專利名稱：原位雜交技術優(yōu)化及應用的制作方法
技術領域：
本技術屬于分子生物學和細胞生物學領域
背景技術：
在研究DNA分子復制原理的基礎上發(fā)展起來的一種技術。其基本原理是兩條核苷 酸單鏈片段，在適宜的條件下，能過氫鍵結合，形成DNA-DNA、DNA-RNA或RNA-RNA雙鍵分子 的特點，應帶有標記的(有放射性同位素，如3H、35S、32P、熒光素生物素、地高辛等非放射性 物質)DAN或RNA片段作為核酸探針，與組織切片或細胞內待測核酸。(RNA或DNA)片段進 行雜交，然后可用放射自顯影等方法予以顯示，在光鏡或電鏡下觀察目的mRNA或DAN的存 在與定位；用原位雜交術，可在原位研究細胞合成某種多肽或蛋白質的基因表達。此方法有 很高的敏感性和特異性，可進一步從分子水來探討細胞的功能表達及其調節(jié)機制。目前原位雜交技術還存在假陽性、表達不夠穩(wěn)定等一些問題。只能通過尋找到適 合的參數(shù)和反應過程才能夠得到穩(wěn)定的結果。本發(fā)明通過長期的實驗得到滿足條件的反應 條件，具有低假陽性、重復性高等特點。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是優(yōu)化原位雜交技術，提高實驗反應的靈敏度和準確度，進而為細 胞生物學和分子生物學提供可靠的實驗技術平臺。原位雜交實驗優(yōu)步驟如下1.雜交引物合成1)200叫雙鏈0嫩(1“1)和7. 5ng隨機引物(1 μ 1)混合后置于印pendorf管內， 水浴煮沸5分鐘后，立即置于冰浴中1分鐘；2)與此同時，盡快在一置于冰浴中的0. 5ml印pendorf管內混合下列化合物· 20mmol/L DTT 1 μ 1·未標記的dNTP溶液1 μ 1· IOX隨機標記緩沖液1 μ 1· [α-32P]dATP(比活性> 3000Ci/mmol ;10μ Ci/μ 1)3μ 1· ddH20 1 μ 13)將步驟(1)印pendorf管中的溶液移到步驟(2)管中。4)加入5單位(約1 μ DKlenow片段，充分混合，在微型離心機中以12000g離心 1-2秒，使所有溶液沉于試管底部，在室溫下保溫3-16小時。5)在反應液中加入10μ 1緩沖液A后，將放射性標記的探針保存在-20°C下備用。 同時計算放射比活性。2.固定、后固定和脫水實驗材料經(jīng)4%多聚甲醛溶液灌流固定后，再將其置于 4%多聚甲醛溶液中后固定7個小時4°C后固定，隨后將其置于30%蔗糖溶液直至實驗材料 沉底；
3.切片標本盡可能采多聚甲醛固定及蔗糖浸泡作冰凍切片，這一制備法既能避 免mRNA降解，又能保持良好的組織形態(tài)；4.預雜交1)每個管中置換成大約300ulHYB-溶液，60°C水浴5分鐘，避免振蕩。
2)用等體積的HYB+取代HYB-。3) 60°C水浴，預雜交4小時以上。5.雜交1)吸去預雜交的HYB+，加上IOOul已加入探針的HYB+溶液(探針濃度約為Ing/ ul)；2)60°C 溫浴過夜；3)將探針回收，放于-20C保存(通常探針可重復使用十次左右)；4)加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60°C，放置30分鐘，重復一次；5)置換 2XSSCTlml，60°C，放置 15 分鐘；6)置換 0. 2XSSCTlml，60°C，放置 30 分鐘，重復一次；7)用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動；8)室溫下加Iml 1:2: 7溶液，時間為一小時；9)按1 3000的比例在1 2 7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C冰箱過夜；10)用Iml含10%熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然 后用ImlMABT置換，25分鐘，再用ImlMABT溶液置換，一小時以上，最后用ImlMABT溶液置 換，25分鐘；11)用Iml ImM左旋米唑的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘；12)將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate (底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室 溫下顯色；13)每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色；14)將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4%多聚甲醛固定， 拍照；15) 4C冰箱保存。原位雜交中溶液的配制1. PBS NaCl 8gKCl 0. 2gNa2HPO4 1. 44gKH2PO4 0. 24gDEPC H2O ILHCl 調 PH 值至 7· 4抽濾，滅菌2. 4%多聚甲醛PBS IL
加熱持續(xù)攪拌至溶液澄清。-20°C保存3. PBST PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0. 1 % ；4. 20XSSC Na3Citrate 2H20 88. 2gNaCl 175. 5gDEPC H20 至 1L抽濾，滅菌5. SSCT SSC加上Tween-20使其終濃度為0. 1 %6. HYB-甲酰胺20XSSC儲液DEPC水=2 1 1配制加入Tween-20使其終濃度為0. 1 %，-20c保存7. HYB+ HYB-20mlyeast RNA 10mgheparin lmg。-20°C 保存。8. MAB maleic acid 11. 6gNaCl 8. 8g用固體 NaOH(約 7g)調至 Ph = 7. 54°C 保存9. MABTMAB加上Tween-20使其終濃度為0. 1 %10. 10% blocking reagent blocking reagent 8gMAB 72ml11. 1 2 7 溶液滅活羊血清10%BM blocking reagent MABT = 1:2:7用時現(xiàn)配12. Staining buffer Tris 12. lgpH9. 5Mgcl2 6H20 10. 2g,13. Nacl 5. 85gTween-20 lml,用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為ImM。
權利要求
一種優(yōu)化的原位雜交方法，其特征在于通過增加實驗材料的后固定和脫水等實驗步驟，以及在雜交引物合成、固定、后固定和脫水、切片、預雜交、雜交反應步驟中應用適當?shù)姆磻獥l件和反應參數(shù)，提高了原位雜交的靈敏度和降低了假陽性的出現(xiàn)。
2.如權利要求1所述的優(yōu)化的原位雜交方法，所述預雜交的步驟為1)每個管中置換成大約300ulHYB-溶液，60°C水浴5分鐘，避免振蕩。2)用等體積的HYB+取代HYB-。3)60°C水浴，預雜交4小時以上。
3.如權利要求1所述的優(yōu)化的原位雜交方法，所述固定、后固定和脫水的步驟為實驗 材料經(jīng)4%多聚甲醛溶液灌流固定后，再將其置于4%多聚甲醛溶液中后固定7個小時4°C 后固定，隨后將其置于30%蔗糖溶液直至實驗材料沉底。
全文摘要
本發(fā)明公開了優(yōu)化后的原位雜交技術以及在生物研究中的應用，屬于細胞生物學和分子生物學研究領域。由于傳統(tǒng)的原位雜交技術存在著不穩(wěn)定性、可重復性差以及假陽性等缺點。本發(fā)明根據(jù)傳統(tǒng)的原位雜交實驗的原理和技術為藍本，通過長期對實驗反應條件的準確觀察研究，提出了優(yōu)化方案首先對原位雜交實驗中所需的引物設計提出了新的參數(shù)和標準；其次，在原位雜交實驗中，固定、后固定與切片、預雜交、以及原位雜交等實驗流程中，提出了創(chuàng)新性的實驗流程和反應參數(shù)。本發(fā)明拓展了傳統(tǒng)的原位雜交技術，為分子生物學和基因組學的研究提供了一個更可行、更準確的方案。
文檔編號C12Q1/68GK101805781SQ200910008920
公開日2010年8月18日 申請日期2009年2月13日 優(yōu)先權日2009年2月13日
發(fā)明者呂麗娟, 席超, 王丹, 王燕偉 申請人:王燕偉;王丹;席超;呂麗娟