專利名稱：：一組基于三疣梭子蟹its基因的微衛(wèi)星引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一組基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物，可應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定與評價(jià)和遺傳結(jié)構(gòu)分析的微衛(wèi)星引物。
背景技術(shù)：
：三疣梭子蟹(/3的^^/TM/a似力，俗稱海蟹或大蟹，屬于甲殼綱，十足目，梭子蟹科。它廣泛分布在中國南北沿海，是中國大型海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，是沿海重要的漁業(yè)資源，開展三疣梭子蟹群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和種質(zhì)鑒定工作，對于三疣梭子蟹的增養(yǎng)殖親本選擇和原種、家系和優(yōu)良品種資源保護(hù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前常用來進(jìn)行評價(jià)生物遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定的分子標(biāo)記均具有一定程度的缺陷，如RAPD技術(shù)(隨機(jī)擴(kuò)增序列多態(tài)性DNA,RandomamplifiedpolymorphicDNA),常因RAPD引物過短10個(gè)堿基、退火溫度過低一般36-37°C，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的一些非特異結(jié)果，其可靠程度和真實(shí)性是主要的缺陷；而AFLP技術(shù)(擴(kuò)增片段長度多態(tài)性，Amplifiedfragmentlengthpolymorphism),又因操作條件復(fù)雜如要求酶切、成本相對較高而限制了其廣泛的應(yīng)用。微衛(wèi)星標(biāo)記是一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)，實(shí)質(zhì)就是基因組中大量存在的串聯(lián)重復(fù)序列，以這些重復(fù)序列作為遺傳標(biāo)記可以進(jìn)行種質(zhì)鑒定與標(biāo)記、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等一系列工作，其工作原理是通過已知的基因序列尋找微衛(wèi)星序列然后在微衛(wèi)星序列上下游設(shè)計(jì)特異性引物，這樣設(shè)計(jì)的引物就成為微衛(wèi)星引物，通過使用設(shè)計(jì)好的成對引物就可以通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出微衛(wèi)星標(biāo)記帶，通過電泳凝膠成像技術(shù)成像后進(jìn)行種質(zhì)鑒定與標(biāo)記、遺傳多樣性分析或遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。應(yīng)用微衛(wèi)星引物擴(kuò)增出的微衛(wèi)星序列電泳分離時(shí)具有單堿基的高分辨率，遺傳信息量大，通常為顯性標(biāo)記，呈孟德爾式遺傳，具有很高的穩(wěn)定性和多態(tài)性，且DNA用量較AFLP少，技術(shù)要求低，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)則正好克服了RAPD和AFLP技術(shù)的這些缺點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。'ITS(IntemalTranscribedSpacer),為核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)域，編碼核糖體的18srRNA、5.8srRNA和28srRNA基因的兩段內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)，ITS-1和ITS-2具有較快的進(jìn)化速率。目前，ITS作為分子標(biāo)記在種質(zhì)資源評價(jià)和群體結(jié)構(gòu)分析中被認(rèn)為是最廣泛的基因之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是針對現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一組基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物，該引物可克服現(xiàn)有技術(shù)引物過短，退火溫度低，操作條件復(fù)雜，成本高、準(zhǔn)確性低的缺陷。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是通過以下的技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一組基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物，其特點(diǎn)是，它通過以下步驟如下，(1)^^集三疣梭子蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的ITS基因，將該基因電泳回ITS目的片段，將該片段與載體進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆后雙向測序；(2)將測定序列通過正反向拼接后建立完整的ITS基因序列，通過TRF程序來査找微衛(wèi)星位點(diǎn)；(3)X寸找到的可用位點(diǎn)應(yīng)用GenamicsExpressionTrialVersion1.1程序來設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，最終得到如表1所示微衛(wèi)星引物(SEQUENCENO:1-16)及對應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)。以下對發(fā)明人所作的研究試驗(yàn)進(jìn)行闡述。實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹采集于遼寧大連、山東東營、江蘇連云港、浙江舟山、福建纟章州、廣東湛江6個(gè)種群地區(qū)海域，采集時(shí)間、地點(diǎn)、簡稱及采集數(shù)量見表2，采集到的三疣梭子蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-7(TC低溫冰箱或75%酒精保存。(1)DNA提取取組織約50mg，先用蒸餾水將組織中的乙醇清洗干凈，然后按照常規(guī)的酚一氯仿法提取DNA。(2)PCR擴(kuò)增及其產(chǎn)物的純化、克隆ITS區(qū)的引物序列為ITSF:5'-TACGTCCCTGCCCTTTGTA-3鄰ITSR:5'-TGTTGGTTTCTTTTCCTCCG-3'(由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司5合成)。其中ITSF序列為18SrRNA序列，反向引物ITSR為28SrRNA序歹ij，這樣獲得的產(chǎn)物為含有部分18SrRNA序列和部分28SrRNA序列，中間部分則為全部的ITS全長序列，中間包含一個(gè)5.8S的序列，本研究中所指ITS基因包含有三段分別為ITS1，5.8SrRNA和ITS2，均為全長序列。PCR反應(yīng)總體積為50(il，包括5^110XPCRBuffer,,125mmol/LMgCl2，1(il10mmol/LdNTP4|al2.5mmol/L雙向引物，0.4jilTaqDNA聚合酶(5U/(il),3plDNA模板，加無菌雙蒸水至50fi1。PCR反應(yīng)條件為94'C預(yù)變性5min后進(jìn)行降落PCR，94。C變性45s，53。C退火45s(每5個(gè)循環(huán)降低2°C)，72。C延伸1.5min，15個(gè)循環(huán)，接下來進(jìn)行94。C變性45s,47。C退火45s,72。C延伸1.5min,15個(gè)循環(huán)，最后72。C充分延伸10min4。C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，染色后在凝膠成像系統(tǒng)檢測。用UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物技術(shù)有限公司)純化回收目的帶后，與PUCm-T載體進(jìn)行連接反應(yīng)，16t;水浴2h，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，與含Amp的LB平板過夜，挑取白色單菌落，以菌斑為模板，迸行PCR擴(kuò)增，電泳檢測并篩選陽性轉(zhuǎn)化子。表1三疣梭子蟹ITS基因微衛(wèi)星引物及對應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)表引物編號重復(fù)類型可能的重復(fù)數(shù)微衛(wèi)星起始位置上下游引物序列引物起始位置T邁值('C)擴(kuò)增目的片段大小F:GAACCTGCGGAAGGATCATTATCGT2260ITS157AATC0-4.381157bpR:TTGTACTCCTGCGGACGGTGGCACA15468F:ATAATGGCCGTGTGCCAC10851ITS91ACA0-3.314091bpR:GTCAAACAGGGAAGGAGGC18051CTCCF:GCCTCCCTTGCCTGTCAACA15557ITS1060-2215106bpAR:GGTCTACCGCTCAAACAATCCTT23855F:ATACTTTCCTTCGTGCAAGGA22551ITS211CTA5.3-7.3270211bpR:ACACGGGTAGTGTACGGTTTAA41451F:CGATGGAGCGTAGAAGTGAGT32651ITS229TAC4-5443229bpR:TGGAATTACGTCGGAACTAGG53451F:AGGCAGAGGCAGTGGAAGTCTG50057ITS395TAC3.3-4.3771395bpR:GGGACCGCTTCCGTTAGGATTT87359F:TAGTACAATGAAATGAGGGCACC83453ITS291CTAG2.5-6.51066291bpR:AATCATAGGAGGTTGGGAGCC110454F:ACGTTGAGTGGAGCCAAAA124847ITS232GA5-61311232bpR:GGTTTCTTTTCCTCCGCTTAl柳45表2三:疣梭子蟹樣本信息采集地點(diǎn)大連(L)連云港(G)東營(DY)舟山(Z)漳州(zz)湛江(C)釆樣曰期2005.92005.102005-112005-92006.12005-采集個(gè)體數(shù)目223133301036曱殼寬度(cm)平均值i標(biāo)準(zhǔn)差13.40±0.5515.75±1.5914.37±1.0411.94±1.4516.20±1.6616.85±1.75(3)測序?qū)⒖寺‘a(chǎn)物送上海華大天源生物科技務(wù)有限公司進(jìn)行純化回收，然后采用擴(kuò)增產(chǎn)物在ABIprismTM377測序儀上直接進(jìn)行正反雙向測序，6個(gè)群體共測定出24個(gè)三疣梭子蟹ITS基因序列——初始序列(5'-部分18SrRNA序列-ITS基因序列-部分28SrRNA序列-3，序列表中的第41、42號序列(SEQUENCENO:41-42)為其中的2個(gè)原始序列)，其中去掉載體后的序列的結(jié)構(gòu)為5'-部分18SrRNA序列-ITS基因序列-部分28SrRNA序列-3,中間部分則為全部的ITS全長序列(序列表中第16-40號共24個(gè)序例，SEQUENCENO:16-40)。以上序列的確定均通過GenBankBlast同源比對而確定。(4)微衛(wèi)星位點(diǎn)的確定將測序的結(jié)果使用DNASTAR軟件中的Seqman程序進(jìn)行雙向拼結(jié)，ITS基因的序列見序列表，并將所有序列使用DNASTAR軟件中的Seqman程序轉(zhuǎn)化為基因序列的FASTA格式，以便TandemRepeatsFinder軟件識(shí)別(簡稱為TRF程序)。將序列轉(zhuǎn)化成FASTA模式后用TRF程序依次打開，設(shè)定TRF程序的math(匹配),mismath(錯(cuò)配)和indel(插入缺失)參數(shù)為分別為2，7，7,最小重復(fù)序歹i!(minimumalignmentscoretoreportreapeat)為20，最大區(qū)間(maximumperiodsize)為2000，然后運(yùn)行Run,結(jié)果即保存到FASTA文件格式的目錄下，即序列數(shù)據(jù)所在的文件夾中，每Run—個(gè)FASTA格式的序列文件變會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)HTML格式的結(jié)果文件。HTML格式的結(jié)果文件中分別顯示微衛(wèi)星所在的序列位置，大小，拷貝數(shù)，重復(fù)堿基等情況。將所有的FASTA格式序列文件通過運(yùn)行TRF程序查找到的微衛(wèi)星結(jié)果;每一個(gè)個(gè)體對應(yīng)兩個(gè)結(jié)果文件，一個(gè)以表格形式概括找到的微衛(wèi)星所以位置(Indices)、重復(fù)大小(PeriodSiz)和重復(fù)數(shù)(CopyNumber),另一個(gè)是表格內(nèi)容的對應(yīng)序列的列舉。將所有三疣梭子蟹個(gè)體的微衛(wèi)星結(jié)果中這三個(gè)指標(biāo)匯總結(jié)果到表3。表3即為三疣梭子蟹ITS基因中所存在的所有微衛(wèi)星標(biāo)記。7表3三疣梭子蟹ITS基因中的微衛(wèi)星分布<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table>AATC重復(fù)次數(shù)為3.3次.在上述表3中，個(gè)體一縱欄三疣梭子蟹的個(gè)體編號(從L5到ZZ7共24個(gè)個(gè)體)所對應(yīng)的序列自上而下依次對應(yīng)序列表中的第17-40號序列(SEQUENCENO:17至SEQUENCENO:40)。上述DNASTARV3.0軟件的出處為SteveShearDown,1989-2001versionreservedbyDNASTARInc.,Madison,WI，USA;上述TandemRepeatsFinde(TRF)軟件的出處為G.Benson,"Tandemrepeatsfinder:aprogramtoanalyzeDNAseq職ces"NucleicAcidsResearch(1999)Vol.27,No.2，pp.573-580.網(wǎng)址為http:〃tandem.buedu/trf/trf.html(5)微衛(wèi)星引物的開發(fā)考慮到開發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記能夠應(yīng)用這就要求具有良好的多態(tài)性，故將表3中不存在多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)去掉，因此"GAGGCA"、"GCG"、"ATATC"和"GCGTGT"這四個(gè)微衛(wèi)星將不作考慮，因?yàn)?GAGGCA"均為重復(fù)2.2次，"GCG"均為重復(fù)3.7次，"ATATC"均為重復(fù)2.2次，"GCGTGT"均為重復(fù)2次，其余的微衛(wèi)星均有多態(tài)產(chǎn)生，開發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記引物組是理想的。用表3中所有具有多態(tài)性的微衛(wèi)星來開發(fā)引物，以AATC為例，其余過程相同。開發(fā)過程如下對表3中重復(fù)類型為AATC的微衛(wèi)星，將其任一個(gè)體的序列導(dǎo)入到引物設(shè)計(jì)軟件(選擇設(shè)計(jì)引物的個(gè)體ITS基因序列依據(jù)為不同個(gè)體的微衛(wèi)星兩側(cè)翼區(qū)序列均保守相同，因此任一個(gè)體均可以用來設(shè)計(jì)引物，出于方便，一般選擇該微衛(wèi)星位點(diǎn)沒有丟失的序列來設(shè)計(jì)，如AATC這個(gè)微衛(wèi)星則最好選擇Lll(SEQUENCENO:19)，DY3(SEQUENCENO:22)等等含有AATC3.3個(gè)拷貝的三疣梭子蟹個(gè)體ITS基因序列。下面以Lll(對應(yīng)SEQUENCENO:19)為例說明AATC微衛(wèi)星引物開發(fā)過程打開軟件GenamicsExpressionTrialVersion1.1程序(出自http:〃genamics.com/expression/),(因原始序列中的ITS基因的起始序列含有一段18SrRNA基因，而ITS全長序列中AATC微衛(wèi)星所在位置位于靠近ITS區(qū)的起始81bp處，堿基過短不利于引物的選擇，因此，選擇在18SrRNA基因上設(shè)計(jì)上游引物，同理，表3中的最后一個(gè)微衛(wèi)星GA則在ITS末端區(qū)，下游引物則要在部分28SrRNA序列上設(shè)計(jì)引物)，將序列表中的第41號序列(SEQUENCENO:41)全部序列復(fù)制到已打開的GenamicsExpression程序中的"DNA1"文件輸入?yún)^(qū)域，點(diǎn)擊菜單欄中的"Sequence"—"Circulartolinear"即可把環(huán)狀DNA變成線型DNA;下一步，點(diǎn)擊工具欄中PrimDsnr按鈕，則出現(xiàn)了所有備選的引物組合，選擇的依據(jù)是上下游引物通火溫度相近即可，引物間包含有AATC微衛(wèi)星，同時(shí)兩引物間不含有別的微衛(wèi)星，因此對AATC微衛(wèi)星可供設(shè)計(jì)引物的區(qū)域?yàn)樾蛄斜碇械牡?1號序列的0-172間，符合該要求的引物為F:GAACCTGCGGAAGGATCATTATCGT，Tm為60，起始位置為22，引物長25bp;R:TTGTACTCCTGCGGACGGTGGCACA,Tm為68，起始位置為154，引物長為25bp，這樣擴(kuò)增的目的片段為158bp,這樣同樣的將表3中其余的7個(gè)可用的微衛(wèi)星的引物設(shè)計(jì)出來，其余微衛(wèi)星設(shè)計(jì)引物的序列除GA用序列表中的第42號序列(SEQUENCENO:42)，CTCCA用序列表中的第30號序列(SEQUENCENO:30)夕卜，其余5個(gè)均使用序列表中的第18號序列(SEQUENCENO:18)來設(shè)計(jì)。結(jié)果得到如表1所述的基于三疣梭子蟹ITS基因微衛(wèi)星引物。本發(fā)明將微衛(wèi)星和ITS的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來開發(fā)得到基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星標(biāo)記引物，且開發(fā)出該基因的微衛(wèi)星標(biāo)記引物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本發(fā)明篩選出的引物擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好，可應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)評價(jià)和種質(zhì)鑒定以及三疣梭子蟹的群體遺體多樣性評價(jià)，具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和操作簡便等特點(diǎn)，可克服現(xiàn)有技術(shù)引物過短，退火溫度低，操作條件復(fù)雜，成本高、準(zhǔn)確性低的缺陷。具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對其權(quán)利的限制。實(shí)施例l。本發(fā)明是一組基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物，它通過以下步驟得到，(1)采集三疣梭子蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的ITS基因，將該基因電泳回ITS目的片段，將該片段與載體進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ct感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆后雙向測序；(2)將測定序列通過正反向拼接后建立完整的ITS基因序列，通過TRF程10序來査找微衛(wèi)星位點(diǎn)；(3)對找到的可用位點(diǎn)應(yīng)用GenamicsExpressionTrialVersionU程序來設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，最終得到如表1所示微衛(wèi)星引物及對應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)。實(shí)施例2。用實(shí)施例1所述基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，其步驟如下，1.引物的合成應(yīng)用DNA合成儀合成表1中的引物8對，各20D，一般由有DNA合成能力的生物工程公司來完成。2.三疣梭子蟹基因組的提取采集三疣梭子蟹幾個(gè)家系樣本各30個(gè)，新鮮樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，采用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法抽提基因組DNA。具體過程及試劑配方，三疣梭子蟹的基因組DNA采用SDS裂解液配方10mmol/LTris.Cl(pH=8.0)，O.lmmol/LEDTA(pH=8.0)，0.5%SDS，提取的步驟為取三疣梭子蟹的肌肉組織50mg，放入液氮中研磨成細(xì)粉，放入2.0ml的離心管中，加入600(il的SDS組織裂解液，放入55。C水浴搖床，裂解lh后加入蛋白酶K10pl(20mg/ml)，繼續(xù)裂解34h，然后將離心管取出用手指輕彈離心管底部,讓未裂解組織與裂解液充分接觸，使組織細(xì)胞能夠充分裂解，裂解完畢后每只離心管加入600^dTris飽和酚，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置1015min，12000rpm，4。C離心10min，取上清液，加入60(V1氯仿異戊醇混合液，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置1015min，12000rpm，離心10min，取上清液，加入120(^1冷凍無水乙醇，顛倒45-55次，室溫靜置1015min，8000rpm，離心10min，棄上清，即得DNA，在離心管中加入1500(^170%的乙醇，洗滌兩次，然后8000rpm，離心8min，棄上清，室溫風(fēng)干，直至乙醇揮發(fā)完畢，加入50ili1TE，溶解DNA，4。C保存，制備0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測。3.PCR反應(yīng)體系PCR體系:25[il，Mg"濃度為2.5腿ol/L、lOXBuffer的體積為2.75)nl、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTPmixture0.5jul，引物2]ul，其余用水補(bǔ)足；反應(yīng)條件首先95。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入以下40個(gè)循環(huán)94。C變性45s，45°C-52°C(不同引物對應(yīng)不同的退火溫度見表1)Touchdown程序退火45s，ii72。C延伸1.5min，然后72。C再次延伸10min，最后4。C保存。4.電泳檢測與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(1)8%變性聚丙烯酰胺的制備:15ml8%變性膠，7.5ulTEMED,10ulAP。(2)上樣變性上樣緩沖液配方為98%甲酰胺49ml，lOmMEDTA(pH8.0)1ml，0.25%溴芬蘭125g，0.25%二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR產(chǎn)物和上樣緩沖液體1:l加樣2-4微升，同時(shí)設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(DL-2000);(3)電泳電壓以400V左右維持2h置，待溴酚藍(lán)指示劑移至距凝膠前沿l-2cm處時(shí)，關(guān)閉電源；(4)取出凝膠板，用硝酸銀染色；(5)凝膠呈像系統(tǒng)(ChemiDocXRS)拍照，記錄結(jié)果；(6)經(jīng)電泳獲得的圖譜每群體在所有位點(diǎn)的譜帶式樣組成一個(gè)01矩陣。用Arequin2.0軟件進(jìn)行分子方差分析(AM0VA)，計(jì)算遺傳多態(tài)度(ti)和遺傳分化指數(shù)(Fst)等各種種質(zhì)資源評價(jià)指標(biāo)，最終得出評價(jià)結(jié)果。實(shí)施例3。用實(shí)施例1所述基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物進(jìn)行家系鑒定，其歩驟如下，1.提取三疣梭子蟹繁育家系的基因組DNA(1)SDS裂解液配方10mmol/LTris.CI(pH=8.0)，0.l謹(jǐn)ol/LEDTA(pH:8.0)，0.5%SDS。(2)步驟取三疣梭子蟹的步足上的肌肉組織50mg，放入液氮中研磨成細(xì)粉，放入2.0ml的離心管中，加入600ji1的SDS組織裂解液，放入55'C水浴搖床，裂解1小時(shí)后加入蛋白酶K1(^1(20mg/ml)，繼續(xù)裂解34個(gè)小時(shí)，然后將離心管取出用手指輕彈離心管底部,讓未裂解組織與裂解液充分接觸，使組織細(xì)胞能夠充分裂解；裂解完畢后每只離心管加入600^1Tris飽和酚，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置1015min;12000rpm，4離心10min;取上清液，加入600|il氯仿異戊醇混合液，輕輕振蕩搖勻，顛倒50次；室溫靜置1015min;12000rpm，離心10min;取上清液，加入1200^1冷凍無水乙醇，顛倒45-55次；室溫靜置1015im'n;12000rpm，離心10min;棄上清，即得DNA，在離心管中加入1500^170%的酒精，洗滌兩次，然后8000rpm，離心8min;棄上清，室溫風(fēng)干，直至乙醇揮發(fā)完畢；加入5(V1TE，溶解DNA，4。C保存；制備0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物。2.合成10條三疣梭子蟹引物利用實(shí)施例1合成表1中的10條引物。3.PCR反應(yīng)體系PCR體系:25^1，Mg"濃度為2.5mmol/L、10XBuffer的體積為2.75(^1、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTPmixture0.5jlU，引物2pl，其余用水補(bǔ)足；反應(yīng)條件首先95。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入以下40個(gè)循環(huán)94。C變性45s，45°C-52°C(不同引物對應(yīng)不同的退火溫度見表1)Touchdown程序退火45s，72。C延伸1.5min，然后72。C再次延伸10rain，最后4。C保存。4.電泳檢測與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(1)8%變性聚丙烯酰胺的制備:15ml8%變性膠，7.5ulTEMED，編AP。(2)上樣變性上樣緩沖液配方為98%甲酰胺49ml，10mMEDTA(pH8.0)1ml，0.25%溴芬蘭0.125g，0.25%二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR產(chǎn)物和上樣緩沖液體1:l加樣2-4微升，同時(shí)設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(DL-2000);(3)電泳電壓以400V左右維持2h置，待溴酚藍(lán)指示劑移至距凝膠前沿l-2cm處時(shí)，關(guān)閉電源；(4)取出凝膠板，用硝酸銀染色；(5)凝膠呈像系統(tǒng)(ChemiDocXRS)拍照，記錄結(jié)果；(6)經(jīng)電泳獲得的圖譜找到所要研究家系的相應(yīng)特異性分子標(biāo)記，作為該家系的分子標(biāo)記。SEQUENCELISTING<110>淮海工學(xué)院<120>—組基于三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物<130>200卯1<160>42<170>Patentlnversion3.3<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1gaacctgcggaaggatcattatcgt25<210>2<211>25<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>2ttgtactcctgcggacggtggcaca25<210>3<211>18<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>3ataatggccgtgtgccac18<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>4gtcaaacagggaaggaggc19<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>5gcctcccttgcctgtcaaca20<210>6<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>6ggtctaccgctcaaacaatcctt23<210>7<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>7atactttccttcgtgcaagga21<210>8<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>8acacgggtagtgtacggtttaa22<210>9<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>9cgatggagcgtagaagtgagt21<210>10<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>10tggaattacgtcggaactagg21<210>11<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>1115aggcagaggcagtggaagtctg22<210>12<211>22<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>12gggaccgcttccgttaggattt22<210>13<211>23<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>13tagtacaatgaaatgagggcacc23<210>14<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>14aatcataggaggttgggagcc21<210>15<211>19<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>15acgttgagtggagccaaaa19<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物<400>16ggtttcttttcctccgctta20<210>17<211>1363<212>DNA<213>三疣梭子蟹(P.trituberculatus)16aaggatcattatcgtgacgtttctgaaaggaacgeaactaaaagttaaaaagctcgcacc60agggtggcggggtctggcctaatcaatcagtcagcagctcctgcggggsigaacggccgtg120tgccaccgtccgcaggagtacaacaagtagtaggggcctcccttgcctgtcaacagggcc180tccttccctgtttgacaaccttttctccsctcatsctttccttcgtgcaa240ggatcgtttgagcggtagacC33C3CCt3Cetaegtatgetgaacttact300accttattscccctgggataccatggcgatggggCgtagaagtgagtgactgcggcagca360ctgactgctsigctgctcacatgctgcgttcggtcgtccccagtgggtatcattaaaccgt420acactacccgtgtactcaatctscccsttttcactacgtc480ttcccacaagtctcctgaggcagaggcagtggaagtctgataaagagtcggcctagttcc540gacgtaattcttaacggtggatcactcggctcgtgggtcg600atgaagaccgcagcaagctgcgtgtcggtatgtgaatcgcaagaataccagatacatcga660caagtcgaacgcacattgcggcggcggcactctcatgtgctgccgtcactcctacacgag720ggtcggatatgeateggcattgtccagccgcgcaagttactactactact780ctttcs站ccacattcgcgccgaaagggcttcacsccctcacgcgcgtttgtagtacaat840gaaatgagggC3CCCtt3t3aagegggaceggaagcggtcccgtgggtga900gatgcatcatggcatctttcagagtgcttgcgttggtctggctttgaccgcattggggag960ttttcgcctttgtggcgttcccttaagacctaaggcatcgatggcgcaacgcgtgtgcgt1020gttgctgtcacgtgccgatgacttgggcattactcggatgaactagctagctcattacga1080gttttgcctgcggtctcggctcccsscctcctatgattaaagctggttgaggagggegae1140cgggtcggsctgtttgttctgtactgeggetcgcacctsctctaLtamgctggaaggaag1200ggatcgagaacgttgagtggagecaaaacttttttcgaatcttgtcgcgtegactaeggg1260gttagagtacgcgtatcgcttctttcccctgctgtcggccgacg這gagag1320ttgtaaaaagC3ctgtgs33agcttgaatgageggcttgaegg1363<210>18<211>1368<212>DNA<213>三疣梭子蟹(Rtrituberculatus)<400>18aaggatcattatcgtgacgtttctgaaaggaaagtta站sagctcgcacc60agggtggcggggtttggcctaatcaatcagtcagcagctcctgcggggataatggccgtg120tgccaccgtccgcaggagtatagtaggggcctcccttgcctgtcaacagg180gcctccttccctgtttgacastcttttctccsctcsitactttccttcgtg240caaggatcgtttgagcggtatsctSLtactsetaegtatgetgaacttact300sccttattscccctgggataccatggcgatggagegtagaagtgagtgactgcggcagca360ctactgactgctagctgctcacatgetgegttcggtcgtccccagtgggt420ccgtgtactcaatactactaagatcactac480gtcttcccacssgtctcctgsggcagsggcagtggaagtctgataaagagteggectagt540tccgacgtaattCC333C3tetcttaaeggtggatcactcggctcgtggg600tcgatgaagaccgcagcaagctgcgtgtcggtatgtgaatcgcaagaataccagatacat660cgacaagtcgaacgcacattgeggeggeggcsctctcstgtgctgccgtcsctcctscsc720gagggtcggat這testatescatgeateggcattgtccagccgcgcaagttsctsctsict780actctttcasaccacattcgcgecgaaagggcttcac這ccctcacgcgcgtttgtagtac840aatgaaatgagggcacccttataaageggg3CC站StCCtaacggaagcggtcccgtggg90017tgagatgcatc3tggc3tcttacsgagtgcgagttttcgcctttgtggcgttcccttaagcgtgttgctgtcacgtgccgatgacttgggattacgagttttgcctgcggtctcggctccgggcgaccgggtcggactgtttgttctgtaaaggaagggatcgagaacgttgagtggagcctacggggttagagtacgcgtatcgcttctcaaagttgtaaaaagcactgtgaaaagcttttgcgttggtctggctttgaccgcattggg960acctaaggcatcgatggcgcaacgcgtgtg1020cattactcggatgaactagctagctagctc1080caacctcctatgattaaagctggttgagga1140ctgcggctcgcacctactctataaagctgg1200caaaacttttttcgaatcttgtcgcgtcga1260ttcccctgctgtcggccgacgagagagaga1320gaatgagcggcttgacgg1368<210>19<211>1383<212>DNA<213>三疣梭子蟹(P.trituberculatus)<400>19agggtggcggcgtgtgccacggcctccttcgcaaggatcgacttactsccggcagcactgaaaccgtacacgtcttcccattccgacgtagtcgstgssgtcgacaagtccgagggtcggtsctctttcscaatgaaatggtgagatgcaggagttttcggcgtgttgctagctagctagagctggttgatctataaagccttgtcgcgtgacgagagageggatcgtgacgtggtttggcctcgtccgcaggcctgtttgactttgagcggtttsttsccccactgctagctctacccgtgtcaagtctcct3ttCC333C3accgcagcaagaaegcacat3t3tCSLtStC站CC3C3ttCagggcacccttcatggcatccctttgtggcgtcacgtgccctcattacgaggagggegaetggaaggaagegaetaegggagagacaaagttctgaaaggagtacaacaatgggataccagctcacatgcgaggcagagggctgcgtgtctgcggcggcgacatgeateggcgccgaaagtata站gcggttacagagtggttcccttaagatgacttgggttttgcctgegggteggaeggatcgagaagttsgagtacttgtaaaaagtcagtcagcagtagtagggg站tcttttctctsctatscttggcgatgggtgcgttcggtcagtggaagtactcttaacgggtatgtgaagcactctcatgcattgtccaggcttcacacgaccaaatcccttgcgttgggacctaaggcgcattactcgcggtctcggctgtttgttctcgttgagtgggegtatcgetcactgtg站aaaagttasasgctcctgcggcctcccttgcgcgtagaagtcgtccccagtctgataaagagtggstcacttegcaagaatgtgctgccgtgccgcgcaagcctcacgcgctaaeggaagetctggctttgatcgatggcggatga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(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆后雙向測序；將測定序列通過正反向拼接后建立完整的ITS基因序列，通過TRF程序來査找微衛(wèi)星位點(diǎn)；對找到的可用位點(diǎn)應(yīng)用GenamicsExpressionTrialVersion1.1程序來設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，最終得到微衛(wèi)星引物及對應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)。全文摘要本發(fā)明是一組三疣梭子蟹ITS基因的微衛(wèi)星引物，其特征在于，它通過以下步驟得到，先采集三疣梭子蟹提取基因組DNA，通過PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的ITS基因，進(jìn)行克隆后雙向測序，通過TRF程序來查找三疣梭子蟹的ITS基因微衛(wèi)星位點(diǎn)并開發(fā)出微衛(wèi)星引物。本發(fā)明篩選出的引物擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好，可應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)評價(jià)和種質(zhì)鑒定以及三疣梭子蟹的群體遺體多樣性評價(jià)，具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和操作簡便等特點(diǎn)。文檔編號C12Q1/68GK101481735SQ200910029169公開日2009年7月15日申請日期2009年1月7日優(yōu)先權(quán)日2009年1月7日發(fā)明者孟學(xué)平,李曉英,程漢良,董志國,閻斌倫申請人:淮海工學(xué)院