專利名稱：一種海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及海洋芽孢桿菌，具體地說是一種海洋芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌抗生素活性物質(zhì)的方法，選優(yōu)了發(fā)酵培養(yǎng)基、優(yōu)化了發(fā)酵條件。
背景技術(shù)：
眾所周知，抗生素對人類健康至關(guān)重要，人們不斷開發(fā)新的抗生素、免疫制劑等藥物來對付耐藥菌株、真菌感染、愛滋病等各種新老頑固疾病。由于陸地資源的長期開發(fā)，從土壤微生物中尋求能夠產(chǎn)生新天然生理活性物質(zhì)的微生物已經(jīng)越來越困難，而海洋生物資源是陸地生物資源的10倍，而且已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生新化合物的海洋微生物資源較陸地微生物多得多，所以人們把目光投向了海洋，海洋是新資源的寶庫，現(xiàn)在全世界每天都能發(fā)現(xiàn)一些新的海洋微生物，隨著海洋科學(xué)研究的不斷深入，應(yīng)用現(xiàn)代生物技術(shù)開發(fā)海洋新資源已成為當(dāng)今全球關(guān)注的熱點。從海洋微生物這一巨大寶庫中開發(fā)研究新的生物活性物質(zhì)加以利用發(fā)展為高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)，是實現(xiàn)海洋微生物資源持續(xù)發(fā)展利用的重要步驟之一。
有關(guān)海洋微生物產(chǎn)生抗菌活性物質(zhì)的研究，早在四十年代就有研究報道，從海洋分離的微生物中，20～30％具有抗菌活性，頭孢霉素和硫酸小諾霉素就是海洋微生物產(chǎn)生而應(yīng)用到臨床的。國外像美國、日本、歐洲投入很大力量對海洋生物資源進行研究開發(fā)(方金瑞等，日本從海洋微生物開發(fā)新型生物活性物質(zhì)研究的新進展，中國海洋藥物，1995，40，21-25、張榮慶，海洋天然活性物質(zhì)國外研究動態(tài)，中國第五屆海洋湖沼藥物學(xué)術(shù)開發(fā)研討會論文集(上冊)，1998，237-241、郭躍偉，歐洲海洋藥物的研究現(xiàn)狀及對我國海洋藥物研究的啟事，海洋天然產(chǎn)物與生化藥物論文匯編，2000，35-40)；國外一些學(xué)者(Abbanat D.et al，Cell wall active antifungal compounds producedby the marine fungus hypoxylon oceanicum LL-15G256.I.Taxonomy andfermentation.J Antibiot(Tokyo).1998；51(3)296-302.、岡見吉郎，發(fā)酵と工業(yè)，1979，37(6)504-513、Okami，Y.and Hotta，D.J.Antibiotics，1979，32964～966)從海洋微生物中獲得了新的或已知的抗生物質(zhì)。我國對海洋微生物的研究多集中在廣東、福建沿海海域，黃維真、方金瑞在福建沿海海洋微生物研究中也獲得了新的和已知的抗生素(黃維真等，福建沿海底棲放線菌及其產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)，中國海洋藥物，1991，31～6、方金瑞等，海洋放線菌產(chǎn)生的抗生素2B-B的分離和鑒定，中國抗生素雜志，1991.(4)305～306)。
陸地上的芽孢桿菌和海洋芽孢桿菌都能產(chǎn)生抗真菌的肽類抗生素，近年來抗真菌抗生素的篩選非?；钴S，其中發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌屬(Bacillus)、微球菌屬(Micrococus)等能產(chǎn)生陸地上所未見過的抗生素(Murry，1989；William，1993；張士璀等，1998；王書錦等，1998)；申請人在中國海洋微生物資源考察中，分離得到海洋細菌318株，海洋弧菌134株，海洋芽孢桿菌71株；抑菌活性實驗表明其中多株海洋芽孢桿菌(Bacillus)的次生代謝產(chǎn)物能產(chǎn)生抗真菌抗生素，對人體病原真菌白色念珠菌、石膏樣毛癬菌、新型隱球菌、紅色毛癬菌及對植物病原真菌鐮刀菌、葡萄孢霉、稻瘟霉菌、蔬菜根腐病菌等有較強的拮抗作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種成本低、有效組分含量高的海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法。
為了實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明在以往的試驗基礎(chǔ)上用均勻設(shè)計方法對海洋芽孢桿菌發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌抗生素進行優(yōu)化試驗，最后選出發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌抗生素的最佳培養(yǎng)基配方及發(fā)酵條件，具體技術(shù)方案為當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發(fā)酵培養(yǎng)基A的重量組成為玉米粉0.5～2.0％、豆餅粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2-0.6％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、硫酸鋅0.01 0.05％、余量為水；當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結(jié)芽孢桿菌時，其發(fā)酵培養(yǎng)基B的重量組成為豆餅粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量為水；所述微量元素母液組成為四硼酸鈉0.05％、硫酸錳0.05％、硫酸鋅0.05％、鉬酸鈉0.05％、硫酸銅0.002％，余量為水。
所述培養(yǎng)基A組成最好為玉米粉1％、豆餅粉0.6％、葡萄糖0.5％、磷酸二氫鉀0.04％、硫酸鋅0.04％、余量為水；所述培養(yǎng)基B組成最好為豆餅粉2％、淀粉0.2％、玉米粉2％、磷酸二氫鉀0.64％、微量元素母液0.05％，余量為水；當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發(fā)酵時間為18--22小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0；當(dāng)所選L的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結(jié)芽孢桿菌時，其發(fā)酵時間為20--32小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0。
本發(fā)明采用白色念珠菌作指示菌，以制霉菌素(抗真菌抗生素)為標(biāo)準(zhǔn)單位，用二計量杯碟法對抗生素活性進行檢測鑒定。
本發(fā)明具有如下優(yōu)點1.本發(fā)明的培養(yǎng)基所用的發(fā)酵物質(zhì)均是常見、廉價的農(nóng)副產(chǎn)品，成本低，且發(fā)酵周期短，可以大規(guī)模擴大生產(chǎn)。
2.本發(fā)明提供的發(fā)酵生產(chǎn)抗真菌活性物質(zhì)的方法，產(chǎn)生的抗生素有效組分含量高，為進一步開發(fā)和研究海洋芽孢桿菌打下了基礎(chǔ)。
具體實施例方式
抗真菌海洋芽孢桿菌菌種的選取從中國沿海(大連黑石礁、三亞大東海、青島棧橋等地)選取海水和海泥樣品，海水和海泥樣品加水稀釋后涂布在1/3ZoBell2216固體選擇培養(yǎng)基上，經(jīng)28℃培養(yǎng)5～7天，挑取細菌進行分離純化培養(yǎng)。用白色念珠菌或石膏樣毛癬菌作指示菌，通過挖塊法選出對白色念珠菌、石膏樣毛癬菌有抑制作用的海洋細菌，參照伯杰氏手冊和《常見細菌系統(tǒng)鑒定手冊》對海洋細菌進行鑒定，同時進行16SrRNA序列分析方法鑒定海洋細菌，獲得海洋芽孢桿菌中的地衣芽孢桿菌(Bacilluslichenformis)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、解淀粉類芽孢桿菌(Paenibacillus amyloliquefaciens)和凝結(jié)芽孢桿菌(Bacillus coagulans)；實施例1凝結(jié)芽孢桿菌菌種的發(fā)酵過程1)取在菌種培養(yǎng)基培養(yǎng)好的凝結(jié)芽孢桿菌一環(huán)，劃線接種在菌種培養(yǎng)基(培養(yǎng)基葡萄糖2％、蛋白胨0.3％、酵母膏0.8％、瓊脂2％，pH自然，115℃滅菌20分鐘)的平皿中，28℃恒溫培養(yǎng)24小時；2)活性物質(zhì)的發(fā)酵將上述培養(yǎng)1天的菌種取幾環(huán)接入裝有無菌水和玻璃珠的三角瓶內(nèi)，搖勻后按重量含量5％的量接入到發(fā)酵培養(yǎng)基(基礎(chǔ)培養(yǎng)基玉米粉1％、豆餅粉1％、磷酸二氫鉀0.25％、淀粉0.5％、余量為水，pH自然，121℃滅菌20分鐘)中，發(fā)酵培養(yǎng)基上搖床28℃、180rpm恒溫培養(yǎng)，發(fā)酵時間為24(可為20～32)小時；3)發(fā)酵上清液的制備將凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵液用0.5mol草酸調(diào)pH值3～4，然后在70℃水浴中保溫10分鐘，取出后在高速臺式離心機上13000rpm離心1分鐘(或3500轉(zhuǎn)離心20分鐘)，取上清即得；4)抗生素濃度的測量牛津杯法根據(jù)抑菌圈的大小來計量活性物質(zhì)濃度的高低；試驗菌的制備取一環(huán)新鮮培養(yǎng)的沙氏斜面上的白念珠菌接入裝有20ml無菌水的三角瓶中，制成菌懸液。
液體沙氏培養(yǎng)基葡萄糖4％、蛋白胨1％，調(diào)PH 5.4，115℃滅菌20分鐘；固體沙氏培養(yǎng)基即在液體沙氏培養(yǎng)基中加入2％瓊脂。
發(fā)酵時間對活性物質(zhì)產(chǎn)生的影響
在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中按重量含量5％的量接入凝結(jié)芽孢桿菌菌懸液，在28℃、180rpm恒溫培養(yǎng)，不同時間取樣測活性物質(zhì)隨時間的變化見表1；從表1可以看出活性物質(zhì)濃度隨著發(fā)酵時間增加而升高，并在24小時達到最高值，接著開始下降。
表1凝結(jié)芽孢桿菌活性物質(zhì)隨時間變化結(jié)果

實施例2采用均勻設(shè)計方法對培養(yǎng)基進行優(yōu)化試驗，發(fā)酵培養(yǎng)基的具體組成見表2所示，培養(yǎng)基需調(diào)PH6.0～6.5、121℃滅菌20分鐘；其余反應(yīng)條件與實施例1相同；根據(jù)優(yōu)化實驗方案對培養(yǎng)基優(yōu)化的結(jié)果如表2所示，利用微機對所得結(jié)果進行回歸處理得到如下方程Y＝0.4261+3.1010*X3+4.2308*X4+0.2594X1*X1-0.0102*X2*X2+1.4036*X3*X3-2.9738*X4*X4-0.1287*X1*X4-0.0661*X2*X3其中N＝10，R2＝1.0000，S＝0.0006，F(xiàn)＝808151.8700，查表得F＞F0.018.1，F(xiàn)檢驗通過，利用微機進行多元回歸，處理優(yōu)化條件如下X1＝2.0000、X2＝0.2000、X3＝0.2000、X4＝0.6400、X5＝0.0500，Ymax＝34.51，按優(yōu)化配方發(fā)酵，抑菌圈直徑為34.70mm，接近理論值。
從而得凝結(jié)芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基最佳配方為玉米粉2.0％，豆餅粉2.0％、磷酸二氫鉀0.64％、淀粉0.2％、微量元素母液0.05％、余量為水。
微量元素母液組成如下四硼酸鈉0.05％、硫酸錳0.05％、硫酸鋅0.05％、鉬酸鈉0.05％、硫酸銅0.002％，余量為水；上述各元素分別配制，用時混合在一起，按培養(yǎng)基溶液重量(或體積)百分比加入。
表2凝結(jié)芽孢桿菌優(yōu)化發(fā)酵培養(yǎng)基實驗方案和結(jié)果

上述實施例中所得的凝結(jié)芽孢桿菌菌體及發(fā)酵液經(jīng)遼寧省衛(wèi)生防疫站檢測其急性毒理和皮膚刺激實驗，表明凝結(jié)芽孢桿菌菌體及發(fā)酵液無毒，LD50＞15g/kg體重，對皮膚無刺激作用；其發(fā)酵液中的活性物質(zhì)對人體皮膚致病真菌石膏樣毛癬菌，白色念珠菌有很強的抑制作用。如應(yīng)用中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所分離純化的海洋凝結(jié)芽孢桿菌B02效果更好。
實施例3按常規(guī)方法制取海洋地衣芽孢桿菌發(fā)酵種子液，然后進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)；海洋地衣芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)基配方的選優(yōu)(其中以磷酸二氫鉀0.04％和硫酸鋅0.04％為常量，余量為水)，采用均勻設(shè)計進行，以確定培養(yǎng)基最基本成分，如表3所示。
表3地衣芽孢桿菌碳、氮源均勻設(shè)計及結(jié)果因素1 2 3 4 5 6 7 8 9玉米粉0 0.20.40.60.81.01.21.41.6％豆餅粉0.20.61.01.40 0.40.81.21.6％葡萄糖0.61.40.41.20.21.00 0.81.6％蛋白胨0.60.40.20 0.70.50.30.10.8％活性(抑菌圈直徑34.20 38.70 34.94 39.00 32.80 36.84 33.90 35.00 37.50mm)經(jīng)計算機進行逐步線性回歸得到方程Y＝35.1760+2.0558x32-6.0590x42-1.4795x1x2+1.5295x1x4+1.0906x2x3R＝0.9888，S＝0.5398，F(xiàn)＝26.2466，F(xiàn)5，3(α＝0.05)＝9.01，F(xiàn)＞F5，3檢驗通過，置信度＞95％。
其中Y為抑菌圈直徑(mm)，X1玉米粉濃度，X2豆餅粉濃度，X3葡萄糖濃度，X4蛋白胨濃度。
確定發(fā)酵培養(yǎng)基成分中最好為玉米粉1％，豆餅粉0.6％，葡萄糖0.5％，蛋白胨0，磷酸二氫鉀0.04％、硫酸鋅0.04％、余量為水；為驗證該條件，應(yīng)用上述培養(yǎng)基發(fā)酵罐(在7L發(fā)酵罐，70L發(fā)酵罐)發(fā)酵；在發(fā)酵培養(yǎng)基初始PH8.0，通風(fēng)量1∶0.5～1.0，發(fā)酵時間18～22小時的條件下，發(fā)酵罐發(fā)酵中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所分離純化的海洋地衣芽孢桿菌9912，其產(chǎn)生抗真菌抗生素可達到5800制霉菌素單位/ml發(fā)酵液。
權(quán)利要求
1.一種海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法，其特征在于當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發(fā)酵培養(yǎng)基A的重量組成為玉米粉0.5～2.0％、豆餅粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2-0.6％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、硫酸鋅0.01-0.05％、余量為水；當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結(jié)芽孢桿菌時，其發(fā)酵培養(yǎng)基B的重量組成為豆餅粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量為水；所述微量元素母液組成為四硼酸鈉0.05％、硫酸錳0.05％、硫酸鋅0.05％、鉬酸鈉0.05％、硫酸銅0.002％，余量為水。
2.按照權(quán)利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法，其特征在于所述培養(yǎng)基A組成為玉米粉1％、豆餅粉0.6％、葡萄糖0.5％、磷酸二氫鉀0.04％、硫酸鋅0.04％、余量為水。
3.按照權(quán)利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法，其特征在于所述培養(yǎng)基B組成為豆餅粉2％、淀粉0.2％、玉米粉2％、磷酸二氫鉀0.64％、微量元素母液0.05％，余量為水。
4.按照權(quán)利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法，其特征在于當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發(fā)酵時間為18-22小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0。
5.按照權(quán)利要求1所述的海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法，其特征在于當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結(jié)芽孢桿菌時，其發(fā)酵時間為20-32小時，通氣量為1.0∶0.5～1.0。
全文摘要
本發(fā)明涉及海洋芽孢桿菌，具體的說是一種海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的發(fā)酵方法，當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為地衣芽孢桿菌或枯草芽孢桿菌時，其發(fā)酵培養(yǎng)基的重量組成為A.玉米粉0.5～2.0％、豆餅粉0.2～0.8％、葡萄糖0.2－0.6％、磷酸二氫鉀0.01～0.05％、硫酸鋅0.01－0.05％、余量為水；當(dāng)所選取的海洋芽孢桿菌為解淀粉類芽孢桿菌或凝結(jié)芽孢桿菌時，其發(fā)酵培養(yǎng)基的重量組成為B.豆餅粉0.1～2.5％、淀粉0.1～3％、玉米粉0.1～3.0％、磷酸二氫鉀0.1～0.25％、微量元素母液0.05～0.15％，余量為水。本發(fā)明為海洋芽孢桿菌生產(chǎn)抗真菌抗生素的進一步開發(fā)和應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。
文檔編號A61P31/10GK1472327SQ03133499
公開日2004年2月4日 申請日期2003年6月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月25日
發(fā)明者胡江春, 王烈, 馬成新, 劉全永, 薛德林, 王書錦 申請人:中國科學(xué)院沈陽應(yīng)用生態(tài)研究所