專利名稱：一種曼氏無(wú)針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于分子生物學(xué)DNA標(biāo)記技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種曼氏無(wú)針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物。
背景技術(shù)：
微衛(wèi)星DNA (Microsatellite):又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列(short tandemrepeats, STRs)或簡(jiǎn)單序列重復(fù)(simple sequence repeats, SSRs)。它是以1- 6 個(gè)喊基的短核苷酸為基本單位首尾相連組成串聯(lián)重復(fù)序列，由于重復(fù)次數(shù)不同以及重復(fù)程度的不完全造成了每個(gè)位點(diǎn)的長(zhǎng)度多態(tài)性。由于每個(gè)微衛(wèi)星兩端的序列多是相對(duì)保守的單拷貝序列，可根據(jù)其兩端設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，通過PCR技術(shù)來(lái)擴(kuò)增相應(yīng)位點(diǎn)的微衛(wèi)星序列，再經(jīng)電泳分析，即可顯示不同基因型個(gè)體微衛(wèi)星的多態(tài)性。微衛(wèi)星由于分布廣泛，密度大，多態(tài)性豐富，遵循孟德爾分離定律，共顯性遺傳、易于PCR擴(kuò)增，所需DNA數(shù)量極少，對(duì)DNA質(zhì)量要求不高，結(jié)果重復(fù)性好等優(yōu)點(diǎn)，目前已被廣泛應(yīng)用于遺傳多樣性、親緣關(guān)系分析、連鎖圖譜構(gòu)建、功能基因定位、分子標(biāo)記輔助育種(Marker-assisted Selection, MAS)等領(lǐng)域。曼氏無(wú)針烏賊(Sepiella maindroni, Rochebrune)俗稱墨魚、日本無(wú)針烏賊，隸屬軟體動(dòng)物門(Mollusca)、頭足綱(Cephalopoda)、二觸亞綱(Dibranchia)、十腕目(Decapoda)、烏賊超科(Sepiacea)、烏賊科(Sepiidae)、無(wú)針烏賊屬(Sepiella),是我國(guó)近海廣布性種，曾是我國(guó)四大海產(chǎn)漁業(yè)(大黃魚、小黃魚、墨魚與帶魚)之一，以舟山漁場(chǎng)產(chǎn)量最大，在我國(guó)沿海知名度很高。由于過度捕撈，至上世紀(jì)80年代，烏賊的資源量銳減，漁訊消失，趨于瀕危狀態(tài)。為了加強(qiáng)對(duì)曼氏無(wú)針烏賊資源的保護(hù)，近年來(lái)其增殖放流及產(chǎn)卵場(chǎng)的保護(hù)和修復(fù)工作逐步展開，迫切需要對(duì)資源現(xiàn)狀及增殖放流的效果進(jìn)行遺傳學(xué)評(píng)估以制定合理的放流措施。微衛(wèi)星分 子標(biāo)記在物種的群體遺傳學(xué)及放流增殖效果評(píng)估方面具有廣闊的應(yīng)用前景，因此，選用有效的微衛(wèi)星標(biāo)記對(duì)于曼氏無(wú)針烏賊資源的保護(hù)和合理開發(fā)利用具有重要意義。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供曼氏無(wú)針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及多態(tài)性引物，即提供6個(gè)曼氏無(wú)針烏賊的微衛(wèi)星位點(diǎn)，以及相應(yīng)的多態(tài)性引物，為曼氏無(wú)針烏賊的種群遺傳學(xué)、家系鑒定及分子標(biāo)記輔助育種技術(shù)提供有效的工具。本發(fā)明一個(gè)方面提供6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn),其核酸序列分別為SEQ ID N0:l_6。本發(fā)明還提供上述核酸序列的互補(bǔ)序列。本發(fā)明還提供從上述6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其中序列為SEQ ID NO 1的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8。序列為SEQ ID NO :2的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ IDNO :9、SEQ ID NO :10。
序列為SEQ ID NO :3的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ IDNO 1USEQ ID NO :12。序列為SEQ ID NO :4的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ IDNO 13, SEQ ID NO :14。序列為SEQ ID NO :5的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ IDNO 15, SEQ ID NO :16。序列為SEQ ID NO :6的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ IDNO 17, SEQ ID NO :18。本發(fā)明的微衛(wèi)星多態(tài)性引物用于曼氏無(wú)針烏賊種群遺傳多樣性的檢測(cè)，包括如下步驟I)基因組DNA的提取采用苯酚-氯仿法抽提曼氏無(wú)針烏賊肌肉組織的基因組DNA ；2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增采用設(shè)計(jì)的引物，曼氏無(wú)針烏賊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得曼氏無(wú)針烏賊個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物；3)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測(cè)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物； 4)遺傳多樣性分析根據(jù)每個(gè)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。本發(fā)明從曼氏無(wú)針烏賊基因組DNA中篩選6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于曼氏無(wú)針烏賊的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的方法進(jìn)行詳細(xì)的描述，對(duì)于實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常可按常規(guī)條件，如J.薩姆布魯克(Sambrook)等編寫的《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件運(yùn)行。一、微衛(wèi)星位點(diǎn)的篩選1、含有微衛(wèi)星位點(diǎn)的序列查找從構(gòu)建的曼氏無(wú)針烏賊墨囊基因文庫(kù)的序列中用軟件SSRHUNTER1.3 (http://www. biosoft. net/dna/SSRHunter. htm)進(jìn)行微衛(wèi)星序列的查找；參數(shù)設(shè)置為查找含有二堿基、三堿基和四堿基重復(fù)數(shù)5次以上的序列。共篩選出50個(gè)含有微衛(wèi)星重復(fù)的位點(diǎn)，并從中設(shè)計(jì)引物進(jìn)行多態(tài)性的檢測(cè)。2、微衛(wèi)星引物設(shè)計(jì)從含有微衛(wèi)星的基因序列中，選取符合引物設(shè)計(jì)的序列使用PrimerPremier5. O進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。主要參數(shù)設(shè)置為引物長(zhǎng)度18_25p，20個(gè)為最適長(zhǎng)度，PCR產(chǎn)物片段長(zhǎng)度范圍100-350bp，最適退火溫度55-65 °C。GC含量一般在40%_60%之間，盡量避免二級(jí)結(jié)構(gòu)出現(xiàn)。3、將設(shè)計(jì)的弓丨物進(jìn)行多態(tài)性檢測(cè)I)基因組DNA的提取
采用苯酚-氯仿法抽提25個(gè)曼氏無(wú)針烏賊肌肉組織的基因組DNA ；2 )微衛(wèi)星PCR的擴(kuò)增采用設(shè)計(jì)的微衛(wèi)星引物序列擴(kuò)增曼氏無(wú)針烏賊基因組DNA ;反應(yīng)體系10 μ L，包括2 X Power Taq PCR Master Mix (BioTeke, Beijing, China) 5 μι,正、反向引物各 I μ Μ,基因組DNA約100 ng。PCR反應(yīng)程序?yàn)?4° C預(yù)變性3 min，然后進(jìn)行35個(gè)擴(kuò)增循環(huán)，每一循環(huán)包括94° C變性I min，退火溫度I min (各引物退火溫度見表2)，72° C延伸Imin,最后 72° C 延伸 5 min。3)擴(kuò)增產(chǎn)物電泳采用8%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物，800W恒功率電泳1-1. 5小時(shí)分離。膠板通過10%的冰醋酸溶液30min，蒸餾水6min，O. 2%硝酸銀溶液30min，3%的碳酸鈉顯色30秒,終止反應(yīng)即得到擴(kuò)增產(chǎn)物片段,采用10-bp DNA ladder (Invitrogen Inc.)作為marker檢測(cè)等位基因位置。4)遺傳多樣性分析根據(jù)每個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)，從而篩選出具有多態(tài)性的微衛(wèi)星引物及對(duì)應(yīng)的位點(diǎn)。經(jīng)過多樣性檢測(cè)，本發(fā)明共篩選出6個(gè)具有遺傳多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核苷酸序列分別為SEQ ID NO: 1-6,其設(shè)計(jì)的多態(tài)性引物的信息如表I所示表1:6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)及對(duì)應(yīng)引物信息
權(quán)利要求
1.一種曼氏無(wú)針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)，所述的位點(diǎn)為 1)序列為SEQID NO: 1-6中的任一個(gè)的微衛(wèi)星位點(diǎn)， 2)與I)中的微衛(wèi)星位點(diǎn)的核苷酸序列互補(bǔ)的微衛(wèi)星位點(diǎn)。
2.微衛(wèi)星引物對(duì)，所述的引物對(duì)是從權(quán)利要求1所述微衛(wèi)星位點(diǎn)上設(shè)計(jì)的。
3.如權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)，其中序列為SEQID NO :1的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID N0:7、SEQ ID NO :8。
4.如權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)，其中序列為SEQID NO :2的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID N0:9、SEQ ID NO 10o
5.如權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)，其中序列為SEQID NO :3的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID NO =IUSEQ ID NO 120
6.如權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)，其中序列為SEQID NO :4的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID NO 13, SEQ ID NO :14。
7.如權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)，其中序列為SEQID NO :5的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID NO 15, SEQ ID NO 160
8.如權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)，其中序列為SEQID NO :6的微衛(wèi)星位點(diǎn)設(shè)計(jì)的引物對(duì)，其上下游序列分別為SEQ ID NO 17, SEQ ID NO 180
9.權(quán)利要求2所述的微衛(wèi)星引物對(duì)用于曼氏無(wú)針烏賊種群遺傳多樣性的檢測(cè)，包括如下步驟1)基因組DNA的提取采用苯酚-氯仿法抽提曼氏無(wú)針烏賊肌肉組織的基因組DNA； 2)微衛(wèi)星PCR擴(kuò)增采用設(shè)計(jì)的引物，曼氏無(wú)針烏賊基因組DNA為模板進(jìn)行PCR，獲得曼氏無(wú)針烏賊個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物； 3)電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物采用變性聚丙烯酰胺凝膠電泳及銀染法檢測(cè)微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物； 4)遺傳多樣性分析根據(jù)每個(gè)個(gè)體微衛(wèi)星擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量大小確定基因型，采用GENEPOP 4. O. 10計(jì)算遺傳多樣性參數(shù)。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種曼氏無(wú)針烏賊微衛(wèi)星位點(diǎn)及引物，6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，其核酸序列分別為SEQ ID NO:1-6。引物序列為SEQ ID NO:7-18。 本發(fā)明從曼氏無(wú)針烏賊基因組DNA中篩選6個(gè)微衛(wèi)星位點(diǎn)，并在微衛(wèi)星重復(fù)序列兩端的側(cè)翼區(qū)設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行擴(kuò)增，獲得的產(chǎn)物具有高度的多態(tài)性和穩(wěn)定性，可用于曼氏無(wú)針烏賊的群體遺傳學(xué)、親緣關(guān)系分析、分子標(biāo)記輔助育種等領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N15/11GK103060317SQ201210592860
公開日2013年4月24日 申請(qǐng)日期2012年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2012年12月29日
發(fā)明者李榮華, 王春琳, 章成龍, 宋微微, 母昌考, 詹萍萍 申請(qǐng)人:寧波大學(xué)