專利名稱：一種利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于植物育種領(lǐng)域，涉及一種辣椒感疫病育種材料的淘汰方法， 特別涉及一種利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法。利用該方法可 將辣椒感疫病育種材料在其生長的早期階段予以淘汰，具有周期短、成本低、 結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，且不影響對(duì)其他性狀的觀察，可節(jié)約大量的人力、物力及
土地資源，并大大提高育種效率。
背景技術(shù)：
辣椒疫病是由疫霉菌(尸AF^。/^y^ra L.)引起的一種毀滅性
土傳病害，在世界各地均有發(fā)生，我國則有逐年加重的趨勢(shì)。該病大流行時(shí)， 田間辣椒成片萎蔫直至全部死亡，致使辣椒的產(chǎn)量急劇減少，甚至絕收。
選育辣椒抗疫病品種是防治該病害最經(jīng)濟(jì)有效的途徑之一，但辣椒對(duì)疫 病的抗性既存在垂直抗性，也存在水平抗性，在某些育種材料中，垂直抗性 和水平抗性共存。另外，不同辣椒育種材料對(duì)疫病的抗性呈現(xiàn)"遺傳多樣化" 的特點(diǎn)，表現(xiàn)為單基因遺傳、寡基因遺傳和多基因遺傳共存。這樣，直接篩 選抗病育種材料進(jìn)行辣椒抗疫病新品種選育就會(huì)存在鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確、育種 周期長及新品種抗性不穩(wěn)定等諸多局限。
將感病育種材料淘汰是辣椒抗疫病育種的另一種可行途徑，不僅可以避 免辣椒抗疫病性鑒定困難的問題，而且能夠最大限度地保留抗病育種材料的 遺傳多樣性，最大限度地滿足其他不同育種目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)。
目前使用的淘汰辣椒感疫病育種材料的主要方法是人工苗期接種，這種 方法操作繁瑣、易受環(huán)境影響，鑒定結(jié)果不準(zhǔn)確、不穩(wěn)定。利用分子標(biāo)記進(jìn) 行辣椒感疫病育種材料的淘汰具有操作簡單，結(jié)果可靠，不受環(huán)境影響，鑒定成本低等優(yōu)點(diǎn)。發(fā)明人利用cDNA-AFLP技術(shù)獲得了接種疫霉菌后在辣椒感 疫病育種材料中特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因，根據(jù)此基因的核苷酸序列設(shè)計(jì)特異引 物即可獲得感疫病辣椒育種材料的分子標(biāo)記，以用于感疫病辣椒育種材料的 快速淘汰，加快辣椒抗疫病優(yōu)良新品種的選育進(jìn)程。

發(fā)明內(nèi)容
針對(duì)上述辣椒育種材料抗疫病性鑒定中存在的問題，本發(fā)明的目的在 于，提出一種利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法。該方法利用分 子標(biāo)記技術(shù)在生長早期階段淘汰感疫病的辣椒育種材料，具有周期短、成本 低、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，且不影響對(duì)其他性狀的觀察，可節(jié)約大量的人力、物 力及土地資源，并大大提高育種效率。
為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下的技術(shù)解決方案 一種利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，其特征在于，具體 過程包括如下步驟 '
(1) 將抗疫病性未知的辣椒育種材料播種于育苗盤進(jìn)行常規(guī)管理，待 幼苗長至3 4片真葉時(shí)，用改良SDS法分別提取不同育種材料幼嫩葉片的 基因組DNA;
(2) 以上述幼嫩葉片的基因組DNA為模板，利用分子標(biāo)記的正反向引 物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；
上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)所用分子標(biāo)記的正向引物的核苷酸序列為5' -ctg tgatatggaagggg認(rèn)c-3 ，， 反向弓l物的核苷酸序歹廿為5, -認(rèn)tcgctggg 朋aagaatg-3，。
上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25uL，其中含1X擴(kuò)增Buffer, 10ng 25ng模板DNA， 2. 0mmol/L的MgCl2， 0. 4 u mol/L的正向引物，0.4umol/L 的反向引物，0.2 mmol/L的dNTPs， 0. 5 U ra《DNA聚合酶。
上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?5"C預(yù)變性5min，再進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)程序?yàn)?4。C變性lmin， 54。C退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進(jìn)行34個(gè) 循環(huán)，最后在72t:下延伸10min， 4"C保存。
(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴化乙錠染色， 利用凝膠成像系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果；
(4) 對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行如下判定 若電泳結(jié)果顯示能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，說明該育種材
料為感疫病辣椒育種材料，將其淘汰；
若電泳結(jié)果顯示不能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，說明該育種 材料為抗疫病辣椒育種材料，可用于進(jìn)一步的辣椒抗疫病新品種選育。
本發(fā)明的方法和人工苗期接種方法相比，具有下述技術(shù)效果
(1) 利用本發(fā)明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，可在育種材料生長 的早期階段進(jìn)行，而不影響對(duì)其他性狀的觀察。
(2) 利用本發(fā)明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，可靠性高，不受外 界環(huán)境條件影響。
(3) 利用本發(fā)明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，所需周期短，可在 1 2天內(nèi)得到篩選結(jié)果。
(4) 利用本發(fā)明的方法淘汰辣椒感疫病育種材料，所需成本低，僅為 2元/份 3元/份育種材料。


圖1為利用本發(fā)明的方法對(duì)公認(rèn)的辣椒抗疫病育種材料CM334和感疫病 育種材料Early Calwonder的淘汰結(jié)果。圖中，第1泳道為CM334，無990bp 條帶；第2泳道為Early Calwonder，有990bp條帶；第3泳道為DNA分子量標(biāo) 準(zhǔn)DL2000。
圖2為利用本發(fā)明的方法對(duì)抗疫病辣椒育種材料CM334、感疫病辣椒育種 材料Early Calwonder,以及A2、 All、 B19、 B27、 2031、 2056、 2096、茄門等8份抗疫病性未知的辣椒育種材料的鑒定結(jié)果。其中，第1泳道和第2 4 泳道分別為Early Calwonder和其他3份感疫病育種材料(B27、茄門和2096)， 有990 bp條帶出現(xiàn)。第5泳道和第6 10泳道分別為CM334和其他5份抗疫病育 種材料(A2、 All、 B19、 2056、 2031)，無990bp條帶出現(xiàn)。第11泳道為DNA 分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000。
以下結(jié)合附圖和應(yīng)用實(shí)例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的詳細(xì)說明。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明是利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，首次利用分子 標(biāo)記技術(shù)對(duì)辣椒感疫病育種材料在生長早期階段進(jìn)行淘汰，其具體步驟如
下
(1) 將抗疫病性未知的育種材料播種于育苗盤進(jìn)行常規(guī)管理，溫度保
持在25。C 30。C、相對(duì)濕度50% 70%，光照3000 4000 Lx。待幼苗長至3 4片真葉時(shí)，用改良SDS方法(鞏振輝等，以PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的微量DNA 提取方法[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997， 25 (1): 45-47)分別提取不同育 種材料幼嫩葉片的基因組DNA，用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，并用1X TE緩沖溶液將DNA濃度調(diào)至25ng/ u L。
(2) 以上述基因組DNA為模板，根據(jù)發(fā)明人獲得的接種疫霉菌后在感
疫病辣椒育種材料中特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的正反向引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。其中，正向引物的核苷酸序列為5' -ctgtgatatggaagg gg獄c -3，，反向弓i物的核苷酸序歹廿為5，-認(rèn)tcgctgggaaa卿atg-3，0
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25u L，其中含1X擴(kuò)增Buffer, 10ng 25ng 模板DNA， 2. 0 mmol/L的MgCl2， 0.4 umol/L的正向引物，0.4umol/L的 反向引物，0.2ramol/L的dNTPs， 0. 5 U 7a《DNA聚合酶。其中，PCR擴(kuò)增的 反應(yīng)程序?yàn)?5"C預(yù)變性5min，再進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)程序?yàn)?4"C變性lmin， 54。C退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后在72""C下延伸10min， 4'C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在美國Bio-rad DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，用終濃度為1 Ug/mL溴化乙錠染色，利用Genesnap凝膠成像系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果。 根據(jù)所記錄的電泳結(jié)果，按如下方式判定
如果電泳結(jié)果顯示能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，說明該材料 為感病育種材料，可將其淘汰；
如果電泳結(jié)果顯示不能擴(kuò)增出一條長度為990 bp的特征條帶，說明該 材料為抗病育種材料，可用于進(jìn)一步的辣椒抗疫病新品種選育。
以下是本發(fā)明的具體應(yīng)用實(shí)例，這些均是較優(yōu)的例子，本發(fā)明的應(yīng)用并 不限于這些實(shí)施例。 應(yīng)用實(shí)施例1:
(1) 將公認(rèn)的辣椒感疫病育種材料Early Calwonder和抗疫病育種材 料CM334播種于育苗盤進(jìn)行常規(guī)管理，溫度保持在25'C 3(TC、相對(duì)濕度 50% 70%，光照3000Lx 4000Lx。待幼苗長至3 4片真葉時(shí)，用改良SDS 方法(鞏振輝等，以PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的微量DNA提取方法[J].西北農(nóng)業(yè) 大學(xué)學(xué)報(bào)，1997， 25 (1): 45-47)分別提取不同親本嫩葉的基因組DNA， 用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，并用1XTE緩沖溶液將DNA濃度調(diào)至25 ng/u匕。
(2) 以上述基因組DNA為模板，根據(jù)發(fā)明人獲得的接種疫霉菌后在感
疫病辣椒育種材料中特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的正、反向引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。其中，正向引物的核苷酸序列為5' -ctgtgatatggaaggg gaacc-3，，反向弓l物的核苷酸序歹!j為5， -aactcgctgggaaaagaatg-3，。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25uL，其中含IX擴(kuò)增Buffer, 10ng 25ng 模板DNA， 2. 0mmol/L的MgCl2， 0. 4 u mol/L的正向引物，0.4umol/L的反 向引物，0. 2mmol/L的dNTPs， 0. 5 U 7^^DNA聚合酶。其中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?5t:預(yù)變性5min，再進(jìn)入PCR循環(huán)，循 環(huán)程序?yàn)?4。C變性lmin， 54。C退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進(jìn)行34個(gè) 循環(huán)，最后在72。C下延伸10min， 4。C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在美國Bio-rad DNA 擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
(3) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，用終濃度為1 Hg/mL溴化乙錠染色，利用Genesnap凝膠成像系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果。 根據(jù)電泳結(jié)果顯示，感疫病辣椒育種材料Early Calwonder能擴(kuò)增出一條長 度為990bp的特征條帶，而抗疫病辣椒育種材料CM334不能擴(kuò)增出一條長度 為990bp的特征條帶(參見圖1)。 應(yīng)用實(shí)施例2:
(1) 將公認(rèn)的辣椒感疫病育種材料Early Calwonder和抗疫病育種材 料CM334和A2、 All、 B19、 B27、 2031、 2056、 2096、茄門等8份抗疫病性 未知的辣椒育種材料按羅德旭等方法(羅德旭等，辣椒疫病抗病性分子鑒定 技術(shù)研究[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008， 17 (5): 76-80)進(jìn)行抗病性鑒定，即 在植株6 8葉時(shí)采用灌根法進(jìn)行接種，接種前l(fā)d灌透水。接種時(shí)，用玻棒 在距幼苗根莖約3 cm處扎一孔，孔深3 cm，準(zhǔn)確吸取3mL濃度為1X lOVmL 疫霉菌游動(dòng)孢子懸浮液注入孔內(nèi)，每品種10株，重復(fù)3次。保濕24h后， 在28'C，相對(duì)濕度90%，光照為4000Lx， 12h的人工氣候箱內(nèi)促使發(fā)病。接 種后7d調(diào)査發(fā)病級(jí)別，并計(jì)算病情指數(shù)。
(2) 接種結(jié)果顯示，Early Calwonder的病情指數(shù)為97. 6，屬于高感 疫病育種材料；CM334的病情指數(shù)為0，屬于高抗疫病育種材料。A2、 All、 B19、 B27、 2031、 2056、 2096、茄門等8份抗疫病性未知的辣椒育種材料中， 表現(xiàn)感病的有3份，分別為B27、茄門和2096，其病情指數(shù)分別為80. 7、 72.7、 54.2;表現(xiàn)抗病的有5份，分別為All、 A2、 B19、 2056、 2031，其 病情指數(shù)分別為0 (高抗)、5 (高抗)、12.7 (抗病)、42.5 (中抗)、45.7(中抗)。
(3) 將上述10份辣椒育種材料播種于育苗盤進(jìn)行常規(guī)管理，溫度保持 在25。C 30。C、相對(duì)濕度50% 70%，光照3000 Lx 4000Lx。待幼苗長至3 4片真葉時(shí)，用改良SDS方法(鞏振輝等，以PCR鑒定轉(zhuǎn)基因植株的微量DNA 提取方法[J].西北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1997， 25 (1): 45-47)分別提取不同親 本嫩葉的基因組DNA，用核酸蛋白定量儀測定DNA濃度，并用1XTE緩沖溶 液將DNA濃度調(diào)至25ng/ u L。
(4) 以上述基因組DNA為模板，根據(jù)發(fā)明人獲得的接種疫霉菌后在感
疫病辣椒育種材料中特異誘導(dǎo)表達(dá)的基因序列設(shè)計(jì)分子標(biāo)記的正、反向引物 進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。其中，正向引物的核苷酸序列為5' -ctgtgatatggaaggg gaacc-3，，反向弓I物的核苷酸序歹U為5， -aactcgctgggaaaagaatg-3，。
PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25uL，其中含IX擴(kuò)增Buffer, 10ng 25ng 模板DNA， 2. Ommol/L的MgCl2， 0. 4 u mol/L的正向引物，0.4umol/L的反 向引物，0. 2mmol/L的dNTPs， 0. 5 U 7sg DNA聚合酶。PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序 為95'C預(yù)變性5min，再進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)程序?yàn)?4。C變性lmin， 54°C 退火lmin， 72。C延伸1. 5min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后在72t)下延伸10min， 4。C保存。PCR擴(kuò)增反應(yīng)在美國Bio-rad DNA擴(kuò)增儀上進(jìn)行。
(5) PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1. 2%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，用終濃度為1 u g/mL溴化乙錠染色，利用Genesnap凝膠成像系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果。
(6) 電泳結(jié)果顯示，感疫病辣椒育種材料Early Calwonder和其他3 份感疫病育種材料(B27、 2096、茄門)能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征 條帶，而抗疫病辣椒育種材料CM334和其他5份抗疫病育種材料(A2、 All、 B19、 2056、 2031)不能擴(kuò)增出一條長度為990 bp的特征條帶(附圖2)。
(7) 分子標(biāo)記淘汰結(jié)果與人工苗期接種淘汰結(jié)果表現(xiàn)一致。
權(quán)利要求
1、一種利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，其特征在于，具體過程包括如下步驟(1)將抗疫病性未知的辣椒育種材料播種于育苗盤進(jìn)行常規(guī)管理，待幼苗長至3～4片真葉時(shí)，用改良SDS法分別提取不同育種材料幼嫩葉片的基因組DNA；(2)以上述幼嫩葉片的基因組DNA為模板，利用分子標(biāo)記的正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)；分子標(biāo)記的正向引物的核苷酸序列為5’-ctgtgatatggaaggggaacc-3’，反向引物的核苷酸序列為5’-aactcgctgggaaaagaatg-3’(3)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴化乙錠染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果；(4)對(duì)電泳結(jié)果進(jìn)行如下判定若電泳結(jié)果顯示能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，說明該育種材料為感疫病辣椒育種材料，將其淘汰；若電泳結(jié)果顯示不能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，說明該育種材料為抗疫病辣椒育種材料。
2、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的總體積為25uL，其中含1X擴(kuò)增Buffer, 10ng 25ng模板DNA， 2.0mmol/L MgCl2，0. 4 u mol/L的正向引物，0. 4 y mol/L的反向引物，0. 2 mmol/LdNTPs， 0. 5 U DNA聚合酶。
3、 如權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述步驟(2)中PCR擴(kuò)增反應(yīng)的程序?yàn)?5-C預(yù)變性5min，再進(jìn)入PCR循環(huán)，循環(huán)程序?yàn)?4。C變性lmin， 54。C退火lmin， 72""C延伸1. 5min，共進(jìn)行34個(gè)循環(huán)，最后在72°C下延伸10min， 4'C保存。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種利用分子標(biāo)記淘汰辣椒感疫病育種材料的方法，將抗疫病性未知的辣椒育種材料播種于育苗盤進(jìn)行常規(guī)管理，等幼苗長至3～4片真葉時(shí)，用改良SDS法分別提取不同育種材料嫩葉的基因組DNA，利用分子標(biāo)記的正反向引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在1.2％瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，溴化乙錠染色，利用凝膠成像系統(tǒng)觀察、記錄電泳結(jié)果。若電泳結(jié)果顯示能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，則該材料為感疫病辣椒育種材料，將其淘汰；若電泳結(jié)果顯示不能擴(kuò)增出一條長度為990bp的特征條帶，則該材料為抗疫病辣椒育種材料。該方法可將辣椒感疫病育種材料在其生長的早期階段予以淘汰，具有淘汰周期短、成本低、結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)，且不影響對(duì)其他性狀的觀察。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101487049SQ200910021240
公開日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者劉珂珂, 鞏振輝, 李大偉, 逯明輝, 陳儒鋼, 煒 黃 申請(qǐng)人:西北農(nóng)林科技大學(xué)