專利名稱：一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明為一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法，將現(xiàn)代生物調(diào)控技 術(shù)應(yīng)用于蛹蟲(chóng)草深層液體發(fā)酵，專用于富含蟲(chóng)草素的蛹蟲(chóng)草菌絲生產(chǎn)，屬于生物工程技 術(shù)領(lǐng)域。
二背景技術(shù)：
蛹蟲(chóng)草在我國(guó)又叫北冬蟲(chóng)夏草，是一種能寄生多種鱗翅目昆蟲(chóng)蛹及幼蟲(chóng)的蟲(chóng)草菌。 蛹蟲(chóng)草與冬蟲(chóng)夏草在藥化和藥理上十分相似，在功能食品、醫(yī)藥和生物技術(shù)方面有很好 的實(shí)用價(jià)值。近年國(guó)內(nèi)外生產(chǎn)上市的一些名為冬蟲(chóng)夏草的藥品和功能食品，相當(dāng)部分實(shí) 際都是用蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)的。蛹蟲(chóng)草子實(shí)體中最主要的特征性功能成分為蟲(chóng)草素，但研究表 明人工培養(yǎng)無(wú)性菌絲體中蟲(chóng)草素含量很少。
目前,蛹蟲(chóng)草生產(chǎn)仍以固體栽培為主，因其周期長(zhǎng)、勞動(dòng)強(qiáng)度大、占地多、生產(chǎn)效率
低，而且受環(huán)境、區(qū)域、季節(jié)、原材料、易遭病蟲(chóng)害等限制，產(chǎn)量與質(zhì)量不穩(wěn)定。
隨著液體深層發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展，已對(duì)許多大型真菌進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)，而液體深層發(fā)
酵技術(shù)具有生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)便、材料易得、占地少、周期短、所得產(chǎn)品質(zhì)量好且穩(wěn)定、生產(chǎn) 效率高、容易控制等優(yōu)點(diǎn)；同時(shí)利用深層培養(yǎng)技術(shù)在短時(shí)間內(nèi)培養(yǎng)出大量的菌絲體，既 可作為具有純度高、活力強(qiáng)、繁殖快的液體菌種，使生產(chǎn)原種和栽培種的時(shí)間大大縮短， 能使工廠大規(guī)模生產(chǎn)，為集約化、標(biāo)準(zhǔn)化創(chuàng)造有利條件，具有廣闊的前景。因此，如果 能通過(guò)液體發(fā)酵、加以調(diào)控技術(shù)獲得富含蟲(chóng)草素的蟲(chóng)草發(fā)酵菌粉產(chǎn)品，將會(huì)產(chǎn)生很大的 經(jīng)濟(jì)效益。
內(nèi)生真菌是一類非常特殊的真菌，它們生活在植物組織內(nèi)部，具有獨(dú)特的生物學(xué)和 遺傳學(xué)系統(tǒng)，能產(chǎn)生具有多種生物活性的新型化合物，在作為真菌誘導(dǎo)子方面具有很大 的優(yōu)勢(shì)。本發(fā)明從銀杏中分離內(nèi)生真菌，從中篩選一株對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素積累具有 顯著促進(jìn)作用的菌株，同時(shí)結(jié)合培養(yǎng)基優(yōu)化和無(wú)機(jī)鹽誘導(dǎo)，獲得了一種能顯著提高蛹蟲(chóng) 草發(fā)酵生物量和菌體中蟲(chóng)草素含量的方法。
三
發(fā)明內(nèi)容
技術(shù)問(wèn)題本發(fā)明的目的是提供一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵 方法，實(shí)現(xiàn)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵菌粉的規(guī)?；?biāo)準(zhǔn)化高效生產(chǎn)，富含特征性成分蟲(chóng)草素，產(chǎn)品 質(zhì)量穩(wěn)定。
技術(shù)方案本發(fā)明所提供一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法，包
括
1)生物型誘導(dǎo)子的制備本研究室斜面保存的一株炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌C^tonasp.) YX-28,接種到PDA液體培養(yǎng)基中，PDA液體培養(yǎng)基為土豆200g、葡萄糖20g、 水1000mL、 pH自然，25°C、 120rpm黑暗培養(yǎng)7d。將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，在冰浴 條件下于超聲波細(xì)胞破碎儀中1200W、5min(超聲時(shí)間5s、間隔時(shí)間3s)處理，lOOOOrpm 離心10min，收集上清冷凍干燥，制成20mg/mL的儲(chǔ)備溶液，最后經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾 除菌。
2) 非生物型誘導(dǎo)子制備稱取乙酸鈉、硫酸銨，以70%甲醇水溶液溶解，配制成 濃度分別為0.07mol/L、 0.056mol/L的混合溶液，經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾除菌。
3) 菌種活化將？0厶斜面保存的蛹蟲(chóng)草(0^>^戸附//加^)菌種接種到液體培養(yǎng) 基(土豆200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂lg、維生素B!0.01g、水1000ml) 中活化，黑暗條件下、2(TC、搖床120rpm振蕩培養(yǎng)5天。
4) 蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基的組成按糖蜜20g/L、玉米漿干粉10g/L、氯化鈣0.25g/L、 磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L稱取各組分，以水溶解。
5) 10L—級(jí)種子罐培養(yǎng)按照4)所述培養(yǎng)基配方，以7L體積計(jì)稱取所需各組分， 并按2%。比例(體積比)添加消泡劑，以2-3L水溶解后加入種子罐中，12rC蒸汽滅菌 15min，控制滅菌后培養(yǎng)基體積為罐容積的60%;培養(yǎng)基冷卻后，采用火圈接種法將活 化好的菌液按體積比10%接種到種子罐中，種子罐溫度2(TC，攪拌速率100rpm，無(wú)菌 空氣流量0.75wm，罐壓0.1Mpa，培養(yǎng)3天；
6) IOOL發(fā)酵罐培養(yǎng)按照4)所述培養(yǎng)基配方，以70L體積計(jì)稱取所需各組分， 并按2%。比例(體積比)添加消泡劑，以40L水溶解后加入發(fā)酵罐中，12rC蒸汽滅菌 15min，控制滅菌后培養(yǎng)基體積為罐容積的60%。培養(yǎng)基冷卻后，通過(guò)壓差法將種子罐 中的種子液由專用管道轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，2(TC，攪拌速率100rpm，無(wú)菌空氣流量
0. 75wm，罐壓0.1Mpa，培養(yǎng)96h后由補(bǔ)料口加入步驟1)中所述生物型誘導(dǎo)子過(guò)濾除 菌的銀杏內(nèi)生真菌提取物，使終濃度為120|ag/mL;繼續(xù)培養(yǎng)，120h后由補(bǔ)料口加入步 驟2)中所述非生物型誘導(dǎo)子至乙酸鈉、硫酸銨的終濃度分別為0.5mmol/L、 0.4mmol/L， 繼續(xù)培養(yǎng)至8天終止發(fā)酵。
有益效果蛹蟲(chóng)草是我國(guó)名貴的中藥材之一，其所含藥用成分和多種藥效可與冬蟲(chóng) 夏草相媲美，目前我國(guó)蟲(chóng)草菌粉市場(chǎng)上還沒(méi)有蛹蟲(chóng)草產(chǎn)品，已出現(xiàn)的產(chǎn)品主要是采用被 孢霉屬、蟲(chóng)草頭孢、粉紅膠霉和蝙蝠蛾擬青霉，而且對(duì)于蟲(chóng)草菌粉產(chǎn)品中特征性功能成 分如蟲(chóng)草素等沒(méi)有明確標(biāo)示。本發(fā)明采用現(xiàn)代生物工程技術(shù)，通過(guò)在農(nóng)副產(chǎn)品基質(zhì)中添 加無(wú)機(jī)鹽和內(nèi)生真菌誘導(dǎo)因子提高蛹蟲(chóng)草菌株的菌絲生長(zhǎng)量和其中特征性活性成分蟲(chóng) 草素的含量，使蛹蟲(chóng)草生物量和菌體中蟲(chóng)草素含量比未添加誘導(dǎo)子的對(duì)照培養(yǎng)基分別增 加了 1.76倍和7.14倍，比普通的改良PDA分別增加了 2.35倍、23.25倍，大大減少了 生產(chǎn)成本、提高了產(chǎn)品質(zhì)量，為工業(yè)化生產(chǎn)提供基礎(chǔ)。 本發(fā)明的主要優(yōu)點(diǎn)和積極效果如下
1. 采用糖蜜、玉米漿干粉等作為蛹蟲(chóng)草液體發(fā)酵培養(yǎng)基的主要碳、氮源，為蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)提高豐富的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì)，且節(jié)約成本；
2. 在特定的發(fā)酵時(shí)間通過(guò)添加無(wú)機(jī)鹽和自制的內(nèi)生真菌提取物誘導(dǎo)子聯(lián)合作用，提高 蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)量和菌絲中活性物質(zhì)的含量，既滿足了工業(yè)生產(chǎn)的要求，也符合現(xiàn)代 消費(fèi)者對(duì)食品營(yíng)養(yǎng)和保健的要求。
3. 通過(guò)現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)對(duì)蛹蟲(chóng)草進(jìn)行深層液體培養(yǎng)，工藝簡(jiǎn)單、無(wú)菌操作易控制、生產(chǎn) 效率高，適合規(guī)?；a(chǎn)。
四

圖1內(nèi)生真菌提取物對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量的影響
圖2內(nèi)生真菌提取物對(duì)菌絲體中蟲(chóng)草素含量的影響
圖3硫酸銨對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量的影響
圖4硫酸銨對(duì)菌絲體中蟲(chóng)草素含量的影響
圖5乙酸鈉對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量的影響
圖6乙酸鈉對(duì)菌絲體中蟲(chóng)草素含量的影響
圖7大豆油濃度對(duì)菌體生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素含量的影響
圖8攪拌速率對(duì)菌體生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素含量的影響
圖9發(fā)酵罐通氣量對(duì)菌體生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素含量的影響
五具體實(shí)施例方式
1.誘導(dǎo)子優(yōu)化
預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明培養(yǎng)基中糖蜜、玉米漿、氯化鈣對(duì)蛹蟲(chóng)草生物量有顯著影響，在常 規(guī)的農(nóng)副產(chǎn)品培養(yǎng)基組成基礎(chǔ)上，研究生物型和非生物型誘導(dǎo)子對(duì)菌絲體中蟲(chóng)草素含量 的影響。
在實(shí)驗(yàn)室搖床培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中，蟲(chóng)草菌株在改良的PDA液體(土豆200g、葡萄糖20g、 磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂lg、維生素Bi0.01g、水1000ml)中培養(yǎng)7天可達(dá)到最大生物 量為8.69g/L，菌絲體中蟲(chóng)草素含量為0.47mg/g;
以農(nóng)副產(chǎn)品為原料優(yōu)化的蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基組成為:糖蜜20g/L、玉米漿干粉10g/L、 氯化鈣0.25g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L，水lOOOmL，在該培養(yǎng)基中， 蛹蟲(chóng)草培養(yǎng)7天的生物量為11.62g/L，菌絲體中蟲(chóng)草素含量為1.53mg/g; 1.1生物誘導(dǎo)子對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響
在研究中，我們發(fā)現(xiàn)炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌YX-28對(duì)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)和代謝產(chǎn)物積 累具有促進(jìn)作用。
生物型誘導(dǎo)子的制備將炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌YX-28 (公知公用，見(jiàn)參考文獻(xiàn)[[l] 劉小莉，等.一株銀杏內(nèi)生真菌YX-28的鑒定和分析，食品科學(xué)，2007， 28(6): 205-208; [2] Xiaoli Liu, et al. Antioxidant activity and phenolics of an endophytic々/鎖'a sp. from G/w一 6歸o. Food Chemistry, 2007, 105: 548-554; [3] Xiaoli Liu, et al. Antimicrobial activity of an endophyticsp.YX-28 and identification of its antimicrobial components. Applied Microbiology and Biotechnology, 2008， 78: 241-247])接種至U PDA液體培養(yǎng)基(土豆200g、葡萄糖20g、水1000mL，自然pH)中，25°C、 120rpm黑暗 培養(yǎng)7d，將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，在冰浴條件下于超聲波細(xì)胞破碎儀中1200W，超 聲時(shí)間5s、間隔時(shí)間3s共處理5min， 10000rpm離心10min，收集上清冷凍干燥，制成 20mg/mL的儲(chǔ)備溶液，最后經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾除菌，得生物型誘導(dǎo)子銀杏內(nèi)生真菌水 提物作為生物性誘導(dǎo)子。
考察添加生物性誘導(dǎo)子終濃度分別為50、 100、 120、 150、 200Pg/mL、并在不同發(fā) 酵時(shí)期添加時(shí)對(duì)結(jié)果的影響。圖1結(jié)果顯示添加內(nèi)生真菌提取物會(huì)顯著增加蛹蟲(chóng)草的生 物量，而且添加時(shí)間越早作用越明顯，添加濃度為150Hg/mL能得到最大的生物量，但 更高的濃度會(huì)抑制蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)；圖2結(jié)果顯示，濃度為120Pg/rnL、在發(fā)酵至96h時(shí) 添加會(huì)得到最大的蟲(chóng)草素含量為3.75mg/g。綜合考慮，采用提取物添加濃度為 120Hg/mL、在發(fā)酵至96h時(shí)添加，此時(shí)能得到單位發(fā)酵體積中最大的蟲(chóng)草素產(chǎn)量為 57.23mg/L。
1.2硫酸銨對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響
硫酸銨的添加對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲的生長(zhǎng)和其中蟲(chóng)草素的積累具有相反的作用。發(fā)酵前期 硫酸銨的添加大大抑制了菌體的生長(zhǎng)(圖3)，但對(duì)菌體中蟲(chóng)草素的積累具有極顯著的 促進(jìn)作用(圖4)， 0 96h內(nèi)添加硫酸銨對(duì)產(chǎn)物積累的作用比較緩慢，發(fā)酵至120h時(shí)添 加則迅速增加，添加終濃度為0.4mmol/L時(shí)達(dá)最大含量為8.97mg/g，此時(shí)生物量為 17.09g/L，稍低于僅于96h添加內(nèi)生真菌提取物的水平(18.16g/L)，但單位發(fā)酵體積內(nèi) 的蟲(chóng)草素總量得到了顯著增加。 1.3乙酸鈉對(duì)蛹蟲(chóng)草生長(zhǎng)的影響
圖5結(jié)果顯示，發(fā)酵前期較低濃度的乙酸鈉的添加對(duì)生物量的抑制作用不大，96h 后再添加則對(duì)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)沒(méi)有顯著影響，而對(duì)蟲(chóng)草素的積累有一定的促進(jìn)作用(圖 6)，最理想的終濃度為0.5mmol/L、發(fā)酵至120h時(shí)添加。 2.發(fā)酵罐參數(shù)
為了將優(yōu)化的培養(yǎng)基應(yīng)用于工業(yè)發(fā)酵，研究中試水平上消泡劑、發(fā)酵罐攪拌速率、 通氣量對(duì)蛹蟲(chóng)草菌體的生長(zhǎng)和蟲(chóng)草素積累的影響。 2.1消泡劑
目前食品工業(yè)中采用的消泡劑配料多為聚二甲基硅氧垸、二氧化硅、聚氧乙烯山梨 醇酐、單硬脂酸酯、碳酸鈣等。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)采用工業(yè)消泡劑對(duì)蛹蟲(chóng)草菌絲體的生長(zhǎng)有很大 抑制作用，且在發(fā)酵罐中試實(shí)驗(yàn)中用量大、消泡作用不佳。因此考慮采用食用油作為消 泡劑，本研究采用大豆油。
圖7結(jié)果顯示在攪拌速率為80rpm、通氣量為lwm時(shí)培養(yǎng)基中添加一定量的大豆 油對(duì)菌體生長(zhǎng)有促進(jìn)作用，添加濃度為2%0時(shí)生物量達(dá)到最大，但對(duì)菌絲中蟲(chóng)草素含量 沒(méi)有顯著影響。因此采用大豆油的添加量為2%。。 2.2發(fā)酵罐攪拌速率的確定
圖8結(jié)果表明低攪拌速率下菌絲體生長(zhǎng)量增長(zhǎng)緩慢。攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm時(shí)，蛹蟲(chóng)草菌絲體量產(chǎn)率最高，可達(dá)到19.27g/L。隨著攪拌轉(zhuǎn)速的繼續(xù)提高(120rpm)，剪切作 用力較大，菌絲易被打斷，造成細(xì)胞損傷，菌絲生物量明顯下降。菌體中蟲(chóng)草素含量隨 攪拌轉(zhuǎn)速有一定變化，最大含量在100rpm條件下，因此確定發(fā)酵罐攪拌速率為100rpm。 2.3發(fā)酵罐通氣量對(duì)生物量的影響
發(fā)酵罐通氣量的大小對(duì)蛹蟲(chóng)草的生長(zhǎng)影響較大，圖9結(jié)果顯示，通氣量由0.5wm 增加到0.75wm，菌體生物量迅速提高至20.46g/L，通氣量繼續(xù)增大則生物量變化不明 顯，而且不同的通氣量對(duì)菌體中蟲(chóng)草素含量的影響也不大。 3、結(jié)論
本發(fā)明專利提供一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法，在本專利 條件下進(jìn)行蛹蟲(chóng)草100L發(fā)酵中試，可以達(dá)到蛹蟲(chóng)草生物量為20.46 g/L，菌體中蟲(chóng)草素 含量為10.93 mg/g。結(jié)果比在改良的PDA液體中培養(yǎng)所得到的生物量和蟲(chóng)草素含量分 別提高了2.35倍、23.25倍；比在未添加誘導(dǎo)子的、以農(nóng)副產(chǎn)品為原料的培養(yǎng)基中所得 到的生物量和蟲(chóng)草素含量分別提高了 1.76倍、7.14倍。 實(shí)施舉例-
1) 生物型誘導(dǎo)子的制備-
參照以上步驟l.l
2) 非生物型誘導(dǎo)子制備
稱取乙酸鈉、硫酸銨，以體積比70%甲醇水溶液溶解，配制成濃度分別為0.07mol/L、 0.056mol/L的混合溶液，經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾除菌，得非生物型誘導(dǎo)子；
3) 蛹蟲(chóng)草菌株的搖瓶培養(yǎng)活化
將蛹蟲(chóng)草(Co^yce戸mito"&)菌種(市售)接種到液體培養(yǎng)基(土豆200g、葡萄糖 20g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂lg、維生素Bi0.01g、水1000ml)中活化，黑暗條件下、 2CTC 、搖床120rpm振蕩培養(yǎng)5天。
4) IOL—級(jí)種子罐培養(yǎng)
稱取糖蜜140g、玉米漿干粉70g、氯化鈣1.75g、磷酸二氫鉀3.5g、磷酸氫二鉀3.5g、 大豆油35mL，以3L左右水溶解后加入10L種子罐中，調(diào)節(jié)pH為4.0，通入蒸汽滅菌， 121'C保持15min。待培養(yǎng)基冷卻后采用火圈接種法將活化好的菌液按10% (V/V)比 例接種到種子罐中，溫度2(TC，攪拌速率100rpm，通入無(wú)菌空氣，流量為0.75vvm， 保壓0.1Mpa，培養(yǎng)3天。
5) IOOL發(fā)酵罐培養(yǎng)
稱取糖蜜1400g、玉米漿干粉700g、氯化鈣17.5g、磷酸二氫鉀35g、磷酸氫二鉀 35g、大豆油350mL，以40L左右水溶解后加入100L種子罐中，調(diào)節(jié)pH為4.0，通入 蒸汽滅菌，12rC保持15min。待培養(yǎng)基冷卻后通過(guò)壓差法將種子罐中的種子液由專用 管道轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，20°C，攪拌速率100rpm，通入無(wú)菌空氣0.75wm，保壓0.1Mpa 培養(yǎng)。
取經(jīng)0.22pm濾膜過(guò)濾除菌的、20mg/mL銀杏內(nèi)生真菌水提物420mL，在發(fā)酵96h
7時(shí)由補(bǔ)料泵添加到發(fā)酵罐中。
取無(wú)菌的、以70%甲醇水溶液溶解的0.07mol/L乙酸鈉和0.056mol/L硫酸銨混合溶 液500mL，在發(fā)酵120 h時(shí)由補(bǔ)料泵添加到發(fā)酵罐中。
至第8天時(shí)停止發(fā)酵，放料。生物量測(cè)定蟲(chóng)草培養(yǎng)物于4000rpm離心15min得 菌絲體，以去離子水洗滌3次，將菌絲體冷凍干燥至恒重，稱重。蟲(chóng)草素測(cè)定采用高 效液相色譜法(劉小莉，等.蟲(chóng)草發(fā)酵菌絲體中蟲(chóng)草素和腺苷含量的檢測(cè)，中國(guó)衛(wèi)生檢 驗(yàn)雜志，2008， 18(12): 2507-2508)。
經(jīng)測(cè)定，在本發(fā)明條件下蛹蟲(chóng)草生物量和菌體中蟲(chóng)草素含量比未添加誘導(dǎo)子的對(duì)照 培養(yǎng)基分別增加了 1.76倍和7.14倍，比改良PDA分別增加了 2.35倍、23.25倍。
權(quán)利要求
1、一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法，包括1)生物型誘導(dǎo)子的制備將炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌(Xylaria sp.)YX-28菌株接種到PDA液體培養(yǎng)基中，PDA液體培養(yǎng)基為土豆200g、葡萄糖20g、水1000mL、pH自然，25℃、120rpm黑暗培養(yǎng)7d，將培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后，在冰浴條件下于超聲波細(xì)胞破碎儀中1200W、超聲時(shí)間5s、間隔時(shí)間3s共處理5min，10000rpm離心10min，收集上清冷凍干燥，制成20mg/mL的儲(chǔ)備溶液，最后經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，得生物型誘導(dǎo)子；2)非生物型誘導(dǎo)子制備稱取乙酸鈉、硫酸銨，以體積比70％甲醇水溶液溶解，配制成濃度分別為0.07mol/L、0.056mol/L的混合溶液，經(jīng)0.22μm濾膜過(guò)濾除菌，得非生物型誘導(dǎo)子；3)菌種活化將PDA斜面保存的蛹蟲(chóng)草(Cordyceps militaris)菌種接種到液體培養(yǎng)基中活化，黑暗條件下、20℃、搖床120rpm振蕩培養(yǎng)5天，液體培養(yǎng)基為土豆200g、葡萄糖20g、磷酸二氫鉀0.5g、硫酸鎂1g、維生素B10.01g、水1000ml；4)蛹蟲(chóng)草發(fā)酵培養(yǎng)基按糖蜜20g/L、玉米漿干粉10g/L、氯化鈣0.25g/L、磷酸二氫鉀0.5g/L、磷酸氫二鉀0.5g/L稱取各組分，以水溶解；5)10L一級(jí)種子罐培養(yǎng)按照4)所述培養(yǎng)基配方，以7L體積計(jì)稱取所需各組分，并按體積比2‰添加消泡劑，以2-3L水溶解后加入種子罐中，121℃蒸汽滅菌15min，控制滅菌后培養(yǎng)基體積為罐容積的60％；培養(yǎng)基冷卻后，采用火圈接種法將活化好的菌液按體積比10％接種到種子罐中，種子罐溫度20℃，攪拌速率100rpm，無(wú)菌空氣流量0.75vvm，罐壓0.1Mpa，培養(yǎng)3天；6)100L發(fā)酵罐培養(yǎng)按照4)所述培養(yǎng)基配方，以70L體積計(jì)稱取所需各組分，并按體積比2‰比例添加消泡劑，以40L水溶解后加入發(fā)酵罐中，121℃蒸汽滅菌15min，控制滅菌后培養(yǎng)基體積為罐容積的60％；培養(yǎng)基冷卻后，通過(guò)壓差法將種子罐中的種子液由專用管道轉(zhuǎn)移到發(fā)酵罐中，20℃，攪拌速率100rpm，無(wú)菌空氣流量0.75vvm，罐壓0.1Mpa，培養(yǎng)96h后由補(bǔ)料口加入步驟1)中所述生物型誘導(dǎo)子過(guò)濾除菌的銀杏內(nèi)生真菌提取物，使終濃度為120μg/mL；繼續(xù)培養(yǎng)，120h后由補(bǔ)料口加入步驟2)中所述非生物型誘導(dǎo)子至乙酸鈉、硫酸銨的終濃度分別為0.5mmol/L、0.4mmol/L，繼續(xù)培養(yǎng)至8天終止發(fā)酵。
2、 根據(jù)權(quán)利要求1所述一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法，其特征 在于所用消泡劑為大豆油。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用于高蛹蟲(chóng)草生物量和高蟲(chóng)草素含量的發(fā)酵方法，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。將蛹蟲(chóng)草菌種活化后，接種到一級(jí)種子罐，再進(jìn)一步擴(kuò)大到發(fā)酵罐，在發(fā)酵罐中達(dá)到一定生物量后加入生物型誘導(dǎo)子炭角菌屬銀杏內(nèi)生真菌提取液，和非生物型誘導(dǎo)子乙酸鈉、硫酸銨，促進(jìn)菌體中蟲(chóng)草素的產(chǎn)生。本發(fā)明采用優(yōu)化的培養(yǎng)基有效增加蛹蟲(chóng)草的菌絲生長(zhǎng)量，并通過(guò)誘導(dǎo)子調(diào)控作用，蛹蟲(chóng)草生物量和菌體中蟲(chóng)草素含量比未添加誘導(dǎo)子的對(duì)照培養(yǎng)基分別增加了1.76倍和7.14倍，比普通的改良PDA分別增加了2.35倍、23.25倍。大大提高了蛹蟲(chóng)草菌絲體的生產(chǎn)量和有效特征性成分的含量，有著廣闊的市場(chǎng)前景。
文檔編號(hào)C12P19/40GK101554121SQ200910027839
公開(kāi)日2009年10月14日 申請(qǐng)日期2009年5月15日 優(yōu)先權(quán)日2009年5月15日
發(fā)明者劉小莉, 單成俊, 周劍忠, 張麗霞, 瑩 李, 英 王, 黃開(kāi)紅, 黃自蘇 申請(qǐng)人:江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 被以下專利引用 (1),