能夠明顯改善不純度。本說明書提供了培養(yǎng)鏈球菌的工藝，其中鏈球菌以補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)。鏈 球菌的某些菌株被認(rèn)為是cps的“不良生產(chǎn)者”，因為它們在培養(yǎng)時產(chǎn)生的cps水平通常都 很低。這種不良生產(chǎn)者的例子包括GBS菌株DK21和2603。但是，利用本文所公開的方法， 即使這些被認(rèn)為只能產(chǎn)生低水平cps的菌株也能生產(chǎn)出高水平的cps。因此，本發(fā)明提供了 提高鏈球菌菌株的cps產(chǎn)率的工藝，該工藝包括以補(bǔ)料分批培養(yǎng)的方式培養(yǎng)鏈球菌，其中 在分批或連續(xù)培養(yǎng)條件下，“不良生產(chǎn)者”菌株只能生產(chǎn)出低于30mg/gmw或低于10mg/gmw 的 cpsO優(yōu)選的是，本發(fā)明提供了一種補(bǔ)料分批培養(yǎng)鏈球菌的方法，其中可以生產(chǎn)出高產(chǎn)
12率的cps。對于不良生產(chǎn)者來說，cps的優(yōu)選產(chǎn)率為10mg/geDW或更高(優(yōu)選15、20、25、30 或更高)，對于其他菌株來說，cps的優(yōu)選產(chǎn)率為30mg/geDW (優(yōu)選40、50、60、70、80、90、100、 110、120、130、140、150、160、170、180、190、200 或更高)。優(yōu)選的是，培養(yǎng)基內(nèi)的 cps 產(chǎn)率 為 10mg/L 或更高(例如，20、30、40、50、60、70、80、90、100、120、140、160、180、200、220、240、 260、280、300或更高)。更優(yōu)選的是，培養(yǎng)基內(nèi)的cps產(chǎn)率為50mg/L或更高(例如，150、 200、250、300、350、400、450、500、550、600、650或更高)。因此，與連續(xù)培養(yǎng)相比，本發(fā)明可 以是CPS的產(chǎn)率提高到更高的產(chǎn)率/單位體積的水平。在某些情況下，單位體積的產(chǎn)量至 少是連續(xù)培養(yǎng)所得到的量的兩倍，更優(yōu)選的是連續(xù)培養(yǎng)所得到的量的2. 5倍或3倍。本發(fā)明還提供了通過發(fā)酵培養(yǎng)鏈球菌菌株的方法，該方法包括兩次瞬時添加酵母 提取物，然后線性添加碳源，優(yōu)選不用算法來檢測PH。線性添加的碳源優(yōu)選葡萄糖。每一次 添加都在指定的OD水平時開始，該時間點是經(jīng)過選擇的，通過調(diào)節(jié)細(xì)菌的生長速率可以達(dá) 到較高的cps體積產(chǎn)量，使微生物適應(yīng)生成最大血清型特異性的cps。在一個實施方式中，第一次瞬時添加酵母提取物是從2. 8-3. 2的OD水平開始的， 優(yōu)選約3. 0。在另一實施方式中，第二次瞬時添加酵母提取物是從4. 3-4. 7的OD水平開始 的，優(yōu)選約4. 5。在另一實施方式中，線性添加碳源是從9. 8-10. 0的OD水平開始的，優(yōu)選約 10?？傊€性添加碳源與以前復(fù)雜的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝相比是一個進(jìn)步，因為后者 需要利用算法通過監(jiān)測培養(yǎng)基的PH來控制培養(yǎng)。培養(yǎng)以后，細(xì)菌需要經(jīng)過進(jìn)一步的處理步驟來純化cps并將其連接到載體蛋白 上。因此本發(fā)明還包括從細(xì)菌純化cps的步驟以及將莢膜多糖連接到載體蛋白上形成蛋白 質(zhì)-多糖連接物的步驟(參見圖1-2)。純化出的cps還需要進(jìn)一步處理以制備藥物制備 物。在優(yōu)選實施方式中，純化是用本文所描述的改良純化方法完成。鏈球菌術(shù)語“鏈球菌”是指選自無乳鏈球菌(GBS)、釀膿鏈球菌(S. pyogenes) (GAS)、肺炎 鏈球菌(S. pneumoniae)(肺炎球菌)和變異鏈球菌的細(xì)菌。鏈球菌還可以是嗜熱鏈球菌或 乳酸鏈球菌。優(yōu)選的鏈球菌是GBS，優(yōu)選的血清型是la、Ib、3、4或5。優(yōu)選的GBS菌株是 090(Ia)、7357(Ib)、H36b(Ib)、DK21(2)、M781(3)、2603(5)或 CJBlll (5)。參見圖 3A-B。如 果使用的鏈球菌是肺炎鏈球菌，那么優(yōu)選的血清型是4、6B、9V、14、18C、19F和23F中的一種 或多種，或者全部。血清型1也是優(yōu)選的。優(yōu)選的血清型是1、3、4、5、68、7 、抓、14、18(、19 和23F中的一種或多種，或者全部。另外，使用本發(fā)明的方法生產(chǎn)出的培養(yǎng)物可以是勻質(zhì)的(S卩，由單一物種或鏈球 菌菌株組成)，或者是異質(zhì)的(即，包含兩種或多種物種或鏈球菌菌株)。優(yōu)選的培養(yǎng)物是 勻質(zhì)的。所用的鏈球菌可以是野生型菌株，或者是經(jīng)過遺傳改造的。例如，經(jīng)過修飾后產(chǎn)生 非天然莢膜多糖或異源多糖，或者產(chǎn)率提高。生產(chǎn)工藝概述GBS的生產(chǎn)分為四個部分(1)通過發(fā)酵生產(chǎn)每一種cps及其原始回收；(2)微孔 過濾滲透物的純化；(3)干純化的cps的制劑制備；以及(4)糖結(jié)合物生物分子的特征鑒定。
第一步在中試規(guī)模的廠房內(nèi)進(jìn)行了優(yōu)化，包括通過發(fā)酵生產(chǎn)生物質(zhì)，生物質(zhì)的連 續(xù)流動離心，細(xì)胞團(tuán)(或細(xì)胞膏)的收集，微生物的滅活和cps的釋放，以及最后微孔過濾 細(xì)胞膏和收集滲透物。發(fā)酵包括(1)接種制備物，(2)發(fā)酵，生物質(zhì)的離心，細(xì)胞團(tuán)的化學(xué) 處理以及細(xì)胞團(tuán)的微孔過濾，如圖4所示。本發(fā)明提供了以生產(chǎn)規(guī)模生產(chǎn)cps的方法，該方法包括提供表達(dá)cps的鏈球菌菌 株接種物的方法以及通過發(fā)酵培養(yǎng)菌株的方法。培養(yǎng)包括監(jiān)測培養(yǎng)基的光密度(OD)，這樣 在OD達(dá)到指定加料水平時，向培養(yǎng)基中兩次瞬時添加酵母提取物，隨后線性添加碳源，這 樣就無需算法通過監(jiān)測培養(yǎng)基的PH來控制培養(yǎng)。接種物培養(yǎng)接種物的培養(yǎng)可在經(jīng)過121°C高壓滅菌的搖瓶內(nèi)完成。接種物包含復(fù)合培養(yǎng)基 (由酵母提取物、Na2HPO4. 2H20、NaH2P04. H2O以及天然pH約為7. 3的一水葡萄糖組成)、維生 素溶液(由硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇和煙酰胺組成，用NaOH稀釋)和生物素溶液。在優(yōu) 選實施方式中，省去了維生素溶液，只以生物素溶液作為維生素補(bǔ)充。在一個優(yōu)選實施方式中，每一個搖瓶接種2. 75 士 0. 25mL工作種子液。培養(yǎng)物在約 35°C振蕩培養(yǎng)，大約200rpm培養(yǎng)約4小時。此后通過測定590nm處的OD來評估生物質(zhì)的 濃度，進(jìn)行革蘭氏染色。如果OD59tlnm值在約0.6-1. 8之間，革蘭氏染色顯示只有革蘭氏陽性 球菌，那么將搖瓶的內(nèi)容物倒入與發(fā)酵罐的孵育管相連的熱滅菌的罐內(nèi)。在接種物制備期間，優(yōu)選的條件如下培養(yǎng)基初始PH為7. 3士0. 1，工作種子液的 體積為2. 5-3. Oml/瓶，孵育溫度為35 士 1°C，振蕩速度為200士 lOrpm。在搖瓶培養(yǎng)結(jié)束時， 最終OD59tlnm優(yōu)選在0. 6-1. 8之間，革蘭氏染色優(yōu)選只有革蘭氏陽性菌。在發(fā)酵罐內(nèi)，培養(yǎng)物 的純度優(yōu)選不含污染物。最后，孵育時間優(yōu)選3-5小時之間。補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝本發(fā)明提供了利用生產(chǎn)規(guī)模的補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝培養(yǎng)鏈球菌的改良方法(參見 圖6-18)。補(bǔ)料分批培養(yǎng)可以是固定體積的，也可以是可變體積的。對于固定體積的補(bǔ)料 分批培養(yǎng)來說，底物進(jìn)料量有限因此不會稀釋培養(yǎng)物(例如，利用濃縮的液體或氣體，或者 利用透析)。對于可變體積的補(bǔ)料分批培養(yǎng)來說，發(fā)酵期間的體積是變化的，因為有底物進(jìn) 料。對于300L發(fā)酵罐的發(fā)酵工藝來說，優(yōu)選條件如下培養(yǎng)溫度設(shè)定在36士 1 °C，發(fā)酵 罐內(nèi)的余壓設(shè)定在約0. 2巴，pH設(shè)定在7. 3士0. 1，用4M NaOH調(diào)節(jié)pH，初始攪拌速度設(shè)定 在50rpm，初始空氣流設(shè)定在20升/分(L/min)，發(fā)酵罐內(nèi)的泡沫水平通過肉眼監(jiān)測，需要 時用消泡劑PPG2500調(diào)節(jié)，溶解氧張力(DOT)設(shè)定在30%，通過攪拌(50_350rpm之間)、空 氣流(20-100L/min之間)和氧氣流(O-lOOL/min之間)逐級調(diào)節(jié)。本發(fā)明提供了在指定OD水平上向培養(yǎng)基中兩次瞬時添加酵母提取物，隨后線性 添加碳源。在發(fā)酵的批期以及接種后2小時采樣，測定0D59(tam。每15分鐘采集一次樣品，直 到OD59tlnm達(dá)到3，在這個時間點利用150g/L的酵母提取物溶液開始首次瞬時添加。首次添 加后約45分鐘，再次測定0D59(tam。每15分鐘采集一次樣品，直到OD59tlnm達(dá)到5，在這個時間 點利用150g/L的酵母提取物溶液開始第二次瞬時添加。當(dāng)OD59tlnm達(dá)到10-12時開始線性 添加。在線性添加期間，每小時采樣一次測定0D59(tam。線性添加持續(xù)約3小時，此時停止參 數(shù)的自動控制。攪拌速度調(diào)節(jié)到IOOrpm，穩(wěn)定設(shè)定在30°C。
14
牛長培養(yǎng)基適用于維持鏈球菌生長的任何類型的液體生長培養(yǎng)基都可以使用。優(yōu)選的培養(yǎng)基 包括復(fù)合培養(yǎng)基，如哥倫比亞肉湯(Columbia broth)、LB、托德-哈維特(Todd-Hewitt)、 OC培養(yǎng)基、血肉湯或腦-心浸液；半確定成分培養(yǎng)基如MCDM ；用于鏈球菌的化學(xué)成分確定 培養(yǎng)基如M1、MC、FMC(參考文獻(xiàn)11)或C-48(參考文獻(xiàn)12)；以及用于培養(yǎng)真核細(xì)胞系的包 含必須營養(yǎng)缺陷組分的組合培養(yǎng)基如RPMI、耗竭培養(yǎng)基(spent medium)、麥克伊氏培養(yǎng)基 (McCoy' s)和伊格爾氏培養(yǎng)基(Eagle' s)。典型的生長培養(yǎng)基包含酵母提取物以及生長 所需的其他因子，其中包括脂質(zhì)(長鏈脂肪酸如亞油酸或油酸)、類固醇(如膽固醇)、嘌呤 和嘧啶、礦物質(zhì)、維生素和生長因子、氨基酸(L-和/或D-型)和/或化學(xué)元素或無機(jī)離子 (如Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、P和/或Zn)。通過增加培養(yǎng)基的濃度可以達(dá)到更高的0D， 獲得更高的cps體積產(chǎn)量。相應(yīng)的，用于培養(yǎng)鏈球菌的復(fù)合培養(yǎng)基優(yōu)選包含酵母提取物、磷 酸鹽源、碳源、維生素源以及可選的氨基酸源，其中維生素源由生物素以及可選的選自煙酰 胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇中的一種或多種維生素組成。用于培養(yǎng)鏈球菌的化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基優(yōu)選包含磷酸鹽源、礦物質(zhì)源、碳源、維 生素源和氨基酸源，其中維生素源由泛酸鈣、煙酰胺和選自生物素、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽 酸吡哆醇和葉酸的一種或多種維生素組成。生長培養(yǎng)基還可以包含一種或多種抗生素和消泡劑?？股赝ǔ０敲顾亍?氨芐青霉素和四環(huán)素?？股乜捎糜诋a(chǎn)生選擇壓力以便于篩選出包含抗生素耐藥基因的特 殊細(xì)菌和/或篩選出革蘭氏陽性細(xì)菌(例如，鏈球菌)。因此，抗生素可用于維持表達(dá)理想 CPS的細(xì)菌的篩選壓力。例如，抗生素氨曲南可有效抑制革蘭氏陰性細(xì)菌，但是對革蘭氏陽 性細(xì)菌無效。消泡劑是本領(lǐng)域熟知的，其中包括礦物油、醫(yī)用油、聚硅氧烷甘油共聚物、硅酮 化合物和乳化劑、烷氧基化的化合物、礦物油/合成混合物、甘油/酯混合物等。培養(yǎng)物中還可以添加促生長的各種其他因子，如脂質(zhì)(例如，長鏈脂肪酸如亞油 酸或油酸)、類固醇(如膽固醇)、嘌呤和嘧啶、礦物質(zhì)、維生素和生長因子、氨基酸(L-和/ 或D-型)和/或化學(xué)元素或無機(jī)離子(如Fe、K、Mg、Mn、Ca、Co、Cu、P和/或Zn)。如果生長培養(yǎng)基包含動物來源的添加劑如牛血清白蛋白，這些添加劑應(yīng)當(dāng)來自于 無傳播性海綿狀腦病的動物，這樣才能避免污染培養(yǎng)基和最后的cps。碳源所用碳源的類型不是關(guān)鍵因素。優(yōu)選的初級碳源選自如下一組葡萄糖、果糖、蔗 糖、麥芽糊精、淀粉、菊糖、甘油、蔬菜油如豆油、烴類、醇如甲醇和乙醇、有機(jī)酸如乙酸。更優(yōu) 選的碳源選自葡萄糖、甘油、乳糖、果糖、蔗糖和豆油。術(shù)語“葡萄糖”包括葡萄糖漿，即，包含 葡萄糖寡聚物的葡萄糖組合物。碳源可以固體或液體的形式添加到培養(yǎng)物中。優(yōu)選的是， 碳源的添加是可控的，這樣可避免對細(xì)胞產(chǎn)生滲透性應(yīng)激，導(dǎo)致過量進(jìn)料。一般通過不將發(fā) 酵期間所需的全部碳源都加入到初始批培養(yǎng)物中來控制。碳源的添加需要控制的另一個原 因是避免耗竭，導(dǎo)致生長受限和色素產(chǎn)生(參考文獻(xiàn)13)。氮源所有氮源的類型不是關(guān)鍵因素。優(yōu)選的氮源選自尿素氨水、銨鹽(如硫酸銨、磷 酸銨、氯化銨和硝酸銨)、其他硝酸鹽、氨基酸如谷氨酸和賴氨酸、酵母提取物、酵母自溶產(chǎn) 物、酵母氨基酸氮源、蛋白質(zhì)水解產(chǎn)物(其中包括而不限于胨類、酪蛋白水解產(chǎn)物如胰蛋白胨和酪蛋白氨基酸)、大豆粉、Hy-Soy、胰蛋白酶大豆肉湯、棉籽粉、麥芽提取物、玉米漿和糖 蜜。更優(yōu)選的氮源選自氨水、硫酸銨、氯化銨和磷酸銨。最優(yōu)選的氮源是氨水。使用氨水作 為氮源的優(yōu)點在于添加的氨水還可以作為PH控制劑。如果使用硫酸銨和/或磷酸銨作為氮源，那么至少可以滿足微生物的一部分硫和 /或磷需求。磷源如上所述，磷可以添加到生長培養(yǎng)基中。磷可以是鹽的形式，尤其是以磷酸鹽(如 上述磷酸銨)或多聚磷酸鹽的形式添加。如果使用多聚磷酸鹽，那么可以使用磷酸鹽晶體， 如多聚磷酸鈉(參考文獻(xiàn)14)。這種磷酸鹽晶體是可用的，因為它們的溶解特性很高，這樣 就可以制備出濃縮的營養(yǎng)培養(yǎng)基而不會在混合時產(chǎn)生沉淀。其他變量培養(yǎng)物的溫度維持在30-45°C之間(例如，31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、 42、43、44°C)。優(yōu)選的溫度約為36°C。因此，必須加熱或冷卻含培養(yǎng)物的容器以確保培養(yǎng) 物的溫度保持恒定。溫度可用于控制倍增時間(td)，因此，對于一個給定的培養(yǎng)工藝來說， 不同相的溫度可以是不同的(即，分批相、分批進(jìn)料相和碳源進(jìn)料相)。培養(yǎng)物的氧飼可以是受控的?？梢钥諝?、富集氧、純氧或其任意組合的形式供應(yīng) 氧。監(jiān)測氧濃度的方法是本領(lǐng)域熟知的。氧可以某種進(jìn)料速率供應(yīng)，或者根據(jù)培養(yǎng)物溶氧 含量的測定結(jié)果，按照維持溶氧含量恒定的要求供氧。攪拌或換氣速率也可以是受控的。這樣可確保營養(yǎng)物和氧被轉(zhuǎn)移到包含培養(yǎng)物的 生物反應(yīng)器各處。營養(yǎng)物溶液和細(xì)胞個體之間的相對速率應(yīng)該在0.5m/sec左右(例如， 0. 1、0· 2、0· 3、0· 4、0· 5、0· 6、0· 7、0· 8、0· 9 或 1. Os)。如上所述，可以通過添加酸或堿來控制培養(yǎng)物的pH。在培養(yǎng)期間當(dāng)pH下降時優(yōu)選 加堿。合適的堿的例子包括NaOH和ΝΗ40Η。所有這些變量都可以通過計算機(jī)、計算機(jī)輔助裝置或上述控制算法來控制。這些 變量的改變可用于控制培養(yǎng)物的倍增時間。多糖制備從細(xì)菌中制備莢膜多糖的方法是本領(lǐng)域熟知的，例如，參見參考文獻(xiàn)15、16、17 等。對于GBS來說，可以使用下列方法(也可參見參考文獻(xiàn)18)。更具體地說，可以使用本 發(fā)明的純化莢膜多糖的方法。如上所述，本發(fā)明的這些方法包括如下步驟中的一個或多個。起始材料一般而言，在細(xì)菌生長期間有少量莢膜多糖釋放到培養(yǎng)基中，因此起始材料可以 是細(xì)菌培養(yǎng)物離心后的上清液。然而更常見的是通過處理有莢膜的細(xì)菌本身(或者包含細(xì) 菌肽多糖的材料)來制備起始材料，這樣結(jié)可以釋放出莢膜多糖?？梢酝ㄟ^各種方法使細(xì) 菌釋放出cps，其中包括化學(xué)的、物理的或酶催化的處理方法。因此，可在初始蛋白質(zhì)/核酸 沉淀反應(yīng)前處理多糖的水性制備物。典型的化學(xué)處理方法是堿提取(參考文獻(xiàn)19)(例如，使用氫氧化鈉)，該方法可裂 解莢膜多糖與肽多糖骨架之間的磷酸二酯連接。但是，在通過堿處理使莢膜多糖去N乙酰 化時，隨后必須進(jìn)行再N乙酰化。典型的酶催化處理方法包括使用變?nèi)芫睾挺?-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(參考文
16獻(xiàn)20)。這些物質(zhì)可作用于細(xì)菌的肽多糖，使其釋放出可用于本發(fā)明的莢膜多糖，但是也會 導(dǎo)致型特異性的糖類抗原的釋放。另一種酶催化處理方法包括用II型磷酸二酯酶(0DE2) 處理。PED2與氫氧化鈉一樣可裂解磷酸鹽(見上)，釋放出莢膜多糖，但是不會裂解型特異 性的糖類抗原，也不會導(dǎo)致莢膜多糖去N乙?；?，因此簡化了下游步驟。因此PDE2酶是制 備莢膜多糖的優(yōu)選選項?？捎糜诒景l(fā)明的工藝的優(yōu)選起始材料是去N乙酰化的莢膜多糖，可通過US 6248570所述的堿提取方法獲得(參考文獻(xiàn)19)。另一種優(yōu)選的起始材料是PDE2處理鏈球 菌后的產(chǎn)物?？稍谏鲜龀恋砬皩⑦@種材料濃縮(例如，超濾)。起始材料可以經(jīng)過醇沉淀去除污染的蛋白質(zhì)和/或核酸，如下文所述。醇沉淀和陽離子交換培養(yǎng)后獲得的鏈球菌莢膜多糖通常都是不純的，包含細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)污染物。 這些污染物可通過用RNA酶、DNA酶和蛋白酶順序過夜處理來去除。但是，一種優(yōu)選選項不 用酶催化去除污染物，而是通過醇沉淀方法。如果需要(例如，堿提取后)，材料在沉淀前通 常需要中和。用于沉淀污染的核酸和/或蛋白質(zhì)的醇優(yōu)選低聚醇，如甲醇、乙醇、1-丙醇、2-丙 醇、1-丁醇、2-丁醇、2-甲基-1-丙醇、2-甲基-2-丙醇、二元醇等。根據(jù)經(jīng)驗就可以選擇 出合適的醇，無需過多試驗，但是醇如乙醇和異丙醇(2-丙醇)是優(yōu)選的，而不是醇如苯酚。醇優(yōu)選添加到多糖懸液中，終濃度在10%到50%之間(例如，30%左右)。最有用 的濃度是能夠使污染物完全沉淀而不會使多糖沉淀的濃度。醇的最佳終濃度要根據(jù)提取多 糖的細(xì)菌血清型而定，無需過多負(fù)擔(dān)只需常規(guī)試驗就可確定。在乙醇濃度超過50%時可以 觀察到多糖沉淀。添加的醇可以是純的，也可以是用易混合溶劑稀釋的形式(例如，水)。優(yōu)選的 容積混合物是乙醇水混合物，優(yōu)選比例在約70 30到約95 5之間(例如，75 25、 80 20,90 10)。糖類還可以用水性金屬陽離子處理。優(yōu)選單價和二價金屬陽離子，二價陽離子更 優(yōu)選，如Mg、Mn、Ca等，因為它們能更有效地形成復(fù)合物。鈣離子是特別優(yōu)選的，因此醇混合 物優(yōu)選包含可溶性的鈣離子。可以鈣鹽的形式添加到糖類/醇混合物中，以固體或水溶液 的形式。優(yōu)選通過使用氯化鈣來提供鈣離子。鈣離子的優(yōu)選濃度在10到500mM之間(例如，約0. 1M)。鈣離子的最佳終濃度要 根據(jù)獲取多糖的鏈球菌菌株和血清型而定，無需過多負(fù)擔(dān)只需常規(guī)試驗就可確定。污染的蛋白質(zhì)和/核酸經(jīng)過醇沉淀以后溶液中只剩下莢膜多糖。通過任何合適的 方式都可以將沉淀的材料從多糖中分離出來，例如離心。上清液經(jīng)過微孔過濾，特別是死端 式過濾(垂直過濾)去除可能會在下面的步驟中阻塞濾器的顆粒(例如，直徑超過0. 22ym 的沉淀顆粒)。作為死端式過濾的另一種選項，可以使用正切微孔過濾。例如，使用0.2μπι 纖維素膜進(jìn)行正切微孔過濾。正切微孔過濾步驟后通常是利用0. 45/0. 2 μ m的濾器進(jìn)行過 濾ο透析過濾可以使用透析過濾步驟。例如，如果方法中包括上述的醇沉淀和陽離子交換，那么 這個步驟可在沉淀蛋白質(zhì)和/或核酸后進(jìn)行。同樣，如果方法中包括下述的陽離子去污劑處理的步驟，那么這個透析過濾步驟可在去污劑介導(dǎo)的沉淀前進(jìn)行。在包括利用附著濾器 進(jìn)行過濾的本發(fā)明的方法中，例如，利用蛋白質(zhì)附著濾器進(jìn)行過濾，這個透析過濾步驟可在 該過濾之前進(jìn)行。一般來說，透析過濾步驟在沉淀蛋白質(zhì)和/或核酸之后以及去污劑介導(dǎo) 的沉淀或使用附著濾器進(jìn)行過濾，如蛋白質(zhì)附著濾器，之前使用。如果使用堿提取或磷酸二酯酶來釋放莢膜多糖，那么透析過濾步驟尤其有優(yōu)勢， 因為型特異性的糖類也可以被水解，形成比完整莢膜多糖小很多的片段。這些小片段可通 過透析過濾步驟去除。正切流過濾是典型方法。因此濾膜應(yīng)該是能夠允許型-特異性抗原的水解產(chǎn)物通 過而保留莢膜多糖的濾膜。截留值范圍通常為10kDa-30kDa。也可以使用更小的截留值，因 為型特異性抗原的水解片段通常在IKDa左右(5聚、8聚和11聚糖)，但是更高的截留值更 有利于去除污染物而不會導(dǎo)致莢膜多糖的丟失。一般要進(jìn)行至少5個循環(huán)的正切流透析過濾，例如，6、7、8、9、10、11或更多個循 環(huán)。一般來說，要進(jìn)行兩個循環(huán)的正切流透析過濾。在第一和第二個循環(huán)之間，第一透析 過濾循環(huán)的保留物可用乙酸/乙酸鈉溶液處理。得到的懸液通過過濾去除沉淀物，例如用 0. 45 μ m的濾膜。懸液還可以用或者再用0. 2 μ m的濾膜過濾。透析過濾之后還可以用0. 45/0. 2 μ m的濾膜進(jìn)一步過濾。陽離子去污劑處理沉淀可溶性多糖的許多技術(shù)都是本領(lǐng)域熟知的?？蛇x的是，可以利用一種或多種 陽離子去污劑沉淀糖類，盡管優(yōu)選的純化實施方式不用去污劑沉淀。用陽離子去污劑處理 莢膜多糖和型特異性糖類的混合物會導(dǎo)致莢膜多糖優(yōu)先沉淀，因而可以方便和有效地使型 特異性糖類的污染達(dá)到最小化?？捎糜诒景l(fā)明工藝的特別優(yōu)選的去污劑是四丁銨和十六烷基三甲基銨硝酸鹽 (例如，氫溴酸鹽)。溴化十六烷基三甲銨(CTAB)是特別優(yōu)選的(參考文獻(xiàn)21)。CTAB也 被稱作十六烷基三甲基銨溴化物、西曲溴銨、溴棕三甲銨和森替麥德(Centimide)。其他去 污劑包括海美溴銨和十四烷基三甲銨鹽。去污劑介導(dǎo)的沉淀步驟優(yōu)選用于莢膜多糖。優(yōu)選的是，可選的去污劑沉淀步驟使用與糖類中的唾液酸殘基相互作用，例如，通 過唾液酸的羧基，的去污劑如CTAB。因此，去污劑優(yōu)先沉淀含唾液酸的莢膜多糖，特別是混 合物中較長的糖類，這樣可以是糖類的污染達(dá)到最小化，在較早的處理步驟中具有抗原重 要性的唾液酸可能已被破壞。再增溶當(dāng)使用可選的去污劑沉淀步驟時，多糖(通常是和陽離子去污劑形成復(fù)合物的 形式)可以被再增溶，在水性介質(zhì)或醇性介質(zhì)中。對于水性再增溶作用來說，沉淀物中的 CM—陽離子通常被金屬陽離子所取代；對于醇性再增溶來說，CM—陽離子通常得以保留。選 擇水性或醇性再增溶取決于獲取多糖的GBS血清型以及該階段依然存在的污染物。例如， 沉淀團(tuán)中有時會存在色素，通過醇再增溶作用然后通過碳過濾可將其有效去除。用于再增溶的典型水性介質(zhì)包含金屬陽離子。優(yōu)選單價和二價陽離子，但是更優(yōu) 選的是二價陽離子，如Mn、Ca等。鈣離子是特別有用的，因此再增溶優(yōu)選使用鈣，通過添加 氯化鈣來提供。鈣濃度優(yōu)選在10到500mM之間(例如，約0. 1M)。鈣離子的最佳終濃度要
18根據(jù)獲取多糖的鏈球菌血清型而定，無需過多負(fù)擔(dān)只需常規(guī)試驗就可確定。用于再增溶的典型醇性介質(zhì)是基于乙醇制備的。可以使用沉淀核酸和/或蛋白質(zhì) 所用的相同的醇，但是沉淀莢膜多糖所需的濃度通常會稍高，例如，優(yōu)選醇的終濃度在70% 到95%之間(例如，70%、75%、80%、85%、90%或95%左右)。醇的最佳終濃度要根據(jù)獲 取多糖的鏈球菌血清型而定。為了達(dá)到較高的醇濃度，優(yōu)選添加含水量低的醇，例如，96% 的乙醇。再增溶作用一般在室溫下進(jìn)行。優(yōu)選避免酸性條件，再增溶作用通常發(fā)生在PH約 為7左右。再增溶的材料相對于沉淀前的懸液來說是經(jīng)過高度純化的。一種制備糖類的優(yōu)選方法包括沉淀多糖，然后利用上述低聚醇增溶沉淀的多糖。 再增溶以后，多糖還需要經(jīng)過進(jìn)一步處理以去除污染物。在即使是微量的污染物也不可接受的情況下(例如，用于生產(chǎn)人用疫苗)，這一點 是特別重要的。通常包括一個或多個過濾步驟，例如，深度過濾，通過活性炭過濾、尺寸過濾 和/或超濾。一旦通過過濾去除污染物以后，要將多糖沉淀以進(jìn)行下一步的處理和/或加 工。通過陽離子交換可以很容易地實現(xiàn)(例如，通過添加鈣鹽或鈉鹽)。利用附著濾器過濾在優(yōu)選實施方式中，莢膜多糖的純化還包括通過濾器過濾去除蛋白質(zhì)和/或DNA 污染物的步驟，例如，蛋白質(zhì)附著濾器，蛋白質(zhì)和/或DNA可粘附其上，但是莢膜多糖不會粘 附或只有弱的粘附。這種濾器的優(yōu)選例子是碳濾器。合適的粘附濾器如上所述。利用附著濾器過濾以后還可利用0. 45/0. 2 μ m濾膜進(jìn)行過濾。再N乙?；貼乙酰化的步驟可在，例如，使用附著濾器過濾以后進(jìn)行，或者再次過濾。如果 GBS莢膜多糖內(nèi)的唾液酸殘基已經(jīng)去N乙?；?，在上述堿處理期間，那么優(yōu)選進(jìn)行再N 乙?；?re-N-acetylation)。利用試劑如乙酸酐(CH3CO)2O，例如，溶于5%碳酸氫銨中，可 以很容易地完成受控的再N乙?；痆Wessels等，(1989) Infect Immun 57:1089-94]。再次透析過濾可以再進(jìn)行一次透析過濾步驟，例如，再N乙?；?。透析過濾可按照上述“透 析過濾”部分的描述完成。透析過濾之后再用0. 45/0. 2 μ m的濾膜過濾。終產(chǎn)物優(yōu)選的是，最后將多糖制備成干粉末的形式，用于連接。結(jié)合物制備培養(yǎng)細(xì)菌并制備出莢膜多糖以后，糖類可連接到載體蛋白上。一般來說，糖類與載 體的共價連接可增強(qiáng)糖類的免疫原性，因為可將其從T非依賴性抗原轉(zhuǎn)化成T依賴性抗原， 從而激發(fā)免疫記憶。結(jié)合物特別適用于兒科疫苗(例如，參考文獻(xiàn)22)，是大家熟知的技術(shù) (例如，參考文獻(xiàn)23-32的綜述)。優(yōu)選的載體蛋白是細(xì)菌毒素或類毒素，如白喉類毒素或破傷風(fēng)類毒素。白喉毒素 的CRM197變體(參考文獻(xiàn)32-34)是特別優(yōu)選的載體，如白喉類毒素一樣。其他合適的載 體蛋白包括腦膜炎奈瑟菌外膜蛋白(參考文獻(xiàn)35)、合成肽(參考文獻(xiàn)36，37)、熱休克蛋白(參考文獻(xiàn)38，39)、百日咳蛋白(參考文獻(xiàn)40，41)、細(xì)胞因子(參考文獻(xiàn)42)、淋巴因子(參 考文獻(xiàn)42)、激素(參考文獻(xiàn)42)、生長因子(參考文獻(xiàn)42)、包含各種病原體來源抗原的多 個人CD4T細(xì)胞表位的人工合成蛋白(參考文獻(xiàn)43)如參考文獻(xiàn)44)、流感嗜血桿菌的 蛋白質(zhì)D(參考文獻(xiàn)45，46)、肺炎球菌表面蛋白PspA(參考文獻(xiàn)47)、肺炎球菌溶血素(參 考文獻(xiàn)48)、離子攝取蛋白(參考文獻(xiàn)49)、艱難梭菌的毒素A或B (參考文獻(xiàn)50)、GBS蛋白 (見下文)(參考文獻(xiàn)51)等。與載體的連接優(yōu)選通過-NH2基團(tuán)，例如，載體蛋白賴氨酸殘 基或精氨酸殘基側(cè)鏈內(nèi)的-NH2基團(tuán)。如果糖類含有游離醛基，那么它可以和載體內(nèi)的氨基 反應(yīng)通過還原胺化作用形成結(jié)合物。這種結(jié)合物可通過還原胺化作用制備，參與的基團(tuán)有 糖類內(nèi)氧化的半乳糖(它可以形成醛基)和載體或連接子內(nèi)的氨基。連接還可以通過-SH 基團(tuán)，例如，半胱氨酸殘基側(cè)鏈內(nèi)的-SH基團(tuán)。使用多個載體蛋白也是可能的，例如，以便于降低載體抑制的風(fēng)險。因此，不同的 鏈球菌菌株或血清型可使用不同的載體蛋白，例如，GBS血清型Ia糖類可連接到CRM197上， 而血清型Ib糖類可連接到破傷風(fēng)類毒素上。一個特定的糖類抗原使用多個載體蛋白也是 可能的，例如，血清型III糖類可分成兩組，其中一些連接到CRM197上，而另一些連接到破 傷風(fēng)類毒素上。但是，通常優(yōu)選所有糖類使用相同的載體蛋白。一個載體蛋白可攜帶多個糖類抗原(參考文獻(xiàn)52，53)。例如，一個載體蛋白可連 接上來自于血清型Ia和Ib的糖類。為達(dá)到此目的，在連接反應(yīng)前可將不同的糖類混合在一 起。但是，通常優(yōu)選每一個血清型用不同的結(jié)合物，結(jié)合以后再將不同的糖類混合在一起。 不同的結(jié)合物可包含相同的載體。包含過量蛋白(例如，1 5)和過量糖類(例如，5 1)之間的糖類蛋白比例 (w/w)的結(jié)合物是優(yōu)選的。1 2到5 1之間的比例是優(yōu)選的，正如1 1.25到1 2.5 之間的比例一樣。1 1到4 1之間的比例也是優(yōu)選的。對于較長的糖鏈來說，通常是糖 類過量?？傊?，本發(fā)明提供了結(jié)合物，其中結(jié)合物包含連接到載體上的鏈球菌，優(yōu)選無乳鏈 球菌的莢膜多糖基序，其中糖類載體的比例至少為2:1。 組合物可包含少量游離載體。當(dāng)本發(fā)明的組合物中的給定載體蛋白既有游離的形 式也有結(jié)合的形式時，未結(jié)合形式占組合物內(nèi)載體蛋白總量的比例優(yōu)選不超過5 %，優(yōu)選重 量百分比低于2%。任何合適的結(jié)合反應(yīng)都可以利用，如果需要時可帶有合適的連接子。在結(jié)合前糖類通常被活化或功能化?；罨?，例如，氰化試劑如CDAP(例如， 1-氰-4- 二甲基氨吡啶四氟硼酸鹽)(參考文獻(xiàn)54，55等)。其他合適的技術(shù)利用碳二亞 胺、酰胼、活化酯、雙環(huán)庚烷、P-硝基苯甲酸、N-羥基琥珀酰亞胺、S-NHS、EDC和TSTU (也可 參見參考文獻(xiàn)29的前言部分)。通過連接基團(tuán)進(jìn)行連接可用任何已知的方法完成，例如，參考文獻(xiàn)56和57所描 述的方法。一種類型的連接是通過多糖的還原胺化作用，產(chǎn)生的氨基與脂肪酸連接基團(tuán)的 一個末端偶聯(lián)，然后將蛋白質(zhì)偶聯(lián)到脂肪酸連接基團(tuán)的另一個末端(參考文獻(xiàn)27，58，59)。 其他連接子包括B-丙酰胺基(參考文獻(xiàn)60)、硝基苯基-乙胺(參考文獻(xiàn)61)、鹵代酰鹵 (haloacyl halide)(參考文獻(xiàn)62)、糖苷鍵(參考文獻(xiàn)63)、6_氨基己酸(參考文獻(xiàn)64)、 ADH(參考文獻(xiàn)65)、C4到C12基序(參考文獻(xiàn)66)等。除了使用連接子之外，也可以直接連 接。與蛋白直接連接包括多糖氧化然后與蛋白發(fā)生還原胺化作用，例如，如參考文獻(xiàn)67和
2068所描述的。優(yōu)選的方法是，將氨基基團(tuán)引入到糖類中(例如，用-NH2取代末端=0基團(tuán))，然 后用脂肪二酯衍生化(例如，脂肪酸N-羥基琥珀酰亞胺二酯)，再和載體蛋白反應(yīng)。另一種 優(yōu)選的反應(yīng)利用CDAP活化蛋白質(zhì)D載體。結(jié)合以后，可將游離的糖類與結(jié)合的糖類分離。有許多合適的方法可用，其中包括 熟睡層析、正切超濾、透析過濾等(也可參見參考文獻(xiàn)69和70等)。當(dāng)本發(fā)明的組合物包含解聚的寡糖時，優(yōu)選在結(jié)合前完成解聚，例如，在糖類活化
、r -在一個優(yōu)選的結(jié)合方法中，糖類是與脂肪酸二酰胼反應(yīng)。對于血清群A來說，也可 以在這個階段添加碳二亞胺。這個反應(yīng)過后添加氰基硼氫化鈉。然后制備衍生出的糖類， 例如，通過超濾。隨后衍生出的糖類與載體蛋白混合(例如，與白喉類毒素混合)，添加碳二亞胺。 反應(yīng)過后回收結(jié)合物。其他步驟除了包括上述步驟以外，本發(fā)明的方法還可包括其他步驟。例如，本發(fā)明的方法可 包括從細(xì)菌中制備出莢膜多糖之后，在連接之前，解聚莢膜多糖的步驟。解聚可降低糖類的 長度，對GBS來說可能是不好的。對于鏈球菌來說，尤其是GBS，較長的糖類比較短的糖類更 具有免疫原性(參考文獻(xiàn)71)。結(jié)合以后，可以測定未結(jié)合載體蛋白的水平。一種測定方法是毛細(xì)管電泳(參考 文獻(xiàn)72)(例如，在游離溶液中)或膠束動電色譜(參考文獻(xiàn)73)。結(jié)合以后，可以測定未結(jié)合糖類的水平。一種測定方法是HPAEC-PAD(參考文獻(xiàn) 69)。結(jié)合以后，可以利用從未結(jié)合糖類中分離結(jié)合糖類的步驟。一種分離方法是利用 選擇性地沉淀一種組分的方法。優(yōu)選選擇性沉淀結(jié)合的糖類，而使未結(jié)合糖類留在溶液中， 例如，通過脫氧膽酸鹽處理(參考文獻(xiàn)69)。結(jié)合以后，可以進(jìn)行測定結(jié)合物分子大小和摩爾質(zhì)量的步驟。更具體地說，可以測 定其分布。一種測定方法是分子排阻層析，利用多角光散射光密度測定法和微分折光測定 法(SEC-MALS/RI)檢測(參考文獻(xiàn)74)。結(jié)合物組合各個結(jié)合物可按上述方法制備，適用于任何肺炎球菌血清群。優(yōu)選制備適用于血清群1、3、4、5、6B、7F、9V、14、18C、19F和23F中的一個或多個的 結(jié)合物。然后混合各種結(jié)合物以提供多價混合物。也可能混合選定數(shù)目的結(jié)合物以提供二價、三價、四價、五價、六價、七價或十一 價混合物(例如，混合 l+3+4+5+6B+7F+9V+14+18C+19F+23F、4+6B+9V+14+18C+19F+23F 或 1+4+6B+9V+14+18C+19F+23F 等)。對于GBS來說，優(yōu)選制備適用于血清群la、Ib或III中的一個或多個的結(jié)合物。可以通過將結(jié)合物逐個添加到緩沖液中來混合它們。優(yōu)選的溶液是磷酸鹽緩沖生 理鹽水(磷酸鈉的終濃度為IOmM)。最終混合物中每種結(jié)合物的優(yōu)選濃度(以糖類計)在 1到20 μ g/ml之間，例如，5到15 μ g/ml之間，如約8 μ g/ml?？蛇x的是，在這個階段可以添加鋁鹽佐劑(例如，Al3+的終濃度在0. 4到0. 5mg/ml之間)。混合以后，混合的結(jié)合物可通過過濾除菌。藥物組合物利用本發(fā)明的方法制備出的結(jié)合物可與藥學(xué)上可接受的載體組合。這種載體包括 其自身不會誘導(dǎo)產(chǎn)生對接受組合物的個體有害的抗體的任何載體。合適的載體通常是代謝 緩慢的較大的大分子，如蛋白質(zhì)、多糖、聚乳酸、聚氨基酸、氨基酸共聚物、蔗糖、海藻糖、乳 糖和脂質(zhì)凝聚物(如油滴或脂質(zhì)體)。這種載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的。疫苗還可以 包含稀釋劑，如水、鹽水、甘油等。另外，敷料如增濕劑或乳化劑、PH緩沖物質(zhì)等也可包含在 內(nèi)。無熱原的磷酸鹽緩沖的無菌生理鹽水是典型的載體。有關(guān)藥學(xué)上可接受的賦形劑的完 整討論可參見參考文獻(xiàn)75。組合物可包含抗菌劑，特別是多劑量形式的包裝時。組合物可包含去污劑，例如，吐溫(Tween (聚山梨酯))，如吐溫80 (TWEEN80 (TM))。 去污劑的含量一般很低(例如，大于0. 01% )。組合物可包含鈉鹽以賦予張力(例如，氯化鈉)。氯化鈉的濃度一般為10士2mg/ ml ο組合物通常包含緩沖劑。一般是磷酸鹽緩沖劑。組合物可包含糖醇(例如，甘露醇)或二糖(例如，蔗糖或海藻糖)，例如，濃度為 15-30mg/ml左右(例如，25mg/ml)，特別是需要冷凍干燥時或者包含從冷凍干燥的材料重 構(gòu)的材料時。冷凍干燥前需將組合物的PH調(diào)整到6. 1左右以便于冷凍干燥。結(jié)合物可與其他免疫調(diào)節(jié)劑一起用藥。更具體地說，組合物通常包含疫苗佐劑。本 發(fā)明的組合物中所用的佐劑包括而不限于A.含礦物質(zhì)的組合物組合物中所包含的適合作為本發(fā)明的佐劑的礦物質(zhì)包括礦物質(zhì)鹽，如鋁鹽和鈣鹽 (或其混合物)。本發(fā)明包括礦物質(zhì)鹽如羥化物(例如，羥基氧化物)、磷酸鹽(例如，羥基 磷酸鹽，正磷酸鹽)、硫酸鹽等(參考文獻(xiàn)，例如，參見參考文獻(xiàn)76的8和9章)，或者不同 礦物質(zhì)化合物和具有合適形式的化合物(例如，凝膠、結(jié)晶的、無定形的等)的混合物，優(yōu)選 吸附其上。組合物中所含的礦物質(zhì)也可以是金屬鹽顆粒的形式(參考文獻(xiàn)77)。磷酸鋁是特別優(yōu)選的，尤其是適用于包含流感嗜血桿菌糖類抗原的組合物，典型 的佐劑是無定形的羥基磷酸鋁，P04/A1摩爾比在0. 84到0. 92之間，含量為0. 6mg Al+Vml0可以用低劑量的磷酸鋁吸附，例如，50_100yg Al3+/結(jié)合物/劑量。如果組合物 中包含不止一種結(jié)合物，那么并非所有結(jié)合物都需要被吸附。鈣鹽包括磷酸鈣(例如，參考文獻(xiàn)258所描述的“CAP”顆粒)。鋁鹽包括具有合適 形式(例如，凝膠、結(jié)晶的、無定形的等)羥化物、磷酸鹽、硫酸鹽等。優(yōu)選吸附到這些鹽上。 組合物中所含的礦物質(zhì)也可以是金屬鹽顆粒的形式(參考文獻(xiàn)77)。鋁鹽佐劑在下文有詳 細(xì)描述?？梢允褂帽环Q作氫氧化鋁和磷酸鋁的佐劑。這些名字是傳統(tǒng)叫法，只是為了方便 使用，是對實際化合物不準(zhǔn)確的描述(例如，參見參考文獻(xiàn)76的9章)。本發(fā)明可以使用通 常被用作佐劑的任何“氫氧化物”或“磷酸鹽”佐劑。被稱為“氫氧化鋁”的佐劑通常是羥基氧化鋁鹽，一般來說至少有一部分是結(jié)晶
22的。羥基氧化鋁可用化學(xué)式AlO(OH)表示，通過紅外(IR)光譜檢測可以將其與其他鋁化 合物如氫氧化鋁Al (OH)3區(qū)分開來，特別是根據(jù)是否存在1070厘米-YcnT1)的吸收帶和 βΟΘΟ-βΙΟΟοπι-1處的強(qiáng)肩峰(參考文獻(xiàn)76的9章)。氫氧化鋁佐劑的結(jié)晶度可通過半高處 衍射帶寬度(WHH)反映，低結(jié)晶顆粒具有較大的譜線增寬，這是因為結(jié)晶的顆粒較小。WHH 增大表面積增大，具有較高WHH值的佐劑具有較強(qiáng)的抗原吸附能力。氫氧化鋁佐劑的常見 形態(tài)是纖維狀(例如，投射電鏡照片所見)。氫氧化鋁佐劑的PI —般約為11，即，在生理PH 條件下佐劑自身帶表面正電荷。據(jù)報道，PH為7. 4時氫氧化鋁佐劑的吸附能力在1. 8-2. 6mg 蛋白質(zhì)/mgAl+++之間。被稱為“磷酸鋁”的佐劑一般是羥基磷酸鋁，通常還包含少量硫酸鹽(即，羥基磷 酸硫酸鋁)。通過沉淀可以獲得，沉淀期間的反應(yīng)條件和濃度會影響鹽中磷酸基取代羥基的 程度。羥基磷酸鹽的Ρ04/ΑΙ摩爾比一般在0.3到1.2之間。根據(jù)是否存在羥基可以將羥 基磷酸鹽與純的AlPO4區(qū)分開來。例如，3164CHT1處存在IR帶(例如，當(dāng)加熱到200°C時) 說明存在結(jié)構(gòu)羥基[參考文獻(xiàn)76的9章]。磷酸鋁佐劑的P04/A13+摩爾比一般在0. 3到1. 2之間，優(yōu)選在0. 8到1. 2之間，更 優(yōu)選的是0.95+0. 1。磷酸鋁通常是無定形的，特別是羥基磷酸鹽。典型的佐劑是P04/A1摩 爾比在0. 84到0. 92之間的無定形羥基磷酸鋁，含量為0. BmgAl3VmI0磷酸鋁一般呈顆粒 狀(例如，透視電鏡照片可見板塊狀形態(tài))。吸附抗原以后顆粒的直徑一般在0. 5-20μπι之 間(例如，約5-10 μ m)。據(jù)報道，pH為7. 4時磷酸鋁佐劑的吸附能力在0. 7-1. 5mg蛋白質(zhì) /mgAl+++之間。磷酸鋁的零電荷點(PZC)與磷酸基取代羥基的程度成負(fù)相關(guān)，通過沉淀來制備鹽 時所用的反應(yīng)條件和反應(yīng)物的濃度決定了取代的程度。改變?nèi)芤褐杏坞x磷酸鹽離子的濃度 (更多磷酸鹽=更酸性的PZC)或通過添加緩沖劑如組氨酸緩沖劑(是PZC變得更堿性)可 改變PZC。本發(fā)明所用的磷酸鋁的PZC —般在4. 0到7. 0之間，更優(yōu)選的是5. 0到6. 5之 間，如約5. 7。用于制備發(fā)明的組合物的鋁鹽懸液可包含緩沖劑(例如，磷酸鹽或組氨酸或氨丁 三醇緩沖劑)，但這不是必須的。懸液優(yōu)選無菌無熱原。懸液可包含游離水性磷酸鹽離子， 例如，濃度在1. 0到20mM之間，優(yōu)選5到15mM，更優(yōu)選的是約10mM。懸液也可包含氯化鈉。本發(fā)明可使用氫氧化鋁和磷酸鋁的混合物，如達(dá)隆瑞克斯TM(DAR0NRIX )。在這 個例子中，磷酸鋁的含量高于氫氧化鋁，例如，重量比至少為2 1，如>5 1、>6 1、> 7 1、> 8 1、> 9 1 等?？捎糜诨颊叩慕M合物中Al+++濃度優(yōu)選低于10mg/ml，例如< 5mg/ml、< 4mg/ml、 < 3mg/ml、< 2mg/ml、< lmg/ml等。優(yōu)選范圍在0. 3到lmg/ml之間。優(yōu)選最大量為0. 85mg/劑量。B.油乳劑適合用作本發(fā)明的佐劑的油乳劑組合物包括角鯊烯_水乳劑，如MF59(參考文獻(xiàn) 76的10章；也可參見參考文獻(xiàn)78) (5%角鯊烯，0.5%吐溫80和0. 5%司盤85，使用微流化 器制成亞微米顆粒)。完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)也可以使用。乳劑內(nèi)的油滴的直徑一般低于5 μ m,甚至是亞微米直徑的油滴，可提供穩(wěn)定乳劑 的微流化器可以達(dá)到這樣小的尺寸。直徑小于220nm的油滴是優(yōu)選的，因為它們能通過過濾除菌。C.皂苷制劑(參考文獻(xiàn)76的22章)皂苷制劑也可用作本發(fā)明的佐劑。皂苷是一種由固醇苷和三萜類糖苷組成的混 合群，存在于多種植物的皮、葉、干、根甚至花中。Quillaia saponaria Molina樹皮的皂 苷作為佐劑已被廣泛研究。皂苷也可以取自Smilax omata(sarsaprilla)、Gypsophilla paniculata (brides veil) > and Saponaria officianalis (soaproot)白勺??？！品。gHi^^ 制劑包括純化的制劑如QS21，以及脂質(zhì)佐劑如ISC0M。QS21的商品名是STIMULON(TM)。利用HPLC和RP-HIPLC已經(jīng)純化出了皂苷組合物。利用這些技術(shù)純化出的特殊組 分經(jīng)過了鑒定，其中包括QS7、QS17、QS18、QS21、QH_A、QH-B和QH-C。優(yōu)選的皂苷是QS21。 參考文獻(xiàn)79描述了 QS21的制備方法。皂苷制劑還可包含固醇，如膽固醇(參考文獻(xiàn)80)。可利用皂苷和膽固醇的組合物制成被稱為免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)的 獨特顆粒(參考文獻(xiàn)76的23章)。ISCOM通常還包含磷脂，如磷脂酰乙醇胺或 phosphatidyiclioline。任何已知的皂苷都可用于ISC0M。優(yōu)選的是，ISCOM包含QuilA、 QHA和QHC中的一種或多種。ISCOM在參考文獻(xiàn)80-82中有進(jìn)一步的描述?？蛇x的是，ISCOM 可不含其他去污劑(參考文獻(xiàn)83)。有關(guān)開發(fā)以皂苷為基礎(chǔ)的佐劑的綜述可參見參考文獻(xiàn)84和85。D.病毒體和病毒樣顆粒病毒體和病毒樣顆粒(VLP)也可用作本發(fā)明的佐劑。這些結(jié)構(gòu)通常包含來自于病 毒的一種或多種蛋白質(zhì)，可選的是與磷脂組合或制成制劑。它們通常都是非致病性的非復(fù) 制型的，一般不含任何天然病毒基因。病毒蛋白可通過重組制備，或者從完整病毒中分離。 適用于病毒體或VLP的這些病毒蛋白包括來自于流感病毒的蛋白(如HA或NA)、來自于乙 型肝炎病毒的蛋白(如核蛋白或衣殼蛋白)、來自于戊型肝炎病毒、麻疹病毒、辛德畢斯病 毒、輪狀病毒、手足口病病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、諾沃克病毒、人乳頭狀瘤病毒、HIV, RNA噬菌體、 Q^-噬菌體(如包膜蛋白)、GA-噬菌體、fr-噬菌體、AP205噬菌體和Ty (如逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子 Ty蛋白pi)的蛋白。VLP在參考文獻(xiàn)86-91中有進(jìn)一步的討論。病毒體在參考文獻(xiàn)92中 有進(jìn)一步的討論。E.細(xì)菌或微生物衍生物適用于本發(fā)明的佐劑包括細(xì)菌或微生物衍生物，如腸道細(xì)菌脂多糖(LPS)的非毒 性衍生物、脂質(zhì)A衍生物、免疫刺激性寡核苷酸和ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物。LPS的非毒性衍生物包括單磷酰脂質(zhì)A (MPL)和3_0_去酰化MPL (3dMPL)。3dMPL 是帶有4、5或6乙?；瘋?cè)鏈的3去-0-乙酰化單磷酰脂質(zhì)A的混合物。優(yōu)選的“小顆粒” 形式的3去-0-乙?；瘑瘟柞Ｖ|(zhì)A在參考文獻(xiàn)93中有描述。這種“小顆?！钡?dMPL要 足夠小以便于能夠用0. 22 μ m的膜過濾除菌(參考文獻(xiàn)93)。其他非毒性LPS衍生物包括 單磷酰脂質(zhì)A模擬物，如氨基烷基氨基葡萄糖苷磷酸鹽衍生物，例如RC-529 (參考文獻(xiàn)94， 95)。脂質(zhì)A衍生物包括大腸桿菌脂質(zhì)A的衍生物，如0M-174。0M-174在參考文獻(xiàn)96 和97中有描述。適合作為本發(fā)明的佐劑的免疫刺激性寡核苷酸包括含有CpG基序(包含一個非甲 基化胞嘧啶以及一個由磷酸鍵連接起來的鳥嘌呤)的核苷酸序列。包含重復(fù)或聚(dG)序列的雙鏈RNA和寡核苷酸也顯示具有免疫刺激性。CpG可包含核苷酸修飾/類似物，如磷硫酰修飾，可以是雙鏈的，也可以是單鏈的。 參考文獻(xiàn)98、99和100公開了可能的類似物取代，例如，用2’ -脫氧-7-脫氮鳥苷取代鳥 苷。CpG寡核苷酸的佐劑效應(yīng)在參考文獻(xiàn)101-106中有進(jìn)一步的討論。CpG序列可靶向到TLR9，如基序GTCGTT或TTCGTT (參考文獻(xiàn)107)。CpG序列可特 異性地誘導(dǎo)Thl免疫反應(yīng)，如CpG-A 0DN,它也可以更特異性地誘導(dǎo)B細(xì)胞反應(yīng)，如CpG-B ODN0參考文獻(xiàn)108-110有關(guān)于CpG-A和CpG-BODN的討論。優(yōu)選的CpG是CpG_A0DN。優(yōu)選的是構(gòu)建CpG，這樣5’末端易于被受體識別。可選的是，兩個CpG寡核苷酸序 列以其3’末端相連形成“免疫聚合物”。參見，例如，參考文獻(xiàn)107和111-113。因此，細(xì)菌ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選的蛋白 來源于大腸桿菌(大腸桿菌不耐熱腸毒素“LT”)、霍亂(“CT”)或百日咳(“PT”)。使用 脫毒的ADP-核糖基化毒素作為黏膜佐劑可參見參考文獻(xiàn)114，作為胃腸外佐劑可參見參考 文獻(xiàn)115。毒素或類毒素優(yōu)選全毒素的形式，包含A和B亞單位。優(yōu)選的是，A亞單位包含 脫毒突變；優(yōu)選的B亞單位是非突變的。優(yōu)選的佐劑是脫毒的LT變體，如LT-K63、LT-R72 和LT-G192。利用ADP核糖基化毒素及其脫毒衍生物，特別是LT-K63和LT-R72，作為佐劑 可參見參考文獻(xiàn)116-123。氨基酸取代的數(shù)字編碼優(yōu)選根據(jù)ADP核糖基化毒素A和B亞單 位的比對而定，如參考文獻(xiàn)124所述，本文已完整納入作為參考。F.人免疫調(diào)節(jié)劑適于作為本發(fā)明的佐劑的人免疫調(diào)節(jié)劑包括細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素(例如， 11^-1、11^-2、11^-4、11^-5、11^-6、11^-7、11^-12(參考文獻(xiàn) 125)等)(參考文獻(xiàn) 126)、干擾素(干 擾素-Y )、巨噬細(xì)胞集落刺激因子和腫瘤壞死因子。優(yōu)選的免疫調(diào)節(jié)劑是IL-12。G.生物粘附劑和黏膜粘附劑生物粘附劑和黏膜粘附劑也可用作本發(fā)明的佐劑。合適的生物粘附劑包括酯化的 透明質(zhì)酸微球(參考文獻(xiàn)127)或黏膜粘附劑如聚(丙烯酸)、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯烷酮、 多糖和羧甲基纖維素的交聯(lián)衍生物。殼聚糖及其衍生物也可用作本發(fā)明的佐劑(參考文獻(xiàn) 128)。H.微粒微粒也可用作本發(fā)明的佐劑。優(yōu)選的是由生物可講解的和非毒性的材料(例如， 聚(α-羥酸)、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚酸酐(polyarthydride)、聚己酸內(nèi)酯等)形成的 包含聚(丙交酯-共_乙交酯)的微粒(即，直徑為約IOOnm到約150 μ m的顆粒，更優(yōu)選 的是直徑為約200nm到約33 μ m,最優(yōu)選的是直徑為約500nm到約10 μ m)，可選的是進(jìn)行處 理使其具有帶負(fù)電荷的表面(例如，用SDS處理)或帶正電荷的表面(例如，用陽離子去污 劑處理，如CTAB)。I.脂質(zhì)體(參考文獻(xiàn)76的13和14章)適于作為佐劑的脂質(zhì)體制劑的例子可見于參考文獻(xiàn)129-131的描述。J.聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯制劑適用于本發(fā)明的佐劑包括聚氧乙烯醚和聚氧乙烯酯(參考文獻(xiàn)132)。這種制劑 還包括聚氧乙烯山梨坦酯和辛苯昔醇的組合物(參考文獻(xiàn)133)以及聚氧乙烯烷基醚或酯 表面活性劑與至少一種其他非離子表面活性劑如辛苯昔醇的組合物(參考文獻(xiàn)134)。優(yōu)
25選的聚氧乙烯醚選自如下一組聚氧乙烯-9-十二烷基醚(聚乙二醇單十二醚9)、聚氧乙 烯-9-硬脂酰醚、聚氧乙烯-8-硬脂酰醚、聚氧乙烯-4-十二烷基醚、聚氧乙烯-35-十二烷 基醚和聚氧乙烯-23-十二烷基醚。K.聚膦腈(PCPP)PCPP制劑在參考文獻(xiàn)135和136中有描述。L.胞壁酰肽適合作為本發(fā)明的佐劑的胞壁酰肽的例子包括N-乙酰胞壁酰-L-蘇氨酰-D-異 谷酰胺(thr-MDP)、N-乙酰胞壁酰-L-丙氨酰-D-異谷酰胺(nor-MDP)和N-乙酰胞壁 酰-L-丙氨酰-D-異谷氨酰-L-丙氨酸-2-(1’ -2’ - 二棕櫚酰-sn-甘油_3_羥基磷酰氧 基)-乙胺(MTP-PE)。M.咪唑并喹諾酮化合物適合作為本發(fā)明佐劑的咪唑并喹諾酮化合物的例子包括IMIQUAMOD(TM)及其類 似物(例如，RESIQUIMOD 3M(TM)，參考文獻(xiàn)137和138有進(jìn)一步的描述。本發(fā)明還包括上述一種或多種佐劑的組合。例如，下列佐劑組合物可用于本發(fā)明 (1)皂苷和水包油乳劑(參考文獻(xiàn)139) ； (2)皂苷(例如，QS21) +非毒性LPS衍生物(例 如，3dMPL)(參考文獻(xiàn)140) ； (3)皂苷(例如，QS21)+非毒性LPS衍生物(例如，3dMPL) + 膽固醇；⑷皂苷(例如，QS21)+3dMPL+IL-12(可選的+固醇)(參考文獻(xiàn)141) ； (5) 3dMPL 與，例如，QS21和/或水包油乳劑的組合(參考文獻(xiàn)142) ； (6)SAF，其中包含10%角鯊?fù)椤?0. 4%吐溫SO(TM)、5%普流尼克嵌段聚合物L(fēng)121和thr_MDP，微流化成亞微米乳劑或振蕩 制成大顆粒乳劑；(7) RIBI (TM)佐劑系統(tǒng)(RAS)，(Ribi免疫化學(xué)(Ribi Immunochem))，其中 包含2%角鯊烯，0. 2吐溫SO(TM)和一種或多種選自如下一組的細(xì)菌細(xì)胞壁成分單磷酰脂 質(zhì)A (MPL)海藻糖二霉菌酸酯(TDM)和細(xì)胞壁骨架(CWS)；優(yōu)選MPL+CWS (DETOX (TM))；以及 (8) 一種或多種礦物質(zhì)鹽(如鋁鹽)+LPS的非毒性衍生物(如3dMPL)。參考文獻(xiàn)76的7章描述了可作為免疫刺激劑的其他物質(zhì)。優(yōu)選使用氫氧化鋁和/或磷酸鋁佐劑，抗原通常吸附在這些鹽上。磷酸鈣是另一 種優(yōu)選佐劑。組合物可以是無菌和/或無熱原的。組合物可以是人體等滲的。組合物可盛裝在小瓶中，或者包裝在預(yù)裝注射器內(nèi)。注射器可帶或不帶針頭。注 射器內(nèi)可盛裝單次劑量的組合物，而小瓶內(nèi)可盛裝單次劑量的或多次劑量的組合物。可注 射的組合物通常是液體或懸液。另外，也可以是固體形式的(例如，凍干的)，在注射前用液 體載體制備成溶液或懸液。組合物可以單位劑量或多次劑量的形式包裝。如果是多次劑量的形式，小瓶優(yōu)選 預(yù)裝注射器。根據(jù)常規(guī)方法就可確定有效的給藥體積，但是人用注射組合物的體積一般為 0. 5ml。如果組合物需要在使用前制備(例如，凍干形式的組分)，以試劑盒的形式提供， 那么試劑盒可包含兩個小瓶，或者包含一個預(yù)裝注射器和一個小瓶，其中注射器的內(nèi)容物 用于在注射前溶解小瓶的內(nèi)容物。可用作疫苗的免疫原性組合物包含免疫有效量的抗原以及所需的任何其他組分。 免疫有效量是指當(dāng)給予個體該劑量時，無論是作為單次劑量還是作為一系列劑量的一部
26分，都可以起到有效治療或預(yù)防的作用。這種劑量因需要治療的個體的健康和物理狀況、年 齡、被治療個體的種群(例如，非人靈長類、靈長類等)、個體免疫系統(tǒng)合成抗體的能力、相 應(yīng)達(dá)到的保護(hù)程度、疫苗的劑型、醫(yī)生對醫(yī)療狀況的評估以及其他因素的不同而不同。據(jù)估 計該劑量的范圍應(yīng)該比較寬，通過常規(guī)試驗可以確定，每種鏈球菌結(jié)合物的量通常在Iyg 到20 μ g之間(以糖類計)。因此，本發(fā)明提供了制備藥物組合物的方法，該方法包括步驟(a)按照上述方法 制備結(jié)合物；(b)結(jié)合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合。本發(fā)明還提供了制備藥學(xué)產(chǎn)品的方法，該方法包括步驟(a)按照上述方法制備 結(jié)合物；(b)結(jié)合物與一種或多種藥學(xué)上可接受的載體混合；以及(c)將結(jié)合物/載體混合 物包裝到容器內(nèi)，如小瓶或注射器，從而得到藥學(xué)產(chǎn)品。插入到注射器內(nèi)可在工廠或外科完 成。本發(fā)明還提供了利用糖類-蛋白質(zhì)結(jié)合物制備藥學(xué)組合物的方法，該方法包括結(jié) 合物與藥學(xué)上可接受的載體混合物的步驟，其中結(jié)合物是通過上述處理結(jié)合物的方法制備 的。結(jié)合方法和混合步驟可由不同的人在不同的地點(例如，在不同的國家)不同的時間 完成。本發(fā)明還提供了將糖類-蛋白質(zhì)結(jié)合物包裝成藥學(xué)產(chǎn)品的方法，其中結(jié)合物是通 過上述處理結(jié)合物的方法制備的。結(jié)合方法和包裝步驟可由不同的人在不同的地點(例 如，在不同的國家)不同的時間完成。藥物用途本發(fā)明還提供了治療患者的方法，該方法包括將組合物給予患者。患者可能是自 身有患病的風(fēng)險，或者是孕婦(母源免疫)?；颊邇?yōu)選人。人可以是任何年齡的，例如，2歲 以內(nèi)、2-11歲、11-55歲、55歲以上等。本發(fā)明還提供了用于治療的組合物。本發(fā)明還提供了組合物在制造用于治療疾病 的藥物中的用途。優(yōu)選的疾病是流感或肺炎。組合物通常直接給予患者。直接給藥可通過胃腸外途徑(例如，經(jīng)皮注射、皮下注 射、腹膜內(nèi)注射、靜脈注射、肌肉注射或注射到組織的細(xì)胞間隙內(nèi))或通過直腸內(nèi)、口服、陰 道內(nèi)、眼內(nèi)、真皮內(nèi)、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、耳內(nèi)、肺內(nèi)或其他粘附給藥途徑完成。肌肉注射(例如，注 射到大腿或上臂)是優(yōu)選的。注射可通過針頭(例如，皮下針頭)完成，或者也可以通過無 針注射。肌肉注射劑量一般為0.5ml。本發(fā)明可用于激發(fā)系統(tǒng)和/或黏膜免疫。劑量療法可以是單次劑量方案或多次劑量方案。多次劑量方案用于初始免疫和/ 或加強(qiáng)免疫。初始劑量方案之后可以用加強(qiáng)劑量方案。通過常規(guī)途徑可以確定初次劑量之 間的時間間隔(例如，4-16周之間)和初始免疫與加強(qiáng)免疫之間的時間間隔。細(xì)菌感染可影響身體的各個區(qū)域，因此組合物可制成各種形式。例如，組合物可制 成可注射形式的溶液或懸液。也可以制備成適于在注射前用液體載體制成溶液或懸液的固 體形式(例如，凍干組合物)。組合物可制備成用于局部給藥的劑型，例如，軟膏、乳膏或粉 末。組合物也可以制備成用于口服給藥的劑型，如片劑或膠囊，或者糖漿(可選的是添加調(diào) 味劑)。組合物可制備成用于肺內(nèi)給藥的劑型，如吸入劑，使用細(xì)粉末或噴霧。組合物可制 備成栓劑或子宮套。
組合物可制備成適于鼻內(nèi)、耳內(nèi)或眼內(nèi)給藥的劑型，如噴霧、滴劑、凝膠或粉末 (參考文獻(xiàn)143和144)。優(yōu)選可注射的組合物。本發(fā)明組合物中的其他抗原性組分本發(fā)明的方法還包括鏈球菌結(jié)合物與下列一種或多種其他抗原混合的步驟-B型嗜血流感菌的糖類抗原(例如，參考文獻(xiàn)145的14章)。-腦膜炎球菌B血清群的純化蛋白抗原。-腦膜炎球菌B血清群的外膜制備物。-甲型肝炎病毒的抗原，如滅活病毒(例如，46，147)。-乙型肝炎病毒的抗原，如表面和/或核心抗原(例如，147，148)。-白喉抗原，如白喉類毒素(例如，參考文獻(xiàn)145的13章)。-破傷風(fēng)抗原，如破傷風(fēng)類毒素(例如，參考文獻(xiàn)145的27章)。-百日咳博得特菌的抗原，如百日咳博得特菌的百日咳全毒素(PT)和絲狀血凝素 (FHA)，可選的是與百日咳桿菌粘附素和/或凝集原2和3組合(例如，參考文獻(xiàn)149和150 ； 參考文獻(xiàn)145的21章)-脊髓灰質(zhì)炎抗原(例如，151，152)，如IPV(參考文獻(xiàn)145的24章)。-麻疹、腮腺炎和/或風(fēng)疹抗原(例如，參考文獻(xiàn)145的19、20和26章)。-流感抗原(例如，參考文獻(xiàn)145的17章)，如血凝素和/或神經(jīng)酰胺酶表面蛋白。-粘膜炎莫拉菌的抗原(例如，153)。-無乳鏈球菌的蛋白抗原(B型鏈球菌)(例如，154，155)。-釀膿鏈球菌的抗原(A型鏈球菌)(例如，155，156，157)。-金黃色葡萄球菌的抗原(例如，158)。組合物可包含這些抗原中的一種或多種。如果需要時可使毒性蛋白抗原脫毒(例如，通過化學(xué)和/或基因方法使百日咳毒 素脫毒(參考文獻(xiàn)150))。如果組合物中包含白喉抗原，那么優(yōu)選的是組合物還包含破傷風(fēng)抗原和百日咳抗 原。同樣，如果組合物中包含破傷風(fēng)抗原，那么優(yōu)選的是組合物還包含白喉抗原和百日咳抗 原。同樣，如果組合物中包含百日咳抗原，那么優(yōu)選的是組合物還包含破傷風(fēng)抗原和白喉抗 原。因此，DTP組合物是優(yōu)選的。組合物中抗原的濃度一般至少為每種lg/ml?？傊魏谓o定的抗原的濃度都要足 以激發(fā)抗該抗原的免疫反應(yīng)。除了在本發(fā)明的免疫原性組合物中使用蛋白質(zhì)抗原以外，也可以使用編碼抗原的 核酸(優(yōu)選DNA，例如，以質(zhì)粒的形式)。 抗原優(yōu)選吸附在鋁鹽上。組合物中所包含的優(yōu)選非鏈球菌抗原是那些能產(chǎn)生抗B型流感嗜血桿菌(Hib)保 護(hù)作用的抗原；通常為Hib莢膜多糖抗原。B型流感嗜血桿菌的糖類抗原是大家熟知的。優(yōu)選的是，Hib糖類共價結(jié)合到載體蛋白上以增強(qiáng)其免疫原性，尤其是用于兒童 時。多糖結(jié)合物的總體制備方法，特別是Hib莢膜多糖的詳細(xì)制備方法已有詳細(xì)描述。本發(fā)明可以使用任何合適的Hib結(jié)合物。合適的載體蛋白在上文已有描述，Rib 糖類的優(yōu)選載體是CRM 197 (HbOC)、破傷風(fēng)類毒素(PRP-T)和腦膜炎球菌的外膜復(fù)合物(PRP-OMP)。結(jié)合物的糖類基序可以是多糖(例如，全長磷酸多核糖基核糖醇(PRP))，但是優(yōu) 選使多糖水解成寡糖(例如，MW在約1到5kDa之間)。優(yōu)選的結(jié)合物包含通過脂肪酸連接子與CRM197共價連接的Hib寡糖(參考文獻(xiàn) 159，160)。破傷風(fēng)類毒素也是優(yōu)選的載體。優(yōu)選的是，Hib抗原的給藥可以產(chǎn)生濃度超過0. 15 μ g/ml的抗-PRP抗體，更優(yōu)選 的是 lyg/ml。如果組合物包含Hib糖類抗原，那么優(yōu)選的是不包含氫氧化鋁佐劑。如果組合物 包含磷酸鋁佐劑，那么Hib抗原可吸附在佐劑上(參考文獻(xiàn)161)，也可以是非吸附的(參考 文獻(xiàn)162)。防止吸附可通過在抗原/佐劑混合期間選擇正確的PH、選擇合適的零電荷點和 組合物中各種不同抗原的合適混合順序來達(dá)到(參考文獻(xiàn)163)。本發(fā)明的組合物可包含不止一種Hib抗原。Hib抗原可以是凍干的，例如，用于腦 膜炎球菌的重建。因此，Hib抗原可以和腦膜炎結(jié)合物分開包裝，或者混合在一起。本發(fā)明的組合物中所包含的其他非鏈球菌抗原是那些來源于性傳播疾病(STD) 的抗原。這些抗原可用于預(yù)防或治療STD，如衣原體、生殖器皰疹、肝炎(如HCV)、生殖器疣、 淋病、梅毒和/或軟下疳(參考文獻(xiàn)164)?？乖蓙碓从谝环N或多種病毒或細(xì)菌性STD。可 用于本發(fā)明的病毒STD抗原可來源于，例如，HIV、單純皰疹病毒(HSV-1和HSV-2)、人乳頭 瘤病毒(HPV)和/或肝炎病毒(HCV)?？捎糜诒景l(fā)明的細(xì)菌性STD抗原可來源于，例如，淋 球菌、沙眼衣原體、蒼白密螺旋體、杜克雷嗜血桿菌或大腸桿菌。除非另外說明，利用分子生物學(xué)、重組DNA和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)可以實現(xiàn)本 發(fā)明，這些技術(shù)是本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的。這些技術(shù)在文獻(xiàn)中有詳細(xì)描述。參見， 例如，((DNA克隆》(DNA Cloning)，I和II卷(D. N Glover編輯，1985)；《寡核苷酸合 成》(Oligonucleotide Synthesis) (MT Gait 編輯，1984)；《核酸雜交》(Nucleic Acid Hybridization) (B. D. Hames 和 ST Higgins 編輯，1984)；《轉(zhuǎn)錄和翻譯》(Transcription and Translation) (B. D. Hames 和 ST Higgins 編輯，1984)；《動物細(xì)胞培養(yǎng)》(Animal Cell Culture) (R. I. Freshney 編輯，1986)；《固定化細(xì)胞和酶》(Immobilized Cells and Enzymes) (IRL 出版社，1986) ；B. Perbal，《分子克隆實用指南》(A Practical Guide to Molecular Cloning) (1984)；胃歹[J^t去》(the Methods in Enzymology series) ( ψ 術(shù)出版社有限公司(Academic Press, Inc.))，特別是154和155卷；《哺乳動物基因轉(zhuǎn)移 載體》(GeneTransfer Vectors for Mammalian Cells) (J. H. Miller 禾口 Μ· P. Calos 編輯， l987，冷泉港實驗室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory)) ；Mayer 和 Walker 編輯 (1987)，《細(xì)胞和分子生物學(xué)中的免疫化學(xué)方法》(Immunochemical Methods inCell and Molecular Biology)(倫敦學(xué)術(shù)出版社(Academic Press, London)) ；Scopes, (1987)，《蛋 白質(zhì)純化原理與實踐》(Protein Purification principles andPractice)，第 2 版(紐 約斯普瑞英格-佛拉格出版社(Springer-Verlag，N. Y.)；《實驗免疫學(xué)手冊》(Handbook of Experimental Immunology)第 I-IV 卷(D. Μ. Weir 和 C. C. Blackwell 編輯，1986)；《雷 明頓藥物學(xué)》(Remington' s PharmaceuticalSciences)，濱州伊斯頓馬克出版公司(Mack Publishing Company，Easton，Pa.)，第 19 版(1995)；《酶學(xué)方法》(Methods In Enzymology) (S. Colowick和N. Kaplan編輯，學(xué)術(shù)出版有限公司(Academic Press, Inc.)；《實驗免疫學(xué)
29手冊》(Handbookof Experimental Immunology)第 I-IV 卷(D. M. Weir 和 C. C. Blackwell 編輯，1986，布萊克韋爾科學(xué)出版社(Blackwell Scientific Publications) ；Sambrook等， 《分子克隆實驗室手冊》(Molecular Cloning =A Laboratory Manual)(第2版，1989)；《表 面和膠體化學(xué)手冊》(Handbook of Surface and ColloidalChemistry) (Birdi,K. S.編輯， CRC 出版社(CRC Press), 1997)；《分子生物學(xué)簡明方法》(Short Protocols in Molecular Biology)，第4版，(Ausubel等編輯，1999，約翰威利父子出版公司(John Wiley & Sons))； 《分子生物學(xué)技術(shù)實驗室重點課程》(Molecular Biology Techniques =An Intensive Laboratory Course) (Ream 等編輯，1998，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press))；《PCR》(生物 技術(shù)系列叢書引言)(PCR{Introduction to Biotechniques Series)，第 2 版，(Newton 和Graham編輯，1997，斯普瑞英格_佛拉格出版社(Springer-Verlag))；以及Peters和 Dalrymple，《區(qū)域病毒學(xué)》(Fields Virology)(第 2 版)，F(xiàn)ields 等(編輯)，紐約 B. N. Raven 出版社(B. N. Raven Press, New York, NY)。本說明書使用了核苷酸和氨基酸的標(biāo)準(zhǔn)縮寫。本文所引用的所有出版物、專利和專利申請都已完整納入本文作為參考。 實施例為了闡明本文的方法，我們研究了分離自GBS病患者的無乳鏈球菌090、H36b、 M781和CBJ111，這些菌株可產(chǎn)生四種有代表性的血清型(la、lb、III和V)。實施例1-5升和20升發(fā)酵A)接種物制備工藝的開發(fā)三種GBS血清型菌株的生長試驗在包含IOOOml接種培養(yǎng)物的5000ml無檔板搖瓶 中進(jìn)行，培養(yǎng)物中包含:8g/L 二水Na2HPO4(默克)、2g/L —水Na2HPO4(默克)、17g/L酵母 自溶提取物(迪菲克實驗室(Difco laboratories) )、lmg/L生物素(默克)和33g/L—水 D-葡萄糖(默克)。所有化合物都溶解到反滲水(ROW)中，通過0.22 μ m孔徑的濾膜(奈 爾基因公司(Nalgene))過濾除菌，然后通過無菌操作添加到5000ml錐形瓶中，燒瓶經(jīng)過 1220C 30分鐘高壓滅菌處理。對于每一個系列的搖瓶試驗來說，用不同體積的解凍培養(yǎng)物(工作種子菌儲存在 10%的甘油中，-70°c保存)接種培養(yǎng)基(PH= 7. 3)，在35°C的水平搖床柜(Irmova 4330， 偏心圓1英寸)上以200rpm振蕩培養(yǎng)。在培養(yǎng)的不同時間點測定590nm處的光密度值(novaspecll分光光度計-法瑪西 亞生物技術(shù)公司(Pharmacia Biotech)，在光密度值大于或等于0. 5時還要監(jiān)測pH值(pH 計，麥?zhǔn)瞎?Metrohm))。指數(shù)生長期的倍增時間通過生長曲線線性部分的回歸分析確定。 曲線的斜率對應(yīng)于最大比生長速率ymax，倍增時間(td)用公式td= 1η2/μ計算。B) 5升和20升發(fā)酵罐的準(zhǔn)備在裝填容器和培養(yǎng)基滅菌前應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)方法校正發(fā)酵裝置(pH電極和ρ02表)。由于GBS是營養(yǎng)缺陷型微生物，因此它不能合成特殊有機(jī)化合物，如氨基酸和維 生素，這些化合物是其生長所必須的。因此，已經(jīng)開發(fā)出了一種低成本的不含動物源組分的 復(fù)合培養(yǎng)基，如W007/052168所述。用于生產(chǎn)多糖的基礎(chǔ)培養(yǎng)基包含2g/L 二水Na2HPO4 (默克)、16. 7g/L酵母自溶提取物(迪菲克實驗室)、32g/L —水D-葡萄糖(默克)、lmg/L生物素(默克)、0· 5mg/L鹽 酸硫胺素(BDH 實驗室(BDH Laboratories))、0. 5mg/L 核黃素(佛盧卡(Fluka))、0. 5mg/L 煙酸(卡爾埃爾巴(Carlo Erba))、0. 5mg/L鹽酸吡哆醇(西格瑪(Sigma))和防止泡沫形 成的lml/L聚乙烯甘油(BDH實驗室)。由于空培養(yǎng)罐無法滅菌，因此用磷酸鹽、酵母提取物和聚乙烯甘油(7L的發(fā)酵罐 加入4. 2L，30L的發(fā)酵罐加入16L)填充發(fā)酵罐，在121°C原位滅菌30分鐘。在滅菌期間會 有一些液體蒸發(fā)掉。根據(jù)經(jīng)驗判斷培養(yǎng)基的高度可以評估出因蒸發(fā)而損失的液體量，在滅 菌前多加一些水(7L的發(fā)酵罐多加0. 5L，30L的發(fā)酵罐多加1L)。同時用ROW溶解一水D-葡萄糖(550g/L)和維生素(鹽酸硫胺素、煙酸和鹽酸吡 哆醇各0. 5g/L，核黃素0. 05g/L,生物素0. 2g/L)的濃縮液，通過0. 22 μ m孔徑的濾膜(奈 爾基因公司)分別過濾除菌，通過無菌操作加到發(fā)酵罐內(nèi)，形成最終的濃度(對于7L的發(fā) 酵罐來說300mL —水D-葡萄糖、25mL生物素、5mL維生素溶液(鹽酸硫胺素、煙酸和鹽酸 吡哆醇)和50mL核黃素；對于30L的發(fā)酵罐來說1000mL —水D-葡萄糖、IOOmL生物素、 17mL維生素溶液(鹽酸硫胺素、煙酸和鹽酸吡哆醇)和170mL核黃素)。C) 5L和20L發(fā)酵罐的培養(yǎng)GBS表達(dá)的cps與其他包膜細(xì)菌致病原一樣不是組成型的，而是在體外生長期間 不斷變化的，分離自不同感染位點的原始培養(yǎng)物的表達(dá)也是不同的(參考文獻(xiàn)173)。盡管 有這種現(xiàn)象，但是對GBS的這種表面表達(dá)的糖類抗原的調(diào)節(jié)知之甚少。據(jù)報道連續(xù)培養(yǎng)物 中的細(xì)胞生長速率是調(diào)節(jié)莢膜多糖產(chǎn)生的主要因素，III型莢膜多糖生長速率依賴性的合 成不依賴于生長限速營養(yǎng)物。實際上，當(dāng)細(xì)胞維持的較快的質(zhì)量倍增時間(1. 4小時-1OT1)) 時比較慢的生長速率(IltT1)時的cps產(chǎn)率更高(參考文獻(xiàn)174)。在開始的時候，所有有關(guān)GBS的研究都是通過分批培養(yǎng)使細(xì)胞生長，其特征是生 長速率、營養(yǎng)物濃度和PH都是變化的。分批培養(yǎng)的細(xì)胞所經(jīng)歷的生長參數(shù)改變會導(dǎo)致代謝 產(chǎn)生變化，進(jìn)而影響細(xì)胞的組成。連續(xù)培養(yǎng)可以使細(xì)胞在穩(wěn)定的底物、產(chǎn)物和生物質(zhì)濃度的 環(huán)境中以及由研究者控制的速率下達(dá)到連續(xù)指數(shù)生長。如果能夠維持生長速率條件就可以 達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)。但是，對于工業(yè)生產(chǎn)來說應(yīng)避免連續(xù)培養(yǎng)，因為這容易產(chǎn)生穩(wěn)定性的問題和 污染，以制造規(guī)模來生產(chǎn)也是很昂貴的，因為需要連續(xù)進(jìn)料培養(yǎng)基和營養(yǎng)物。5L和20L規(guī)模的培養(yǎng)分別在Biostat CT5-2和C20-3反應(yīng)器(BB國際生物技術(shù) 公司(B. Braun Biotech International))，其總體分別為6. 9L和31L。生物反應(yīng)器分別裝 配有2個和3個攪拌子，每一個攪拌子有6個葉片。另外，還有測定溶氧濃度(Inpro 6500 系列2氧傳感器；MT公司(Mettler Toledo))、pH(Pa/2模式；MT公司)、溫度(ptlOO電極， MKJ公司(M. K. Juchleim GmbH))、泡沫(L300/Rd. 28模式；BB國際生物技術(shù)公司)所用的 可蒸汽滅菌的探針接口。操作由DCU-3數(shù)字控制單位和MFCs/win軟件包聯(lián)合控制和記錄 (BB國際生物技術(shù)公司)。排出生物反應(yīng)器的廢氣內(nèi)的二氧化碳和氧濃度由1310發(fā)酵罐監(jiān) 測器(Irmova)和GMUX-8分析儀(BB國際生物技術(shù)公司)監(jiān)測。培養(yǎng)在如下條件下進(jìn)行36°C 士 1°C，0. 2巴的壓力，培養(yǎng)基中p02 = 30士 10%飽和 度，通過轉(zhuǎn)速調(diào)節(jié)，7L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速在100 士 10 %到700 士 10 % rpm之間，30L發(fā)酵罐的轉(zhuǎn)速 在50士 10%到500士 10% rpm之間，換氣速率為0. 1和1. Ον/ν/m士 10%。培養(yǎng)基的pH維持 在7. 3士0. 2，通過可控的添加4M氫氧化鈉自動調(diào)節(jié)。各種參數(shù)如溫度、ph和攪拌的監(jiān)測和
31控制由PID控制單位執(zhí)行。用消泡劑乳劑(BDH實驗室)自動控制泡沫。IOOOmL無菌接種培養(yǎng)基用合適體積的待測菌株工作種子液接種，在35°C下孵育 一個理想的時期，利用旋轉(zhuǎn)搖床振蕩。當(dāng)接種物燒瓶內(nèi)的培養(yǎng)物達(dá)到指數(shù)生長中期(0D在 0.8到1.2之間)時，利用足量的這種培養(yǎng)物接種新鮮批培養(yǎng)基(4. 7L或17L)，得到的初始 OD 為 0. 032。發(fā)酵的批相可持續(xù)到培養(yǎng)物OD59tlnm達(dá)到2.5 (士0.5)時。當(dāng)培養(yǎng)物達(dá)到或接近這 個OD值時，開始添加第一指數(shù)分批進(jìn)料的酵母提取物培養(yǎng)基(150g/L)，繼續(xù)培養(yǎng)45-50分 鐘以維持比生長速率(P)在0. 1381Γ1。在第一部分結(jié)束時，OD達(dá)到4. 5 士 0.5，此時開始添 加第二指數(shù)分批進(jìn)料的酵母提取物培養(yǎng)基(150g/L)，維持μ等于0. 9241Γ1，繼續(xù)培養(yǎng)45-50 分鐘。這些進(jìn)料相可使細(xì)菌的倍增時間從20-25分鐘，通常批相是這種長度，延長到45分 鐘，這樣可以使微生物適應(yīng)多糖合成的理想條件。最后，為了提高生產(chǎn)力，在第二次添加酵 母提取物結(jié)束時，即OD達(dá)到10. 0士2，通過ρΗ調(diào)節(jié)的進(jìn)料方式添加濃縮的一水D-葡萄糖 (550g/L)，持續(xù)3小時，繼續(xù)培養(yǎng)，以避免底物完全耗竭，底物完全耗竭的結(jié)果是色素產(chǎn)生 和莢膜多糖產(chǎn)量減少。在發(fā)酵過程中以一定的時間間隔從培養(yǎng)物液體中取50mL少量樣品，用于分析細(xì) 菌的生長、葡萄糖消耗以及多糖產(chǎn)生情況。D) GBS的收獲和滅活當(dāng)生長速率持續(xù)下降時收獲培養(yǎng)物，一般發(fā)生在ρΗ控制的葡萄糖相開始后的3小 時。培養(yǎng)物立刻在室溫下離心，7741xg離心45分鐘(AvantiTM離心機(jī)J-20XPI，貝克曼庫 爾特(Beckmam coulter)).棄去上清，儲存在_20°C用于葡萄糖分析，測定收獲物的重量。純化GBS多糖首先需要滅活和水解cps。將IM的氫氧化鈉加入到細(xì)胞團(tuán)內(nèi)，終濃 度為0. 8M。反應(yīng)混合物在37°C孵育36小時，并且以120rpm的速度振蕩，任何測定血清型 特異性的cps的含量。E)發(fā)酵罐清洗收獲培養(yǎng)物以后，需要清洗發(fā)酵罐和輔助裝置。首先在發(fā)酵罐內(nèi)加上ROW，通過人 工添加4M的氫氧化鈉將ρΗ提高到12。通過將水加熱到80°C，維持30分鐘完成清潔，壓力 維持在0.2巴，200rpm攪拌以確保熱量均勻分散。完成清潔后，收獲含氫氧化鈉的水，發(fā)酵 罐用ROW清洗直到ρΗ值下降到5-7的范圍內(nèi)。一般來說，要達(dá)到理想的ρΗ需要清洗三次。 清空發(fā)酵罐，從各自接口上取下探針和輔助裝置。用于接種的帶隔膜的接插件和用于添加 營養(yǎng)物和校正試劑的帶隔膜的接插件以及用去收獲和儲存樣品的瓶子分別滅菌，在122°C 高壓滅菌30分鐘。發(fā)酵罐在填充上ROW，121°C滅菌30分鐘。實施例2-2L發(fā)酵菌株和培養(yǎng)基無乳鏈球菌III型菌株M781最初是從患GBS腦膜炎的新生兒體內(nèi)分離出來的，由 Carol J.Baker提供。菌株M781的細(xì)胞用經(jīng)過調(diào)整的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基培養(yǎng)，這種培養(yǎng) 基最初是為A型鏈球菌開發(fā)的(參考文獻(xiàn)174)。用于分批培養(yǎng)試驗的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基 的成分列在表1中。表1 化學(xué)成分確定培養(yǎng)基成分批相 利用標(biāo)準(zhǔn)溶液(pH值=7和4)通過兩點校正方法校正pH探針。將p02和pH探 針安裝到培養(yǎng)罐上。將葡萄糖加入到發(fā)酵罐(Applikon 3L)內(nèi)，122°C高壓滅菌30分鐘。 所有其他化合物分別通過0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾除菌，然后通過無菌操作添加到發(fā)酵罐 內(nèi)。為了避免培養(yǎng)基出現(xiàn)沉淀，準(zhǔn)備濃縮溶液(20x磷酸鹽、IOOx硫酸鹽、50x鈉鹽、240x含 氮堿基、9000x維生素、35x氨基酸水溶液和90x氨基酸氫氧化鈉溶液)，以合適的體積按照 如下順序添加到碳源內(nèi)，得到希望的終濃度磷酸鹽、氨基酸、維生素、硫酸鹽和含氮堿基。當(dāng)添加完所有添加物后，校正PO2探針。發(fā)酵罐充氮氣過夜后的PO2為0。培養(yǎng)基氧飽和以 后，開始運(yùn)行條件時電極的斜率校正到100%。B) 2L規(guī)模的培養(yǎng)菌株M781表達(dá)莢膜多糖的預(yù)實驗通過分批培養(yǎng)進(jìn)行。為了活化細(xì)胞，IOOmL化學(xué)成分確定培養(yǎng)基(pH值=7. 2，用6M鹽酸調(diào)整)通過 0. 22 μ m孔徑的濾膜(奈爾基因公司)過濾除菌，加入到500mL錐形瓶中，接種0. ImL解凍 的M781培養(yǎng)物(工作種子液儲存在10%甘油中，-70°C保存)。這個種子培養(yǎng)物在35°C的 水平搖床(Innova 4330，偏心圓1英寸)上孵育，200rpm振蕩培養(yǎng)9小時。然后將種子培 養(yǎng)物接種到含1.8L基礎(chǔ)培養(yǎng)基的2. 5L加套發(fā)酵罐(Applikon)中，初始OD值為0.4。發(fā)酵由愛普力肯儀器公司(Applikon Instruments)的數(shù)字測量和控制單位(生 物控制器 ADI 1030 (Biol controller ADI 1030)，愛普力肯(Applikon))控制，所有數(shù)據(jù) 由計算機(jī)(BioXpert軟件)采集。溫度由外部恒溫器(?？?Haake))自動控制在36°C。 溶氧由可滅菌的電極(愛普力森(Applisens))測定，通過在150到IOOOrpm之間自動調(diào)節(jié) 攪拌速度(電動機(jī)控制器ADI 1012)以及在0. 1到1. Ον/ν/m之間調(diào)節(jié)換氣速率(氣流控 制器，愛普力肯)使空氣飽和度維持在30%以上。培養(yǎng)物的pH通過自動滴定2M氫氧化鈉 (泵驅(qū)動器，麥弗公司(Masterflex))維持在7. 3)。對于有未知限速因子的補(bǔ)料分批培養(yǎng)來說，培養(yǎng)開始于批生長相(1.2L)，然后是 進(jìn)料相。為了開發(fā)出最佳的補(bǔ)料分批培養(yǎng)策略，利用三種補(bǔ)料分批培養(yǎng)技術(shù)來檢測每一種 細(xì)胞生長；(I)PH-穩(wěn)態(tài)，(2)DOT-穩(wěn)態(tài)以及(3)指數(shù)生長。定期監(jiān)測cps濃度。 為了利用pH-穩(wěn)態(tài)方法控制底物進(jìn)料速度，在培養(yǎng)過程中通過用蠕動泵(MCD公司 儀器(Masterflex Concode Drive))添加進(jìn)料溶液將培養(yǎng)基的pH調(diào)整到7. 3。當(dāng)pH超過 7. 3的設(shè)定點時，說明葡萄糖已經(jīng)被耗竭。這時自動添加營養(yǎng)物將pH再次調(diào)整到設(shè)定點。對于p02-穩(wěn)態(tài)策略來說，p02高于40%的溶氧設(shè)定點時自動添加碳源。對于指數(shù)培養(yǎng)技術(shù)來說，在指數(shù)生長期結(jié)束時啟動蠕動泵以使比生長速率維持在 0. 921Γ1 (td = 45分鐘)，這是莢膜多糖生產(chǎn)的最近倍增時間。按照如下公式進(jìn)料 其中F是進(jìn)料速率，μ是比生長速率，(VX)tl是開始進(jìn)料時的生物質(zhì)，tf是開始進(jìn) 料時的時間，Sf,const是飼料的底物濃度，Yx7s是葡萄糖的細(xì)胞產(chǎn)率系數(shù)。C)用于鑒定所需細(xì)胞因子的搖瓶試驗微生物所需的生長因子通過從確定成分培養(yǎng)基中去除各個營養(yǎng)物以及通過確定 有此得到的培養(yǎng)基是否支持生長來確定。試驗在500mL無檔板的搖瓶中進(jìn)行，其中包含 IOOmL化學(xué)成分確定的培養(yǎng)基(參見表1)。培養(yǎng)基的pH值用6M鹽酸調(diào)整到7. 2，然后通過0. 22 μ m孔徑的濾膜(奈爾基因 公司)過濾除菌。對于每一個系列的搖瓶試驗來說，培養(yǎng)基接種0. ImL解凍的M781培養(yǎng) 物(工作種子液儲存在10%甘油中，-70°C保存)，在35°C的水平搖床(Irmova 4330，偏心 圓1英寸)上孵育，200rpm振蕩培養(yǎng)。18小時后測定590nm處的ODfcovaspecII分光光度 計-法瑪西亞生物技術(shù)(PharmaciaBiotech))和pH值(pH計，麥?zhǔn)瞎?。
在缺少氨基酸和維生素的培養(yǎng)基中生長的細(xì)菌與在包含所有化合物的培養(yǎng)基中 生長的對照培養(yǎng)物比較。實施例3-分析方法A)生長測定在采集樣品以后通過測定培養(yǎng)物在590nm處的OD值(Novaspec II分光光度計， 法瑪西亞生物技術(shù)(Pharmacia bioteck))來檢測生物質(zhì)含量。稀釋樣品是為了使吸光度 值在0. 10-0. 50的范圍內(nèi)?；瘜W(xué)成分確定培養(yǎng)基內(nèi)的細(xì)胞濃度通過將精確體積的培養(yǎng)物肉湯(30mL)加入到 經(jīng)過干燥和稱重的50mL聚乙烯離心管中來測定，以g/L計。細(xì)胞用Avanti-TM JA-20 XPl 貝克曼庫爾特冷凍離心機(jī)(Avanti-TM JA-20 XPIBeckman Coulter)離心，27，217xg，4°C離 心45分鐘。棄去上清，在85°C烤箱中干燥細(xì)胞團(tuán)24小時，然后稱重。確立OD59tlnm與gmw/L 生物質(zhì)(細(xì)胞干重)的關(guān)系。1個OD59tlnm等于0. 44gCDff/L生物質(zhì)。B)革蘭氏染色革蘭氏染色可以分出兩類主要的細(xì)胞壁。具有包含少量肽多糖和特征性的脂多糖 的細(xì)胞壁的細(xì)菌是革蘭氏陰性的，而具有包含相對較多的肽多糖但是不含脂多糖的細(xì)胞壁 的細(xì)菌是革蘭氏陽性的。在實驗室規(guī)模和中試規(guī)模的發(fā)酵中使用這種方法可確保種子培養(yǎng) 物和發(fā)酵罐培養(yǎng)物是純的。至于染色技術(shù)，顯微玻片上的細(xì)胞熱固定，用堿性染料結(jié)晶紫染色，該染料可將所 有細(xì)菌細(xì)胞染成藍(lán)色。然后細(xì)胞用碘_碘化鉀溶液處理，使碘進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，與結(jié)晶紫染料形 成水溶性的復(fù)合物。細(xì)胞用乙醇溶劑處理，碘-結(jié)晶紫復(fù)合物在乙醇溶液中是可溶的。用 溶劑處理以后，只有革蘭氏陽性細(xì)胞仍然被染色。染色以后，細(xì)胞用復(fù)染劑番紅精處理，這樣就可以看到脫色的革蘭氏陰性細(xì)胞。復(fù) 染的革蘭氏陰性細(xì)胞呈紅色，而革蘭氏陽性細(xì)胞依然是藍(lán)色。將復(fù)染劑漂洗去后，玻片稍微 加熱使殘存的水分蒸發(fā)掉。然后將玻片放到顯微鏡載物臺上，在油鏡上滴上鏡油。C)葡萄糖含量測定在培養(yǎng)物上清中，利用比色法測定葡萄糖消耗量，測定溶液在340nm處的1厘米 (cm)光程吸光度(NADPH)，并與利用純葡萄糖制作的標(biāo)準(zhǔn)曲線比較。在有己糖激酶和ATP存在的條件下，D-葡萄糖可被磷酸化成D-葡萄糖_6_磷酸， 同時生成ADP D-葡萄糖在己糖激酶和ATP存在時磷酸化形成D-葡萄糖_6_磷酸，同時形成 ADP
D-葡萄糖+ATP己麵》D-葡萄糖-6-磷酸+ADP在葡萄糖-6-磷酸脫氫酶存在的條件下，D-葡萄糖-6-磷酸可以被NADP氧化，形 成D-葡萄糖酸鹽-6-磷酸和NADPH
D-葡萄糖-6-磷酸+NADP+㈣*1·6—8* P-葡萄糖酸鹽-6-磷酸+NADPH+ H+這個反應(yīng)中形成的NADPH量可以換算成D-葡萄糖的量。這個試驗中D-葡萄糖的量在1到50 μ g之間。為了產(chǎn)生足夠的吸光度差異，樣品
36溶液稀釋到D-葡萄糖的濃度在0. 08到0. 5g/L之間。上清儲存在_20°C的冰箱中終止酶反應(yīng)，用ROW系列稀釋。50 μ L稀釋上清與10 μ L 包含己糖激酶(約320U)和葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(約160U)的溶液在室溫下孵育15分 鐘，其中酶用含NADP、ATP和硫酸鎂的三乙醇胺緩沖液(ρΗ = 7. 6)溶解。按照羅氏的方法將樣品加入到一次性比色杯(1cm光路)中，利用分光光度計在室 溫下測定340nm處的吸光度值。D)測定莢膜多糖的含量N-乙酰-D-神經(jīng)胺酸(唾液酸)是一種酸性糖，通常作為真核細(xì)胞糖類結(jié)構(gòu)的組 分而存在(糖蛋白和糖脂)。對于原核細(xì)胞來說，也發(fā)現(xiàn)唾液酸是少數(shù)幾個屬的致病性細(xì) 菌的cps組成成分[10]。事實上，GBS血清型特異性的cps包含如下糖的重復(fù)單位N-乙 酰-神經(jīng)氨酸或唾液酸、葡萄糖、半乳糖和N乙酰葡萄糖胺。由于唾液酸是多糖的組成成分， 因此測定其含量可用于檢測血清型特異性的cps的產(chǎn)量，方法由Svermerholm設(shè)計(參考 文獻(xiàn)176)。在測定唾液酸的含量以前，滅活樣品中的cps要先經(jīng)過部分純化和濃縮。多糖用 氫氧化鈉水解36小時以后，1. 5mL滅活的樣品在15600xg離心25分鐘(離心機(jī)5415R-艾 本德股份公司(Eppendorf))以去除細(xì)胞。上清液用ROW按1 10稀釋，然后用森曲肯 (centricon)離心式濾器(米力普(Millipore)的Ultracel YM-30再生纖維素)純化和濃 縮。按照下列方法使稀釋的樣品通過各向異性膜超濾可達(dá)到需要的濃度。將樣品池插入到過濾瓶內(nèi)，然后在樣品池內(nèi)加入1. 5mL水，共添加兩次，在 2519xg、20°C離心20分鐘，清潔森曲肯系統(tǒng)。系統(tǒng)準(zhǔn)備好以后加入1. 5mL稀釋的樣品， 2519xg離心30分鐘。離心力可使溶劑和低分子溶質(zhì)透過膜進(jìn)入到過濾瓶內(nèi)。大分子如cps 被保留在樣品池內(nèi)的膜上。樣品體積縮小后，可提高保留的溶質(zhì)的濃度。保留物用0.5mL 0. 5m的NaCl洗滌三次以去除雜質(zhì)，然后在2519xg、20°C離心20分鐘。為了回收，將0. 5mL 0. 5M的NaCl加入到樣品池內(nèi)。通過將一個瓶子放到樣品池 上，倒置，然后在205xg離心1分鐘使cps轉(zhuǎn)移到保留物瓶內(nèi)?；厥罩貜?fù)兩次以回收所有的
Cps0為了測定唾液酸的量，使用包含間苯二酚-鹽酸的比色法。定量分析試劑包含 0. 2g間苯二酚(默克)，溶于包含80ml 37% HCl、20mL水和20 μ mo 1 CuS045H20(默克)的 溶液中，以確保酸性水解。試驗過程如下lmL包含5_25 μ g唾液酸的樣品加入到2mL間苯二酚試劑中。加 入試劑后混合溶液，在沸水浴中100°c加熱20分鐘，期間可產(chǎn)生藍(lán)-紫色。試管在室溫下冷卻，利用Novaspec 11分光光度計測定554nm處的吸光度值。使 用Icm光路和ImL容量的一次性比色杯。在5_25 μ g范圍內(nèi)，吸光度值與唾液酸的濃度成 正比。為了補(bǔ)償生物材料中的非特異性顏色，對照樣品不添加間苯二酚。在計算唾液酸 的量之前，待測樣品的吸光度值減去空白樣品的吸光度值。同時進(jìn)行的是，在相同條件下準(zhǔn)備0、5、10、15、20和25yg N-乙酰唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶 液。N-乙酰唾液酸的量通過UV LAMBDA程序利用N-乙酰唾液酸標(biāo)準(zhǔn)溶液得到的公式計算。090、H36b和M781的莢膜多糖包含31% (w/w)的N-乙酰唾液酸。CJBlll的莢膜多糖包含23% (w/w)的N-乙酰唾液酸.因此，cps濃度可用這個校正因子確定。Cps的體 積產(chǎn)率用mg/L表示，cps比產(chǎn)率用mg/L. OD表示。實施例4-簡化的復(fù)合培養(yǎng)基和線性添加A)接種物制備工藝的開發(fā)在制備GBS血清型特異性cps的發(fā)酵工藝中，使用包含500mL培養(yǎng)基的2000mL搖 瓶準(zhǔn)備接種培養(yǎng)物。但是，這些搖瓶不適合中試規(guī)模和生產(chǎn)規(guī)模的制備。因此，用新?lián)u瓶研 究四種GBS菌株(090、H36b、M781和CJB111)的行為以開發(fā)出適于中試規(guī)模的接種物制備 工藝。然后按照cGMP的要求利用這個工藝制備I期臨床前試驗所用的批次。本實施例的第一個目標(biāo)是找到這四種GBS菌株在包含IOOOmL培養(yǎng)基的5000mL錐 形瓶中的生長參數(shù)，另外還研究指數(shù)生長后期所需的最佳培養(yǎng)時間以及發(fā)酵罐中合適的PH 值。第二目標(biāo)是研究用于接種搖瓶的工作種子液的體積，這是為了調(diào)整培養(yǎng)時間，使菌株具 有合適的生長速率的同時可以在發(fā)酵日之前的晚上(培養(yǎng)時間約8小時)或者在發(fā)酵日早 晨較早的時候(培養(yǎng)時間約3小時)開始接種。三種GBS血清型的研究用3mL工作種子液接種IOOml新鮮無菌接種培養(yǎng)基。另夕卜， 每個試驗都進(jìn)行兩次以確保重現(xiàn)性。但是，由于得到的生長曲線和倍增時間是一樣的，因此 每個試驗只用一個結(jié)果。對于090菌株來說，細(xì)胞的指數(shù)生長期為6. 5小時，倍增時間為30分鐘(μ _ = 1. 411Γ1)。因此，在6. 8的合適ρΗ條件下，6小時就足以達(dá)到指數(shù)生長中期。由于這個時間無 法在發(fā)酵日的前一天晚上接種搖瓶，因此工作種子液的體積減少到0. ImL以延長這個培養(yǎng) 時間。在這些條件下，細(xì)菌的指數(shù)生長期為8. 5小時，倍增時間為35分鐘(Ufflax= 1. 201Γ1)。 因此，這個菌株的接種培養(yǎng)物準(zhǔn)備時間需要8小時。對于H36b菌株來說，只進(jìn)行一個試驗，工作種子液體積為3mL。細(xì)胞立即進(jìn)入指 數(shù)生長期，倍增時間為25分鐘(μ_= 1.651^)，減速期開始于4. 5小時后。因此，為了使 OD處于0. 8-1. 2的范圍，使ρΗ在6. 5左右(7+0. 5)，這個菌株的培養(yǎng)基必須在發(fā)酵前4小 時接種。對于Μ781菌株來說，試驗進(jìn)行兩次，第一次用3mL的工作種子液，第二次用0. ImL 的工作種子液。用3mL的工作種子液培養(yǎng)時間需要3小時。為了使培養(yǎng)時間延長2. 5小時 培養(yǎng)過夜(5倍增時間)，使用0. ImL的工作種子液。我們觀察到時間差只有30分鐘，倍增 時間從31. 4分鐘(Ufflax = 1. 321Γ1)下降到27. 5分子(μ max = 1. 511Γ1)。因此這個菌株用 0. ImL的工作種子液，搖瓶必須在發(fā)酵前8小時接種。對于CJBlll菌株來說，只進(jìn)行一個試驗，工作種子液體積為3mL。細(xì)胞立即進(jìn)入 指數(shù)生長期，倍增時間為21分鐘(μ_= 1.9811_1)，減速期開始于4.5小時后。因此，為了 使OD處于0. 8-1. 2的范圍，使ρΗ在6. 5左右(7+/-0. 5)，這個菌株的培養(yǎng)基必須在發(fā)酵前 4小時接種。在這個新接種工藝能用于中試規(guī)模的發(fā)酵前，必須在cGMP條件下研究這四株 GBS,以進(jìn)一步驗證接種物制備工藝。如《藥品生產(chǎn)和質(zhì)量管理規(guī)范》(GoodManufacturing Practices)(卷4)所述“驗證試驗需按照確定的方法進(jìn)行。當(dāng)采用任何新生產(chǎn)工藝或制 備方法時，步驟應(yīng)該能夠證明其在常規(guī)工藝中的適用性。利用特殊材料和設(shè)備的確定的工 藝應(yīng)當(dāng)顯示能夠始終如一地生產(chǎn)出復(fù)合質(zhì)量要求的產(chǎn)品”。這個新的接種物制備工藝用要每個菌株的最佳工作種子液體積重復(fù)驗證。對于090菌株來說，要達(dá)到理想的范圍，即OD 為1 士0.2，pH為6. 5士0.2，要用0. ImL的工作種子液和8. 5小時的培養(yǎng)時間。對于H36b菌 株來說，達(dá)到指數(shù)生長晚期需要3mL的工作種子液和4小時的培養(yǎng)時間。對于M781菌株來 說，要達(dá)到0. 8-1. 2的理想OD范圍要用0. mL的工作種子液和7. 50小時的培養(yǎng)時間。對于 CJBlll菌株來說，達(dá)到理想OD需要3mL的工作種子液和4小時的培養(yǎng)時間。這個接種物制備工藝可用于中試規(guī)模的發(fā)酵，要使200L發(fā)酵罐的初始OD達(dá)到 0. 032需要4個搖瓶，每個搖瓶包含IOOOmL培養(yǎng)基。B)發(fā)酵工藝開發(fā)i)復(fù)合培養(yǎng)基中添加維生素溶液的需求量驗證由于GBS是營養(yǎng)缺陷型微生物，因此它不能合成特殊有機(jī)化合物，如氨基酸和維 生素，這些化合物是其生長所必須的。因此，已經(jīng)開發(fā)出了一種低成本的不含動物源組分的 復(fù)合培養(yǎng)基，如W007/052168所述。這個復(fù)合培養(yǎng)基可通過加熱滅菌，其中添加生物素和維 生素溶液，維生素包括硫胺素、核黃素、煙酸和鹽酸吡哆醇，溶于0. IM氫氧化鈉和甲醇中， 濃度為0. 5g/L。用于培養(yǎng)GBS的酵母提取物包含這些維生素，但是其比例因酵母自溶產(chǎn)物的生產(chǎn) 工藝和加工過程不同而不同(表2)(參考文獻(xiàn)177)。 為了得到低成本的簡單生產(chǎn)工藝，需要評價添加到復(fù)合培養(yǎng)基中的生物素和四種 維生素溶液的作用，其對無乳鏈球菌三種特殊菌株的生長和cps生產(chǎn)的效應(yīng)。在開發(fā)出適用于中試規(guī)模的cps工藝的發(fā)酵工藝之前，用實驗室規(guī)模的發(fā)酵罐監(jiān) 測三種GBS血清型的生長情況，使用的參數(shù)是上述實施例中所開發(fā)出來的。在這些條件下，加入葡萄糖3小時后最終OD是不同的，090菌株的OD為14，而H36b 的OD為28. 5，這些菌株的cps濃度在300-550mg/L之間?；诎踩缘脑蛞苊馐褂眉状?，同時維生素在氫氧化鈉中會丟失其特性，因 此選擇硫胺素、鹽酸吡哆醇和煙酸的ROW溶液。同時，對工藝進(jìn)行第二項改動。由于維生素 是不耐熱的化合物，酵母提取物培養(yǎng)基要用0. 22 μ m孔徑的濾膜過濾除菌，而不是高壓滅 菌，通過無菌操作添加磷酸鹽培養(yǎng)基，而不是在121°C高壓滅菌30分鐘?？紤]到上述改動，每一個菌株都要進(jìn)行新的發(fā)酵試驗。雖然三個菌株的生長情況等于(H36b)或好于(090和M781)上述實施例建立的工藝，但是培養(yǎng)物依然有色素產(chǎn)生。事 實上，在Fraile等人的文章中，整合到細(xì)胞壁上的橙黃色色素的產(chǎn)生是人溶血性GBS的特 殊特性，可作為用培養(yǎng)基鑒定GBS臨床樣品的基礎(chǔ)(參考文獻(xiàn)178)。為了去除這種化學(xué)污 染(顏色)，純化工藝需要一個額外步驟，該步驟使用Z-碳表面。對于發(fā)酵結(jié)束時的cps產(chǎn)量來說，經(jīng)過改動的工藝可以使090和M781菌株的cps 濃度升高約100mg/L，M781菌株的cps濃度升高約300mg/L。另外，每克細(xì)胞干重的cps百 分含量也更高。對于這三株無乳鏈球菌來說，添加核黃素不是必須的，因為酵母提取物中的 維生素濃度足以滿足這些菌株的營養(yǎng)需求。為了減少培養(yǎng)基中添加的維生素溶液量，進(jìn)行只使用生物素的試驗。雖然H36b和 M781的cps濃度輕微下降，但是cps產(chǎn)量依然比上述實施例建立的工藝有提高。對于無乳 鏈球菌的生長和cps生產(chǎn)來說，復(fù)合培養(yǎng)基中添加維生素不是必須的，因為除了生物素以 外，酵母提取物中的維生素足以滿足這三種特殊GBS菌株的營養(yǎng)需求。另外，根據(jù)純化的數(shù)據(jù)，缺乏維生素的條件下產(chǎn)生的cps的結(jié)構(gòu)與上述實施例建 立的工藝所得到的結(jié)構(gòu)是一樣的，乙?；潭鹊?，產(chǎn)物的純度可以接受。我們還監(jiān)測了去除生物素后090菌株的生長情況。在這個試驗中，OD值從18降 低到14，cps濃度降低超過100mg/L。酵母提取物中的生物素濃度不足以滿足這個GBS菌 株的生長要求。事實上，從酵母提取物的組成來看，生物素存在的量(0. 25mg/100g)比其他 維生素低?？傊?，去除硫胺素、核黃素、煙酸和鹽酸吡哆醇對GBS的生長和cps產(chǎn)生的影響很 小。因此，從發(fā)酵工藝中去除四種維生素，這樣復(fù)合培養(yǎng)基中只添加生物素。對于CJBlll 來說，最終條件也只使用生物素。ii)驗證用于生產(chǎn)GBS血清型特異性莢膜多糖的復(fù)合補(bǔ)料分批工藝的必要性據(jù)報道，細(xì)胞生長速率是調(diào)節(jié)cps產(chǎn)生的主要因素，III型cps生長速率依賴性的 產(chǎn)生不依賴于生長限速化合物(參考文獻(xiàn)173)。如W02007/052168所述，現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)出 了一種復(fù)合補(bǔ)料分批發(fā)酵工藝，該工藝可維持有利于cps生成的營養(yǎng)環(huán)境和生長速率。這 種復(fù)合補(bǔ)料分批工藝結(jié)合了指數(shù)技術(shù)降低細(xì)菌倍增時間和PH穩(wěn)態(tài)技術(shù)在最后3小時使用 葡萄糖以提高cps生產(chǎn)力。這個工藝結(jié)合了分批培養(yǎng)和連續(xù)培養(yǎng)技術(shù)的優(yōu)點。事實上，補(bǔ) 料分批發(fā)酵可得到很高的細(xì)胞密度，因為指數(shù)生長期延長以及在發(fā)酵期間可控制底物進(jìn)料 的條件。然而，復(fù)合補(bǔ)料分批技術(shù)需要使用帶有復(fù)雜算法的軟件來控制發(fā)酵，使用這個軟件 必須要驗證算法是否復(fù)合GMP標(biāo)準(zhǔn)。因此，要簡化發(fā)酵工藝以避免使用算法。按照上述實施例建立的工藝，使用相同的OD值開始每一次進(jìn)料，瞬時添加。另外， 每一批添加150g/L酵母提取物和500g/L葡萄糖，占初始批體積的10%。兩次瞬時添加分 別在OD為3和4. 5時，占總需求體積的1/5和4/5。當(dāng)OD達(dá)到10時，開始線性添加濃縮葡 萄糖以取代PH穩(wěn)態(tài)期。添加速率需要經(jīng)過計算以使葡萄糖添加的量與3小時復(fù)合補(bǔ)料分 批工藝中的相同。利用新工藝進(jìn)行每一個菌株的發(fā)酵，監(jiān)測細(xì)胞密度和cps產(chǎn)量。對于090菌株來 說，簡化工藝的結(jié)果與復(fù)合補(bǔ)料分批工藝的結(jié)果相同。對于090和H36b菌株來說，生長速 率比復(fù)合補(bǔ)料分批工藝快，發(fā)酵結(jié)束時的OD從24增加到32.每克細(xì)胞干重的cps濃度和 cps量分別提高約300mg/L和5mg。ps/g。DW。對于M781菌株來說，生長速率和cps產(chǎn)量相同。
40因此，可以通過線性添加葡萄糖而不監(jiān)測PH來簡化發(fā)酵工藝。對于CJBlll來說，只進(jìn)行最 后的簡化線性添加而不監(jiān)測PH的過程來驗證該方法的效率。這個使用兩次瞬時添加酵母提取物和線性添加葡萄糖的工藝是優(yōu)選的中試規(guī)模 的發(fā)酵方法。這個新工藝無需算法或在培養(yǎng)物中添加維生素溶液。由酵母提取物、磷酸鹽、 葡萄糖和生物素組成的復(fù)合培養(yǎng)基是一種低成本的高效工藝，可得到具有重現(xiàn)性的生長行 為和cps產(chǎn)生。C)預(yù)驗證發(fā)酵工藝我們驗證和優(yōu)化了以前開發(fā)出的用于生產(chǎn)GBS cps的發(fā)酵工藝。我們監(jiān)測了 H36 菌株的生長和cps產(chǎn)生，其中每一個參數(shù)都經(jīng)過了改動，并且與對照培養(yǎng)物比較。報告了 DOT研究、溫度和pH。培養(yǎng)溫度為36°C，pH為7. 3，整個過程中培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧維持在30%。添加葡萄 糖3小時后，最終OD為25. 3，平均生產(chǎn)率為1. 84g/L. h。每克細(xì)胞干重的cps濃度和cps 量分別為 540mg/L 和 59mg。ps/gCDW。I)溶氧水平的影響無乳鏈球菌是一種兼性厭氧微生物，在有氧的條件下可通過有氧呼吸合成ATP; 但是它也能轉(zhuǎn)化成厭氧生長。首選，培養(yǎng)基內(nèi)的溶氧維持在15%。在發(fā)酵結(jié)束時可以觀察到平均生產(chǎn)率從 1.84g/L.h下降到1. 14g/L.，但是590nm處的OD依然能達(dá)到23. 2。cps濃度降低，約為 406mg/L,每克細(xì)胞干重的 cps 較少(39. 8mgcps/gCDff)。溶氧維持在60%進(jìn)行相同的發(fā)酵試驗。在這種情況下，平均生產(chǎn)率為1. 16g/L.h， 最終OD為20. 5。特異生產(chǎn)率降低到433mg/L，每克細(xì)胞干重內(nèi)的cps量減少到49mg。ps/gmw。根據(jù)這些結(jié)果，中試規(guī)模的生產(chǎn)選擇30%的溶氧，攪拌速率為50_350rpm，空氣流 速為20-100L/min。由于氧比空氣貴，因此只在發(fā)酵過程的最后數(shù)小時使用，從而使生產(chǎn)工 藝成本維持在低水平。ii)溫度的影響我們還監(jiān)測了改變溫度時的生長情況和cps產(chǎn)生情況，改變溫度是指比標(biāo)準(zhǔn)溫度 36°C升高或降低2°C。溫度降低到34°C，倍增時間將下降，平均生產(chǎn)率從1. 84g/L. h下降到1. 04g/L. h。 但是，cps濃度將下降到60% (312mg/L)，在此溫度下?lián)p失約20mg。ps/gCDW。當(dāng)溫度調(diào)整到38°C時，平均生長率從1. 84g/L. h下降到1. 45g/L. h。另外，在發(fā)酵 結(jié)束時cps濃度和每克細(xì)胞干重的cps量都明顯降低(分別為(267mg/L和32. lmg。ps/gCDW)。由于改變發(fā)酵工藝的溫度將影響GBS的倍增時間，并且會明顯降低血清型特異性 cps的產(chǎn)量，因此36°C被確定為GBS生長和cps產(chǎn)生的最佳溫度。iii)pH值的研究另外我們還通過試驗來優(yōu)化pH值，pH值從最初的7. 3調(diào)整到7. 0和7. 5。當(dāng)pH 維持在7. 0時，最終OD從23. 5增加到28. 8，平均生產(chǎn)率為1. 52g/L. h。但是cps濃度從 540mg/L 減少到 412mg/L。在pH7. 5的條件下進(jìn)行了相同的發(fā)酵過程。從OD來看生長行為相同，但是平均生 產(chǎn)率為1. 08g/L. h，cps體積生產(chǎn)率明顯下降，從540mg/L降低到323mg/L。因此在發(fā)酵期間，將PH維持在7. 3對細(xì)胞密度和cps產(chǎn)生來說是最佳的。iii)壓力值的研究通過試驗比較兩種壓力0. 2巴和0. 5巴下的發(fā)酵過程來優(yōu)化壓力。當(dāng)壓力維持在 0. 5時，最終OD為23. 5，平均生產(chǎn)率是1. 5g/L. h。但是，cps濃度從540mg/L降低到272mg/ L0經(jīng)過試驗檢測了溶氧、溫度、pH和壓力的效應(yīng)以后，我們發(fā)現(xiàn)以前建立的條件是獲 得高細(xì)胞密度和血清型特異性CPS的優(yōu)化條件。實施例4-開發(fā)化學(xué)成分確定培養(yǎng)基由于上述實施例所用的復(fù)合培養(yǎng)基所包含的有機(jī)材料的組成并不完全清除(例 如，酵母提取物)，因此發(fā)酵工藝的表現(xiàn)是有差異的。一種降低變異性但是能夠保持生產(chǎn)率 的方法是用化學(xué)成分確定培養(yǎng)基替代復(fù)合培養(yǎng)基，化學(xué)成分確定培養(yǎng)基主要由無機(jī)化合物 組成。這種替換使發(fā)酵工藝可控，并且能簡化多糖的純化。以前的研究(參考文獻(xiàn)179)證明無乳鏈球菌可在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中生長，這 種培養(yǎng)基可獲得與復(fù)合培養(yǎng)基一樣的生長速率和生長量。本研究的目的在于首先研究代表 血清型III的無乳鏈球菌M781菌株的生長特性及其所需的生長因子。為了提高生物質(zhì)和 cps的產(chǎn)量，我們開發(fā)了一種簡單的補(bǔ)料分批工藝。A)利用化學(xué)成分確定培養(yǎng)基進(jìn)行GBS生長研究為了開發(fā)補(bǔ)料分批工藝，一般來說必須首先分析微生物以確定最佳的無生命條 件、不同的生長期、消耗的和產(chǎn)生的組分、生物質(zhì)和產(chǎn)物形成之間的關(guān)系、生長限速底物以 及比生長速率和限速底物濃度之間的關(guān)系。但是，有關(guān)GBS的行為信息已經(jīng)從用于開發(fā)復(fù) 合培養(yǎng)基的研究中獲知。在上述實施例中用復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)GBS所用的最佳pH和溫度條 件應(yīng)用到上面表1所述的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基上。i)錐形瓶的GBS生長試驗M781菌株生長預(yù)實驗用500mL錐形瓶通過分批培養(yǎng)進(jìn)行。細(xì)胞在指數(shù)生長期培養(yǎng) 8小時，倍增時間為45分鐘(μ ^x = O-Qlh-1) ο第一個生長期過后，比生長速率開始下降， 細(xì)胞進(jìn)入2小時的減速期。最終光密度在1. 5左右，當(dāng)光密度達(dá)到0. 7左右時指數(shù)生長期結(jié)束。ii) 2L發(fā)酵罐的GBS生長試驗第二步，用2L發(fā)酵罐監(jiān)測GBS生長情況。在這些條件下，培養(yǎng)基的pH通過自動添 加2M的氫氧化鈉維持在7. 3。為了活化細(xì)胞，使用上述搖瓶內(nèi)的培養(yǎng)物。當(dāng)接種物搖瓶達(dá)到指數(shù)生長后期時 (OD590nm)，這種培養(yǎng)物的體積用于接種1. 8L新鮮培養(yǎng)基，得到的初始OD為0. 4。細(xì)胞立刻進(jìn) 入指數(shù)生長期，持續(xù)3小時，倍增時間為42分鐘(μ _= LOOtT1)。2小時的減速期之后是 靜止期，這時的OD為2. 56。搖瓶和發(fā)酵罐的倍增時間相同。雖然最終的OD有稍許提高，但 是生物質(zhì)產(chǎn)量(0.05g/L.h)依然很低。和發(fā)酵罐中所見到的一樣，pH維持在7. 3。另外，可 以看到葡萄糖不是GBS的限速物質(zhì)，因為當(dāng)細(xì)胞開始進(jìn)入減速期時可用的葡萄糖為5. 7g/ L0B)限速化合物的鑒定根據(jù)幾乎完全已知的酵母提取物培養(yǎng)基的組分，比較復(fù)合培養(yǎng)基工藝所用的營養(yǎng)
42源的濃度和批確定培養(yǎng)基的組分以確定GBS達(dá)到最終約15的OD所需的不同化合物之間的 合適比例，同時鑒定生長限速化合物。使用復(fù)合培養(yǎng)基的工藝批培養(yǎng)基中包含17g/L酵母 提取物，在進(jìn)料期間再添加19g/L，因此共有36g/L供無乳鏈球菌使用。比較36g/L酵母提取物的組分和成分確定培養(yǎng)基的初始濃度，比較內(nèi)容包括礦物 質(zhì)、葡萄糖、維生素和氨基酸含量(參見表3)。對于礦物質(zhì)源來說，現(xiàn)有的成分確定培養(yǎng)基 中的所有化合物都足以滿足GBS生長需求，但是鉀比復(fù)合培養(yǎng)基高6. 5倍。對于維生素和氨 基酸源來說，使用成分確定培養(yǎng)基的工藝所用的所有濃度都低于使用復(fù)合培養(yǎng)基的工藝。 酵母提取物中的維生素或氨基酸濃度的比例與成分確定培養(yǎng)基內(nèi)的批濃度相似，但是與分 子的特性不同。然而，酵母提取物的精確組分還未完全清楚。比較所用的數(shù)值也是平均值， 每種組分的比例因酵母提取物的生產(chǎn)工藝和加工過程不同而有明顯區(qū)別。表3 復(fù)合培養(yǎng)基和CDM工藝組分比較 實施例5-化學(xué)成分確定培養(yǎng)基擴(kuò)展用于發(fā)酵補(bǔ)料分批發(fā)酵通常以批模式開始，生物質(zhì)達(dá)到一定濃度或者底物消耗一定程度后 向發(fā)酵罐內(nèi)添加限速底物溶液。因此，營養(yǎng)培養(yǎng)基必須是簡單組合物。本研究的目的在于 開發(fā)出一種能夠鑒定限速化合物但是不影響生長速率的批培養(yǎng)基。A)開發(fā)用于補(bǔ)料分批工藝的批培養(yǎng)基為了開發(fā)出成分確定的補(bǔ)料分批培養(yǎng)基，需要逐個添加限速化合物，評價其對生 長的影響。首先將表2的每一種維生素的濃度都提高到10倍。結(jié)果發(fā)現(xiàn)維生素對GBS的 生長是至關(guān)重要的。細(xì)胞立刻進(jìn)入指數(shù)生長期，持續(xù)4小時，倍增時間從42分鐘(μ_ = LOOtT1)下降到33分鐘(μ_= 1.261^)。3小時以后，細(xì)胞進(jìn)入減速期，持續(xù)2小時后進(jìn) 入靜止期，這時已培養(yǎng)5小時。最終的OD為3. 70，比以前的試驗高出50%。在批培養(yǎng)基中 加入維生素后，可以觀察到正效應(yīng)，但是他們不是唯一的限速化合物。指數(shù)生長期在3小時 后結(jié)束，但是在細(xì)胞進(jìn)入減速期時依然還有6. 3g/L的葡萄糖可用。添加IOX維生素和IOX氨基酸進(jìn)行相同的試驗。對于添加IOX維生素的發(fā)酵來說， 最終OD更高(OD59tlnm = 4. 5)。細(xì)胞的指數(shù)生長期持續(xù)4小時。葡萄糖不是限速化合物，因為 細(xì)胞進(jìn)入減速期時依然還有4g/L葡萄糖。向初始培養(yǎng)基中添加IOX的鉀進(jìn)行相同的試驗。在這種情況下，倍增時間延長(td =49分鐘)，細(xì)胞進(jìn)入靜止期時的最終OD降低(OD59tlnm = 2. 9)。初始鉀濃度增加10倍對 生長有副作用。因此，鉀需要通過進(jìn)料來添加，或者以較小的批量添加以避免添加的鉀使鉀 的濃度達(dá)到抑制水平。
按照本試驗，批培養(yǎng)基中礦物質(zhì)的含量與初始的化學(xué)成分確定培養(yǎng)基相同，但是 維生素和氨基酸的濃度都增加10倍。磷酸鹽和碳源添加到進(jìn)料培養(yǎng)基中，但是要確定每一 種組分的濃度，必須和使用復(fù)合培養(yǎng)基的工藝進(jìn)行新的比較。由于批培養(yǎng)基中存在33g/L 的葡萄糖，因此在線性添加期間在加入55g/L葡萄糖。從而使葡萄糖和IOX的鉀的比例相 同，進(jìn)料培養(yǎng)基組成如下275g/L葡萄糖、10. 08g/L K2HPO4和14. 8g/L KH2PO40 500mL這種 溶液添加到1.2L批培養(yǎng)基內(nèi)。B)開發(fā)補(bǔ)料分批工藝補(bǔ)料分批發(fā)酵的策略是以GBS消耗底物相同的速率添加限速底物。營養(yǎng)物的進(jìn)料速率可通過決定微生物的生長速率和產(chǎn)物形成所需的碳循環(huán)的效 率以及使副產(chǎn)物最小化來影響補(bǔ)料分批發(fā)酵。C)B型鏈球菌所需的生長因子無論是自養(yǎng)菌還是異養(yǎng)菌都需要少量的某些必須有機(jī)化合物來維持生長，微生物 無法從現(xiàn)有的營養(yǎng)素中合成這些化合物。生長因子是細(xì)胞所需要的少量化合物，因為它們要在生物合成中完成特殊任務(wù)。 對生長因子的需求是因為細(xì)胞內(nèi)有被阻斷的代謝通路或者缺少代謝通路。一般分為三類 (1)核酸合成所需的嘌呤和嘧啶；(2)蛋白質(zhì)合成所需的氨基酸；以及(3)作為某些酶的輔 酶和功能基團(tuán)的維生素。本研究的目的在于鑒定無乳鏈球菌M781菌株所需的生長因子，從而可以通過減 少化合物的數(shù)目來簡化培養(yǎng)基以及確保低成本的生產(chǎn)工藝。D)無乳鏈球菌M781菌株所需的氨基酸通過從培養(yǎng)基中逐個去除氨基酸我們發(fā)現(xiàn)L-丙氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酰胺和 L-脯氨酸是可有可無的(參見圖20和表4)。這些氨基酸通常可使?jié)岫戎当葘φ张囵B(yǎng)物升 高80%以上，但是如果缺少其他任何氨基酸，培養(yǎng)基中的細(xì)菌將無法生長。
表4 從CDM刪除單個氨基酸對GBS M781菌株生長的影響+ 在缺失該氨基酸時，M781菌株的生長水平只有對照的40%或更低-生長水平至少是對照的40%。當(dāng)培養(yǎng)基中存在15種氨基酸時可以得到滿意的生長水平。利用2L規(guī)模的發(fā)酵來 比較只有必需氨基酸時M781的生長情況。其生長水平與存在19種氨基酸時的水平相似。 在兩種情況下，沒有觀察到遲滯期，但是從化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中去除4種氨基酸后倍增 時間從 62 分鐘(μ max = 0. & 2Κ1)降低到 78 分鐘(μ max = 0. 5331^)。刪除這四種氨基酸對M781菌株的OD和cps產(chǎn)生的影響將在最終的工藝中確定。E)無乳鏈球菌M781菌株所需的維生素通過從培養(yǎng)基中逐個去除維生素我們發(fā)現(xiàn)泛酸鈣和煙酰胺是可有可無的(參見 圖21和表5)。在刪除生物素、葉酸、鹽酸吡哆醇、核黃素和硫胺素的試驗中，濁度值大于 65%。當(dāng)只添加泛酸鹽和煙酰胺時，得到了與對照相同的最終0D。
46 表5 從化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中刪除單個維生素對B型鏈球菌M781菌株生長的影 響+ 在缺失該氨基酸時，M781菌株的生長水平只有對照的40%或更低-生長水平至少是對照的40%。利用只含泛酸鈣和煙酰胺的原始培養(yǎng)基進(jìn)行分批發(fā)酵。培養(yǎng)8小時以后，OD達(dá)到 0.2。因此，只用這兩種維生素的培養(yǎng)不是最佳的。利用500mL錐形瓶進(jìn)行一個新試驗，逐 個向已經(jīng)添加泛酸鈣和煙酰胺的培養(yǎng)基中添加經(jīng)過第一搖瓶試驗證明是生長所不需要的 維生素。在這個試驗中，與只用泛酸鈣和煙酰胺的試驗所觀察到的結(jié)果一樣，培養(yǎng)18小時 后每個搖瓶內(nèi)的濁度值都與對照培養(yǎng)物相同。在發(fā)酵罐中進(jìn)行的其他試驗?zāi)軌蜩b定出無乳鏈球菌M781菌株生長所必需的維生
ο實施例6-中試生產(chǎn)本實施例的目的在于驗證上述實施例的參數(shù)是否能夠用于以生產(chǎn)規(guī)模來制備無 乳鏈球菌的血清型特異性莢膜多糖。接種物的培養(yǎng)i)培養(yǎng)基用溫度滅菌(高壓滅菌程序n° 1分鐘(min.)/最大(maX.)，40min.，121°C，表6)， 的4個5L搖瓶培養(yǎng)接種物，每個搖瓶內(nèi)包含IL復(fù)合培養(yǎng)基(17g/L酵母提取物Difco，8g/ L Na2HPO4. 2H20, 2g/L NaH2PO4. H2O和33g/L—水葡萄糖，0. 2 μ m奈爾基因公司一次性過濾系 統(tǒng)過濾除菌，用3M NaOH將給pH調(diào)整到7.3士0. 1)，在接種前添加IOmL維生素溶液(硫胺 素、核黃素、鹽酸吡哆醇和煙酰胺，每種0.05g/L，用0. IM NaOH稀釋，0.2μπι過濾除菌)和 5mL生物素(生物素0. 2g/L，0. 2 μ m過濾除菌)。 ii)搖瓶接種和培養(yǎng)條件每個搖瓶接種2. 75士0. 25mL從_70°C冰箱解凍的工作種子液。培養(yǎng)基在35士 1°C 的孵箱(IN-L0641)中培養(yǎng)，200士 IOrpm振蕩，培養(yǎng)4小時。然后通過測定590nm處的OD值 和革蘭氏染色來評價生物質(zhì)的濃度。如果OD59tlnm值達(dá)到1. 2-0. 6，并且革蘭氏染色的結(jié)果得 到確認(rèn)(只有革蘭氏陽性球菌)，那么將4個搖瓶的內(nèi)容物倒入5L熱滅菌(高壓滅菌程序 n° lmin. /max.)的瓶內(nèi)，這個瓶與 300L BB生物技術(shù)(B. Braun Biotech)/開麥普(Chemap) 發(fā)酵罐(ID VS-L0530)的孵育管相連。iii)接種物制備的關(guān)鍵變量接種物制備的關(guān)鍵變量描述于表7和表8中。 iv)設(shè)備的滅菌和清洗使用完以后，搖瓶和5L瓶要經(jīng)過熱滅菌(高壓滅菌程序n° 8，臟循環(huán)，參見表6 的說明)和清洗。B)300L發(fā)酵罐培養(yǎng)i)培養(yǎng)基和設(shè)備的準(zhǔn)備300L空發(fā)酵罐的機(jī)械管道和空氣過濾器要經(jīng)過滅菌(程序SEAL2和EXFC2)。然
48后檢查探針并校正。用PH為7和10的兩種緩沖液校正pH探針。氧探針的校正是將探針 放入通氮氣的水中設(shè)定為0%點，放入空氣中設(shè)定為100%點。其校正在發(fā)酵罐內(nèi)進(jìn)行。在300L發(fā)酵罐內(nèi)配制基礎(chǔ)培養(yǎng)基(120L，2g/L Na2HPO4. 2H20,120L加ImL消泡劑 "PPG 2500”)并滅菌(程序FVES 2)。滅菌期間檢查氧探針的0%值，如果需要重新初始化。 在滅菌的冷卻相之后，溫度降到36°C，加入17L150g/L的酵母提取物、9L 550g/L的一水葡 萄糖、2L維生素溶液(硫胺素、核黃素、鹽酸吡哆醇和煙酰胺，每種0.05g/L，用0. IM NaOH 稀釋)完成基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制，添加的溶液都用0.2μπι過濾滅菌。培養(yǎng)基氧化后校正氧探 針的100%值。加入4L接種物后，發(fā)酵的起始體積為150L，酵母提取物的終濃度為17g/L， 葡萄糖的終濃度為33g/L。這些添加都是通過可滅菌管道進(jìn)行的，管道帶有蠕動泵，最大速 度(400rpm)相當(dāng)于550mL/min的流速。ii)發(fā)酵過程和過程質(zhì)量控制接種前加入生物素溶液(1L 0.2g/L的生物素，0.2μπι過濾除菌)。然后用包含4 個搖瓶的接種物的5L瓶接種300L發(fā)酵罐。然后檢查下列參數(shù)值，如果需要進(jìn)行調(diào)整，在發(fā)酵過程中自動控制這些參數(shù)-培養(yǎng)溫度控制在36士 1 °C，-發(fā)酵罐內(nèi)的余壓設(shè)定在0.2巴，-pH設(shè)定在7. 3士0. 1，用4M NaOH調(diào)節(jié)。不用酸溶液校正pH，因為發(fā)酵時pH值會 自然下降，-初始攪拌速度設(shè)定在50rpm，初始?xì)饬髟O(shè)定在20L/min，-發(fā)酵罐內(nèi)泡沫水平通過肉眼觀察，如果需要用消泡劑PPG2500調(diào)整，-溶氧張力(DOT)設(shè)定在30%，通過如下方式逐級調(diào)節(jié)·攪拌(攪拌速度在50到350rpm之間)·氣流(數(shù)值范圍在20到lOOL/min)之間·氧流(數(shù)值范圍在0到lOOL/min)之間在發(fā)酵的批期采樣，接種2小時后采樣測定OD59tlnmt5然后每15分鐘采集一次樣品， 直到OD59tlnm達(dá)到3。達(dá)到該目標(biāo)OD后，開始用3. 6L酵母提取物溶液(150g/L)添加第一指 數(shù)分批進(jìn)料，群體倍增時間維持在300分鐘。第一次添加后約45分鐘，測定0D59(tam。然后每15分鐘采集一次樣品，直到OD59tlnm 達(dá)到5。達(dá)到該目標(biāo)OD后，開始用酵母提取物溶液(150g/L)添加第二指數(shù)分批進(jìn)料，群體 倍增時間維持在50分鐘。在這個第二指數(shù)分批進(jìn)料結(jié)束時，開始pH穩(wěn)態(tài)分批進(jìn)料。當(dāng)pH值超過7. 18時添 加一水葡萄糖溶液(550g/L)。在進(jìn)料期間每小時采集一次樣品測定0D59(tam。發(fā)酵在最后一次進(jìn)料后約3小時結(jié)束。然后停止參數(shù)的自動控制。攪拌速度設(shè)定 在lOOrpm，溫度設(shè)定在30°C。iii)發(fā)酵過程的關(guān)鍵變量發(fā)酵過程的關(guān)鍵變量描述于表9和表10中。 iv)設(shè)備的清潔、滅菌和清洗生物質(zhì)從300L發(fā)酵罐內(nèi)取出后，將200L ROW加入到發(fā)酵罐內(nèi)開始清潔。然后向 發(fā)酵罐內(nèi)添加3M NaOH直到pH達(dá)到11.溫度控制在80°C，保持30分鐘。冷卻到室溫后將 發(fā)酵罐內(nèi)的溶液倒入位置較低的廢液槽內(nèi)。然后加入200L ROff開始滅菌，按照標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程(SOP)激活程序(FVES2)。滅菌 的冷卻相結(jié)束后從發(fā)酵罐上取下PH和氧探針，分別儲放在3M KCl溶液和ROW中。最后用200L IM NaOH清洗發(fā)酵罐，IOOrpm攪拌至少30分鐘。洗滌后將這200L NaOH清空到killer tank內(nèi)，再通過噴霧囊向發(fā)酵罐內(nèi)加100L NaOH，這樣可以清洗罐的上 面部分。這100L用多葉回轉(zhuǎn)泵再循環(huán)至少30分鐘。經(jīng)過這個清洗步驟以后，發(fā)酵罐用ROW 清洗直到PH降低到5-7之間。C)生物質(zhì)離心i)設(shè)備準(zhǔn)備將一個含生理鹽水(約100L，9g/L NaCl，0. 2 μ m過濾除菌)的罐連接到轉(zhuǎn)移管上， 該轉(zhuǎn)移管將300L發(fā)酵罐與Alfa-Laval離心機(jī)(ID CT-L0526)連接起來。在離心過程中用 這個水洗滌生物質(zhì)團(tuán)。然后熱滅菌轉(zhuǎn)移管，像生物質(zhì)分離器和收集罐一樣。設(shè)備的準(zhǔn)備在 發(fā)酵結(jié)束前完成以便于發(fā)酵一結(jié)束就盡快開始離心。ii)連續(xù)流動離心過程連續(xù)流動離心過程由如下循環(huán)組成
以100L/h的流速離心生物質(zhì)7分鐘，手動調(diào)節(jié)。生物質(zhì)通過轉(zhuǎn)移管從發(fā)酵罐轉(zhuǎn)移 到分離器中，發(fā)酵罐內(nèi)的壓力加到0.6巴。以100L/h的流速用生理鹽水洗滌3分鐘，手動調(diào)節(jié)，排出細(xì)胞團(tuán)。這個循環(huán)可重復(fù)進(jìn)行直到生物質(zhì)處理完畢。不收集上清，而是將其排到廢物槽內(nèi)。 在處理期間細(xì)胞團(tuán)收到罐(VS-L0536)內(nèi)，然后通過硅酮連接管轉(zhuǎn)移到100L—次性無菌袋 內(nèi)進(jìn)行化學(xué)處理，余壓升高到0. 3巴。iii)離心的關(guān)鍵變量發(fā)酵過程的關(guān)鍵變量描述在表11中。 監(jiān)測的變量包括排出次數(shù)和收集的生物質(zhì)的重量。iv)設(shè)備的滅菌和清洗細(xì)胞團(tuán)離心并轉(zhuǎn)移到一次性袋內(nèi)后，加熱滅菌和清洗轉(zhuǎn)移管、分離器和生物質(zhì)的 收集罐。轉(zhuǎn)移管和分離器用100L NaOH在發(fā)酵罐內(nèi)室溫下清洗，然后通過轉(zhuǎn)移管以100L/h 的流速轉(zhuǎn)移到分離器內(nèi)。然后用20L IM NaOH循環(huán)30分鐘清洗收集罐，用噴霧囊清洗以便 于清洗罐的上部。經(jīng)過這個清洗步驟以后，再用ROW清洗罐，直到pH下降到5到7之間。D)細(xì)胞團(tuán)的化學(xué)處理i)細(xì)胞團(tuán)的滅活化學(xué)處理細(xì)胞團(tuán)是為了滅活細(xì)菌并使其釋放cps。處理包括向細(xì)胞團(tuán)內(nèi)加入4M NaOH溶液(通過蠕動泵的管)，達(dá)到0. 8M NaOH的理論濃度。添加的4M NaOH的重量等于 生物質(zhì)的重量除以4，因為IL等于1kg。這個步驟在帶有整合攪拌系統(tǒng)的100L—次性袋內(nèi) 完成，在LS系統(tǒng)(Levtech Sartorius System) (ID AG-10645，恒溫平衡攪拌器)中處理。 調(diào)節(jié)溫度使細(xì)胞團(tuán)的溫度維持在37°C，然后以ISOrpm攪拌一定的時間。12h足以滅活微生 物。36h是使細(xì)菌莢膜釋放cps的合適時間。在其他試驗中，我們發(fā)現(xiàn)Ih足以滅活微生物， 而24h是使細(xì)菌莢膜釋放cps的合適時間。相應(yīng)的，36h或24h是這個步驟的合適時間。ii)滅活的關(guān)鍵變量發(fā)酵過程的關(guān)鍵變量描述在表12中。
51 iii)中和與沉淀使用帶蠕動泵的硅酮管加入IM TRIS緩沖液，使終濃度達(dá)到0. IM0添加的TRIS的 重量為滅活的生物質(zhì)的重量除以9。這個添加的重要性在于避免中和期間細(xì)胞團(tuán)的pH發(fā)生 變化。因此用一次性袋內(nèi)的PH探針控制pH。加入6MHC1使最終pH達(dá)到7. 5-8. 5。加入2M CaCl2和96%乙醇溶液以沉淀細(xì)胞團(tuán)內(nèi)的蛋白質(zhì)和核酸。CaCl2的終濃度 為0. 05M,乙醇為30%。添加的2M CaCl2的重量等于中和的生物質(zhì)的重量除以19，96%乙 醇的重量等于中和的含CaCl2的生物質(zhì)的重量除以3. 1。E)經(jīng)過處理的細(xì)胞團(tuán)的微孔過濾和透析用CaCl2和30%乙醇化學(xué)處理的生物質(zhì)經(jīng)過微孔過濾回收釋放到上清中的多糖并 去除細(xì)胞殘留物以及蛋白質(zhì)和核酸沉淀物。i)設(shè)備準(zhǔn)備微孔過濾和透析采用SSII+底座(Sartorius Sartocon II plus holder)，其帶有 一次性容器和4個0. 22 μ m Hydrosart盒，每個0. 6m2，總表面積為2. 4m2。系統(tǒng)用90Nm的 轉(zhuǎn)矩扳手緊固。盒用20L IM NaOH處理，通過0. 2 μ m過濾除菌，使用多葉回轉(zhuǎn)泵保證和調(diào)節(jié)系統(tǒng) 內(nèi)的壓力。然后在如下條件下再循環(huán)滲余物和滲透物-入口壓力2·O士0. 2 巴-滲透物閥關(guān)閉5分鐘然后打開用蒸餾水清洗系統(tǒng)直到pH達(dá)到5-7，然后用20L生理鹽水(0. 9g/L NaCl，使用 0. 2 μ m過濾滅菌)洗滌，在如下條件下使pH達(dá)到5-7 -入口壓力Pin= 2. 0 士 0. 2 巴-滲透物壓力=Pperm= 0巴(打開閥門)-滲余物閥門關(guān)閉。微孔過濾前用透析緩沖液(34.77g/L NaCl,4. 49g/L TRIS，10. 93g/L CaCl2,pH用 6HC1調(diào)整到7. 8士0. 1，最終體積的WFI qsp 74. 4，96%乙醇直到最終體積，0. 2 μ m過濾除 菌)使盒條件化。ii)微孔過濾和透析包含處理的生物質(zhì)的一次性袋的出口連接到微孔過濾容器的入口上。容器的滲余 物出口連接到包含處理的生物質(zhì)的一次性袋上使處理的生物質(zhì)再循環(huán)。滲透物出口連接到 200L 一次性無菌袋上以收集滲透物。開始時滲透物閥門是關(guān)閉的，使細(xì)胞團(tuán)在微孔過濾系統(tǒng)內(nèi)循環(huán)。然后打開這個閥 門，控制多葉回轉(zhuǎn)泵的速度以達(dá)到如下條件-入口壓力Pin= 2. 0 士 0. 2 巴-滲透物壓力=Pperm= 0. 6 士 0. 1 巴
生物質(zhì)濃縮10倍，滲余物用3倍體積的緩沖液透析。為了準(zhǔn)確確定微孔過濾 系統(tǒng)內(nèi)的循環(huán)，滲余物的重量必須高于10kg。這樣滲余物濃縮直到生物質(zhì)的重量達(dá)到 10士0.5kg。然后以連續(xù)步驟透析。所用的緩沖液的重量用CaCl2-乙醇混合物的重量除以 理論濃縮因子10然后乘以透析理想循環(huán)數(shù)來計算。iii)滲透物過濾除菌在收集到200L —次性袋內(nèi)以前，滲透物用微孔過濾系統(tǒng)出口處的 2000cm2Sartobran P 0. 22 μ m濾器過濾除菌。最終產(chǎn)物儲存在室溫下，然后放行到純化部 門。iv)微孔過濾和透析的關(guān)鍵變量微孔過濾和透析的關(guān)鍵變量描述在表13中。 監(jiān)測的變量包括滲透物流速和多糖的量。ν)設(shè)備清洗微孔過濾以后將入口連接到包含100L生理鹽水的罐上以洗滌一次性盒和容器。 然后用20L IM NaOH清潔系統(tǒng)，滲透物和滲余物連接到入口上，再循環(huán)30分鐘，維持下列條 件入口壓力Pin = 2. 0士0. 2 巴滲透物閥門關(guān)閉5分鐘然后大開。然后清空系統(tǒng)和管道，用蒸餾水洗滌直到滲透物和滲余物的pH值達(dá)到5-7。未達(dá) 到這個目標(biāo)PH，拆解系統(tǒng)。微孔過濾和透析期間滲透物除菌所用的Sartobran P濾器的完整性檢測在將這批 產(chǎn)物放行到純化部門前進(jìn)行。F)發(fā)酵模式描述我們分析了 3種GBS菌株M781(血清型III)、H36b(血清型Ib)和090 (血清型 Ia)相應(yīng)的中試規(guī)模的發(fā)酵試驗的發(fā)酵模式并與30L發(fā)酵罐(BBBB公司(B. Braun Biotech Biostat))的實驗室規(guī)模的發(fā)酵進(jìn)行了比較，后者使用的是H36b菌株，工藝二者相同。三種中試規(guī)模發(fā)酵的OD59tlnm模式非常相似，與對照發(fā)酵也類似(參見圖22)。微生 物生長的一般模式可用如下方式描述批相持續(xù)約2. 5小時，此時的OD59tlnm等于3。酵母提 取物溶液的第一指數(shù)分批進(jìn)料(Fl，150g/L)持續(xù)約45分鐘，此時的OD59tlnm等于5。酵母提 取物溶液的第二指數(shù)分批進(jìn)料(F2，150g/L)持續(xù)約45分鐘，此時的OD59tlnm約等于10。一水 葡萄糖的第三PH穩(wěn)態(tài)分批進(jìn)料(F3，550g/L)持續(xù)約3小時。G)生長速率和群體倍增時間評價
53
在3個輪次的預(yù)實驗以及對照發(fā)酵過程中評價生長速率(μ)和群體倍增時間 (td)。數(shù)值顯示在圖22以及表14中。 預(yù)實驗輪次的第一指數(shù)分批進(jìn)料過程中的群體倍增時間在43到77分鐘的范圍 內(nèi)，這個結(jié)果至少和參照發(fā)酵一樣好。但是，理想的群體倍增時間為30分鐘。預(yù)實驗輪次 的第二指數(shù)分批進(jìn)料過程中的群體倍增時間在41到64分鐘的范圍內(nèi)，這個結(jié)果與參照發(fā) 酵幾乎一樣(55分鐘)，非常接近理論群體倍增時間(50分鐘)。H)莢膜多糖產(chǎn)量評價在發(fā)酵結(jié)束時利用比色法測定cps的濃度，該方法的根據(jù)是測定cps內(nèi)唾液酸化 合物的濃度。根據(jù)這個結(jié)果，通過cps濃度乘以發(fā)酵罐內(nèi)的最終體積(參照發(fā)酵20L，中試 規(guī)模的發(fā)酵215L)來計算培養(yǎng)期間產(chǎn)生的cps量。如下文“發(fā)酵相關(guān)分析方法”中所述，還 要計算出體積生產(chǎn)率和比生產(chǎn)率。數(shù)值報告在表15中。 I)初始工藝的簡化用兩種方式簡化發(fā)酵工藝以避免規(guī)模放大后可能出現(xiàn)的變化以及降低發(fā)酵罐污 染的風(fēng)險。第一種方式是從接種培養(yǎng)基和發(fā)酵罐的培養(yǎng)基中去除包含硫胺素、核黃素鹽酸吡 哆醇和煙酰胺(每種0. 05g/L,用0. IM NaOH稀釋，0. 2 μ m過濾除菌)的維生素溶液。確實， 實驗室規(guī)模的發(fā)酵結(jié)果顯示添加這些維生素并不是GBS生長所必須的，對cps產(chǎn)生的影響 可忽略不計。第二種方式是調(diào)整發(fā)酵過程中進(jìn)料相的參數(shù)。兩個酵母提取物指數(shù)進(jìn)料相可用兩 次瞬時添加替代，葡萄糖的PH穩(wěn)態(tài)進(jìn)料相可用線性添加替代。第一次瞬時添加(Fl)包括 當(dāng)OD59tlnm達(dá)到2. 5-3的范圍時用蠕動泵以550mL. mirf1的速度添加3. 6L 150g/L的酵母提 取物。第二次瞬時添加(F2)包括當(dāng)OD59tlnm達(dá)到4. 5-5的范圍時用蠕動泵以550mL. mirf1的速度添加13. 4L 150g/L的酵母提取物。第三次線性添加(F3)包括當(dāng)OD59tlnm達(dá)到10-12的 范圍時用蠕動泵以95mL. miiT1的速度添加17L葡萄糖溶液。J)發(fā)酵模式描述以及和以前輪次的比較我們分析了這個輪次預(yù)實驗的發(fā)酵模式并與第一系列的試驗進(jìn)行了比較，以確保 簡化的工藝對中試規(guī)模的發(fā)酵沒有任何影響。3次中試規(guī)模的發(fā)酵試驗的OD59tlnm模式非常相似，與第一輪次的預(yù)實驗所觀察到 的一般模式也很相似(參見圖23)。二者之間的相似性說明了工藝的修改對微生物的生長 沒有影響，如實驗室規(guī)模的發(fā)酵所證明的。K)生長速率、群體倍增時間和莢膜多糖產(chǎn)量的評價這個系列的生長速率和群體倍增時間(表16)與第一輪次的預(yù)實驗非常相似，沒
有觀察到明顯的區(qū)別。 這些預(yù)實驗的最終cps濃度與上一輪次的預(yù)實驗相同。這說明實驗室規(guī)模或中試 規(guī)模發(fā)酵工藝的修改沒有產(chǎn)生明顯差異(表17)。 L)工藝的關(guān)鍵步驟和工藝驗證所需的采樣計劃的確定在這兩個系列的中試規(guī)模發(fā)酵過程中，已經(jīng)用其接受標(biāo)準(zhǔn)和相關(guān)采樣計劃確定 了關(guān)鍵工藝步驟的重要過程質(zhì)量控制。第一過程質(zhì)量控制是接種前搖瓶的OD59tlnm,優(yōu)選 0. 6-1. 8之間以避免在發(fā)酵罐內(nèi)開始培養(yǎng)時出現(xiàn)可能的遲滯期，如實驗室規(guī)模的發(fā)酵所見 的那樣。下面的過程質(zhì)量控制與培養(yǎng)物的純度相關(guān)搖瓶培養(yǎng)基做革蘭氏染色并將瓶子和 發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基加到培養(yǎng)板上培養(yǎng)以確保環(huán)境中無污染物。另外在培養(yǎng)結(jié)束時再進(jìn)行革 蘭氏染色并將發(fā)酵罐內(nèi)的培養(yǎng)基鋪到培養(yǎng)板上以證明發(fā)酵過程中無污染。細(xì)胞團(tuán)滅活36 小時后用0. SMNaOH溶解細(xì)胞團(tuán)并鋪到培養(yǎng)板上培養(yǎng)以證明細(xì)胞團(tuán)已被滅活。表18中所描 述的其他過程質(zhì)量控制用于計算cps的純化產(chǎn)率。我們設(shè)計出了一套參數(shù)變異模式(Po2，氣流，O2流，攪拌，pH，溫度)，這是發(fā)酵工藝重現(xiàn)性的好指標(biāo)。L)通用發(fā)酵模式的描述以及與上述輪次的比較這個輪次試驗的OD59tlnm模式非常相似，與本實施例中較早輪次的試驗所觀察的一 般模式也很相似(參見圖24)。這個系列的生長速率和群體倍增時間(表18)與預(yù)實驗輪次的結(jié)果是一致的。更 具體地說，三個輪次試驗進(jìn)料相的生長速率在以前報道的最大和最小生長速率數(shù)值之間。 但是，M781培養(yǎng)過程中F3相的生長速率以及090培養(yǎng)高喲吃中F2相的生長速率與以前報 道的最小值稍低(分別為0. 15 < 0. 18和0. 62 < 0. 65)，但是OD59tlnm的最終值都在較早輪 次的試驗所觀察到的OD59tlnm的極值之間(第一輪次的預(yù)實驗中090和H36b菌株的數(shù)值分 別為14和25. 1)。 通過比較三株細(xì)菌的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，試驗輪次中cps的最終濃度和量比預(yù)實驗輪次的 結(jié)果稍高(參見表19)。H36b菌株的數(shù)值在其他菌株以前獲得的數(shù)值之間(0.351^，位于 0. 26和0. 42之間，二者分別是090第一預(yù)實驗輪次的結(jié)果和M781第二預(yù)實驗輪次的結(jié) 果)。M781和090菌株的數(shù)值與預(yù)期的稍高。因此，這些菌株的cps/生物質(zhì)比例超過10%， 這意味著對純化有利。 關(guān)鍵過程質(zhì)量控制的分析第一個過程質(zhì)量控制是接種前搖瓶的OD59tlnm,范圍在菌株090的0. 80和M781的 1. 50之間。在發(fā)酵罐內(nèi)開始培養(yǎng)時沒有觀察到遲滯期。搖瓶培養(yǎng)物的純度分析通過革蘭氏 染色確定，結(jié)果顯示只有革蘭氏陽性球菌，儲液瓶和發(fā)酵罐的培養(yǎng)基在培養(yǎng)結(jié)束時也只有 革蘭氏陽性球菌。在滅活36小時后用0. SMNaOH稀釋滅活的細(xì)胞團(tuán)，鋪到培養(yǎng)板上培養(yǎng)。在4個輪次的試驗過程中參數(shù)的變異模式(Po2，氣流，O2流，攪拌，pH，溫度)與預(yù) 實驗輪次所報道的一般模式相似。
表20 中試規(guī)模發(fā)酵輪次的結(jié)果(多糖純化) * μ g/mg 干重表21 中試規(guī)模發(fā)酵輪次的結(jié)果(活化/結(jié)合) (1) Ja 和 Ib 1. 0-3. 5 ；III 0. 5-2. 5 ；V 0. 5-3. 0*通過NMR廣呢糖廣如等量的發(fā)酵體積表22 =IOOOL放大規(guī)模后的預(yù)測產(chǎn)量(根據(jù)中試工藝預(yù)測)
57 發(fā)酵相關(guān)的分析方法生物質(zhì)測定。在發(fā)酵過程中，通過在590nm波長處測定培養(yǎng)物的光密度值來監(jiān)測 生物質(zhì)的含量。樣品必須經(jīng)過稀釋以使吸光度的讀數(shù)值落在0.300-0. 600的范圍內(nèi)。收獲 物的濕重在16000xg離心25分鐘后測定。莢膜多糖含量測定。GBS的血清型特異性莢膜多糖是由下列糖的重復(fù)單位組成的 NANA =N乙酰神經(jīng)氨酸或唾液酸；GLUC 葡萄糖；GAL 半乳糖和NAGA =N乙酰葡萄糖胺。唾液 酸含量用 Svennerholm 建立的化學(xué)方法測定(Svennerholm L.，(1957) Biochem. Biophys. ACTA 24:604-611)。不同的血清型重復(fù)單位的組成是不同的，因此每一種血清型所用的校 正因子也是不同的。 樣品制備?！るx心 10 0D. mL 的量(16000xg, 5min, 4°C )[標(biāo)準(zhǔn)化]·用ImL PBS洗滌細(xì)胞團(tuán)，然后離心(16000xg，5min，4°C )[洗滌]·向細(xì)胞團(tuán)內(nèi)加入 500mcL Na0H(2N，65°C，lh)[水解]· 1 小時后用 5OOmcL HCl (2N，4°C )中和[中和]·通過離心去除細(xì)胞碎片(l6000xg，3Omin, 4°C )[純化]·上清液過濾除菌(0. 22微米)[除菌]
58
· IOOmL 用 9OOml 水稀釋[稀釋]標(biāo)準(zhǔn)曲線制備。菌株C0H1_13(非包膜的)的培養(yǎng)物以樣品相同的方式制備。稀 釋步驟的特征是加入已知量的唾液酸儲存夜以達(dá)到如下終濃度1、5、10、15、20和30mg/mL。 (IOOmL 上清液 +χ mL 唾液酸 SS+900-χ mL H2O)?；瘜W(xué)反應(yīng)。試劑的起始材料為A =間苯二酚(2%, H2O) ；B = CuSO4. 5Η20(0· 1Μ， H2O)。新鮮試劑按如下方法混合:10mLA+0. 25mL B+H20(Vfin = 20mL) - > +HCl (37% ) (Vfin =IOOmL)。試劑混合后可在4°C保持穩(wěn)定達(dá)1周。ImL稀釋的樣品加Iml試劑，90°C孵育 40分鐘，然后測定564nm處的吸光度值。定量。利用標(biāo)準(zhǔn)曲線確定樣品中的NANA量?！な褂醚逍偷男Ｕ蜃覽特異性CP含量(mg/LOD)]·乘以培養(yǎng)物的OD [體積CP含量(mcg/mL或mg/L)]·乘以收獲物的體積[產(chǎn)生的總CP (mg)]實施例6-純化本實施例顯示的是典型純化方法，該方法與以前分離和純化GBS la、lb、III和V 型多糖的方法相比可以得到更高水平的純度。例如如下處理步驟從細(xì)菌中提取和純化天然GBS V型多糖細(xì)菌發(fā)酵GBS V型菌株(例如，CJB11)用復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)。任何培養(yǎng)方法都可以 使用，但是本文所描述的發(fā)酵培養(yǎng)方法是優(yōu)選的。發(fā)酵生物質(zhì)的滅活和多糖提取(堿處理)如果需要，生物質(zhì)應(yīng)加熱使之到室溫。 氫氧化鈉(4M)加到回收的生物質(zhì)內(nèi)，終濃度為0.8M，混合均勻。然后懸液在37°C孵育36 小時并伴隨混合。生物質(zhì)的中和通過堿處理提取以后，加入IM TRIS堿(121. 14g/mol)，終濃度為 50mM(52. 6mL/L堿混合物)，懸液混合均勻?；旌衔锏膒H用HCl (6M)調(diào)整到7. 8 (1 1稀 釋的濃鹽酸)。 醇沉淀加入2M CaCl2,終濃度為0. IM (52. 6mL/L中和混合物)，懸液混合均勻。加 入乙醇(96% (ν/ν))，終濃度為30% (ν/ν)乙醇(428mL/L)，懸液混合均勻。正切微孔過濾醇沉淀的上清通過正切微孔過濾回收，使用0.2μπι纖維 素膜(SSH 0. Im2 (Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2))，透析緩沖液包含 NaCl (0. 5M)+CaCl2 (0. IM)+乙醇30% (ν/ν)，緩沖到ρΗ7· 8。微孔過濾使用透析體積。滲透 物用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾除菌(Sartorius Sartobran濾膜)。注作為替代方法，滲余 物可通過離心澄清(保留上清液)并儲存在2-8°C。正切透析過濾30kDa 為了去除儲存期間形成的顆粒物質(zhì)，材料用0. 45/0. 2 μ m 濾膜(Sartobran 濾膜)過濾。材料在 30kDa 纖維素膜(SSH 0. Im(SartoriusSartocon Hydrosart 0. Im))上透析過濾，透析液為25倍體積的TRIS 50mM+NaCl 0. 5M,緩沖到 PH 8. 8，然后更換10被體積的透析液Na2CO2 0. 3M+NaC10. 3M，緩沖到pH 8.8。壓力設(shè)定 Δ P [Pin-Pout] < 0. 7 巴，TMP[(Pin+P。ut)/2] > 1. O (例如，Pin = 2 巴，Pout = 1 巴)。滲余物 用0. 45/0. 2 μ m濾膜(Sartorius Sartobran濾膜)過濾除菌。然后材料儲存在2_8°C備用 (最多儲存15天)。深度過濾CUNOBioCap 2000 1300cm2膠囊(或CUNO Z-Carbon R52SP濾膜，用于
59較小規(guī)模的制備)上的深度過濾用于去除殘留的蛋白質(zhì)污染。所用的膠囊或濾膜數(shù)量根據(jù) 下列比例確定0. 5cm7mg殘留蛋白質(zhì)。使用CUNO膠囊的例子利用蠕動泵洗滌膠囊，洗滌液為超過9. OL的Na2CO3 300mM+NaCl 0. 3M,緩沖到pH 8. 8，流速為350士50mL/min。如果材料的體積少于1. 6L,要 用Na2CO3 0. 3M+NaCl 0. 3M，緩沖到pH 8. 8，稀釋到正確體積。材料過濾后用2. 5L Na2CO3 0. 3M+NaCl 0.3M，緩沖到pH 8. 8，洗滌濾膜。從不同膠囊獲得的材料混合起來。收集的材料 用一個新膠囊過濾(用以前數(shù)量的1/5)，然后用2. 5L Na2CO3 0. 3M+NaCl 0. 3M，緩沖到pH 8. 8，洗滌。材料用0. 45/0. 2 μ m濾膜(Sartorius Sartobran濾膜)過濾除菌。材料儲存 在2-8°C備用(最多儲存15天)。多糖的再N乙酰化材料用緩沖到pH 8. 8的Na2CO3 (0. 3M) +NaCl (0. 3M)稀釋到2mg 多糖/mL(根據(jù)間苯二酚唾液酸試驗估計)。按如下比例制備乙酸酐儲存液8. 3mL乙酸酐 +8. 3mL 96%乙醇+983. 4mL水。將新配制的乙酸酐儲存液加到多糖溶液中，以> 22 1乙 酸酐多糖重復(fù)單位的比例稀釋到2mg/mL。材料在室溫下混合孵育2小時。2小時的孵育 結(jié)束時測定PH，驗證是否在約8. 8。通過正切透析過濾30kDa純化再N乙?；亩嗵菫榱巳コ齼Υ孢^程中形成的顆 粒，材料用0.45/0. 2 μ m濾膜(Sartobran濾膜)過濾。注通過離心澄清也是可以接受的。 材料在30kDa纖維素膜(SH 0. Im2 (Sartocon HydrosartO. Im2))上透析過濾，透析液為13 倍體積的IOmM乙酸鈉溶液，設(shè)定壓力APtPin-P0uJ < 0. 7巴，TMP [ (Pin+P。ut)/2] > 1· 0(例 如 Pin = 2 巴，P。ut = 1 巴)。材料用 0. 45/0. 2 μ m 濾膜(Sartorius Sartobran 濾膜)過濾 除菌。材料儲存在2-8°C備用(最多儲存15天)?；厥斩嗵羌尤?M的CaCl2,終濃度為0. IM(52. 6mL/L中和混合物)，懸液混合均 勻。添加乙醇(96% (ν/ν))到終濃度80% (ν/ν)(比例為4L/L溶液)，懸液混合均勻。沉 淀用新配制的96%乙醇(每個約50mL)洗滌。3000xg離心10分鐘收集沉淀，真空干燥成 粉末。分析方法濕-化學(xué)分析通過唾液酸濕-化學(xué)分析確定糖含量(Svermerholm，L。Biochem. Biophys. Acta 1957，24，604)。用鹽酸水解樣品，水解條件為80°C 90分鐘，然后用NaOH中 和，注射到DIONEX(TM)系統(tǒng)中。數(shù)據(jù)用CHR0MELE0N(TM)軟件處理。用七分鐘線性梯度的 90 10 到 60 40 0. lMNa0H，0. IM 乙酸鈉0. IM NaOH, 0. 5M NaNO3 洗脫糖，使用的是帶 PAl 網(wǎng)罩的 CarboPac PAl 柱，流速為 1. OmL/min。通過注射未水解的用水溶解成1. 0mg/ml的多糖樣品來測定游離唾液酸。在這 種方式中，從結(jié)合的唾液酸中分離出游離唾液酸是有可能的。圖29顯示的是多糖樣品和 0.5yg/ml標(biāo)準(zhǔn)品(灰線)的重疊。再生步驟出現(xiàn)的峰值是未水解的多糖。游離唾液酸是 一個重要參數(shù)，因為它與免疫反應(yīng)相關(guān)。利用MicroBCA(TM)商品化試劑盒(Pierce)測定殘留蛋白質(zhì)含量。按照Sheldon， Ε. L.等，Biochem. Biophys. Res. Comm. 1989，156 (1) 474 發(fā)表的方法測定殘留核酸含量。利用HPAEC-PAD分析方法通過測定鼠李糖殘基的含量來確定殘留的B型多糖的含 量。鼠李糖是B型糖類中的特異性糖，上述類型多糖中未發(fā)現(xiàn)有鼠李糖存在，可用于確定莢 膜多糖純化后污染的糖類殘留物的濃度。分析的樣品是純化的GBS III型多糖，如圖30所示。樣品未出現(xiàn)鼠李糖峰，說明不存在其他糖類污染。向樣品中加入鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)品后可得到 灰色色譜圖。樣品和標(biāo)準(zhǔn)品用2N TFA水解，在100°C水解3. 0小時，然后SpeedVac內(nèi)蒸發(fā)， 用450 μ 1水重建。鼠李糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的范圍為1. 0-10.0 μ g/mL·色譜條件如下=CarboPac PAl柱，帶PAl網(wǎng)罩，流速為l.Oml/min，NaOH 12mM 15分鐘，然后用NaOH 500mM再生5分 鐘，隨后用NaOH 12mM再平衡25分鐘。色譜分析各種類型多糖的大約分子量通過HPLC測定，使用SUPER0SE(TM)6HR 10/30色譜柱(GE健康護(hù)理公司(GE Healthcare))，PPS平衡，右旋糖酐校正。NMR分析將粉末溶解到ImL氧化氘(D20，Aldrich)中形成均勻濃度來紙杯純化 的多糖樣品。分裝(750μ 的樣品轉(zhuǎn)移到5-mm NMR管(Wilmad)中。在25°C的條件下，用 Bruker 600MHz光譜儀記錄1H NMR試驗，使用5_mm寬帶探針(Bruker)。利用XWINNMR軟件 包(Bruker)采集和處理數(shù)據(jù)。利用進(jìn)行32次掃描的標(biāo)準(zhǔn)單-脈沖試驗采集1_D質(zhì)子NMR 光譜。傳感器設(shè)定在HDO頻率(4. 79ppm)。利用總的再循環(huán)時間獲取定量物質(zhì)的IH NMR光 譜以確保完全回收每一個信號(5x縱向弛豫時間Tl)。記錄2-D同-和異-相關(guān)NMR光譜分配給1_D質(zhì)子NMR模式(參見，圖25_28)。 通過與已發(fā)表的數(shù)據(jù)進(jìn)行比較來確認(rèn)峰值分配(Michon，F(xiàn). ； Chal if our, R. ； Fe ldman, R.； ffessels, Μ. ；Kasper, D. L. ；Gamian, Α. ；Pozsgay, V. ；Jennings, HJ. Infect Immun 1991 ； 59 ； 1690以及相關(guān)文章)。結(jié)果和討論這個過程提供了一種從鏈球菌純化各種類型多糖的簡單、快速而有效的新方法。 其優(yōu)點在于該方法不使用DNA酶、RNA酶和蛋白酶處理。產(chǎn)品回收率高，而所有主要污染物 (蛋白質(zhì)、賀歲和B型多糖)可降低到以下。這個新純化方法可用于制造來源于這 些莢膜多糖的臨床和商業(yè)材料。產(chǎn)物的純度已經(jīng)過確認(rèn)，如表24所示。 表24-GBS Ia、Ib、III和V型多糖產(chǎn)物純度總結(jié)Γ唾液酸濕-化學(xué)分析；2MicroBCA 蛋白質(zhì)商用試劑盒分析；3核酸試驗；4B型多糖試驗)根據(jù)分子排阻層析的結(jié)果估計，上述類型多糖的平均分子量為1a、Ib型約為 200kDa, III和V型約為IOOkDa0 GBS la、lb、III和V型多糖的結(jié)構(gòu)一致性通過IHNMR光 譜測定法確定圖25-28)。實施例7-純化本實施例顯示的是可以提供比以前純化莢膜多糖的方法更高水平純度的其他典 型純化方法。GBS la、lb、III和V型多糖的分離和純化
利用如下處理步驟從細(xì)菌中提取和純化天然GBS V型多糖細(xì)菌發(fā)酵GBS V型菌株(例如，CJB11)用復(fù)合培養(yǎng)基培養(yǎng)。任何培養(yǎng)方法都可以 使用，但是本文所描述的發(fā)酵培養(yǎng)方法是優(yōu)選的。發(fā)酵生物質(zhì)的滅活和多糖提取(堿處理)如果需要，生物質(zhì)應(yīng)加熱使之到室溫。 氫氧化鈉(4M)加到回收的生物質(zhì)內(nèi)，終濃度為0.8M，混合均勻。然后懸液在37°C孵育36 小時并伴隨混合。生物質(zhì)的中和通過堿處理提取以后，加入IM TRIS堿(121. 14g/mol)，終濃度為 50mM(52. 6mL/L堿混合物)，懸液混合均勻?；旌衔锏膒H用HCl (6M)調(diào)整到7. 8 (1 1稀 釋的濃鹽酸)。醇沉淀加入2M CaCl2,終濃度為0. IM (52. 6mL/L中和混合物)，懸液混合均勻。加 入乙醇(96% (ν/ν))，終濃度為30% (ν/ν)乙醇(428mL/L)，懸液混合均勻。正切微孔過濾醇沉淀的上清通過正切微孔過濾回收，使用0.2μπι纖維 素膜(SSH 0. Im2 (Sartorius Sartocon Hydrosart 0.1m2))，透析緩沖液包含 NaCl (0. 5M)+CaCl2 (0. IM)+乙醇30% (ν/ν)，緩沖到ρΗ7· 8。微孔過濾使用透析體積。滲透 物用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾除菌(Sartorius Sartobran濾膜)。注作為替代方法，滲余 物可通過離心澄清(保留上清液)并儲存在2-8°C。正切透析過濾30kDa 為了去除儲存期間形成的顆粒物質(zhì)，材料用0. 45/0. 2 μ m濾 膜(Sartobran濾膜)過濾。材料通過第一透析過濾步驟過濾，使用30kDa纖維素膜(SSH 0. 6m2 (Sartorius Sartocon Hydrosart 0. 6m2))，透析液為 20 倍體積的 TRIS 5OmM，NaCl 0. 5M，緩沖到pH 8. 8，然后更換10被體積的IOmM磷酸鈉，緩沖到pH 7. 2。壓力設(shè)定=Pin = 3巴，Pout = 1巴。第一透析過濾步驟的滲余物稀釋到10kg，然后用pH4. O的乙酸/乙酸鈉 溶液(2L)處理。處理后得到的懸液用GFPIus 0. 45 μ m膠囊(Sartoris)過濾以去除沉淀， 然后再次用0. 2μπι濾膜(Sartobran Sartorius)過濾。pH維持在4. 4 士 0. 1。過濾的產(chǎn)物 再次用ρΗ8· 8的Na2CO3 0. 3Μ，NaCl 0. 3Μ透析過濾。使用0. 45/0. 2濾膜過濾后，材料儲存 在2-8°C備用(最多儲存15天)。用CUNO膠囊粘附過濾利用CUNO Z-碳R53SLP8藥桶進(jìn)行過濾。使用蠕動泵將 藥桶裝配在專用容器內(nèi)，然后用超過20L的WFI洗滌，流速為580士40mL/min。然后用超過 20. OL的pH8. 8的Na2CO3 0. 3M，NaCl 0. 3M以相同的流速洗滌。如果材料的體積少于20L， 那么要用PH 8. 8的Na2CO3 0. 3M,NaCl 0.3M稀釋到理想體積。然后過濾材料并收集到無菌 袋內(nèi)。容器內(nèi)加入20LpH8. 8的Na2CO3 0. 3M,NaCl 0. 3M，過濾后收集6L過濾的產(chǎn)物。材料 用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾。材料儲存在2-8°C備用(最多儲存15天)。多糖的再N乙酰化Z-碳過濾的材料用乙酸酐/乙醇溶液處理使其再N乙?；?處理IL多糖溶液所需的反應(yīng)混合物按如下比例制備4. 15mL乙酸酐+4. 15mL 96%乙醇。 反應(yīng)溶液在室溫下攪拌孵育2小時。2小時結(jié)束時檢測pH，確定其在7左右。通過正切透析過濾30kDa純化再N乙酰化的多糖材料在30kDa纖維素膜(0. Im2, SH(Sartocon Hydrosart))上透析過濾，透析液為13倍體積的pH7. 2的IOmM磷酸鉀，設(shè)定 壓力 APEPin-P0uJ < 0. 7 巴，TMP[(Pin+P。ut)/2] > 1· 0(例如 Pin = 2 巴，Pout = 1 巴)。材 料用0. 45/0. 2 μ m濾膜過濾。材料儲存在_20°C備用。參考文獻(xiàn)
62
1．Ada&工saacs(2003)Clin Microbiol Infect 979—85。
2．Shen等，(2001)Vaccine 19850—6l。
3．Palazz i等，(2004)?。甀nfect．Di S．190558—64。
4．Merritt等，(2000)?。瓸iotech．8l189—97。
5．Dassy&Fournier(1996)Infect．Immunel．642408—14。
6．Suarez等，(2001)Appl．Env．Microbi01．67969—7l。
7．Wicken等，(1983)?。瓸act．15384—92。
8．Paoletti等，(1996)Infect．Immun01．641220—26。
9．Ross等，(1999)?。瓸act．18l5389—94。
10．Paoletti等，(1999)?。甀nfect．DiS．180892—95。
11．Terleckyj等，(1975)Infect．Immun01．11649—55。
12．Willett&Morse(1966)?。瓸acteri01．9l(6)2245—50。
13．Merritt等，(1978)?。瓹lin．Microbi01．8105—07。
14．W095／29986。
15．W098／32873。
16．Frash(1990)《生物技術(shù)工藝進(jìn)展》13卷123—145頁(AdvancesinBi。teChn。l。giCal Processes)(Mizrahi&Van Wezel編輯)。
17．EP 0072513。
18．UK 0502096．1(專禾0申卞青)；w。2006／082527。
19．US 6248570。
20．Deng等，(2000)丁Bi01．Chem．2757497—7504。
21．Inzana(1987)Infect．Immun．551573—79。
22．Ramsay等，(200 1)Lancet 357(925 1)195—96。
23．Lindberg(1999)Vaccine 17增刊2$28—36。
24．Buttery&Moxon(2000)丁R Col l Physicians Land 34163—68。
25．Ahmad&ChapniCk(1999)Infect．DiS．Clin．North Am．13113—33，vii。
26．Goldblatt(1998)．T．Med．Microbi01．47563—7。
27．EP 0477508。
28．US 5306492。
29．W098／4272 l。
30．Dick等，《結(jié)合物疫苗》(Conjugate Vaccines)(Cruse等編輯)Karger，Basel，1989，1048—114。
31．《海默森生物結(jié)合技術(shù)》(Hermanson Bioconjugate／echniques)，學(xué)術(shù)出版社(Academic Press)，圣迭戈(1996)ISBN0123423368。
32．Anonymous(2002年1月)研究公報，453077。
33．Anderson(1983)Infect．Immun．39(1)233—8。
34．Anderson等，(1985)?。瓹lin．Invest．76(1)52—59。
] 35．EP 0372501f。
36．EP 0378881f。0713]37. EP 0427347A。
0714]38. W093/17712。
0715]39. W094/03208。
0716]40. W098/58668。
0717]41. EP 0471177A。
0718]42. W091/01146 ο
0719]43. Falugi 等，(2001)Eur. J. Immunol. 31 :3816_24。
0720]44. Baraldo 等，(2004) Infect. Immun. 72 4884-87
0721]45. EP 0594610A。
0722]46. W000/56360。
0723]47. W002/091998o
0724]48. Kuo 等，(1995) Infect. Immun. 63 :2706_13。
0725]49. W001/72337。
0726]50.W000/61761。
0727]51. W004/041157。
0728]52. W099/42130。
0729]53. W004/011027。
0730]54. Lees 等，(1996) Vaccine 14:190—98。
0731]55. W095/08348。
0732]56. US 4882317。
0733]57. US 4695624。
0734]58. Porro 等，(1985)MoI. Immunol. 22 :907_19。
0735]59.EP 0208375A。
0736]60. W000/10599。
0737]61. Gever 等，Med. Microbiol. Immunol, 165 :171-288 (1979)。
0738]62. US 4057685。
0739]63. US 4673574 ；US 4761283 ；US 4808700。
0740]64. US 4459286。
0741]65. US 4965338。
0742]66. US 4663160。
0743]67. US 4761283。
0744]68. US 4356170。
0745]69. Lei 等，(2000)Dev. Biol. (Basel) 103 :259_64。
0746]70.W000/38711 ;US 6146902。
0747]71. Wessels 等，(1998) Infect. Immun. 66 :2186_92。
0748]72. Lamb 等，(2000)Dev. Biol. (Basel) 103 :251_58。
0749]73. Lamb 等，(2000) Journal of Chromatography A 894:311-18。
0750]74. D' Ambra 等，(2000)Dev. Biol. (Basel) 103 :241-42。
0751]75. Gennaro (2000)《雷明頓藥物科學(xué)與實踐》(Remington :The Science and
64Practiceof Pharmacy)，第 20 版，ISBN :0683306472。 76.《疫苗設(shè)計》(Vaccine Design) (1995)Powell & Newman 編輯，ISBN 030644867X。 Plenum。
0753]
0754]
0755]
0756]
0757]
0758]
0759]
0760]
0761]
0762]
0763]
0764]
0765]
0766]
0767]
0768]
0769]
0770]
0771]
0772]
0773]
0774]
0775]
0776]
0777]
0778] 79-85c
0779]
0780]
0781]
0782]
0783] 654-58c
32 :247-71。 Reviews 32 :321_38〔
77.WXKV23105。
78.W090/14837。
79.US5057540。
80.W096/33739。
81.EP0109942A。
82.W096/11711。
83.W000/07621。
84.Ban 等，(1998)Advanced Drug Deliveiy Reviews
85.Sjolanderet (1998)Advanced Drug Delivery
86.Niikura 等，(2002) Virology 293:273-80。
87.Lenz 等，(2001) J. Immunol 166 :5346_55。
88.Pinto 等，(2003) J. Infect. Dis. 188 :327_38。
89.Gerber 等，(2001) Virology 75:4752-60。
90.W003/024480o
91.W003/024481。
92.Gluck 等，(2002) Vaccine 20 :B10_B16。
93.EP0689454A。
94.Johnson 等，(1999) Bioorg. Med. Chem. Lett. 9 :2273_78。
95.Evans 等，(2003)Expert Rev. Vaccines 2:219-29。
96.Meraldi 等，(2003) Vaccine 21:2485-91。
97.Pajak 等，(2003) Vaccine 21:836-42。
98.Kandimalla等，(2003)Nucleic Acids Research 31:2393-2400。
99.ΜΧ^ΛδΤδ 。
100.W099/62923。
101.Krieg (2003) Nature Medicine 9:831—35。
102.McCluskie 等,(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32
103.W098/40100。
104.US6207646。
105.US6239116。
106.US6429199。
107.Kandimalla^, (2003)Biochemical Society Transactions 31(第 3 部分)
0784]108. Blackwell 等，(2003) J. Immunol. 170 :4061_68。
0785]109. Krieg(2002)Trends Immunol. 23 =64-65
0786]110. W001/95935。
lll.Kandimalla 等，(2003)BBRC 306:948-53。112. Bhagat 等，(2003)BBRC 300:853-61。113. W003/035836。114. W095/17211。115. W098/42375。116. Beignon 等，(2002) Infect. Immun. 70 :3012_19。117. Pizza 等，(2001) Vaccine 19:2534—41。118. Pizza 等，(2000) Int. J. Med. Microbiol. 290 =455-61 119. Scharton-Kersten 等，(2000) Infect. Immun. 68 :5306_13。120. Ryan 等，(1999) Infect Immun. 67 :6270_80。121. Parti do s 等，(1999) Imnunol. Lett. 67 :209_16。122. Peppoloni (2003)Expert Rev Vaccines 2:285—293。123. Pine 等，(2002) J. Control Release 85:263—70。124. Domenighini 等，(1995)MoI. Microbiol. 15 :1165_67。125. W099/40936。126. W099/44636。127. Singh 等，(2001) J. Cont. Release 70 :267_76。128. W099/27960。129. US 6090406。130. US 5916588。131. EP 0626169A。132. W099/52549。133. W001/21207。135. Andrianov 等，(1998)Biomaterials 19:109—15。136. Payne 等，(1998)Adv. Drug Delivery Review 31 :185_96。137. Stanley(2002)Clin. Exp. Dermatol. 27 :571_77。138. Jones (2003) Curr. Opin. Investig. Drugs 4:214-18。139. W099/11241。140. W094/00153。141. W098/57659。142. EP 0835318，EP 0735898 和 EP 0761231 (專利申請)。143. Almeida & Alpar(1996)J. Drug Targeting 3 :455_67。144. Agarwal & Mishra(1999) Indian J. Exp. Biol. 37 :6_16。145.《疫苗》(Vaccines) (2004) Plotkin & Orenstein 編輯，ISBN 0-7216-9688-0。146. Bell (2000)Pediatr. Infect. Dis. J. 19 :1187_88。147. Iwarson(1995)APMIS 103:321-26。148. Gerlich 等，(1990) Vaccine 8 增干:S63_68 & 79-80。149. Gustafsson 等，(1996) N. Engl. J. Med. 334 :349_55。150. Rappuoli 等，(1991) TIBTECH 9 :232_38。
151. Sutter 等，(2000)Pediatr. Clin. North Am. 47 :287_308。152. Zimmerman & Spann (1999) Am. Fam. Physician 59:113-18,125-26。153. McMichael (2000) Vaccine 19，增刊 1 :S101_107。154.Schuchat (1999)Lancet 353(9146) :51_56.155. W002/34771。156. Dale(1999)Infect. Dis. Clin. North Am. 13 :227_43，viii。157. Ferretti 等，(2001)PNAS USA 98:4658-63。158.Kuroda 等，(2001) Lancet 357(9264) : 1225-40，1218-19。159. Kanra^, (1999) The Turkish Journal of Pediatrics 42:421—27。160. Ravenscroft 等，(2000)Dev. Biol. (Basel) 103 :35_47。161. W097/00697。162. W002/00249。163. W096/37222 ;US 6333036。164. W000/15255。165.Svennerholm(1957)Biochem. Biophys. ACTA 24 :604_11。166. Rubens 等，(1987) Proc. Natl. Acad. Sci. 84 :7208_12。167. "B 型鏈球菌感染”(Group B Streptococcal infections)。Edward， M. S.禾口CJ. Baker，Infections diseases of the fetus and the newborn infants,2001, 1091-1156 頁。168. “非孕婦的 B 型鏈球菌疾病”(Group B streptococcal disease in non pregnantadults) ；Farley, MM. , Clinical Infections diseases,2001, 33 :556_561。169.(Vaccination against Group B Streptococcus) Health PaulT.禾口 Feldman Robert G. Expert Rev. Vaccines 4(2)，2005，207—218。170. “圍產(chǎn)期B型鏈球菌疾病預(yù)防公共健康展望”(Prevention of perinatal groupB streptococcal disease :a public health perspective) ；Schumat A. , ffitmey C. G. , ZangwillK.M., Centers for Disease Control and prevention,1996, MMWE 45 (RR-7)，1-24。171. “母體抗體缺乏與新生兒B型鏈球菌感染之間的關(guān)系”(Correlation ofmaternal antibody deficiency with susceptibility to neonatal group B Streptococcal infection) ；Baker C.J. ,Kasper D. L. , N England Med. ,1976,294/753-6。172. “生長速率對B型鏈球菌產(chǎn)生細(xì)胞組分的調(diào)節(jié)”(Regulation of cell componentproduction by growth rate in the Group B Streptococcus) ；Robin A. Ross, Lawrence C. Madoff，禾口 Lawrence C. Paoletti, Journal of Bacteriology，1999 年 10 月， 181 卷，W17, 5389-94 頁。173. “細(xì)胞生長速率調(diào)節(jié)GBS III型莢膜多糖的表達(dá)”(Cell growth rate regulatesexpression of GBS type III capsular polysaccharide) ；Lawrence C. Paoletti, Robin A. Ross,禾口 Kenneth D.Johnson, Infection and Immunity, pril 196, 64 卷第 4 冊，1220-1226 頁。174.幾種口腔鏈球菌生齲齒菌株在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中的生長“(Growth
67ofSeveral Cariogenic strains of oral streptococci in a Chemically defined Medium) ；B. Terleckyj, N. P. ffillett 禾口 G. D. Shockman, Infection and Immunity,1975 年 4月，11卷第4冊，649-55頁。175. “唾液酸"(The sialic acids) ；George ff. Jourdian, Lawrence Dean,禾口 SaulRoseman，The Journal of Biological Chemistry，246 卷第 2 冊，1971 年 1 月 25 日出 版，480-85 頁。176. “唾液酸的定量測定/間苯二酚鹽酸比色法”(Quantitative estimation of sialicacids/a colorimetric resorcinol hydrochloric acid method) ；Lars Svennerholm, Biochimica and Biophysoca Acta，1957，24177. “酵母提取物制備、特性和組成”(Yeast extract production, properties andcomponents) ；Rolf Sommer，第 9 屆國際酵母論壇上發(fā)表的文章(Paper given at the 9thInternational Symposium of Yeasts),悉尼，1996 年 8 月。178. “在半確定成分培養(yǎng)基中培養(yǎng)的無乳鏈球菌產(chǎn)生的色素”(Pigment productionby Streptococcus agalactiae in Quasi-Defined Media) ；Fraile等,Applied andEnvironmental Microbiology, 2001 年 1 月 22 日，67 卷第 1 冊，473-74 頁。179. “無乳鏈球菌在化學(xué)成分確定培養(yǎng)基中生長的要求”(Requirement for growthof Streptococcus agalactiae in a chemically defined medium) ；Norman P. ffillet,Guy F. Morse 禾口 Sharon A. Carlisle,Journal of Bacteriology,1967 年 10 月， 94 卷(第 4冊)，124了-48 頁。180. Tettelin 等，(2002)Proc. Natl. Acad. Scl USA, 10. 1 073/pnas. 182380799。181.國際專利申請 W002/34771.182. Terpe等，“標(biāo)簽融合蛋白概述從分子和生化原理到商品化的系 統(tǒng)，，( “Overview of tag protein fusions :from molecular and biochemical fundamentals tocommercial systems " ), Appl Microbiol Biotechnol(2003)60 523-533。183. W099/27961。184. W002/074244。185. W002/064162。186. W003/028760。187. Gennaro (2000)《雷明頓藥物科學(xué)與實踐》(Remington :The Science andPractice of Pharmacy)，第 20 版，ISBN :0683306472。188.《疫苗設(shè)計亞單位和佐劑方法》(Vaccine design :the subunit and adjuvantapproach)(1995)Powell & Newman。 ISBN 0-306-44867-X。189. W000/23105。190. W000/07621。191. Barr 等，“ISC0M 和其他皂苷佐劑” (“ISCOMs and other saponin basedadjuvants " ), Advanced Drug Delivery Reviews (1998) 32 :247_271。 Sjolander等，“口服皂苷和ISC0M疫苗的攝取和佐劑活性”(〃 Uptake and adjuvant activity oforally delivered saponin and ISCOM vaccines " ) , Advanced DrugDelivery Reviews(1998) 32 :321_338。192. Niikura等，“嵌合重組戊型肝炎病毒樣顆粒作為提呈外源表位的口服疫苗載 體，，(〃 Chimeric Recombinant Hepatitis E Virus-Like Particles as an Oral Vaccine VehiclePresenting Foreign Epitopes" )，Virology(2002)293 :273_280。193. Lenz等，“乳頭狀瘤病毒樣顆粒誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞的急性活 化，，(“Papi 11 omarivurs-Like Particles Induce Acute Activation of Dendritic Cells" )，Journal oflmmunology(2001)5246-5355。194. Pinto,等，抗人乳頭狀瘤病毒(HPV)_16 L1的細(xì)胞免疫反應(yīng)-用重 組HPV-16L1病毒樣顆粒免疫的健康志愿者(〃 Cellular Immune Responses to HumanPapillomavirus(HPV)-16 LI Healthy Volunteers Immunized with Recombinant HPV-16L1 Virus Like Particles " ), Journal of Infectious Diseases (2003)7S5 327-338。195. Gerber等，人乳頭狀瘤病毒樣顆粒在與大腸桿菌不耐熱腸毒素變 體R192G或CpG共同使用時是有效的口服免疫原(〃 Human Papillomavirus Virus-Like ParticlesAre Efficient Oral Immunogens when Coadministered with Escherichia coli Heat-LabileEnterotoxin Mutant R192G or CpG " ), Journal of Virology(2001)75(10) :4752_4760。196. Gluck 等，“未來開發(fā)疫苗的新技術(shù)平臺”("New Technology Platforms in theDevelopment of Vaccines for the Future" ), Vaccine(2002) 20 :B10_B16o197. Johnson 等，(1999)BioorgMed Chem Lett 9:2273-2278。198.Meraldi等，‘‘0M-174，一種可能用于人的新型佐劑，在與伯氏瘧原蟲環(huán)孢 子蛋白來源的合成的C末端片段242-310共同使用時可誘導(dǎo)保護(hù)性反應(yīng)”(“0M-174, a New Adjuvant with a Potential for Human Use， Induces a Protective Response withAdministered with the Synthetic C—Terminal Fragment 242—310 from the circumsporozoiteprotein of Plasmodium berghei" )，Vaccine(2003) 27 :2485_2491。199. Pajak等，“佐劑0M_174可在體內(nèi)誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞的迀移和成 熟” ("TheAdjuvant 0M-174 induces both the migration and maturation of murine dendritic cells invivo" )，Vaccine(2003) 21 :836_842。200. fendimalla等，“多種合成的核苷酸基序的識別模式具有不同細(xì)胞 因子誘導(dǎo)模式的高效免疫調(diào)節(jié)寡脫氧核苷酸藥物的設(shè)計和幵發(fā)”(”Divergent syntheticnucleotide motif recognition pattern :design and development of potentimmunomodulatory oligodeoxyribonucleotide agents with distinct cytokine inductionprofiles'7 ), Nucleic Acids Research (2003) 31 (9) :2393_2400。201. Krieg，‘‘CpG基序細(xì)菌提取物中的活性成分？”( “ CpG motifs :the activeingredient in bacterial extracts ？ 〃 )，Nature Medicine (2003)9 (7) 831-835。202.McCluskie等，“利用乙型肝炎表面抗原和CpG DNA免疫小鼠的胃腸外和黏 膜初次免疫策略，，(〃 Parenteral and mucosal prime-boost immunization strategies in micewith hepatitis B surface antigen and CpG DNA" )，F(xiàn)EMS Immunology and
69MedicalMicrobiology(2002)32 179 185。203. Kandimalla等，“Toll樣受體9 新型合成CpG DNA的識別和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 i周節(jié)，，(〃 Toll-like receptor 9 -modulation of recognition and cytokine induction by novelsynthetic CpG DNAs" ),Biochemical Society Transactions(2003)31 (第 3 部 分)654-658。204.Blackwell等，“CpG-A-誘導(dǎo)的單核細(xì)胞IFN_ Y -可誘導(dǎo)的蛋白 質(zhì)-10的產(chǎn)生可由類漿細(xì)胞樹突狀細(xì)胞來源的IFN- a調(diào)節(jié)”(〃 CpG-A-Induced MonocytelFN-gamma-Inducible Protein—10 Production is Regulated by Plasmacytoid Dendritic CellDerived IFN-alpha" ), J. Immunol. (2003)770(8) :40614068。205. Krieg，“CpG 上的 A 至lj Z”( “ From A to Z on CpG “ )，TRENDS in Immunology(2002)23(2) :64_65。206. Kandimalla等，‘‘CpG寡核苷酸內(nèi)的二級結(jié)構(gòu)可影響免疫調(diào)節(jié)活 性，，(〃 Secondary structures in CpG oligonucleotides affect immunostimulatory activity" )，BBRC(2003)306 :948_953。207. Kandimalla等，‘‘Toll樣受體9 新型合成CpG DNA的識別和細(xì)胞因子誘導(dǎo)的 i周節(jié)，，(〃 Toll-like receptor 9 -modulation of recognition and cytokine induction by novelsynthetic GpG DNAs" ),Biochemical Society Transactions(2003)37(第 3 部 分)664-658。208. Bhagat等，“CpG五和六脫氧核苷酸可用作高效免疫調(diào)節(jié)劑”(〃 CpG penta andhexa deoxyribonucleotides as potent immunomodulatory agents ") BBRC(2003)300 :853_861。209. Singh 等，(2001) J. Cont. Rele. 70 :267_276。210. W099/27960。211. W099/52549。212. W001/21207。213. W001/21152。214.AndrianOV等，“通過聚磷腈水溶液的凝聚制備水凝膠微球”(〃 Preparation ofhydroge1 microspheres by coacervation of aqueous polyphophazene solutions" )，Biomaterials(1998)19(1-3) :109_115.215. Payne等，“蛋白質(zhì)從聚磷腈基質(zhì)中的釋放”(“Protein Release fromPolyphosphazene Matrices“ ), Adv. Drug. Delivery Review(1998)37(3) :185-196。216. Stanley，‘‘Imiqulmod 和 imidazoquinolones 作用機(jī)制和治療潛 力，，(” Imiqulmodand the imidazoquinolones :mechanism of action and therapeutic potential" )Clin ExpDermatol(2002) 27(7) :571_577。217. Jones，“瑞喹莫德 3M”( “ Resiquimod 3M 〃)，Curr Op in Investig Drugs(2003)4(2) :214_218。219. W098/57659。220.歐洲專利申請 0835318,0735898 和 0761231。221. Ramsay 等，(2001) Lancet 357(9251) 195-196。
70
222. Lindberg(1999) Vaccine 17，增刊 2 :S28_36。223. Buttery & Moxon(2000)J R Coll Physicians Lond 34:163—168。224. Ahmad & Chapnick(1999)Infect Dis Clin North Am 13 113 133，vii。225. Goldblatt (1998) J. Med. Microbiol. 47 :563_567。226.歐洲專利 0 477 508。227.美國專利號 5，306，492.228.國際專利申請 W098/42721。229.《結(jié)合物疫苗》(Conjugate Vaccines) (Cruse 等編輯)，ISBN 3805549326，特 別是卷10 :48-114。230. Hermanson(1996)《生物結(jié)合技術(shù)》(Bioconjugate Techniques)，ISBN 0123423368 或 012342335X。231. Research Disclosure, 453077(2002 年 1 月)。232. EP-A-0372501。233. EP-A-0378881。234. EP-A-0427347。235. W093/17712。236. W094/03208。237. W098/58668。238. EP-A-0471177。239. W000/56360。240. W091/01146。241. W000/61761。242. W001/72337。243. Robinson & Torres (1997) Seminars in Immunology 9:271—283。244. Donnelly 等，(1997)Annu Rev Immunol 15:617—648。245. Scott-Taylor & Dalgleish(2000)Expert Opin Investig Drugs 9 471-480。246. Apostolopoulos & Plebanski(2000)Curr Opin Mol. Ther 2 :441_447。247. Ilan(1999)Curr Opin Mol. Ther 1 :116_120。248. Dubensky 等，(2000)Mol. Med 6:723-732。249. Robinson & Pertmer(2000)Adv Virus Res 55 :1_74。250. Donnelly 等，(2000) Am J Respir Crit Care Med 162 (4Pt 2) :S190_193。251. Davis (1999)Mt. Sinai J. Med. 66 :84_90。252.《當(dāng)代分手生物系方法》(Current Protocols in Molecular Biology) (F. M. Ausubel 等編輯，1987)增補(bǔ) 30。253. Smith & Waterman (1981) Rev. Appl. Math. 2 :482_489。254.美國專利號 6，372，223。255. W000/15251。256. W001/22992。
257.Hehme 等，(2004)Virus Res. 103(1-2) :163_71。258.美國專利號 6，355，271。259. W000/23105。260.《疫苗設(shè)計亞單位和佐劑方法》(Vaccine design :the subunit and adjuvantapproach) (Powell & Newman編輯)，Plenum 出版社，1995 (ISBN 0-306-44867-X)。
261.美國專利號5,057,540。
262.W005/02620。
263.W096/33739。
264.EP-A-0109942。
265.美國專利號4，578，269。
266.W096/11711。
267.美國專利號6，352，697。
268.W000/07621 和美國專利號 6，506，386。
269.W004/04762。
270.Barr(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32:247—271。
271.Sjolanderet 等，(1998)Advanced Drug Delivery Reviews 32 :321_338c
272.Pizza 等，(2000) Int J Med Microbiol 290:455-461。
273.W095/17211。
274.W098/42375.。
275.Singh 等，(2001) J Cont Release 70:267-276。
276.W099/27960。
277.美國專利號6，090，406。
278.美國專利號5，916，588。
279.EP-A-0626169。
280.W099/52549。
281.W001/21207。
282.W001/21152。
283.W002/72012。
284.Signorelli 禾口 Hadden(2003)Int Immunopharmacol 3(8) :1177_86。
285.W004/64715。
286.Cooper(1995)PharmBiotechnol 6:559-80。
287.《疫苗佐劑制備方法和研究方案》(Vaccine Methodsand Research Protocols) (42卷，分子方法系列 Methodsseries))。ISBN 1-59259-083-7。0' Hagan 編輯。
Adjuvants Preparation (Methods in Molecular288.W005/89837。
289.美國專利號6，692，468。
290.W000/07647。
291.W099/17820。
292.美國專利號5，971, 953。
72
293.美國專利號4，060,082。
294.EP-A-0520618。
295.W098/01174。
296.W090/14837。
297.Podda 禾口 Del Giudice(2003)Expert Rev Vaccines 2:197—203。
298.Podda(2001)Vacccine 19 :2673_2680。
299.Allison 禾口 Byars(1992)Res Immunol 143:519—25。
300.Hariharan 等，(1995)Cancer Res 55:3486-9。
301.W095/11700。
302.美國專利號6，080，725。
303.W005/097181。
304.Han等，(2005) “維生素E對老年人免疫功能和感染性疾病的影響”(ImpactofVitaminE on Immune Function and Infectious Diseases in the Aged),歐洲營養(yǎng)、免
疫功能禾口健康會議(Nutrition, Immune functions and Health EuroConference)，巴黎， 2005 年 6 月 9-10 日。305.美國專利號6，630，161。
306.W002/097072。
307.Hayden 等，(199S) J Clin Invest 101(3) :643_9。
308.Tassignon 等，(2005) J Immunol Meth 305:188-98。
309.Myers等，(1990) “內(nèi)毒素反應(yīng)的細(xì)胞和分子方面” 145-156頁“(Cellularandmolecular aspects of endotoxin reactions)。
310.Ulrich(2000)參考文獻(xiàn) 108 的第 16 章(273-282 頁)。
311.Johnson 等，(1999)J Med Chem 42 :4640_9。
312.Baldrick 等，(2002)Regulatory Toxicol Pharmacol 35:398—413。
313.美國專利號4，680，338。
314.美國專利號4，988,815。
315.W092/15582。
316.Stanley(2002)Clin Exp Dermatol 27:571—577。
317.Wu 等，(2004) Antiviral Res. 64(2) :79_83。
318.Vasilakos 等，(2000)Cell Immunol. 204(1) :64_74。
319.美國專利號 4689338，4929624，5238944，5266575，5268376，5346905，
5352784，5389640，5395937，5482936，5494916，5525612，6083505，6440992，6627640， 6656938,6660735,6660747,6664260,6664264,6664265,6667312,6670372,6677347, 6677348，6677349，6683088，6703402，6743920，6800624，6809203，6888000 和 6924293。320. Jones (2003) Curr Op in Investig Drugs 4:214—218。321. W02004/060308。322. W02004/064759。323.美國專利號 6，924，271。324.美國專利申請?zhí)?2005/0070556。
325.美國專利號5，658，731。[1000]326.美國專利號5，011，828。[1001]327.W02004/87153。[1002]328.美國專利號6，605，617。[1003]329.W002/18383。[1004]330.W02004/018455o[1005]331.W003/082272。[1006]332.PCT/US2005/022769。[1007]333.Johnson 等，(1999)Bioorg Med Chem Lett 9:2273-2278。[1008]334.Evans 等，(2003)Expert Rev Vaccines 2:219-229.[1009]335.Andrianov 等，(1998)Biomaterials 19:109-115。[1010]336.Payne (1998)Adv Drug Delivery Review 31 :185_196。[1011]337.Thompson 等，(2003)Methods in Molecular Medicine 94:255-266。[1012]338.Kandimalla 等，(2003)Nucleic Acids Research 31:2393-2400。[1013]339.W002/26757。[1014]340.W099/62923。[1015]341.Krieg(2003)Nature Medicine 9:831—835。[1016]342.McCluskie 等，(2002)FEMS Immunology and Medical Microbiology32 179-185)[1017]343.W098/40100。[1018]344.美國專利號6，207,646。[1019]345.美國專利號6，239，116。[1020]346.美國專利號6，429，199。[1021]347.Kandimalla^, (2003)Biochemical Society Transactions 31(第 3 部分)654-6583[1022]348.Blackwell 等，(2003) J Immunol 170:4061-4068。[1023]349.Krieg(2002)Trends Immunol 23:64-65。[1024]350.W001/95935。[1025]351.Kandimalla 等，(2003)BBRC 306:948-953。[1026]352.Bhagat 等，(2003)BBRC 300:853-861。[1027]353.W003/035836。[1028]354.W001/22972。[1029]355.Thompson 等，(2005) J Leukoc Biol 78 “低毒性版本的 LPS、MPL 佐劑和 RC529M. CD4+T iffllfi WW^fe^O" (' The low-toxicity versions of LPS, MPL adjuvantandRC529, are efficient adjuvants for CD4+T cells')。[1030]356.英國專利申請GB A 2220211。[1031]357.W0 94/21292。[1032]358.W094/00153。[1033]359.W095/17210。
74[1034]360. W096/26741。361. W093/19780。362. W003/011223。363. Meraldi 等，(2003) Vaccine 21:2485-2491。364. Pajak 等，(2003) Vaccine 21:836-842。365.美國專利號 6，586，409。366. Wong 等，(2003) J Clin Pharmacol 43(7) :735_42。367 美國專利申請?zhí)?2005/0215517。
權(quán)利要求
一種為了以生產(chǎn)規(guī)模制備莢膜多糖(cps)的培養(yǎng)鏈球菌的方法，其中所述方法包括(a)提供表達(dá)cps的鏈球菌菌株的接種物，以及(b)通過發(fā)酵培養(yǎng)菌株，其中所述的培養(yǎng)包括向培養(yǎng)基中線性添加碳源，不需要用算法通過監(jiān)測培養(yǎng)基的pH來控制培養(yǎng)。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟(c)回收莢膜多糖。
3.如權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述鏈球菌菌株還包括無乳鏈球菌。
4.如權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述無乳鏈球菌菌株是090、H36b、CBJlll 或 M781。
5.如權(quán)利要求1到4中任一項所述的方法，其特征在于，所述接種物的光密度(OD)在 約0. 6到約1. 8之間。
6.如權(quán)利要求1到5中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的pH在約6.0到 約7. 5之間。
7.如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，所述pH約等于7.3。
8.如權(quán)利要求1到7中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基的溫度在約34到 約38°C之間。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述溫度為約36°C。
10.如權(quán)利要求1到9中任一項所述的方法，其特征在于，所述碳源還包括葡萄糖。
11.如權(quán)利要求1到10中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)還包括監(jiān)測培養(yǎng)基 的0D，這樣當(dāng)OD達(dá)到指定水平時開始所述的線性添加碳源。
12.如權(quán)利要求11所述的方法，其特征在于，所述指定水平選擇為可達(dá)到更高的cps體 積產(chǎn)量。
13.如權(quán)利要求11或12所述的方法，其特征在于，所述指定水平在約9.8到約10. 2之間。
14.如權(quán)利要求13所述的方法，其特征在于，所述指定水平約為10。
15.如權(quán)利要求11到14中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)還包括監(jiān)測培養(yǎng) 基的0D，這樣在OD達(dá)到第一和第二瞬時添加水平時，在所述的線性添加碳源前兩次瞬時添 加酵母提取物。
16.如權(quán)利要求15所述的方法，其特征在于，所述第一和第二瞬時添加水平選擇為可 達(dá)到更高的cps體積產(chǎn)量。
17.如權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述第一瞬時添加水平在約2.8到約3. 2 之間。
18.如權(quán)利要求17所述的方法，其特征在于，所述第一瞬時添加水平約為3.0。
19.如權(quán)利要求16到18中任一項所述的方法，其特征在于，所述第二瞬時添加水平在 約4. 3到約4. 7之間。
20.如權(quán)利要求19所述的方法，其特征在于，所述第二瞬時添加水平約為4.5。
21.如權(quán)利要求1到20中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是用于培養(yǎng)鏈球 菌的確定成分培養(yǎng)基，包含磷酸鹽源、礦物質(zhì)源、碳源、維生素源和氨基酸源，其中所述維生 素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、 鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙酰胺。
22.如權(quán)利要求1到20中任一項所述的方法，其特征在于，所述培養(yǎng)基是用于培養(yǎng)鏈球菌的復(fù)合培養(yǎng)基，包含酵母提取物、磷酸鹽源、碳源、維生素源以及可選的氨基酸源，其中所 述維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽 酸硫胺素和鹽酸吡哆醇，其中一種維生素必須是生物素。
23.一種用于培養(yǎng)鏈球菌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含鏈球菌菌株、磷酸鹽源、碳源、維生素 源和氨基酸源，其中所述維生素源由選自如下7種維生素的6種或更少的維生素組成生物 素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛 酸鈣和煙酰胺。
24.如權(quán)利要求23所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述鏈球菌是無乳鏈球菌。
25.如權(quán)利要求23或24所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述磷酸鹽源由K2HP04、KH2PO4, Na2HPO4. H2O, NaH2PO4. H2O 或 NaCl 組成。
26.如權(quán)利要求23-25中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述碳源是葡萄糖。
27.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下 7種維生素的6種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙酰胺。
28.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下 7種維生素的5種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙酰胺。
29.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下 7種維生素的4種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙酰胺。
30.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下 7種維生素的3種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、泛酸鈣、核黃素、鹽酸硫胺素、鹽酸 吡哆醇和葉酸，其中的兩種維生素必須是泛酸鈣和煙酰胺。
31.如權(quán)利要求23-26中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由泛酸鈣和 煙酰胺組成。
32.如權(quán)利要求23-31中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸源由選自如下 19種氨基酸的19種或更少的氨基酸組成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 谷氨酸和酪氨酸。
33.如權(quán)利要求23-31中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸源由選自如下 19種氨基酸的18種或更少的氨基酸組成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 谷氨酸和酪氨酸。
34.如權(quán)利要求23-31中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸源由選自如下 19種氨基酸的17種或更少的氨基酸組成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 谷氨酸和酪氨酸。
35.如權(quán)利要求23-31中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸源由選自如下 19種氨基酸的16種或更少的氨基酸組成丙氨酸、精氨酸、谷氨酰胺、甘氨酸、組氨酸、異 亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、天 冬氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸，其中15種必須是精氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨 酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、 谷氨酸和酪氨酸。
36.如權(quán)利要求23-31中任一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述氨基酸源由精氨酸、 甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、 纈氨酸、鹽酸半胱氨酸、谷氨酸和酪氨酸組成。
37.一種用于培養(yǎng)鏈球菌的培養(yǎng)基，該培養(yǎng)基包含鏈球菌菌株、酵母提取物、磷酸鹽源、 碳源、維生素源和氨基酸源，其中所述維生素源由選自如下5種維生素的4種或更少的維生 素組成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸，其中的一種維生素必須是 生物素。
38.如權(quán)利要求37所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述鏈球菌是無乳鏈球菌。
39.如權(quán)利要求37或38所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下5種維 生素的4種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸， 其中的一種維生素必須是生物素。
40.如權(quán)利要求37或38所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下5種維 生素的3種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸， 其中的一種維生素必須是生物素。
41.如權(quán)利要求37或38所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由選自如下5種維 生素的2種或更少的維生素組成生物素、煙酰胺、核黃素、鹽酸硫胺素和鹽酸吡哆醇葉酸， 其中的一種維生素必須是生物素。
42.如權(quán)利要求37或38所述的培養(yǎng)基，其特征在于，所述維生素源由生物素組成。
43.一種從無乳鏈球菌中純化莢膜多糖的方法，該方法包括使用附著濾器過濾的步驟。
44.如權(quán)利要求43所述的方法，其特征在于，所述方法不包括陽離子去污劑處理以沉 淀莢膜多糖的步驟以及隨后的再增溶莢膜多糖的步驟。
45.如權(quán)利要求43或44所述的方法，其特征在于，所述附著濾器是蛋白質(zhì)附著濾器。
46.如權(quán)利要求43-45中任一項所述的方法，其特征在于，所述附著濾器是碳濾器。
47.如權(quán)利要求43-46中任一項所述的方法，其特征在于，所述使用附著濾器過濾的步 驟通過如下步驟進(jìn)行(i)醇沉淀污染的蛋白質(zhì)和/或核酸；以及(ii)透析過濾。
48.如權(quán)利要求43-47中任一項所述的方法，其特征在于，所述使用附著濾器過濾的步 驟通過如下步驟進(jìn)行(iv)再N乙酰化； (ν)透析過濾。
49.一種制備純化的莢膜多糖的方法，該方法包括(a)提供包含莢膜多糖的粗分離物；(b)去除因粗分離物與醇溶液接觸而形成的醇沉淀物；(c)過濾去除小分子化合物而保留莢膜多糖；以及(d)利用蛋白質(zhì)附著濾器去除蛋白質(zhì)污染物，生產(chǎn)出純化的莢膜多糖。
50.如權(quán)利要求49所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟(e)再N乙?；兓?莢膜多糖。
51.如權(quán)利要求50所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟(f)沉淀純化的莢膜多糖。
52.如權(quán)利要求51所述的方法，其特征在于，該方法還包括步驟(g)以莢膜多糖為一種 組分制備疫苗。
53.如權(quán)利要求49-52中任一項所述的方法，其中步驟(b)包括添加醇溶液至足以沉淀 核酸污染物但是不沉淀莢膜多糖的濃度。
54.如權(quán)利要求53所述的方法，其特征在于，所述醇溶液包括乙醇。
55.如權(quán)利要求53或54所述的方法，其特征在于，所述醇溶液還包括CaCl2。
56.如權(quán)利要求54或55所述的方法，其特征在于，所述醇溶液添加至濃度為約10%到 約50%乙醇。
57.如權(quán)利要求56所述的方法，其特征在于，所述醇溶液添加至濃度為約30%乙醇。
58.如權(quán)利要求49-57中任一項所述的方法，其特征在于，所述蛋白質(zhì)附著濾器是活性 碳濾器。
全文摘要
本發(fā)明屬于細(xì)菌培養(yǎng)領(lǐng)域，更具體地說，本發(fā)明涉及優(yōu)化培養(yǎng)條件以提高鏈球菌菌株補(bǔ)料分批培養(yǎng)的細(xì)菌莢膜多糖產(chǎn)率以及適于以生產(chǎn)規(guī)模從鏈球菌菌株純化莢膜多糖的新純化方法，該方法比以前生產(chǎn)規(guī)模的制備所得到的純度水平更高。
文檔編號C12N1/20GK101932698SQ200880126144
公開日2010年12月29日 申請日期2008年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2007年12月20日
發(fā)明者C·M·司卡拉, F·伯爾蒂, F·諾萊利, G·巴卓奇, P·科斯坦蒂諾, R·奧利弗瑞, S·富塔納 申請人:諾華有限公司