專利名稱：一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法
技術領域：
本發(fā)明涉及海洋鹵代酸脫鹵微生物，具體地說是海洋中有氧條件下催化鹵代酸脫 鹵微生物的分離篩選的新方法。
背景技術：
鹵化物被廣泛地用來生產(chǎn)殺蟲劑，除草劑，工業(yè)用溶劑和脫脂劑，其中鹵代酸尤其 手性純產(chǎn)品有著巨大的應用前景。同時由于大量使用，現(xiàn)在有機鹵化物已成為公認的“危險 性”有毒污染物，據(jù)文獻報導鹵代酸廣泛存在于自然環(huán)境之中，尤其是水環(huán)境中。研究脫鹵 酸脫鹵酶一方面可以生產(chǎn)手性有機中間體，另一方面有重大環(huán)境應用價值可以用于污染水 源的脫鹵處理，工廠的有機廢水處理，用于環(huán)境修復等方面。傳統(tǒng)的鹵代酸分離純化方法都 是以土壤為分離源，通過檢測微生物脫鹵產(chǎn)生的鹵族元素來篩選。由于海洋中很多微生物， 海洋藻類，海洋動物可產(chǎn)生多種鹵化物，同時由于大量的工業(yè)和生活廢水排放入海，使得海 洋中有機鹵化物的含量和種類都非常豐富。海洋相對于陸地是脫鹵微生物的更好分離源。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便易行、快速有效的海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離 篩選新方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術方案為首先選取海洋中鹵化物較豐富的海區(qū)(如污染嚴重的河口區(qū))或經(jīng)檢驗含有豐富 鹵化物的海區(qū)中微生物多樣性高的海洋樣品為分離源；通過特殊設計的鹵代酸單一碳源液 體培養(yǎng)富集培養(yǎng)樣品中的脫鹵微生物，通過檢測培養(yǎng)基顏色變化，快速獲得大量目的微生 物；以顯色平板對富集后的大量微生物進行篩選，通過顏色變化很容易挑出活性較好的目 的菌株；最后對初篩得到的目的菌株進行液體培養(yǎng)，用HPLC的方法對菌株脫鹵能力進行檢 測，以比色法檢測菌液0D600值來比較菌株生長能力，最終得到生長性狀良好降解能力較 強的脫鹵菌株。目標菌株可以在有氧條件下催化鹵代物進行脫鹵反應，其反應式為RCL00H+H20 — R0HC00H+HCL—種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法，以海洋樣品為菌株分離源，以鹵代 酸為單一碳源進行富集培養(yǎng)，經(jīng)過顯色平板和液體培養(yǎng)篩選得到具有鹵代酸脫鹵能力的菌 株，具體工藝步驟如下1)取海洋樣品，稱重，樣品于裝有無菌海水的燒杯中洗滌3 5次，洗去樣品表面 附著的微生物和其它雜質；2)將樣品放入滅菌后的研缽中，加 入其5-10倍重量體積比(5-10mL無菌海水/g 樣品)的無菌海水，研磨至均勻的漿液；取漿液I-IOmL加入IOOmL鹵代酸液體培養(yǎng)基中，在 三角燒瓶中20 40°C，150 250轉/分搖瓶培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)液顏色變化由藍色變?yōu)槌燃t 色時，取I-IOmL菌液加入新的鹵代酸液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)；3)觀察菌液再次變?yōu)槌燃t色時取0. 5mL，加入裝有4. 5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；再取上述混勻后的菌液0. 5mL,加入裝有4. 5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混 勻后的菌液200ul備用；重復上述操作過程6-9次，使最終菌液的濃度稀釋到原培養(yǎng)后濃度的10_6 10_9 ；4)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液50-200ul涂鹵代酸顯色培養(yǎng)基平板， 每個備用菌液涂5 10個平板；25 35°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長與情況，當平 板上出現(xiàn)明顯的橙紅色菌株后挑取深紅色的菌落在鹵代酸顯色平板上劃線；劃線后的平板 再于25 35°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3 5天，挑取深紅色的單菌落繼續(xù)在顯色平板上劃線培 養(yǎng)，重復這一過程3 5次；
5)挑選深紅色的菌落接種2216E平板，培養(yǎng)2 3天后挑取單菌落接種2216E液 體培養(yǎng)基在試管中25 35°C，150 250轉/分培養(yǎng)24 48小時，觀察培養(yǎng)液出現(xiàn)明顯 渾濁后取菌液加入裝有體積濃度15-20%甘油水溶液的凍存管中顛倒混勻后-70°C放置保 存?zhèn)溆茫?)在菌株生長的2216E平板上，取1環(huán)菌體接種到裝有100 200mL鹵代酸液體 培養(yǎng)基的三角燒瓶中，培養(yǎng)基中鹵代酸濃度10 30mM，25 35°C，150 250轉/分搖瓶 培養(yǎng)；3天后分光光度計檢測菌液在600nM波長檢測光下吸光值(0D600)，HPLC檢測菌液中 殘留鹵代酸量，0D600值大于等于1，鹵代酸降解率(殘留鹵代酸濃度/鹵代酸初始濃度) 大于等于50%的菌株即為高活力鹵代酸脫鹵菌株。所述海洋樣品為海洋生物、海洋植物、海底沉積物、海泥或海水中的未濾過物，海 水中的未濾過物是指將海水樣品用0. 22uM膜抽濾，膜表面殘留的未濾過物。所述的鹵代酸液體培養(yǎng)基配制過程如下將KH2PO4I 2g、Na2HP0412H20 10 12g、 溴百里酚蘭40 80mg、(NH4)2SO4I 2g和酵母浸粉0. 01 0. 05g加入到IL陳海水中，調 PH值到7. 5 9. 0，120-125度蒸汽滅菌15 20分鐘后，放置冷卻到50 80°C，加入濃度 為IM pH為7. 0經(jīng)0. 22uM濾膜過濾除菌的鹵代酸，至鹵代酸的終濃度為10 30mM。所述鹵代酸是指2-氯丙酸、2-2氯丙酸等烴鏈2號位為鹵族元素(氯、溴、氟、碘) 取代的鹵代脂肪酸。所述鹵代酸顯色培養(yǎng)基配制過程如下將(NH4)2S042g、酵母浸粉0.05g、瓊脂 15-20g、溴百里酚蘭40-80mg加入到IL陳海水中，調pH值到7. 5 9. 0，120-125度蒸汽滅 菌15-20分鐘后，放置冷卻到50 80°C，加入濃度為IM pH為7. 0經(jīng)0. 22uM濾膜過濾除菌 的鹵代酸，至鹵代酸的終濃度為10 30mM。所述2216E培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)配制過程如下將蛋白胨5克、酵母膏1克、磷 酸高鐵0. 01克、瓊脂15 20克加入陳海水1000毫升，氫氧化鈉(質量濃度5% )的溶液 調PH值7. 5-8，煮沸后120-125度蒸汽滅菌15-20分鐘，放置冷卻到60 80°C，倒平板。HPLC檢測條件柱子0DS 200X4. 6，流動相12 88的乙腈水用磷酸調pH到2. 0， 流速:lml/min，柱溫25°，檢測波長210nm，檢測時間8分鐘/樣品。由于在海水中存在高濃度的鹵素離子，微生物脫鹵釋放鹵素離子很難檢測，為此 本方法在富集階段采用了創(chuàng)新設計的氯丙酸培養(yǎng)基，培養(yǎng)基選用PH值在7左右的磷酸鹽緩 沖體系搭配酸堿指示劑溴百里酚蘭，由于磷酸緩沖液和溴百里酚蘭的解離常數(shù)和培養(yǎng)基PH 值相近，該培養(yǎng)基顏色變化和PH變化呈線性，可以通過檢測培養(yǎng)基顏色變化考察氯丙酸降解情況，方法簡便快捷。而在復篩階段采用了精確度高的HPLC方法。這兩種檢測方法的采 用保證了本發(fā)明的有效性和準確性。本發(fā)明適用于環(huán)境保護、污水處理、醫(yī)藥中間體、含氯農(nóng)藥等工業(yè)領域和實驗研究 領域。
具體實施例方式實施例11.取大連凌水河河口排污口附近生長的繁茂膜海綿，用無菌手術刀切成小塊后稱 重1. 64克，于裝有無菌海水的50mL燒杯中洗滌3 5次，洗去海綿表面附著的微生物和其 它雜質。
2.將海綿塊放入滅菌后的研缽中，加入15mL無菌海水，研磨至均勻的漿狀。取勻 漿ImL加入IOOmL鹵代酸液體培養(yǎng)基中(500mL三角燒瓶)28°C 200轉/分搖瓶培養(yǎng)。觀察 培養(yǎng)液顏色變化，7天后培養(yǎng)液由藍色變?yōu)槌燃t色。取ImL菌液加入新的富集培養(yǎng)基中，繼 續(xù)搖瓶培養(yǎng)。3.菌液培養(yǎng)5天后再次變?yōu)槌燃t色時取0. 5mL,加入裝有4. 5mL無菌海水的試管 中渦旋混勻，取混勻后的菌液0. 5mL,加入裝有4. 5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻 后的菌液如上依次梯度稀釋到10-9。4.取10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9稀釋比對應的稀釋液200111涂鹵代酸顯色 平板(12cm)每個梯度涂5個平板。28°C培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長與情況，5天后平 板上出現(xiàn)明顯的橙紅色菌株后挑取深紅色的菌落在鹵代酸顯色平板上劃線，28°C培養(yǎng)箱中 倒置培養(yǎng)3 5天，挑取生長較好的紅色較深的單菌落繼續(xù)在顯色平板上劃線培養(yǎng)，重復這 一過程3 5次。5.挑選生長較好紅色較深的菌落6株分別接種2216E平板，培養(yǎng)2 3天后挑取 單菌落接種2216E液體培養(yǎng)基在試管中28°C 200轉/分培養(yǎng)24小時，觀察培養(yǎng)液出現(xiàn)明顯 渾濁后取200uL加入裝有1800uL20%甘油的凍存管中顛倒混勻后_70°C放置保存?zhèn)溆谩?.每個菌株各取1環(huán)菌體接種鹵代酸液體培養(yǎng)基(鹵代酸濃度20mM， 100mL/500mL三角燒瓶)28°C 200轉/分搖瓶培養(yǎng)。3天后分光光度計檢測菌液的0D600 值，HPLC檢測菌液中殘留鹵代酸量計算降解率。0D600值大于等于1，鹵代酸降解率(培養(yǎng) 基中殘留鹵代酸濃度/培養(yǎng)基中鹵代酸初始濃度)大于等于50 %的菌株有2株，菌株降解 與生長數(shù)據(jù)如下菌株編號12菌液0D6001. 01 1. 23降解率(％)5262實施例1所使用的鹵代酸液體培養(yǎng)基配制過程如下將KH2P04lg、Na2HPO412H20 12g、溴百里酚蘭40mg、(NH4) 2S042g和酵母浸粉0. Olg加入到IL陳海水中，調pH值到7. 6， 125度蒸汽滅菌15分鐘后，放置冷卻到60°C，加入濃度為IM pH為7. 0經(jīng)0. 22uM濾膜過濾 除菌的氯丙酸，至氯丙酸的終濃度為20mM。實施例1所使用的鹵代酸顯色培養(yǎng)基配制過程如下將(NH1)2SOJg,酵母浸粉 0. 05g、瓊脂15g、溴百里酚蘭40mg加入到IL陳海水中，調pH值到7. 6，125度蒸汽滅菌15分鐘后，放置冷卻到60°C，加入濃度為IM pH為7. O經(jīng)0. 22uM濾膜過濾除菌的氯丙酸，至氯丙酸的終濃度為20mM。實施例1所使用的2216E培養(yǎng)基(固體培養(yǎng)基)配制過程如下將蛋白胨5克、酵 母膏1克、磷酸高鐵0. 01克、瓊脂20克加入陳海水1000毫升，氫氧化鈉溶液調PH值7. 6， 煮沸后125度蒸汽滅菌15-20分鐘，放置冷卻到60°C，倒平板。通過菌株的分子生物學(16SrDNA序列比對)鑒定，分離到的菌株與中國普通微生 物菌種保藏中心的惡臭假單胞菌(編號1. 1130)的菌株16SrDNA序列相似性達到100%，可 鑒定為假單胞菌屬，惡臭假單胞菌種。惡臭假單胞菌為海洋中常見的廣泛存在的海洋氯丙 酸降解菌種。實施例2與實施例1不同之處在于，其所選用的海洋樣品為大連石槽水域海泥。分離獲得 菌株16株，分光光度計檢測菌液的0D600值，HPLC檢測菌液中殘留鹵代酸量計算降解率。 0D600值大于等于1，鹵代酸降解率(培養(yǎng)基中殘留鹵代酸濃度/培養(yǎng)基中鹵代酸初始濃 度)大于等于50%的菌株有4株，菌株降解與生長數(shù)據(jù)如下菌株編號1234菌液1.012 1.311 1.342 2.5820D600降解率(％)536265100通過對菌株的分子生物學(16SrDNA序列比對)鑒定，分離到的菌株3與中國普 通微生物菌種保藏中心的惡臭假單胞菌(編號1.2309)的菌株16SrDNA序列相似性達到 100%，可鑒定為假單胞菌屬，惡臭假單胞菌種。菌株1，2，4與中國普通微生物保藏中心的 銅綠假單胞菌(編號1.2031)的菌株16SrDNA序列相似性達到100 %，可鑒定為假單胞菌 屬，銅綠假單胞菌種。假單胞屬細菌菌為海洋中常見的廣泛存在的海洋氯丙酸降解菌種。實施例3與實施例1、2不同之處在于，其所選用的海洋樣品為大連凌水河口水域海水。分 離獲得菌株12株，分光光度計檢測菌液的0D600值，HPLC檢測菌液中殘留鹵代酸量計算降 解率。0D600值大于等于1，鹵代酸降解率(培養(yǎng)基中殘留鹵代酸濃度/培養(yǎng)基中鹵代酸初 始濃度)大于等于50%的菌株有3株，菌株降解與生長數(shù)據(jù)如下菌株編號123菌液1. 112 1.211 1.8420D600降解率(％)546375通過對菌株的分子生物學(16SrDNA序列比對)鑒定，分離到的菌株1與中國普 通微生物菌種保藏中心的惡臭假單胞菌(編號1.2309)的菌株16SrDNA序列相似性達到 100%，可鑒定為假單胞菌屬，惡臭假單胞菌種。菌株2，3與中國普通微生物菌種保藏中心 的惡臭假單胞菌(編號1. 2309)的菌株16SrDNA序列相似性達到98%，可鑒定為假單胞菌 屬，惡臭假單胞菌種。假單胞菌為海洋中常見的廣泛存在的海洋氯丙酸降解菌種。
權利要求
一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法，其特征在于以海洋樣品為菌株分離源，以鹵代酸為單一碳源進行富集培養(yǎng)，經(jīng)過顯色平板和液體培養(yǎng)篩選得到具有鹵代酸脫鹵能力的菌株，具體工藝步驟如下1)取海洋樣品，稱重，樣品于裝有無菌海水的燒杯中洗滌3～5次，洗去樣品表面附著的微生物和其它雜質；2)將樣品放入滅菌后的研缽中，加入無菌海水，無菌海水的加入量為5-10mL無菌海水/g樣品，研磨至均勻的漿液；取漿液1-10mL加入100mL鹵代酸液體培養(yǎng)基中，在三角燒瓶中20～40℃，150～250轉/分搖瓶培養(yǎng)；觀察培養(yǎng)液顏色變化由藍色變?yōu)槌燃t色時，取1-10mL搖瓶中的培養(yǎng)液加入至100mL新的鹵代酸液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)；3)觀察菌液再次變?yōu)槌燃t色時取培養(yǎng)液0.5mL，加入裝有4.5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；再取上述混勻后的菌液0.5mL，加入裝有4.5mL無菌海水的試管中渦旋混勻，取混勻后的菌液200ul備用；重復上述操作過程6-9次，使最終菌液的濃度稀釋到原培養(yǎng)后濃度的10-6-10-9；4)分別取上述稀釋操作中各步的備用菌液50-200ul涂鹵代酸顯色培養(yǎng)基平板，每個備用菌液涂5～10個平板；25～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)，觀察菌株生長與情況，當平板上出現(xiàn)明顯的橙紅色菌株后挑取深紅色的菌落在鹵代酸顯色平板上劃線；劃線后的平板再于25～35℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)3～5天，挑取深紅色的單菌落繼續(xù)在顯色平板上劃線培養(yǎng)，重復這一過程3～5次；5)挑選深紅色的菌落接種2216E平板，培養(yǎng)2～3天后挑取單菌落接種2216E液體培養(yǎng)基在試管中25～35℃，150～250轉/分培養(yǎng)24～48小時，觀察培養(yǎng)液出現(xiàn)明顯渾濁后取菌液加入裝有體積濃度15-20％甘油水溶液的凍存管中顛倒混勻后-70℃放置保存?zhèn)溆茫?)在菌株生長的2216E平板上，取1環(huán)菌體接種到裝有100～200mL鹵代酸液體培養(yǎng)基的三角燒瓶中，培養(yǎng)基中鹵代酸濃度10～30mM，25～35℃，150～250轉/分搖瓶培養(yǎng)；3天后分光光度計檢測菌液在600nM波長檢測光下吸光值，HPLC檢測菌液中殘留鹵代酸量，OD600值≥1，鹵代酸降解率≥50％的菌株即為高活力鹵代酸脫鹵菌株。
2.根據(jù)權利要求1所述的分離篩選方法，其特征在于所述海洋樣品為海洋生物、海洋 植物、海底沉積物、海泥或海水中的未濾過物，海水中的未濾過物是指將海水樣品用0. 22uM 膜抽濾，膜表面殘留的未濾過物。
3.根據(jù)權利要求1所述的分離篩選方法，其特征在于所述的鹵代酸液體培養(yǎng)基配制 過程如下將 KH2PO4I 2g、Na2HP0412H20 10 12g、溴百里酚蘭 40 80mg、(NH4)2SO4I 2g 和酵 母浸粉0. 01 0. 05g加入到IL陳海水中，調pH值到7. 5 9. 0，120-125度蒸汽滅菌15 20分鐘后，放置冷卻到50 80°C，加入濃度為IM pH為7. 0經(jīng)0. 22uM濾膜過濾除菌的鹵 代酸，至鹵代酸的終濃度為10 30mM。
4.根據(jù)權利要求3所述的分離篩選方法，其特征在于所述鹵代酸是指烴鏈2號位為 鹵族元素氯、溴、氟或碘取代的鹵代脂肪酸。
5.根據(jù)權利要求4所述的分離篩選方法，其特征在于所述鹵代脂肪酸為2-氯丙酸或2-2氯丙酸。
6.根據(jù)權利要求1所述的分離篩選方法，其特征在于所述鹵代酸顯色培養(yǎng)基配制過 程如下，將(NH4)2S042g、酵母浸粉0. 05g、瓊脂15 20g、溴百里酚蘭40 80mg加入到IL陳 海水中，調PH值到7. 5 9. 0，120-125度蒸汽滅菌15-20分鐘后，放置冷卻到50 80°C，加 入濃度為IM pH為7. 0經(jīng)0. 22uM濾膜過濾除菌的鹵代酸，至鹵代酸的終濃度為10 30mM。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種海洋鹵代酸脫鹵微生物的分離篩選方法，其以海洋樣品為分離源，通過鹵代酸單一碳源液體培養(yǎng)基富集培養(yǎng)，鹵代酸單一碳源顯色平板篩選，菌株的分離純化，菌體在鹵代酸液體培養(yǎng)條件下催化脫鹵情況檢測四個步驟可以最終得到海洋鹵代酸脫鹵微生物。本發(fā)明適用于環(huán)境保護、污水處理、醫(yī)藥中間體、含氯農(nóng)藥等工業(yè)領域和實驗研究領域。
文檔編號C12N1/20GK101845405SQ20091001086
公開日2010年9月29日 申請日期2009年3月25日 優(yōu)先權日2009年3月25日
發(fā)明者信艷娟, 張衛(wèi), 黃劍宇 申請人:中國科學院大連化學物理研究所