專利名稱：單胺氧化酶診斷試劑(盒)及單胺氧化酶活性濃度測定方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧
化酶活性濃度的方法，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
現(xiàn)有技術(shù)中，測定單胺氧化酶(MAO)活性的方法主要有熒光法、免疫抑制法和化 學(xué)分光光度法。熒光法是以e-苯乙胺作為底物來檢測單胺氧化酶，其依據(jù)是e-苯乙胺 在10 100mg時反應(yīng)速度最大，高于芐胺和5-羥色胺的反應(yīng)速度。免疫學(xué)方法則利用單 胺氧化酶抗體與單胺氧化酶發(fā)生反應(yīng)，測定反應(yīng)后形成的單胺氧化酶同工酶，目前應(yīng)用較 多的單克隆抗體有MA0-A3C9、MA0-A4F10、MA0-A7B10、MA0-A7E10和MA0-B1C2等。
相對而言，化學(xué)分光光度法應(yīng)有更為普遍?？梢杂脝伟费趸复呋奉愥尫?出的過氧化氫(H202)去氧化10-N-甲基氨基甲酰基-3，7-二甲氨基-10-氫-吩噻嗪 (MCDP)等發(fā)色劑進(jìn)行測定，也可以應(yīng)用芐胺(Benzylamine)、對苯甲胺-l3-偶氮萘酚、 丁基胺(butylamine)、戊基胺(amylamine) 、 |3 -苯乙基胺(b-phenylethylamine)、酪 胺(tyr咖ine，又稱"3-對羥基苯乙胺，，，3-pa:rahdroxyphenylethyl咖ine) 、5-羥色胺 (5-hydroxytryptamine)等作為反應(yīng)底物來測定單胺氧化酶的活性。其中，應(yīng)用苯甲胺類型 底物測得的單胺氧化酶的活性比其它底物高，而用丁基胺、戊基胺、P-苯乙基胺作底物測 得的活性約為3-對羥基苯乙胺作底物的30%。目前，單胺氧化酶測定多用芐胺和對苯甲 胺-e-偶氮萘酚作為底物。芐胺法的原理是芐胺在單胺氧化酶的作用下生成芐醛，然后在 強堿性氫氧化鈉的條件下與二硝基苯肼反應(yīng)，生成醛苯腙，這在生化儀上測定較困難；對苯 甲胺-P _偶氮萘酚方法則需要用環(huán)乙烷提取，限制了該方法的實用性，且不能應(yīng)用全自動 生化儀分析。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提出 一 種利用間接酶循環(huán)擴增法 (IndirectEnzymatic Recycling Method)、酶比色法(Enzymatic Colorimetric Method) 及酶(偶)聯(lián)法(Couple Reaction)技術(shù)，連續(xù)監(jiān)測還原型煙酰胺輔酶(還原型輔酶)在 340nm波長處吸光度的變化，得以測定單胺氧化酶活性濃度的方法，同時，本發(fā)明還將給出 用以實現(xiàn)該方法的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，采用該試劑(盒)不僅可以在紫外/ 可見光分析儀或半、全自動生化分析儀上進(jìn)行單胺氧化酶活性濃度測定，而且測定速度快、 準(zhǔn)確度高，因而可以得到切實的推廣應(yīng)用。
本發(fā)明單胺氧化酶活性濃度測定方法如下 胺類化合物+水+氧單胺氧化酶相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫
氨+丙酮酸+吲哚色氨酸酶色氨酸+水 色胺酸+輔酶色胺酸脫氡酶(吲哚-3-基)丙酮酸+氨+還原型輔酶
單胺氧化酶及鐵氧還蛋白亞硝酸還原酶作為作用酶，功能為將胺類化合物酶解產(chǎn) 生亞硝酸。亞硝酸還原酶作為循環(huán)酶將亞硝酸再次變回氨(氫氧化銨)，使氨不斷地被重 復(fù)循環(huán)利用。亞硝酸還原酶作為顯色酶，將還原型輔酶(在340nm處有吸收峰)氧化成為 氧化型輔酶(在340nm處沒有吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度下降的 速度，通過測量340nm處吸光度下降的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。
這種方法應(yīng)用單胺氧化酶(Monoamine Oxidase ;EC 1.4. 3.4 ;EC 1. 4. 3. 6)酶(偶)聯(lián)色氨酸酶(tryptophanase ;EC 4. 1. 99. 1)、色氨酸脫氫酶 (Tryptophandehydrogenase ;EC 1. 4. 1. 19)酶促反應(yīng)連續(xù)監(jiān)測法。單胺氧化酶與色氨酸酶 作為作用酶，功能為將胺類化合物酶解產(chǎn)生色氨酸。色氨酸脫氫酶作為循環(huán)酶將色氨酸再 次變回氨，使由單胺氧化酶酶解胺類化合物產(chǎn)生的氨不斷地被重復(fù)循環(huán)利用。色氨酸脫氫 酶又作為顯色酶，將輔酶(在340nm處沒有吸收峰)還原成為還原型輔酶(在340nm處有 吸收峰)，從而得以測定還原型輔酶在340nm處吸光度上升的速度，通過測量340nm處吸光 度上升的速度，可以測算單胺氧化酶的活性濃度大小。 實驗表明，從測定結(jié)果的準(zhǔn)確性和配制成本的經(jīng)濟性兩方面綜合考慮，無論是單
劑、雙劑還是三劑，如下成分關(guān)系的本發(fā)明單胺氧化酶診斷/測定試劑較為理想 緩沖液 100mmol/L 穩(wěn)定劑 500mmol/L 輔酶 3mmol/L 色氨酸酶 6000U/L 色氨酸脫氫酶 8000U/L 胺類化合物 4mmol/L 丙酮酸 12mmol/L 噴哚 7mmol/L 本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以
下物質(zhì)之一 芐胺、對苯甲胺_ P _偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、P _苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺
或者這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。 本發(fā)明的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)可以是單劑，包括 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚。
試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體試劑，
直接使用。
也可以將上述單劑試劑配成如下雙劑試劑
試劑1 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶。 輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚在試劑1或試劑2中的 位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液體 試劑，直接使用。 還可以將上述單劑試劑配成如下三劑試劑
試劑l 緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚。
試劑2 緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸脫氫酶。
試劑3 緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶。 輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚在試劑1、試劑2或試劑 3中的位置可以不限。試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制 成液體試劑，直接使用。 無論是單劑、雙劑還是三劑，本發(fā)明測定單胺氧化酶活性濃度的方法，其輔酶可以 是NADP+、 NAD+或thio-NAD+中的一種。
具體實施例方式
下面結(jié)合實施例子對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
實施例一 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為單試劑，包括
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 500mmol/L
輔酶 3mmol/L
色氨酸酶 6000U/L
色氨酸脫氫酶 8000U/L
胺類化合物 4mmol/L
丙酮酸 12mmol/L
噴哚 7mmol/L 試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，進(jìn)行冷凍干燥，制成干粉試劑；使用前，加入純凈 水，復(fù)溶后使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37°C，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. 1， 測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑的體積比例為1/25，反 應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值 4180。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例二 本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為雙試劑，包括
試劑1三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 100mmol/L
穩(wěn)定劑 50mmol/L
輔酶 3mmol/L
胺類化合物 4mmol/L








丙酮酸
口引哚
試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
12mmol/L 7mmol/L
鹽酸緩沖液
100,1/L 500,1/L 6000U/L 8000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體雙試劑，可以直接使用。 在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間10分鐘，起始吸光度《0. l，測 試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與試劑1、試劑2的體積比例為 2/20/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右， 理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測 主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
實施例三
本實施例的單胺氧化酶診斷/測定試劑為三試劑，包括 試劑l
三(羧甲基)氨基甲烷-鹽酸緩沖液 lOOmmol, 穩(wěn)定劑 50mmol/L
3mmol/L 4mmol/L 12mmol/L 7mmol/L
















1
輔酶
胺類化合物 丙酮酸 口引哚 試劑2
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 8000U/L
試劑3
三(羧甲基)氨基甲烷 穩(wěn)定劑
鹽酸緩沖液100mmol/L 500,1/L 6000U/L
試劑全部溶解配好后，分裝入瓶，制成液體三試劑，可以直接使用。 測定單胺氧化酶活性濃度時，在全自動生化分析儀上設(shè)定溫度37t:，反應(yīng)時間 10分鐘，起始吸光度《0. l，測試主波長340nm，測試副波長405nm，被測單胺氧化酶樣品與 試劑1、試劑2、試劑3的體積比例為4/40/5/5，反應(yīng)方向為正反應(yīng)(上升反應(yīng))，延遲時間 大約1分鐘左右，檢測時間2分鐘左右，理論K值2170。 加入樣品和試劑后，使之混合并發(fā)生反應(yīng)，最終將反應(yīng)物置于生化分析儀下，檢測
主波長340nm吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。 申請人:經(jīng)過實驗驗證，采用以上發(fā)明內(nèi)容中記載的其他測定方法均能達(dá)到本發(fā)明的目的，鑒于測定步驟等情況與以上實施例類同，不另一一例舉。 總之，實驗證明采用本發(fā)明的測定方法完全可以通過一般生化分析儀器得出所 需的測定結(jié)果——空白試劑吸光度變化(AA/min)《0.001 ;吸光度時間反應(yīng)曲線應(yīng)呈直 線上升；試劑可測有效(R > 0. 99)線形范圍可達(dá)500U/L ;試劑測試的不準(zhǔn)確度，其相對偏
差不超過±5% ;試劑測試的精密度(重復(fù)性)的變異系數(shù)(CV)《3% ;試劑的靈敏度可
達(dá)O. 0002±0. 0001 AA/min/U/L ;試劑在2-8。C下保存，活性可以穩(wěn)定一年；——本發(fā)明靈 敏度高、精確度好，線形范圍寬廣，穩(wěn)定期長，足以便于推廣應(yīng)用。
權(quán)利要求
一種利用間接酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶活性濃度測定方法，其方法如下胺類化合物+水+氧 單胺氧化酶 相應(yīng)醛類產(chǎn)物+氨+過氧化氫氨+丙酮酸+吲哚 色氨酸酶 色氨酸+水色胺酸+輔酶 色胺酸脫氫酶(吲哚-3-基)丙酮酸+氨+還原型輔酶將最終反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀或半、全自動生化分析儀下，檢測主波長340nm吸光度上升的速度，測算出單胺氧化酶的活性濃度大小測定結(jié)果。
2. —種單胺氧化酶診斷緩沖液穩(wěn)定劑輔酶J定試劑(盒)，主要成分包括20-1— 1——500,1/L -4000mmol/L -6mmol/L胺類化合物 丙酮酸 口引哚1000 10001— 1— 1——50mmol/L —50mmol/L —50mmol/L本發(fā)明測定單胺氧化酶活性的診斷試劑盒的成分當(dāng)中，所述"胺類化合物"優(yōu)選以下物質(zhì)之一芐胺、對苯甲胺-e-偶氮萘酚、丁基胺、戊基胺、e-苯乙基胺、酪胺、5-羥色胺或者 這七種物質(zhì)的衍生物，但選擇范圍不受這些列舉所限制。試劑成分的濃度不一定只限于上述范圍；在此范圍內(nèi)效果較好，在此范圍外，試劑仍會 反應(yīng)作用。其特征在于試劑(盒)可以是干粉狀態(tài)，在使用前加水溶解后使用；也可以配制成液 體試劑，直接使用。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚組成單劑試劑。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷J定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚組成雙劑 試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶組成。輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、 口引哚在試劑1或試劑2中的位置可以不限。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于 由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚組成多劑試劑；試劑1，由緩沖液、穩(wěn)定劑、輔酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚組成；試劑2，由緩沖液、穩(wěn) 定劑、色氨酸脫氫酶組成；試劑3，由緩沖液、穩(wěn)定劑、色氨酸酶組成。輔酶、色氨酸酶、色氨 酸脫氫酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚在試劑1、試劑2或試劑3中的位置可以不限。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，其特征在于還包括穩(wěn)定劑 l-4000mmol/L或0. 1 % _100%體積比。所述穩(wěn)定劑為甘油(Glycerol)、丙二醇(Propylene Glycol)、乙二醇(Ethylene glycol)及防腐劑中的至少一種。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用間接酶循環(huán)擴增法、酶比色法及酶聯(lián)法技術(shù)的單胺氧化酶診斷/測定試劑(盒)，同時本發(fā)明還涉及測定單胺氧化酶活性濃度的方法、試劑的組成及成分，屬于醫(yī)學(xué)檢驗測定技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明的試劑(盒)主要成分包括緩沖液、輔酶、胺類化合物、丙酮酸、吲哚、色氨酸酶、色氨酸脫氫酶及穩(wěn)定劑；通過將樣品與試劑按一定的體積比混合，使之發(fā)生一系列的酶促反應(yīng)，再將反應(yīng)物置于紫外/可見光分析儀下，檢測主波長340nm處吸光度上升的速度，從而測算出單胺氧化酶的活性濃度大小。
文檔編號C12Q1/26GK101793718SQ20091002823
公開日2010年8月4日 申請日期2009年2月4日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月4日
發(fā)明者王爾中 申請人:蘇州艾杰生物科技有限公司