專利名稱：：一組基于三疣梭子蟹線粒體d-loop基因的微衛(wèi)星引物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，可應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)鑒定與評(píng)價(jià)和遺傳結(jié)構(gòu)分析的微衛(wèi)星引物。
背景技術(shù)：
：三疣梭子蟹(/^r/^^ercM/a&力，俗稱海蟹或大蟹，屬于甲殼綱，十足目，梭子蟹科。它廣泛分布在中國(guó)南北沿海，是中國(guó)大型海洋經(jīng)濟(jì)蟹類，是沿海重要的漁業(yè)資源，開(kāi)展三疣梭子蟹群體遺傳結(jié)構(gòu)分析和種質(zhì)鑒定工作，對(duì)于三疣梭子蟹的增養(yǎng)殖親本選擇和原種、家系和優(yōu)良品種資源保護(hù)具有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前常用來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)生物遺傳多樣性和種質(zhì)鑒定的分子標(biāo)記均具有一定程度的缺陷，如RAPD技術(shù)(隨機(jī)擴(kuò)增序列多態(tài)性DNA,RandomamplifiedpolymorphicDNA),常因RAPD引物過(guò)短10個(gè)堿基、退火溫度過(guò)低一般36-37°C，導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物的一些非特異結(jié)果，其可靠程度和真實(shí)性是主要的缺陷；而AFLP技術(shù)(擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性，Amplifiedfragmentlengthpolymorphism),又因操作條件復(fù)雜如要求酶切、成本相對(duì)較高而限制了其廣泛的應(yīng)用。微衛(wèi)星標(biāo)記是一種新興的分子標(biāo)記技術(shù)，實(shí)質(zhì)就是基因組中大量存在的串聯(lián)重復(fù)序列，以這些重復(fù)序列作為遺傳標(biāo)記可以進(jìn)行種質(zhì)鑒定與標(biāo)記、遺傳多樣性分析、遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建等一系列工作，其工作原理是通過(guò)己知的基因序列尋找微衛(wèi)星序列然后在微衛(wèi)星序列上下游設(shè)計(jì)特異性引物，這樣設(shè)計(jì)的引物就成為微衛(wèi)星引物，通過(guò)使用設(shè)計(jì)好的成對(duì)引物就可以通過(guò)PCR技術(shù)擴(kuò)增出微衛(wèi)星標(biāo)記帶，通過(guò)電泳凝膠成像技術(shù)成像后進(jìn)行種質(zhì)鑒定與標(biāo)記、遺傳多樣性分析或遺傳連鎖圖譜的構(gòu)建。應(yīng)用微衛(wèi)星引物擴(kuò)增出的微衛(wèi)星序列電泳分離時(shí)具有單堿基的高分辨率，遺傳信息量大，通常為顯性標(biāo)記，呈孟德?tīng)柺竭z傳，具有很高的穩(wěn)定性和多態(tài)性，且DNA用量較AFLP少，技術(shù)要求低，微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)則正好克服了RAPD和AFLP技術(shù)的這些缺點(diǎn)，具有很好的應(yīng)用價(jià)值。線粒體DNA為細(xì)胞核外遺傳物質(zhì)，且以母性遺傳為主，具有結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單、堿基突變率高、核苷酸歧義度大和進(jìn)化速度快等特點(diǎn)，特別適宜種質(zhì)鑒定和遺傳結(jié)構(gòu)分析。D-LOOP俗稱D環(huán)，又稱線粒體控制區(qū)，具有較高的變異水平，特別適合于種以下水平的遺傳分析和親緣關(guān)系鑒定，目前，D-LOOP作為分子標(biāo)記在種質(zhì)資源評(píng)價(jià)和群體結(jié)構(gòu)分析中被認(rèn)為是最廣泛的基因之一。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，開(kāi)發(fā)一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，該引物可克服現(xiàn)有技術(shù)引物過(guò)短，退火溫度低，操作條件復(fù)雜，成本高、準(zhǔn)確性低的缺陷。本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是通過(guò)以下的技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本發(fā)明是一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，其特點(diǎn)是，所述的微衛(wèi)星引物為D-LOOP78DY1:F:AAGGCCTACATACAAAGAGCR:ACTAAGTGAAGAATGAGATAD-LOOP91DY4:F:TATATCTAATTCTTCACTTR:AACTATCTAATTACTGTCTTD-LOOP125DY4:F:CAAAACTAATTCCTATAAACTAAAR:AACCAAAGCATTCCCTGAGD-LOOP52L2:F:TTTGAGAATAAGATGATAGG5R:AACGGGAGAATAAGATGAAAD-LOOP229U3:F:TGGAGTTCCTATTTCATCTTATTR:TCACTTTCTTCCTTTGCTCATD-LOOP150DY2:F:TTTCTTCCTTTACTCATTAR:CTATTTCATCTTATTCTGTCGTTD-LOOP135DY2:F:TACTAGTATATCGTTTAR:ATTTTGTATATTTAGGTGD-LOOP225DY2:F:TCGTTTTATTGATTATTR:AAAAAGTTGAAAGAGTA上述微衛(wèi)星弓I物可通過(guò)以下方法得到，(1)采集三疣梭子蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室提取總DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的D-LOOP基因，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行雙向測(cè)序；(2)將測(cè)定序列通過(guò)正反向拼接后建立完整的D-LOOP基因序列，通過(guò)TRF程序來(lái)查找微衛(wèi)星位點(diǎn)；(3)對(duì)找到的可用位點(diǎn)設(shè)計(jì)微衛(wèi)星引物，最終得到如表1所述微衛(wèi)星引物(序列表中SEQUENCENO:1-16)及對(duì)應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)表1基于三疣梭子蟹D-LOOP基因微衛(wèi)星引物及對(duì)應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)引物重復(fù)可能的微衛(wèi)星起上下游引物序列引物起Tm值擴(kuò)增目的號(hào)類型重復(fù)數(shù)始位置始位置('c)片段大小F:AAGGCCTACATACAAAGAGC15145.7D-LOOP78DY1ATAAAAT0-3.118378bpR:ACTAAGTGAAGAATGAGATA22835.8F:TATATCTAATTCTTCACTT20729.7D-LOOP91DY4ATATT0-3.625494bpR:AACTATCTAATTACTGTCTT30031.5F:CAAAACTAATTCCTATAAACTAAA24142.8D-LOOP125DY4AATATATT0-2315125bpR:AACCAAAGCATTCCCTGAG36549.1F:TTTGAGAATAAGATGATAGG41038.6D-LOOP52L2ATATTA0-243652bpR:AACGGGAGAATAAGATGAAA46145.8F:TGGAGTTCCTATTTCATCTTATT43146.6D-LOOP229L13TAAT0-5491162bpR:TCACTTTCTTCCTTTGCTCAT59248.4F:TTTCTTCCTTTACTCATTA51936.4D-LOOP150DY2ATTA0-5599150bpR:CTATTTCATCTTATTCTGTCGTT66844.9F:TACTAGTATATCGTTTA73225.7D-LOOP135DY2TA0-13844135bpR:ATTTTGTATATTTAGGTG86630.7F:TCGTTTTATTGATTATT79231.3D-LOOP225DY2ATGC0-2.5877225bpR:AAAAAGTTGAAAGAGTA101629.86以下對(duì)發(fā)明人所作的研究試驗(yàn)進(jìn)行闡述。實(shí)驗(yàn)用三疣梭子蟹采集于遼寧大連、山東東營(yíng)、江蘇連云港、浙江舟山、福建漳州、廣東湛江6個(gè)種群地區(qū)海域，采集時(shí)間、地點(diǎn)、簡(jiǎn)稱及采集數(shù)量見(jiàn)表2，采集到的三疣梭子蟹活體運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，-701:低溫冰箱或75%酒精保存。表2三疣梭子蟹樣本信息采集地點(diǎn)大連(L)連云港(G)東營(yíng)(DY)舟山(z)漳州(ZZ)湛江(C)采樣日期采集個(gè)體數(shù)目曱殼寬度(cm)平均值±標(biāo)準(zhǔn)差2005.9222005.10312005.113320059302006.1102005.3613.40±0.5515.75±1.5914.37±1.0411.94±1.4516.20±1.6616.85±1.751、DNA提取。取組織約50mg，先用蒸餾水將組織中的乙醇清洗干凈，然后按照常規(guī)的酚一氯仿法提取DNA。2、PCR擴(kuò)增。根據(jù)GeneBank中三疣梭子蟹線粒體基因組序列(GenBankaccessionNo.AB093006.1)，用DNAStar軟件包中PrimerSelect程序設(shè)計(jì)特異引物，引物的序列為D-loopF:5'-CGAGCTACTACACGCAACAAC-3'禾卩D-loopR:5'-GACGGTGTAAATCCGTTACGA-3'。由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。PCR反應(yīng)總體積為50|al，包括5ji110xPCRBuffer,化l25mmol/LMgCl2，1(J10mmol/LdNTP,4^12.5mmol/L雙向引物，0.4(ilTaqDNA聚合酶(5U/|al),3^1DNA模板，加無(wú)菌雙蒸水至50(^1。PCR反應(yīng)條件為94°C預(yù)變性5min后進(jìn)行降落PCR，94。C變性45s，53T退火45s(每5個(gè)循環(huán)降低2°0，72。C延伸1.5min，15個(gè)循環(huán)，接下來(lái)進(jìn)行94。C變性45s,47。C退火45s,72。C延伸1.5min,15個(gè)循環(huán)，最后72"充分延伸10min，4。C保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，染色后在凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。3、測(cè)序。PCR產(chǎn)物用上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒進(jìn)行純化，后送上海華大天源生物科技有限公司采用擴(kuò)增產(chǎn)物在ABIprismTM377測(cè)序儀上直接進(jìn)行正反雙向測(cè)序，6個(gè)群體(每個(gè)群體至少測(cè)10個(gè))測(cè)定出多個(gè)三疣梭子蟹D-LOOP完整基因序列。然后用DNASTAR軟件中的Seqman程序作比較分析，用存在微衛(wèi)星變異的個(gè)體D-LOOP完整基因序列來(lái)設(shè)計(jì)引物，最終選定的5個(gè)用于制作引物的個(gè)體分別為DY1、DY2、DY4、L2、L13，其對(duì)應(yīng)的D-LOOP完整基因序列依次見(jiàn)序列表第17-21號(hào)序列(SEQUENCENO:17-21)。4、微衛(wèi)星位點(diǎn)的確定。將測(cè)序的結(jié)果使用DNAStar軟件包的Seqman程序進(jìn)行雙向拼結(jié)，并將所有序列使用DNASTAR軟件中的S叫man程序轉(zhuǎn)化為基因序列的FASTA格式，以便TandemRepeatsFinder軟件識(shí)別(簡(jiǎn)稱為T(mén)RF程序)。將序列轉(zhuǎn)化成FASTA模式后用TRF程序依次打開(kāi)，設(shè)定TRF程序的math(匹配)，mismath(錯(cuò)配)和indel(插入缺失)參數(shù)為分別為2，7，7，最小重復(fù)序列(minimumalignmentscoretoreportreapeat)為20，最大區(qū)間(maximumperiodsize)為2000，然后運(yùn)行Rim,結(jié)果即保存到FASTA文件格式的目錄下，即序列數(shù)據(jù)所在的文件夾中，每Rim—個(gè)FASTA格式的序列文件變會(huì)產(chǎn)生兩個(gè)HTML格式的結(jié)果文件。HTML格式的結(jié)果文件中分別顯示微衛(wèi)星所在的序列位置、大小、拷貝數(shù)、重復(fù)堿基等情況。將所有的FASTA格式序列文件通過(guò)運(yùn)行TRF程序査找到的微衛(wèi)星結(jié)果，見(jiàn)表3。表3三疣梭子蟹D-LOOP基因中的可用的微衛(wèi)星位點(diǎn)分布<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>注個(gè)體一縱欄指三疣梭子蟹的個(gè)體編號(hào)，表格的橫行為出現(xiàn)的微衛(wèi)星重復(fù)序列名稱，如"ATAAAAT"指重復(fù)序列為ATAAAAT的微衛(wèi)星，而應(yīng)的表中的數(shù)字如"2.7/183-201"是指DY1這個(gè)個(gè)體在183-201區(qū)間內(nèi)"ATAAAAT"重復(fù)次數(shù)為2.7次。上述DNAStarV3.0軟件的出處為SteveShearDown,1989—2001versionreservedbyDNASTARInc.,Madison,WI，USA;上述TandemRepeatsFinde(TRF)軟件的出處為G.Benson,"Tandemrepeatsfinder:aprogramtoanalyzeDNAseq腿ces"NucleicAcidsResearch(1999)Vol.27,No.2,pp.573-580,網(wǎng)址為http:〃tandem.bu.edu/trf/trf.html。5、微衛(wèi)星引物的開(kāi)發(fā)。考慮到開(kāi)發(fā)微衛(wèi)星分子標(biāo)記能夠應(yīng)用這就要求具有良好的產(chǎn)物長(zhǎng)度多態(tài)性，而不存長(zhǎng)度多態(tài)性的微衛(wèi)星位點(diǎn)去掉，因此結(jié)合DNASTAR中的Seqman對(duì)所有序列進(jìn)行對(duì)比，選擇含有插入或缺失的微衛(wèi)星位點(diǎn)來(lái)開(kāi)發(fā)引物，開(kāi)發(fā)的微衛(wèi)星標(biāo)記引物組是理想的，因此符合條件的微衛(wèi)星位點(diǎn)見(jiàn)表3。用表3中所有具有多態(tài)性的微衛(wèi)星來(lái)開(kāi)發(fā)引物，以"ATAAAAT"為例，其余過(guò)程相同。開(kāi)發(fā)過(guò)程如下對(duì)表3中重復(fù)類型為"ATAAAAT"的微衛(wèi)星，將其任一個(gè)體的序列導(dǎo)入到引物設(shè)計(jì)軟件(選擇設(shè)計(jì)引物的個(gè)體D-LOOP基因序列依據(jù)為不同個(gè)體的微衛(wèi)星兩側(cè)翼區(qū)序列均保守相同，因此任一個(gè)體均可以用來(lái)設(shè)計(jì)引物，出于方便，一般選擇該微衛(wèi)星位點(diǎn)沒(méi)有丟失的序列來(lái)設(shè)計(jì)，如"ATAAAAT"這個(gè)微衛(wèi)星則最好選擇DY1(SEQUENCENO:17)等含有"ATAAAAT"2.7個(gè)拷貝的三疣梭子蟹個(gè)體D-LOOP基因序列。以下以DY1(SEQUENCENO:17)為例說(shuō)明"ATAAAAT"微衛(wèi)星引物開(kāi)發(fā)過(guò)程。打開(kāi)軟件用DNAStar軟件包中PrimerSelect程序，導(dǎo)入DYl(SEQUENCENO:17)序列，點(diǎn)擊菜單欄中的"Conditions"—"S叫uencepositionandlimitits"即可設(shè)定引物所要擴(kuò)增的微衛(wèi)星位置組，選擇的依據(jù)是上下游引物通火溫度相近即可，引物間包含有所在的微衛(wèi)星位點(diǎn)如"ATAAAAT"微衛(wèi)星，同時(shí)兩引物間最好不含有別的微衛(wèi)星，因此對(duì)"ATAAAAT"微衛(wèi)星可供設(shè)計(jì)引物的區(qū)域?yàn)镈Y1(SEQUENCENO:17)序列的0-250間，符合該要求的引物為F:AAGGCCTACATACAAAGAGC，Tm為45.7，起始位置為151;R:ACTAAGTGAAGAATGAGATA,Tm為35.8，起始位置為228，擴(kuò)增的目的片段為78bp，同樣的將表3中其余的7個(gè)可用的微衛(wèi)星的引物設(shè)計(jì)出來(lái)。結(jié)果匯總?cè)绫韑所示。表l設(shè)計(jì)出的引的給出的退火溫度為理論值，實(shí)際應(yīng)用時(shí)可以適當(dāng)提高或降低退火溫度5"C左右。如作為實(shí)際使用時(shí)Tm值在3(TC左右的可以提高到36-4(TC。本發(fā)明將微衛(wèi)星和D-LOOP的優(yōu)點(diǎn)結(jié)合起來(lái)開(kāi)發(fā)基于三疣梭子蟹D-LOOP基因的微衛(wèi)星標(biāo)記引物，且開(kāi)發(fā)出該基因的微衛(wèi)星標(biāo)記引物具有重要的應(yīng)用價(jià)值。篩選出的引物擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好，可應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)評(píng)價(jià)和種質(zhì)鑒定以及三疣梭子蟹的群體遺體多樣性評(píng)價(jià)，該方法具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。具體實(shí)施例方式以下進(jìn)一步描述本發(fā)明的具體技術(shù)方案，以便于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步地理解本發(fā)明，而不構(gòu)成對(duì)其權(quán)利的限制。實(shí)施例1。一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，所述的微衛(wèi)星引物為D-LOOP78DY1:D-LOOP91DY4:D-LOOP125DY4:D-LOOP52L2:D-LOOP229L13:D-LOOP150DY2:D-LOOP135DY2:D畫(huà)LOOP225DY2:F:AAGGCCTACATACAAAGAGCR:ACTAAGTGAAGAATGAGATAF:TATATCTAATTCTTCACTTR:AACTATCTAATTACTGTCTTF:CAAAACTAATTCCTATAAACTAAAR:AACCAAAGCATTCCCTGAGF:TTTGAGAATAAGATGATAGGR:AACGGGAGAATAAGATGAAAF:TGGAGTTCCTATTTCATCTTATTR:TCACTTTCTTCCTTTGCTCATF:TTTCTTCCTTTACTCATTAR:CTATTTCATCTTATTCTGTCGTTF:TACTAGTATATCGTTTAR:ATTTTGTATATTTAGGTGF:TCGTTTTATTGATTATTR:AAAAAGTTGAAAGAGTA所述的微衛(wèi)星引物對(duì)應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)見(jiàn)表1所示。所述的一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物通過(guò)以下方法得到，先采集三疣梭子蟹提取基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的iiD-LOOP基因，將該基因電泳回D-LOOP目的片段，將該片段與載體進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5ci感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆后雙向測(cè)序；將測(cè)定序列通過(guò)正反向拼接后建立完整的D-LOOP基因序列，通過(guò)TRF程序來(lái)查找三疣梭子蟹的D-LOOP基因微衛(wèi)星位點(diǎn)并開(kāi)發(fā)得到微衛(wèi)星引物。實(shí)施例2?；谌嗨笞有稤-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，用其進(jìn)行群體遺傳結(jié)構(gòu)分析，其步驟如下，1.引物的合成應(yīng)用DNA合成儀合成表1中的引物8對(duì)，各20D，一般由有DNA合成能力的生物工程公司來(lái)完成。2.三疣梭子蟹基因組的提取采集三疣梭子蟹幾個(gè)家系樣本各30個(gè)，新鮮樣品帶回實(shí)驗(yàn)室，采用標(biāo)準(zhǔn)酚-氯仿法抽提基因組DNA。具體過(guò)程及試劑配方，三疣梭子蟹的基因組DNA釆用SDS裂解液配方10mmol/LTris.Cl(pH=8.0)，0.1mmol/LEDTA(pH=8.0)，0.5%SDS，提取的步驟為取三疣梭子蟹的肌肉組織50mg，放入液氮中研磨成細(xì)粉，放入2.0ml的離心管中，加入600^1的SDS組織裂解液，放入55。C水浴搖床，裂解lh后加入蛋白酶Kl(Vl(20mg/ml)，繼續(xù)裂解34h，然后將離心管取出用手指輕彈離心管底部,讓未裂解組織與裂解液充分接觸，使組織細(xì)胞能夠充分裂解，裂解完畢后每只離心管加入600nlTris飽和酚，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置1015min，12000rpm，4。C離心10min，取上清液，加入60(^1氯仿異戊醇混合液，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置1015min，12000rpm，離心10min，取上清液，加入1200|il冷凍無(wú)水乙醇，顛倒45-55次，室溫靜置1015min，8000rpm，離心10min，棄上清，即得DNA，在離心管中加入1500|il70%的乙醇，洗滌兩次，然后8000rpm，離心8min，棄上清，室溫風(fēng)干，直至乙醇揮發(fā)完畢，加入50plTE，溶解DNA，4"C保存，制備0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3.PCR反應(yīng)體系PCR體系25)^1，Mg"濃度為2.5腿ol/L、10XBuffer的體積為2.75^1、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTPmixture0.5jil，引物2pl，其余用水補(bǔ)足;反應(yīng)條件首先95。C預(yù)變性5min，然后進(jìn)入以下40個(gè)循環(huán)94。C變性45s，45°C-52。C(不同引物對(duì)應(yīng)不同的退火溫度見(jiàn)表三)Touchdown程序退火45s，72"C延伸1.5min，然后72'C再次延伸10min，最后4"C保存。4.電泳檢測(cè)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(1)8%變性聚丙烯酰胺的制備:15ml8%變性膠，7.5ulTEMED，10ulAP。(2)上樣變性上樣緩沖液配方為98%甲酰胺49ml，10mMEDTA(pH8.0)1ml，0.25%溴芬蘭0.125g，0.25%二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR產(chǎn)物和上樣緩沖液體1:l加樣2-4微升，同時(shí)設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(DL-2000);(3)電泳電壓以400V左右維持2h置，待溴酚藍(lán)指示劑移至距凝膠前沿l-2cm處時(shí)，關(guān)閉電源；(4)取出凝膠板，用硝酸銀染色；(5)凝膠呈像系統(tǒng)(ChemiDocXRS)拍照，記錄結(jié)果；(6)經(jīng)電泳獲得的圖譜每群體在所有位點(diǎn)的譜帶式樣組成一個(gè)01矩陣。用Arequin2.0軟件進(jìn)行分子方差分析(AM0VA)，計(jì)算遺傳多態(tài)度(兀)和遺傳分化指數(shù)(Fst)等各種種質(zhì)資源評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終得出評(píng)價(jià)結(jié)果。實(shí)施例3?；谌嗨笞有稤-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，進(jìn)行家系鑒定，其步驟如下，1.提取三疣梭子蟹繁育家系的基因組DNA(1)SDS裂解液配方1Ommol/LTris.Cl(pH二8.0)，0.1畫(huà)1/LEDTA(pH二8.0)，0.5%SDS。(2)步驟取三疣梭子蟹的步足上的肌肉組織50mg，放入液氮中研磨成細(xì)粉，放入2.0ml的離心管中，加入600|il的SDS組織裂解液，放入55。C水浴搖床，裂解1小時(shí)后加入蛋白酶K10^1(20mg/ml)，繼續(xù)裂解34個(gè)小時(shí)，然后將離心管取出用手指輕彈離心管底部，讓未裂解組織與裂解液充分接觸，使組織細(xì)胞能夠充分裂解；裂解完畢后每只離心管加入600^1Tris飽和酚，輕輕振蕩搖勻，顛倒45-55次，室溫靜置1015min;12000rpm，4離心10min;取上清液，加入600|il氯仿異戊醇混合液，輕輕振蕩搖勻，顛倒50次；室溫靜置1015min;12000rpm，離心10min;取上清液，加入1200^1冷凍無(wú)水乙醇，顛倒45-55次；室溫靜置1015min;12000rpm，離心10min;棄上清，即得DNA，在離心管中加入1500^170%的酒精，洗滌兩次，然后8000rpm，離心8min;棄上清，室溫風(fēng)干，直至乙醇揮發(fā)完畢；加入5(V1TE，溶解DNA，4。C保存；14制備0.8。％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。2.合成表8對(duì)三疣梭子蟹引物利用實(shí)施例1合成表1中的8對(duì)引物。3.PCR反應(yīng)體系PCR體系25^1，Mg"農(nóng)度為2.5mmol/L、10XBuffer的體積為2.75pl、DNA模板50ng、Taq酶1U、dNTPmixture0.5pl，引物2pl，其余用水補(bǔ)足；反應(yīng)條件首先95"預(yù)變性5min，然后進(jìn)入以下40個(gè)循環(huán)94t變性45s，45。C-52。C(不同引物對(duì)應(yīng)不同的退火溫度見(jiàn)表三)Touchdown程序退火45s，72"C延伸1.5min，然后72"C再次延伸10min，最后4匸保存。4.電泳檢測(cè)與數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)(1)8%變性聚丙烯酰胺的制備:15ml8%變性膠，7.5ulTEMED，10ulAP。(2)上樣變性上樣緩沖液配方為98%甲酰胺49ml，10mMEDTA(pH8.0)1ml，0.25%溴芬蘭0.125g，0.25%二甲苯青0.125g，加水到50ml。以PCR產(chǎn)物和上樣緩沖液體1:l加樣2-4微升，同時(shí)設(shè)立合適的DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)物(DL-2000);(3)電泳電壓以400V左右維持2h置，待溴酚藍(lán)指示劑移至距凝膠前沿l-2cm處時(shí)，關(guān)閉電源；(4)取出凝膠板，用硝酸銀染色；(5)凝膠呈像系統(tǒng)(ChemiDocXRS)拍照，記錄結(jié)果；(6)經(jīng)電泳獲得的圖譜找到所要研究家系的相應(yīng)特異性分子標(biāo)記，作為該家系的分子標(biāo)記。SEQUENCELISTING<110>淮海工學(xué)院<120>—組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因微衛(wèi)星引物〈130>200902〈160〉21〈170>Patentlnversion3.3〈210〉1〈211〉20〈212〉醒〈213>人工序列〈220〉〈223〉引物〈400>1aaggcctacatacaaagagc〈210〉2<211>20〈212〉腿〈213〉人工序列〈220〉〈223>引物〈400〉2actaagtgaagaatgagata〈210〉3〈211〉19〈212〉DNA<213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉3tstatctssttcttcsctt16〈210〉4<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>〈223〉引物〈400〉4aactatctaattactgtctt20〈210>5〈211〉24<212>DNA<213〉人工序列〈220〉<223>引物〈400〉5caaaactsL3ttcctataaactaaa24〈210>6〈211〉19<212>腿<213>人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉6aaccaaagcattccctgag19<210>7〈211>20<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物〈400〉7tttgagaataagatgatagg20〈210〉8〈211〉20〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220>〈223〉引物〈400>8aacgggagaataagatgaaa20<210〉9〈211〉23〈212〉謹(jǐn)〈213〉人工序列〈220>〈223>引物〈400>9tggagttcctatttcatcttatt23〈210>10〈211〉21<212〉醒〈213〉人工序列〈220〉〈223>引物<400〉10tcactttcttcctttgctcat21<210>11〈211>19〈212〉DNA〈213>人工序列〈220>〈223>引物〈400〉11tttCttCCttt3CtC3tt319<210>12〈211〉23〈212〉■〈213〉人工序列〈220〉〈223〉引物<400>12ctatttcatcttattctgtcgtt23〈210〉13〈211>17〈212〉薩〈213〉人工序列〈220>〈223>引物<400〉13tactagtatatcgttta17〈210〉14〈211〉18<212>■〈213>人工序列〈220〉<223〉引物〈400〉14attttgtatatttaggtg18<210>15〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉<223>引物〈400>15tcgttttattgattatt17〈210〉16〈211〉17〈212〉腿〈213〉<220><223>人工序列引物<400>16aaaaagttgaaagagta〈210>17<211>1105〈212〉DNA〈213>三疣梭子蟹(P.trituberculatus)〈400〉17gtttgatacttcatsststtaatccttgacatatttaagt60ataagcccattgattatatagtaattatatgtatatatacttatacgact120ctatttaacccgtcaagcgagtataaaataaaggcctacatacaaagagcaatagsttca180acat3站ctaaggtcttatatctcattcttcacttagtgaagagtttaat240ctcctscsttaagacagcaattagatagtt300ctataaactssiSLtgaigtstttctatca^ttctsttattst360catctttaataatatttgctctaaatagagagatgaagcattcccttggg420gaatgctttggttctatattagtattatagttctstcstscctttcccttaaagttaatg480atgctaaggaagtgagttcatgttctcgagaggttcactttcttcctttgctcattagga540gaatccagaaagattcatcctctcgaaccactgaactcacttcC33t3t3aggagatcat600tgattataattattctatctgaacactcttcattcaacggcagaataaga660tgaaataggaSLCtCCatCCtstcatcttattctc站sattcaatttaaasgttgactcca720tgaaagttaaaactatatagtgacttatasiaacggtaagt780atatt3這tstattgttttattgattattacatgtagagtagtgtatatac840atgtatatatgtatgcatgcatagaaattttacacaccta900aatstacsaaaataattagttC3tttC3C3aagttttattttstsittctscttsttctss960tcttsctttt3ttt3Cttt33ttscttsctctttcaacttttttcsttst1020tttttsttctcttastttsttttcttsaattttsttttstsctttctttt1080ttttsttttatctttttststtsct1105<210〉18<211〉1108<212>DNA〈213〉三疣梭子蟹(P.trituberculatus)<400>18taaaaaaattgtttgatacttcataatatttcattaaaataatccttgacatatttaagt60ataagcccattgattatatagtaattatatgtatatataccaatctaactttatacgact120ctatttaacccgtcaagcgagtataaaataaaggcctacatacaaagaacaatagattca180acataaactataaaatataaaggtcttatatctcattcttcacttagtgaagagtttaat24020tataatcaaaccastattststgstttata3Ct3tS站C3333Ct33ttCCt3t333Ct3ataatctaatcacctttaataatatttgctgaatgctttggttctatattagtattatagatgctaaggaagtgagttcatgttctcgaggaatccagaaagattcatcctctcgaaccatasttataattasttscssttsttctstcttgaaataggaactccgtcctatcatcttatattataatattgaaagttgaaactatatagatactagtatatcgttttattgattattacatgtatatatatatatatatacac這cacatCCt333t3t3C3333t33tt3gttC3tttCtaatcttacttttataactaaaaatttacttattttttattctctt這atttattttcttaacattttsttttstctttttstattsctctcctacattaagacagcgattagataatt300aatgagtatttctatcaattctattattat360ctaaatagagagatgaagcattccctcagg420ttctatcatacctttcccttaaagttaatg480aggttcactttcttcctttactcattagga540ctgaactcacttccaatataaggagatcat600gaacactcttcactcaacgacagaataaga660tctcaaaattcaatttaaaagctgactccg720tgacttataaatattcttacaacggtaagc780atatagagtaatgtatatacattaaaacaa840atacgtatgcatgcatagaaattttacaca900acaaagttttattttatattctacttattc960ttssttacttsctctttcMcttttttcst1020站ttttattttstsctttctttttssi3tc310801108〈210〉19〈211〉1099<212〉DNA〈213〉三疣梭子蟹(P.trituberculatus)<400〉19taaaaassttataagcccatCt3ttt33CCgaatgctttgatgctaaggagaatccagaatgaaataggaattataststataccagtatatgtatatatttttataactttctctt33ttttstcttttgtttgatacttgattatatacgtcaagcgaaaactaattccacctttaatgttctatattagtgagttcaagattcatcctacttacaaLtsctccstccttgaaagttaaattgttttattagttcatttttsttttctttststtacttcstastattgtaattatataggtcttataaatatttgctagtattatagtgttctcgagtctcgaaccatsttctstct3tcstcttstaactatatagtgattattacatacgtatgccacaaagttttttaattactaaattttattgtatatatacaaggcctacatctasittcttctcctacattaatgagtattctaaatagagttctstcst3aggttcacttctgaactcactctc站站tttgacttataaatatagagtaatgcatagaatattttatattsctctttcsttstsctttcaatccttgacc站tct站cttataaagagcCSLCttSLgtaSLaagacagtaatctatc站ttagatgaagcacctttccttttcttcctttgttccaatatacattcaacggatattcttscatgtgtatacattttacacatctacttattacttttttcattttt333tCatatttaagtttatacgactagtagattcaagagtttaatttagatagttctattsttstttccctcaggaaagttaatgctcattaggaaggagatcatgagaataagagttgactctaaacggtaaatctaattttatttatttttta60120180240300360420480540600660720780840900960102010801099<210〉20〈211〉1086<212〉DNA〈213〉三疣梭子蟹(P.trituberculatus)<400〉20agtaatataaagaaaataaaataaaagtaatttttgtataatacstttsttagtataattstttcstctttaatcaatgaggattctccttagcatcattgcattccttggattatataatatagtaattttgtgttgaaaaatagagtcgcttatactttttttsiaaagataaaagattagaatatttaggtgtgtttaatgtataccgtcataagttagcttttattctcccgttctccttstsgatgagcaaaaactttaaggagggaatgcttaatagaattatctaattgc站cttttcsctctattgctcgtataaagttaaatatgtcataaaatgctgaaaagttgaaagtagaatat3cscattsctgagtatttataaatttgaattgagtgaggattggaagtgaggaagaaagtgaaaggtatgtcstctctctgatagaaatatgtcttaatgtaagtgaagatttgtatgtaagattggtataggattatttatttaaaaagagagtaagtaatgcatatatctatatgtaaaagtcactatttgagaataagtatttggatgttcagtggtgaacctctcgatagaactatatttagagcactcatttagttaggagtataatgagatataggcctttatttaatgaaatasaagtataaaattaaagtaatttgtgsastacgtatatatatagttttaagatgataggaaaagtaattgtcgagaggatagaacatgaaaatgctaataaatattattsttataggaatagacctttatttatacttgcttatgaagtaatttttagttgaactaactaatatatatgtgacaatatatCtttC33t3ttggagttccttaattagttagaatctttctctcacttccttagaaccaaaaaggtgattatagttttgtttattggtttgattttatagtttgacgggtttaatcaatgg60120180240300360420480540600660720780840900960102010801086<210〉21〈211〉1106〈212〉DNA<213〉三疣梭子蟹(P.trituberculatus)〈400〉21agtaatataaagaaaataaataastttttsaatgaactaatatgtgtgtatatagttttsgatgataggaagagtaattgtcgagaggatagaacatgaattataggaataaagataaaattaagagaatgttataaaagttatttttgtaaacaatats3CtttC站t3tggagttcctgaatctttctctcscttccttagaaccaaaaaagtgattatagttttgtttattggtttgtaaaatgttgsaaaastaatt這agattaggatatttaggttst3C3ttt￡Lttataattgastttcstctttaattagtgaggattctccttagcatcattgcattccctggattatataatatagtaattattatagttaatttaaaaaggaaaaaagttataagtagaagtgta站attttttaatgtataccgttgtaagttaactttattctgccgttctccttstaiaatgagcaaaaactttaaggagggaatgcttaatagaattatctaattgc3這tttttC3taaagtataaagaaagagtaatataaaat站cctatgcatgtatacattacagaatatttataaattgaattgagtgaagattggaagtgaggaagaaagtgaaaggtatgtcstctctctgatagaaatatgtcttaatgtaaatgaaga3t3333tttSgtaattaaagaactttgtgacatacgtatatctatatgtataagtcactattaagaataagtgttcagatgttcagtggtgaacctctcgatag站ctatatttagagcactcatttagttaggagtataatgagatata60120180240300360420480540600660720780840900agacctttacattttatagtttatgttgaatctactgctctttgtatgtaggcctttatt960ttatacttgcttgacgggttaaatagagtcgtataaagttggattggtatatatacatat1020aattactatataatcaatggggctatacttaaatatgtcaaggattattttaatgaaata1080ttatgaagtatcaaacasittttttta110權(quán)利要求1、一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，其特征在于，所述的微衛(wèi)星引物為D-LOOP78DY1FAAGGCCTACATACAAAGAGCRACTAAGTGAAGAATGAGATAD-LOOP91DY4FTATATCTAATTCTTCACTTRAACTATCTAATTACTGTCTTD-LOOP125DY4FCAAAACTAATTCCTATAAACTAAARAACCAAAGCATTCCCTGAGD-LOOP52L2FTTTGAGAATAAGATGATAGGRAACGGGAGAATAAGATGAAAD-LOOP229L13FTGGAGTTCCTATTTCATCTTATTRTCACTTTCTTCCTTTGCTCATD-LOOP150DY2FTTTCTTCCTTTACTCATTARCTATTTCATCTTATTCTGTCGTTD-LOOP135DY2FTACTAGTATATCGTTTARATTTTGTATATTTAGGTGD-LOOP225DY2FTCGTTTTATTGATTATTRAAAAAGTTGAAAGAGTA。2、根據(jù)權(quán)利要求1所述的一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，其特征在于，所述的微衛(wèi)星引物對(duì)應(yīng)的引物指標(biāo)參數(shù)見(jiàn)下表所<formula>formulaseeoriginaldocumentpage3</formula>3、根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一組基于三疣梭子蟹線粒體D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，其特征在于，它通過(guò)以下方法得到，先采集三疣梭子蟹提取基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的D-LOOP基因，將該基因電泳回D-LOOP目的片段，將該片段與載體進(jìn)行連接反應(yīng)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，進(jìn)行克隆后雙向測(cè)序；將測(cè)定序列通過(guò)正反向拼接后建立完整的D-LOOP基因序列，通過(guò)TRF程序來(lái)査找三疣梭子蟹的D-LOOP基因微衛(wèi)星位點(diǎn)并開(kāi)發(fā)得到微衛(wèi)星引物。全文摘要本發(fā)明是一組三疣梭子蟹D-LOOP基因的微衛(wèi)星引物，其特征在于，先采集三疣梭子蟹提取基因組DNA，通過(guò)PCR擴(kuò)增三疣梭子蟹的D-LOOP基因并進(jìn)行雙向測(cè)序，通過(guò)TRF程序來(lái)查找三疣梭子蟹的D-LOOP基因微衛(wèi)星位點(diǎn)并開(kāi)發(fā)出一組微衛(wèi)星引物。本發(fā)明篩選出的引物擴(kuò)增產(chǎn)物清晰、穩(wěn)定、多態(tài)性好，可應(yīng)用于三疣梭子蟹的種質(zhì)評(píng)價(jià)和種質(zhì)鑒定以及三疣梭子蟹的群體遺體多樣性評(píng)價(jià)，該方法具有快速、經(jīng)濟(jì)、準(zhǔn)確和操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)。文檔編號(hào)C12N15/11GK101519690SQ20091002906公開(kāi)日2009年9月2日申請(qǐng)日期2009年1月17日優(yōu)先權(quán)日2009年1月17日發(fā)明者孟學(xué)平,李曉英,程漢良,董志國(guó),閻斌倫申請(qǐng)人:淮海工學(xué)院