專利名稱：一種利用木糖母液制備2,3-丁二醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物化工技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種利用工業(yè)副產(chǎn)物木糖母液制備2， 3-丁 二醇的方法。
背景技術(shù)：
2， 3-丁二醇(2， 3-butanedio1)是一種潛在的高附加值的平臺化合物。近年來由于石 油價格的不穩(wěn)定以及石化產(chǎn)品價格的不斷上漲，2， 3-丁二醇的價格和生產(chǎn)在國際上也引 起越來越廣泛的關(guān)注。2， 3-丁二醇是一種無色無味的手性化合物，分子量90.12KDa，沸 點為180-184'C，凝固點較低，D-2， 3-丁二醇(-6(TC)可以作為抗凍劑。2， 3-丁二醇具 有較高的辛烷值，可以用于生產(chǎn)高級航空煤油。脫水可以轉(zhuǎn)化為工業(yè)溶劑甲乙酮，甲乙酮 可以作為燃料添加劑，并可以作為溶劑用于樹脂和制漆業(yè)。甲乙酮進一步脫水可以得到1， 3-丁二烯，可以作為底物用于合成橡膠工業(yè)(Syu MJ. Biological production of 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55: 10-18)。在我國，2， 3-丁二醇還被添加到白酒中以改 善白酒風味。2， 3-丁二醇脫氫可以得到乙偶因和丁二酮，可以作為香料作為食品添加劑。 2， 3-丁二醇在油墨、化妝品、香薰劑、軟化劑、增塑劑、炸藥和藥物載體等領(lǐng)域也具有 潛在用途(Xiu ZL, Zeng AP. Present state and perspective of downstream processing of biologically produced 1,3-propanediol and 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2008, 78: 917-926)。
隨著石化資源的日益枯竭以及石化工業(yè)對環(huán)境的影響，可再生資源引起來了越來越多 的關(guān)注。由于石油價格的不斷上漲及其不穩(wěn)定性，石化產(chǎn)品價格不斷攀升，利用可再生資 源生產(chǎn)生物基大宗化學品如生物燃料等引起人們的極大興趣。利用可再生的生物質(zhì)資源作 為底物，將生物煉制和綠色化學工業(yè)有機結(jié)合，可以建立起環(huán)境友好的、可持續(xù)性發(fā)展的 材料化學工業(yè)。
木質(zhì)纖維素生物質(zhì)原料，來源廣泛，再生迅速。利用生物、化學技術(shù)，木質(zhì)纖維素生 物質(zhì)原料可以生產(chǎn)可再生的化學品。玉米芯作為一種木質(zhì)纖維素生物質(zhì)原料，在我國有極 其廣泛的資源。在我國，一部分木糖醇是利用從玉米芯水解液中提取的木糖為原料制得的。 在該生產(chǎn)工藝中，產(chǎn)生了大量的副產(chǎn)物木糖母液。木糖母液含有濃度較高的混合糖(總糖 為60%左右)，主要是戊糖——木糖和阿拉伯糖，還有少量葡萄糖，具有開發(fā)應(yīng)用的潛力， 但是目前木糖母液僅有少量關(guān)于焦糖色素生產(chǎn)的文獻報道，其它開發(fā)利用沒有報道，經(jīng)檢 索，對于以木糖母液發(fā)酵生產(chǎn)2， 3-丁二醇的文獻和專利之前更沒有報道。肺炎克雷伯氏 菌具有底物譜廣泛，易于培養(yǎng)等優(yōu)點，可以利用戊糖和己糖產(chǎn)生2， 3-丁二醇，是2， 3-丁二醇生產(chǎn)的優(yōu)勢菌株。目前2， 3-丁二醇的發(fā)酵生產(chǎn)主要集中在利用葡萄糖為底物(Syu MJ. Biological production of 2,3-butanediol. Appl Microbiol Biotechnol, 2001, 55: 10-18; Qin et al. Production of 2,3-butanediol by Klebsiella pneumoniae using glucose and ammonium phosphate.Chin J Chem Eng, 2006, 14:132-136)，利用含戊糖和己糖的工業(yè)副產(chǎn)物原料為底 物發(fā)酵生產(chǎn)2， 3-丁二醇的專利尚沒有報道。而充分利用自然資源中的己糖和戊糖生產(chǎn)高 值化學品，可以提高生物質(zhì)資源的利用效率，降低生產(chǎn)成本。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種利用木糖母液發(fā)酵制備2， 3-丁二醇的方法，以實現(xiàn)工業(yè)副產(chǎn)物木糖母液的開發(fā)利用，生產(chǎn)高值平臺化合物2， 3-丁二醇。
本發(fā)明所述利用木糖母液發(fā)酵制備2， 3-丁二醇的方法包括如下步驟
(1) 選取木糖母液作為發(fā)酵底物，以如下組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基木糖母液60 200 g/L，檸檬酸三銨2 8g/L，磷酸氫二銨5 40 g/L，乙酸鈉l 6g/L，氯化鉀l 5g/L， 硫酸鎂0.05 0.15 g/L，硫酸鋅0.05 0.20 g/L，硫酸錳0.05 0.20 g/L，硫酸亞鐵0.05 0.20 g/L， pH值調(diào)至6.0 7.0;
上述木糖母液總糖濃度為50% 70%，配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始總糖濃度為30 100g/L。
(2) 以肺炎克雷伯氏菌(/^^&//" / "wwo"/fle) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌 (《/efc/e〃fl/wew ow'"e) ATCC 8724作為發(fā)酵菌株，搖瓶或發(fā)酵罐發(fā)酵制備2， 3-丁二醇。
其中所述搖瓶發(fā)酵方法是以體積比5 10%的接種量，將肺炎克雷伯氏菌(尺/6^^//" p"ew附om'ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(^7efc,'e〃"p"eMWO"/ae) ATCC 8724種子液 接種于裝有50 150 mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 160 rpm的搖 床上，30 4(TC培養(yǎng)16 30小時，其中每隔2 4小時取樣測定發(fā)酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，當發(fā)酵液中2,3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵停止；取發(fā)酵液分離、提取2,3-丁二醇；
5升發(fā)酵罐發(fā)酵方法是
當發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始總糖濃度為61 100 g/L，進行分批發(fā)酵，即以體積比5 10% 的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(《/^^//"/ "^附^ &) CICC 10011或者肺炎 克雷伯氏菌(《/^^//<3/7服誦0"/恥)ATCC 8724種子液接種于5升發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液 量為2 4升，以溫度30 40。C、攪拌轉(zhuǎn)速250 500卬m、通氣量0.5 1.5 wm的條件進 行通風攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20 40小時；發(fā)酵液初始pH值調(diào)至6.0 7.0，發(fā)酵過 程中，通過發(fā)酵罐關(guān)聯(lián)控制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調(diào)節(jié)pH 值，使之控制在pH5.5 6.5;發(fā)酵過程中，每隔2 4小時取樣測定發(fā)酵液中的糖殘量和 2,3-丁二醇濃度，2,3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束；取發(fā)酵液分離、提取2,3-丁二醇；
或者，若發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始總糖濃度為30 60g/L，進行補料分批發(fā)酵，即以體積 比5 10。/。的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(/^^/6//"/ 恥"附0附^) CICC 10011 或者肺炎克雷伯氏菌(〖/^>^//0;7"^附卵/^) ATCC 8724種子液接種于5升發(fā)酵罐中，發(fā) 酵罐裝液量為2 4升，溫度30 4(TC、攪拌轉(zhuǎn)速250 500 rpm、通氣量0.5 1.5 wm進 行通風攪拌發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液初始pH值調(diào)至6.0 7.0，發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關(guān)聯(lián)控 制蠕動泵流加4 6 M的KOH或3 6 M的H3P04來調(diào)節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5 6.5;發(fā)酵過程中，每隔2 4小時取樣測定發(fā)酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，當總糖 濃度降到20 40g/L時，脈沖流加木糖母液使底物濃度達到50 70g/L;當發(fā)酵過程中總 糖消耗速率小于2 g/(L七)時，停止補加木糖母液，當2,3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵 結(jié)束；取發(fā)酵液分離、提取2,3-丁二醇。
依據(jù)上述5升發(fā)酵罐的發(fā)酵條件與方法，還可以進行10升、50升或更大容積的發(fā)酵罐 發(fā)酵操作來制備2， 3-丁二醇。
上述種子液的制備方法是
在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)肺炎克雷伯氏菌(ii:/efc/e〃a/wewmow/ae)CICC 10011 或者肺炎克雷伯氏菌(K/e&zW/a/wwwoH/ae) ATCC 8724于裝有50 150 mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 160rpm的搖床上，30 4(TC培養(yǎng)10 16小 時，得到種子液；
其中，上述液體種子培養(yǎng)基的組分和含量分別是葡萄糖10 40g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L，磷酸二氫鉀l 3g/L，硫酸銨5 30g/L，氯化鈉l 3g/L，硫酸鎂0.1 0.3 g/L， pH值調(diào)至6.0 7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
上述肺炎克雷伯氏菌(夂/￡^&//0 /wewmom'fle) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌 ATCC 8724斜面培養(yǎng)用的斜面培養(yǎng)基組分和含量分別是葡萄糖 10 30g/L，蛋白胨2 8g/L，酵母膏2 6g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L，磷酸二氫鉀1 3 g/L，氯化鈉l 3g/L，硫酸鎂0.1 0.3g/L，硫酸鋅0.1 0.3g/L,瓊脂粉15 22g/L， pH 值調(diào)至6.0 7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。所述斜面活化培養(yǎng)的方法是將肺炎 克雷伯氏菌(尺/e^W/"/7加訓ow'"e)菌種接種于斜面培養(yǎng)基，30 4(TC條件下，靜置培養(yǎng) 12 18小時，4'C放置備用。
上述5升發(fā)酵罐較佳的發(fā)酵條件是溫度優(yōu)選35-37r，攪拌轉(zhuǎn)速優(yōu)選300 400rpm、 通氣量優(yōu)選1.0 1.5vvm。
上述總糖的測定方法是取上述發(fā)酵液以8000 10000 rpm離心3 6分鐘，上清液 按體積比稀釋200 600倍后，采用DNS方法測定其中總糖含量。
上述2,3-丁二醇含量測定方法是取上述發(fā)酵液以8000 10000rpm離心3 6分鐘， 上清液按體積比稀釋2 7倍，用萃取劑按體積比l: l萃取上清，用氣相色譜分析測定萃 取物中的2， 3-丁二醇含量。
上述萃取劑是乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯中的一種。
本發(fā)明的顯著特點是
實現(xiàn)了木糖醇工業(yè)副產(chǎn)物木糖母液的開發(fā)利用。將工業(yè)副產(chǎn)物木糖母液用于生產(chǎn)高值
平臺化合物2， 3-丁二醇，有利于降低成本和開發(fā)石化產(chǎn)品替代品。木糖母液直接原料來 源是農(nóng)業(yè)低值副產(chǎn)品玉米芯，原料來源豐富，成本低，再生循環(huán)迅速，并且環(huán)境友好，因 此間接的實現(xiàn)了可再生資源的開發(fā)利用，利用可再生資源代替石化資源生產(chǎn)高價值化學 品，有利于經(jīng)濟社會的可持續(xù)性發(fā)展。
木糖母液含有戊糖——木糖和阿拉伯糖，以及己糖——葡萄糖。目前用含戊糖和己糖 的工業(yè)副產(chǎn)物生產(chǎn)2， 3-丁二醇的專利鮮見報道。本專利實現(xiàn)了含木糖、阿拉伯糖和葡萄 糖的工業(yè)副產(chǎn)物木糖母液的利用，并獲得了高產(chǎn)的2， 3-丁二醇。經(jīng)檢驗，利用本發(fā)明所 述方法最終2， 3-丁二醇的濃度達到78.9 g/L，總糖轉(zhuǎn)化率達到85%以上，2, 3-丁二醇最 大生產(chǎn)率為1.3g/(L/h)，具有極大的推廣和應(yīng)用前景。
具體實施例方式
本發(fā)明所選用的菌株為肺炎克雷伯氏菌(K/efe/e〃a; "e"wo"/ae) CICC 10011或者肺炎 克雷伯氏菌(尺/eZwW/a; "eMmom'ae) ATCC8724。其中，肺炎克雷伯氏菌CICC 10011可由 中國工業(yè)微生物菌種管理保藏中心購得，肺炎克雷伯氏菌ATCC 8724可由美國標準生物 品收藏中心購得。
本發(fā)明所用的木糖母液，是以玉米芯為原料的木糖醇生產(chǎn)工業(yè)中的副產(chǎn)物。其中木糖 母液的常規(guī)生產(chǎn)流程為 一定量玉米芯放入水解釜中，在1.5kg壓力條件下，加入一定稀 釋濃度的硫酸水解一定時間，水解液板框壓濾機過濾，過濾得到的液體中和后用活性炭脫 色，經(jīng)過離子交換樹脂脫酸處理，進入蒸發(fā)裝置中進行蒸發(fā)，得到總糖濃度為20%左右的濃縮液，然后重復脫色、離子交換和蒸發(fā)過程，得到總糖50%左右的濃縮液，然后進 行負壓蒸發(fā)濃縮，得到總糖80%左右的濃縮液，然后在結(jié)晶釜中以l °C/h左右的降溫速 度降溫結(jié)晶。將結(jié)晶后的混合物離心，得到的固體為木糖晶體，得到的液體即為本發(fā)明所 述的木糖母液。
上述木糖母液可以以工業(yè)副產(chǎn)物的形式從山東龍力生物科技有限公司、山東福田藥業(yè) 有限公司、山東邢店生物科技有限公司等公司直接購得。但不同公司不同批次的木糖母液 總糖含量指標有所不同，本發(fā)明方法適用于總含糖量為50 70%的木糖母液。
本發(fā)明方法中涉及的葡萄糖的測定方法為發(fā)酵液稀釋后離心，采用生物傳感分析儀 SBA-40C (山東省科學院生物研究所)測定。測定原理為利用固定化葡萄糖脫氫酶膜專一 性測定葡萄糖含量。
本發(fā)明方法中涉及的木糖、阿拉伯糖檢測方法為Agilent 1100高效液相色譜儀， G1311A四元泵，示差折光分析檢測器，進樣量10iaL。 Agilent HPLC 2D色譜工作站。色 譜柱為ZORBAX碳水化合物分析柱(4.6 X 150 mm)，柱溫30 5(TC，流動相為乙腈 水=80: 20(v/v)，流速1.2mL/min。以保留時間定性，外標法定量。
本發(fā)明方法中涉及的總糖的測定方法為使用DNS方法測定總糖。具體操作過程如 下吸取稀釋好的樣品3 mL于25 mL定糖管中，加入2.0 mL DNS試劑，沸水浴顯色5 分鐘，取出冷卻，用蒸餾水定容至25mL，同時做空白對照，用722型分光光度計測定波 長520nm處吸光度。利用250mg/kg的木糖標準溶液做出標準曲線，然后再根據(jù)標準曲 線計算出發(fā)酵液中總糖含量。
本發(fā)明方法中涉及的2,3-丁二醇的測定方法為VARIAN CP-3380氣相色譜儀檢測。 乙酸丁酯為萃取劑，體積比l: l萃取，取上層有機相檢測。具體測定的條件是火焰離 子監(jiān)測器(FID)溫度為280°C，進樣器溫度為220°C，而毛細管柱溫是從50'C升溫到180 °C，升溫速度20°C/min，載氣為氮氣。利用2,3-丁二醇標準品(德國Sigma-Aldrich公司， 貨號361461)做出標準曲線，再根據(jù)標準曲線計算出發(fā)酵液中2,3-丁二醇的含量。
下面通過具體實施例對發(fā)明作進一步的說明
實施例l
制備肺炎克雷伯氏菌(尺/^^//" /wwwow'ae ) CICC 10011菌株的種子液 將肺炎克雷伯氏菌(《/e^W/a; "eMmow'ae) CICC 10011 (購自中國工業(yè)微生物菌種管 理保藏中心)菌種接種于斜面培養(yǎng)基，35'C條件下，靜置培養(yǎng)14小時，在無菌條件下用接 種環(huán)挑取2環(huán)于裝有100mL液體種子培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為150rpm的 搖床上，37。C培養(yǎng)10小時，即制得肺炎克雷伯氏菌(《/^^^/7加"附0"/^) CICC10011菌 株的種子液。
上述斜面培養(yǎng)基是葡萄糖20g/L，蛋白胨3g/L，酵母膏4g/L，磷酸氫二鉀lg/L，磷 酸二氫鉀lg/L,氯化鈉3 g/L，硫酸鎂O.l g/L，硫酸鋅O.l g/L，瓊脂粉22 g/L， pH值調(diào)至 7.0，蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
上述種子培養(yǎng)基是葡萄糖30 g/L，磷酸氫二鉀2 g/L，磷酸二氫鉀2 g/L，硫酸銨IO g/L， 氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.1g/L， pH值調(diào)至6.5，蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例2
制備肺炎克雷伯氏菌(A:/e6wW/a;wewwom^) ATCC 8724菌株的種子液 將肺炎克雷伯氏菌(幻e^W/a/7朋imwm'ae) ATCC 8724 (購自美國標準生物品收藏中心)菌種接種于斜面培養(yǎng)基，37'C條件下，靜置培養(yǎng)12小時，在無菌條件下用接種環(huán)挑取 l環(huán)于裝有80mL液體種子培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為IOO rpm的搖床上， 35。C培養(yǎng)14小時，即制得肺炎克雷伯氏菌(K/efe/e〃fl/wewmo"/ae) ATCC 8724菌株的種子液。
上述斜面培養(yǎng)基是葡萄糖10g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏6g/L，磷酸氫二鉀3g/L，磷 酸二氫鉀3g/L，氯化鈉lg/L，硫酸鎂0.3g/L，硫酸鋅0.3g/L，瓊脂粉20 g/L， pH值調(diào)至 6.0，蒸餾水配制，U5'C滅菌20分鐘。
上述種子培養(yǎng)基是葡萄糖40 g/L，磷酸氫二鉀3 g/L，磷酸二氫鉀3 g/L，硫酸銨30 g/L， 氯化鈉3g/L，硫酸鎂0.3g/L， pH值調(diào)至7.0，蒸餾水配制，115。C滅菌20分鐘。
實施例3
利用肺炎克雷伯氏菌(尺/e6wW/a ;wa/wo"/ae)CICC 10011在三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二
醇
用實施例1制備的種子液，無菌條件下按體積比為5%的接種量接入裝液量為100 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為120 rpm的搖床上，3(TC培養(yǎng)30小時， 其中每3個小時取一次發(fā)酵液，用于測定發(fā)酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，發(fā)酵完畢 后，2， 3-丁二醇的濃度為43.7g/1，轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的87.4%。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基是初始總糖濃度為100g/L，檸檬酸三銨3g/L，磷酸氫二銨15g/L, 乙酸鈉2g/L，氯化鉀lg/L，硫酸鎂0.05g/L，硫酸鋅0.10g/L，硫酸錳0.05g/L，硫酸亞 鐵0.15g/L， pH值調(diào)至6.4;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例4
利用肺炎克雷伯氏菌(/:Mw^〃ap"eMwow'ae) ATCC 8724在三角瓶中發(fā)酵生產(chǎn)2,3-丁二
醇
用實施例2制備的種子液，無菌條件下按體積比為10%的接種量接入裝液量為150 mL 液體發(fā)酵培養(yǎng)基的500 mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 rpm的搖床上，37。C培養(yǎng)20小時， 其中每2個小時取一次發(fā)酵液，用于測定發(fā)酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，發(fā)酵完畢 后，2， 3-丁二醇的濃度為32.4g/l，轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的92.6%。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基是初始總糖濃度為70g/L，檸檬酸三銨6g/L,磷酸氫二銨25g/L， 乙酸鈉5g/L，氯化鉀5g/L，硫酸鎂0.15g/L，硫酸鋅0.05g/L，硫酸錳0.15g/L，硫酸亞 鐵0.20g/L， pH值調(diào)至7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例5
利用肺炎克雷伯氏菌(尺/e^W/a/ "ewwom'fle) ATCC 8724在5升發(fā)酵罐中分批發(fā)酵生產(chǎn) 2，3-丁二醇
從肺炎克雷伯氏菌(《/e^'e〃a ATCC 8724 (購自美國標準生物品收藏中
心)新活化的斜面上，在無菌條件下用接種環(huán)接1環(huán)于裝有90 mL種子培養(yǎng)基的500 mL三 角瓶中，37°C、 150rpm往復震蕩條件下，培養(yǎng)12小時制得種子液。
德國貝朗(BIOSTAT B, B. Braun) 5升發(fā)酵罐中加入3升發(fā)酵培養(yǎng)基，以體積比計按 6。/。的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入180mL種子培養(yǎng)液，以發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速300rpm，通氣量 1.0 vvm，初始pH值為6.5， 35'C條件發(fā)酵27小時。其中每3個小時取一次發(fā)酵液，測定發(fā) 酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度。發(fā)酵完畢后，2， 3-丁二醇的濃度為30.1 g/1，糖轉(zhuǎn)化率 為理論轉(zhuǎn)化率的86%。
8上述發(fā)酵培養(yǎng)基是初始總糖濃度為70g/L，檸檬酸三銨2g/L，磷酸氫二銨30g/L， 乙酸鈉4g/L，氯化鉀5g/L，硫酸鎂0.10g/L，硫酸鋅0.20g/L，硫酸錳0.10g/L，硫酸亞 鐵0.15g/L， pH值調(diào)至6.5;蒸餾水配制，U5'C滅菌20分鐘。
實施例6
利用肺炎克雷伯氏菌(尺/efe/e〃a p"wmom'ae) CICC 10011在5升發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵 生產(chǎn)2,3-丁二醇
從肺炎克雷伯氏菌(幻efo/e〃fl，ewmo"/"e) CICC 10011 (購自中國工業(yè)微生物菌種管 理保藏中心)新活化的斜面上，在無菌條件下用接種環(huán)接2環(huán)于裝有150mL種子培養(yǎng)基 的500mL三角瓶中，35°C， 100rpm往復震蕩條件下，培養(yǎng)14小時制得種子液。
德國貝朗(BIOSTAT B, B. Braun) 5升發(fā)酵罐中加入3升發(fā)酵培養(yǎng)基，以體積比計按 10。/。的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入300 mL種子培養(yǎng)液，以發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速400 rpm，通氣 量1.5 vvm，初始pH值為7.0， 37'C條件進行發(fā)酵。其中每3個小時取一次發(fā)酵液，測定發(fā) 酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度，當總糖濃度降到20 30g/L時，脈沖流加木糖母液， 使底物濃度達到50 70 g/L。當發(fā)酵過程中總糖消耗速率小于2g/(L七)時，停止補加木糖 母液，當2,3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時間約為61小時。發(fā)酵完畢后，2， 3-丁二醇的濃度為78.9 g/1，糖轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的85.1%。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基是初始總糖濃度為40g/L，檸檬酸三銨4g/L，磷酸氫二銨40g/L， 乙酸鈉6g/L，氯化鉀5g/L，硫酸鎂0.15g/L，硫酸鋅0.10g/L，硫酸錳0.20g/L，硫酸亞 鐵0.05g/L， pH值調(diào)至7.0;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
實施例7
利用肺炎克雷伯氏菌(幻^^//"; "^ 0"/^) ATCC 8724在5升發(fā)酵罐中補料分批發(fā)酵 生產(chǎn)2,3-丁二醇
從肺炎克雷伯氏菌(《/^*//" ; "eMWom'ae) ATCC 8724 (購自美國標準生物品收藏中 心)新活化的斜面上，在無菌條件下用接種環(huán)接l環(huán)于裝有100mL種子培養(yǎng)基的500mL三 角瓶中，35°C， 150ipm往復震蕩條件下，培養(yǎng)13小時制得種子液。
德國貝朗(BIOSTAT B， B. Braun) 5升發(fā)酵罐中加入4升發(fā)酵培養(yǎng)基，以體積比計按 5M的接種量向發(fā)酵培養(yǎng)基中接入200mL種子培養(yǎng)液，以發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速500ipm，通氣量 0.75 wm，初始pH值為6.8， 3(TC條件進行發(fā)酵。發(fā)酵中每3個小時取一次發(fā)酵液，測定發(fā) 酵液中的糖殘量和2,3-丁二醇濃度。當總糖濃度降到20 30g/L時，脈沖流加木糖母液， 使底物濃度達到60 70g/L。當發(fā)酵過程中總糖消耗速率小于2g/(L七)時，停止補加木糖 母液，當2,3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束，發(fā)酵時間約為72小時。發(fā)酵完畢后，2， 3-丁二醇的濃度為67.2 g/1，糖轉(zhuǎn)化率為理論轉(zhuǎn)化率的86.9%。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基是初始總糖濃度為50g/L，檸檬酸三銨6g/L，磷酸氫二銨35g/L， 乙酸鈉4g/L,氯化鉀4g/L，硫酸鎂0.15g/L，硫酸鋅0.15g/L，硫酸錳0.15g/L，硫酸亞 鐵0.15g/L， pH值調(diào)至6.8;蒸餾水配制，115'C滅菌20分鐘。
9
權(quán)利要求
1.一種利用木糖母液制備2，3-丁二醇的方法，其特征在于選取木糖母液作為發(fā)酵底物，以如下組分配制發(fā)酵培養(yǎng)基木糖母液60～200g/L，檸檬酸三銨2～8g/L，磷酸氫二銨5～40g/L，乙酸鈉1～6g/L，氯化鉀1～5g/L，硫酸鎂0.05～0.15g/L，硫酸鋅0.05～0.20g/L，硫酸錳0.05～0.20g/L，硫酸亞鐵0.05～0.20g/L，pH值調(diào)至6.0～7.0；上述木糖母液總糖濃度為50％～70％，配制好的發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始總糖濃度為30～100g/L；以肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)ATCC 8724作為發(fā)酵菌株，搖瓶或發(fā)酵罐發(fā)酵制備2，3-丁二醇；其中所述搖瓶發(fā)酵方法是以體積比5～10％的接種量，將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種于裝有50～150mL發(fā)酵培養(yǎng)基的500mL三角瓶瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100～160rpm的搖床上，30～40℃培養(yǎng)16～30小時，其中每隔2～4小時取樣測定發(fā)酵液中的糖殘量和2，3-丁二醇濃度，當發(fā)酵液中2，3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵停止；取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇；5升發(fā)酵罐發(fā)酵方法是當發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始總糖濃度為61～100g/L，進行分批發(fā)酵，即以體積比5～10％的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種于5升發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為2～4升，以溫度30～40℃、攪拌轉(zhuǎn)速250～500rpm、通氣量0.5～1.5vvm的條件進行通風攪拌發(fā)酵培養(yǎng)，培養(yǎng)時間為20～40小時；發(fā)酵液初始pH值調(diào)至6.0～7.0，發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關(guān)聯(lián)控制蠕動泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4來調(diào)節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；發(fā)酵過程中，每隔2～4小時取樣測定發(fā)酵液中的糖殘量和2，3-丁二醇濃度，2，3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束；取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇；或者，若發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始總糖濃度為30～60g/L，進行補料分批發(fā)酵，即以體積比5～10％的接種量，在無菌條件下將肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)ATCC 8724種子液接種于5升發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐裝液量為2～4升，溫度30～40℃、攪拌轉(zhuǎn)速250～500rpm、通氣量0.5～1.5vvm進行通風攪拌發(fā)酵培養(yǎng)；發(fā)酵液初始pH值調(diào)至6.0～7.0，發(fā)酵過程中，通過發(fā)酵罐關(guān)聯(lián)控制蠕動泵流加4～6M的KOH或3～6M的H3PO4來調(diào)節(jié)pH值，使之控制在pH 5.5～6.5；發(fā)酵過程中，每隔2～4小時取樣測定發(fā)酵液中的糖殘量和2，3-丁二醇濃度，當總糖濃度降到20～40g/L時，脈沖流加木糖母液使底物濃度達到50～70g/L；當發(fā)酵過程中總糖消耗速率小于2g/(L·h)時，停止補加木糖母液，當2，3-丁二醇濃度不再上升時，發(fā)酵結(jié)束；取發(fā)酵液分離、提取2，3-丁二醇。
2. 如權(quán)利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述種子液的制備方法是在無菌條件下用接種環(huán)接1 2環(huán)肺炎克雷伯氏菌(尺/eZwW/a;7"e"wo"/ae)CICC 10011 或者肺炎克雷伯氏菌(A7eZwW/" /w^/wo"/"e) ATCC 8724于裝有50 150 mL液體種子培 養(yǎng)基的500mL三角瓶中，置于轉(zhuǎn)速為100 160rpm的搖床上，30 40'C培養(yǎng)10 16小 時，得到種子液；其中，上述液體種子培養(yǎng)基的組分和含量分別是葡萄糖10 40 g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L，磷酸二氫鉀l 3g/L,硫酸銨5 30g/L，氯化鈉l 3g/L,硫酸鎂0.1 0.3 g/L， pH值調(diào)至6.0 7.0;上述肺炎克雷伯氏菌(《/efe/e〃a /wewwow/ae) CICC 10011或者肺炎克雷伯氏菌 (0e^W/a/wwmo"/ae) ATCC 8724斜面培養(yǎng)用的斜面培養(yǎng)基組分和含量分別是葡萄糖 10 30g/L，蛋白胨2 8g/L，酵母膏2 6g/L，磷酸氫二鉀l 3g/L,磷酸二氫鉀1 3 g/L，氯化鈉l 3g/L，硫酸鎂0.1 0.3g/L，硫酸鋅0.1 0.3g/L，瓊脂粉15 22g/L， pH 值調(diào)至6.0 7.0。
3. 如權(quán)利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述5升 發(fā)酵罐發(fā)酵條件是溫度為35-37。C,攪拌轉(zhuǎn)速為300 400rpm、通氣量為1.0 1.5vvm。
4. 如權(quán)利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述總糖 的測定方法是取所述發(fā)酵液以8000 10000 rpm離心3 6分鐘，上清液按體積比稀釋200 600 倍后，采用DNS方法測定其中總糖含量。
5. 如權(quán)利要求1所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述2， 3-丁二醇含量測定方法是取所述發(fā)酵液以8000 10000 rpm離心3 6分鐘，上清液按體積比稀釋2 7倍，用萃 取劑按體積比l: l萃取上清，用氣相色譜分析測定萃取物中的2， 3-丁二醇含量。
6. 如權(quán)利要求5所述利用木糖母液制備2， 3-丁二醇的方法，其特征在于所述萃取 劑是乙酸乙酯、氯仿、乙酸丁酯中的一種。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用木糖母液制備2，3-丁二醇的方法，是利用木糖母液作為發(fā)酵底物，用肺炎克雷伯氏菌作為發(fā)酵菌株，通過分批發(fā)酵和補料分批發(fā)酵來生產(chǎn)制備2，3-丁二醇。本發(fā)明方法最終2，3-丁二醇的濃度達到78.9g/L，總糖轉(zhuǎn)化率達到85％以上，2，3-丁二醇最大生產(chǎn)率為1.3g/(L·h)。本發(fā)明針對石油資源日益枯竭及石化產(chǎn)品價格上漲，利用可再生農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物玉米芯深加工生產(chǎn)木糖醇的副產(chǎn)物木糖母液，通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)高值平臺化合物2，3-丁二醇，實現(xiàn)了木糖醇工業(yè)副產(chǎn)物木糖母液的后開發(fā)及高價值利用。
文檔編號C12P7/02GK101550431SQ20091001499
公開日2009年10月7日 申請日期2009年5月8日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月8日
發(fā)明者唐鴻志, 姜天翼, 李理想, 鈺 王, 王愛龍, 平 許, 馬翠卿 申請人:山東大學