專利名稱：一種煙酰胺單核苷酸的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，特別涉及一種煙酰胺單核苷酸在制備抗腦卒或抗 缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
缺血性腦卒中的發(fā)病機制復(fù)雜，嚴(yán)重危害人類健康，因此，尋求理想的 腦卒中治療藥物一直是心腦血管醫(yī)藥領(lǐng)域研究的熱點之一。腦卒中治療藥物 中以溶栓劑、神經(jīng)保護(hù)劑為主。現(xiàn)有的腦卒中治療藥物的不足之處主要在于 治療時間窗短、安全性不夠、效果不夠確實。而且，絕大部分藥物是從降低 腦梗死發(fā)生后產(chǎn)生的損害因子方面考慮，從增強機體本身的保護(hù)因子方面考 慮的藥物很少。
煙醜胺單核昔酸(英文名nicotinamide mononucleotide, NMN)是體內(nèi) 存在的一種內(nèi)源性物質(zhì)，也可以通過體外化學(xué)合成。目前，對于煙酰胺單核 苷酸的研究極少，除了一篇在2007年的美國著名學(xué)術(shù)期刊《Cdl Metabolism》 上發(fā)表的論文(Revollo， JR et al. Nampt/PBEF/Visfatin Regulates Insulin Secretion in p Cells as a Systemic NAD Biosynthetic Enzyme. CW/ M"C"6o,/s附， 6 (5): 363-75 (2007))提到使用煙酰胺單核苷酸可以改善Nampt雜合子敲除小 鼠的胰島素分泌功能之外，沒有查詢到這種化合物在治療應(yīng)用中的其他用 途。在腦卒中研究領(lǐng)域中，亦沒有任何相關(guān)文獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明要解決的技術(shù)問題就是針對現(xiàn)有的抗腦卒中藥物存在的治 療時間窗短、安全性低、效果不夠確實的不足，提供一種煙酰胺單核苷酸的新用途和一種新的藥物組合物。
本發(fā)明人經(jīng)過大量試驗研究，驚喜地發(fā)現(xiàn)，煙酰胺單核苷酸具有抗腦卒 中和抗神經(jīng)元損傷(即保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞)的作用，經(jīng)過進(jìn)一步的仔細(xì)研究和 大量試驗，終于完成了本發(fā)明。
因此，本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之一是煙酰胺單核 苷酸在制備防治腦卒中的藥物或保健品中的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之二是煙酰胺單核苷酸在 制備抗神經(jīng)元細(xì)胞損傷的藥物或保健品中的應(yīng)用。
本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案之三是 一種藥物組合物， 其含有藥物活性成分煙酰胺單核苷酸和藥學(xué)上可接受的輔料。
根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語"腦卒中"是指腦血管疾病，俗稱中風(fēng)，通常分為缺 血性或出血性腦卒中，前者又包括腦梗死、腦栓塞以及短暫性腦缺血發(fā)作 (TIA，俗稱小中風(fēng))，后者則包括腦出血和蛛網(wǎng)膜下腔出血。而腦卒中均可 產(chǎn)生缺血缺氧導(dǎo)致的腦細(xì)胞特別是神經(jīng)元細(xì)胞的損傷，進(jìn)而出現(xiàn)相應(yīng)功能障 礙等臨床癥狀。
本發(fā)明的體外試驗顯示出煙酰胺單核苷酸具有抗缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng) 元細(xì)胞損傷而保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞的功效。而以缺血性腦卒中為例，體內(nèi)動物試 驗也證實了煙酰胺單核苷酸具有縮小腦梗死范圍、降低梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū) 的腦細(xì)胞凋亡/死亡數(shù)目，進(jìn)而治療腦梗死的作用。
本發(fā)明中，所述的煙酰胺單核苷酸是人體內(nèi)存在的一種內(nèi)源性物質(zhì)，也 可以人工合成，或者是直接市購的商品。煙酰胺單核苷酸的化學(xué)結(jié)構(gòu)式如 C I )所示<formula>formula see original document page 5</formula>( I )本發(fā)明中，所述的藥學(xué)上可接受的輔料是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物輔料， 其中，稀釋劑、賦形劑如水等；粘合劑如纖維素衍生物、明膠或聚乙烯吡咯 烷酮等；填充劑如淀粉等；崩裂劑如碳酸鈣或碳酸氫鈉；也可以在組合物中 加入其他輔助劑如香味劑和/或甜味劑。本發(fā)明中，所述的藥物組合物可采用醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的方法，將煙酰胺單 核苷酸作為活性成分，與藥學(xué)上可接受的輔料制成各種劑型。當(dāng)用于口服時， 可將其制備成常規(guī)的固體制劑如片劑、粉劑或膠囊劑等；用于注射時，可將 其制備成注射液。在各種制劑中，活性成分的重量含量為0.1% 99.9%，優(yōu) 選的重量含量為0.5 90%。本發(fā)明的藥物組合物可以用于抗腦卒中和抗缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì) 胞損傷。可以按劑型通過口服、腹腔注射、皮下注射、靜脈注射、肌肉注射、 淋巴結(jié)內(nèi)注射、粘膜用藥等途徑應(yīng)用于需要治療的個體。個體可以是人或動 物。劑量一般為1 1000mg/公斤體重/天，具體可根據(jù)個體的年齡、病情等 進(jìn)行變化。本發(fā)明除特別說明之外，所用的百分比都是質(zhì)量百分比。 本發(fā)明所用的原料或試劑均市售可得。相比于現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果如下本發(fā)明提供了一種新的藥物 組合物，其可以有效地防治腦卒中和保護(hù)神經(jīng)元細(xì)胞。這對腦卒中的醫(yī)治具 有重大意義。并且該藥物組合中的活性成分是煙酰胺單核苷酸，煙酰胺單核 苷酸本身是機體內(nèi)源性的保護(hù)物質(zhì)，從目前的資料來看不會產(chǎn)生副作用，因 此作為藥物的安全性很高，治療窗寬。


以下結(jié)合

本發(fā)明的特征和有益效果。圖1是給藥組和對照組大鼠腦梗死范圍檢測的照片。圖2是給藥組和對照組大鼠腦細(xì)胞凋亡/死亡檢測的照片。
具體實施方式
下面用實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但本發(fā)明并不受其限制。下列實施 例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，或按照制造廠商所建 議的條件。實施例1煙酰胺單核苷酸降低缺氧缺糖對神經(jīng)元細(xì)胞的損害制備缺氧缺糖神經(jīng)元細(xì)胞損傷模型，過程如下將胚鼠(Sprague-Dawley大鼠，上海斯萊克實驗動物有限公司)取出，分離大腦 皮層和海馬，消化后懸浮，再鋪板，經(jīng)過抑制神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞生長后，神經(jīng)元 細(xì)胞培養(yǎng)成功；然后改成HBSS無糖培養(yǎng)基，加入10 nM的FK866[英文名 為(E)-N畫[4畫(1畫benzoylpiperidine-4-yl)butyl] -3 -(pyridin-3 -yl)acrylamide ，暫無中 文名，化合物CAS號201034-75-5，此藥物從瑞士 Apoxis公司獲得]，放入 缺氧培養(yǎng)箱，使得氧含量低于0.5% (v/v)，在體外模擬腦缺血狀態(tài)，與此同 時給予300 的煙酰胺單核苷酸(購自Sigma-Aldrich公司，使用前用PBS 稀釋到300 )^Mol/L)。對照組給予PBS液。培養(yǎng)24小時后，分別采用三種 不同的方法評價煙酰胺單核苷酸對神經(jīng)元細(xì)胞的保護(hù)作用，每種方法重復(fù)6 次。結(jié)果表明，煙酰胺單核苷酸可以防止缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元數(shù)目減少(表 1);煙酰胺單核苷酸可以防止缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞活力降低(表2); 煙酰胺單核苷酸可以防止缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放(表 3)。這些結(jié)果說明，煙酰胺單核苷酸具有神經(jīng)保護(hù)作用，可以降低缺氧缺糖 對離體培養(yǎng)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。表l.煙酰胺單核苷酸防止缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元數(shù)目減4對照組(n=6)給藥組(n=6)神經(jīng)元數(shù)目10.0±1.117.5±1.4 ****表示給藥組和對照組相比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。注神經(jīng)元數(shù)目使用MAP-2免疫熒光法測定。數(shù)目越多，表明神經(jīng)元 細(xì)胞存活得越多。MAP-2免疫熒光法測定法可參見文獻(xiàn)Shyu WC, et al. Secretoneurin promotes neuroprotection and neuronal plasticity via the Jak2/Stat3 pathway in murine models of stroke. / C7/". /wveW. 118:133 — 148 (2008)表2.煙酰胺單核苷酸防止缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞活力降低對照組(n=8)給藥組(n=8)神經(jīng)元細(xì)胞活力0.486±0.0530.594±0.104****表示給藥組和對照組相比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(戶<0.01)。 注神經(jīng)元細(xì)胞活力使用CCK-8法測定。數(shù)字越高，表明神經(jīng)元細(xì)胞的活力越高。CCK-8試劑盒購置于日本Dojindo公司，實驗步驟均按照其試劑盒說明書實施。表3.煙酰胺單核苷酸防止缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞乳酸脫氫酶釋放對照組(n=8)給藥組(n=8)乳酸脫氫酶釋放量10.57±0.806.27±0.81****表示給藥組和對照組相比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(戶<0.01)。注乳酸脫氫酶釋放使用乳酸脫氫酶釋放量試劑盒測定。數(shù)字越低，表 面細(xì)胞膜的完整度越高，神經(jīng)元細(xì)胞存活更多。酸脫氫酶釋放量試劑盒購置 于美國Promega公司，實驗步驟均按照其試劑盒說明書實施。中用大鼠(Sprague-Dawley大鼠，體重250g左右，上海斯萊克實驗動物 有限公司)制備局灶性缺血性腦卒中模型，過程如下預(yù)先給予大鼠3天腹 腔注射 (4mg/kg/12 小時 )FK866[英文名為 (E) -N-[4-(l-benzoylpiperidine-4-yl)butyl]-3-(pyridin-3-yl)acrylamide，暫無中文名， 化合物CAS號201034-75-5，此藥物從瑞士 Apoxis公司獲得]注射后，將大 鼠麻醉，分離一側(cè)頸總動脈、頸內(nèi)動脈和頸外動脈，讓尼龍線通過頸內(nèi)動脈 進(jìn)入大腦中動脈，堵塞2小時后，將線拔出，即成功制備大鼠大腦中動脈堵 塞導(dǎo)致的局灶性缺血性腦卒中模型。在大腦中動脈堵塞后30分鐘通過腦立 體定位系統(tǒng)(美國ASI-Instruments公司)，向側(cè)腦室內(nèi)注射給藥，給予濃度 為10mg/ml的煙酰胺單核苷酸2 W。對照組給予生理鹽水。大腦中動脈堵塞 后24小時，檢測腦梗死范圍和腦細(xì)胞凋亡/死亡數(shù)目。腦梗死范圍檢測采用 2，3，5-氯化三苯基四氮唑(購自Amersco公司)染色法，即TTC染色法；腦 細(xì)胞凋亡/死亡數(shù)目檢測采用熒光末端轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記試劑盒(熒光TUNEL法， 試劑盒購自美國Promega公司)檢測細(xì)胞凋亡。重復(fù)8次實驗。8次重復(fù)實 驗結(jié)果顯示，煙酰胺單核苷酸明顯縮小腦梗死范圍(表4)。并且，8次重復(fù) 實驗結(jié)果也顯示煙酰胺單核苷酸明顯降低梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)的腦細(xì)胞凋 亡/死亡數(shù)目(表5)。腦梗死范圍檢測的照片見圖1，腦細(xì)胞凋亡/死亡檢測 的照片見圖2。表4.煙酰胺單核苷酸明顯縮小腦梗死范圍對照組(n=8)給藥組(n=8)腦梗死范圍占全腦的百分比28.9 ±5.4%21.4士1.8% **(均值士標(biāo)準(zhǔn)差)**表示給藥組和對照組相比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(尸<0.01)。表5.煙酰胺單核苷酸明顯降低梗死區(qū)和梗死邊緣區(qū)的腦細(xì)胞凋亡/死亡數(shù)目對照組(n=8)給藥組(n=8)梗死區(qū)凋亡/死亡細(xì)胞數(shù)目173.7±15.5115.4±11.3 **(顯微鏡下每個視野)梗死邊緣區(qū)凋亡/死亡細(xì)胞數(shù) 目(顯微鏡下每個視野)113.9±9.350.5±4.5 ****表示給藥組和對照組相比較，有顯著的統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01)。注梗死區(qū)表示梗死的腦組織的中心區(qū)域，梗死邊緣區(qū)表示梗死的腦組 織和正常腦組織中間的區(qū)域。這兩個區(qū)域都是腦梗死時的受損區(qū)域。
權(quán)利要求
1、煙酰胺單核苷酸在制備防治腦卒中的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
2、 如權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的腦卒中為缺血性腦卒中。
3、 煙酰胺單核苷酸在制備抗神經(jīng)元細(xì)胞損傷的藥物或保健食品中的應(yīng)用。
4、 如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述的神經(jīng)元細(xì)胞損傷為缺 氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷。
5、 一種藥物組合物，其特征在于，其含有藥物活性成分煙酰胺單核苷 酸和藥學(xué)上可接受的輔料。
全文摘要
本發(fā)明公開了煙酰胺單核苷酸在制備抗腦卒中或抗缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷藥物或保健食品中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了一種新的藥物組合物，其可以有效的抗腦卒中和抗缺氧缺糖導(dǎo)致的神經(jīng)元細(xì)胞損傷，這對腦卒中的醫(yī)治具有重大意義。并且該藥物組合物中的活性成分是煙酰胺單核苷酸，煙酰胺單核苷酸本身是機體內(nèi)源性的保護(hù)物質(zhì)，從目前的資料來看不會產(chǎn)生副作用，因此作為藥物的安全性很高，治療時間窗寬。
文檔編號A23L1/30GK101601679SQ20091004767
公開日2009年12月16日 申請日期2009年3月17日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月17日
發(fā)明者張偌瑜, 徐學(xué)文, 徐添穎, 培 王, 田薇薇, 管云楓, 繆朝玉 申請人:中國人民解放軍第二軍醫(yī)大學(xué)