專利名稱：一種利用rna恒溫擴增的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及體外診斷試劑技術領域，具體涉及一種利用磁珠-RNA富集技術提取純化耙標 RNA及恒溫核酸同步放大檢測技術(SAT)對沙眼衣原體(CT)進行檢測的試劑盒。
背景技術：
沙眼衣原體(C7!/amj^'"rrac/iomato,CT)是一種在人體內長期生存并又廣泛傳播的病原 體，大小約250 450nm。由其引起的疾病范圍廣泛，可累及眼、生殖道和其他臟器，可引起 男性尿道炎、附睪炎，女性宮頸炎、盆腔炎等，尤其是與淋球菌等其他病原體合并感染時更 加重疾病的發(fā)展及引起其它并發(fā)癥，也可導致母嬰傳播。因而，沙眼衣原體感染的防治具有 十分重要的公共衛(wèi)生意義。在臨床上，70%~80%的女性和多達50%的男性常表現(xiàn)為無臨床癥 狀的感染，所以實驗室診斷具有重要作用。沙眼衣原體的檢測目前有三類方法細胞生物學 檢測方法；免疫學檢測方法和分子生物學方法。
細胞生物學檢測方法包括顯微鏡檢査和細胞分離培養(yǎng)。顯微鏡檢查可發(fā)現(xiàn)沙眼衣原體包 涵體，因敏感性過低在臨床上不推薦使用，僅限于CT鑒定。培養(yǎng)法的特異性為100%，但敏感 性低，且各個實驗室操作步驟有所不同，沒有標準化。目前組織細胞培養(yǎng)法是診斷CT感染的 "金標準"，但是由于分離培養(yǎng)操作復雜，技術及設備要求高，所需時間長，且敏感性受標本 采集、運送、保存等的影響較大，加上國內很多醫(yī)院不具備細胞培養(yǎng)條件，因而不適于臨床 應用，多用于科研和疑難病例的終鑒定。
免疫學檢測方法包括直接免疫熒光法、膠體金法和酶聯(lián)免疫吸附試驗等。直接熒光抗體 測定(DFA)將針對CT的單克隆抗體用熒光標記，與標本中的CT結合后，熒光顯微鏡檢査 就能見到發(fā)熒光的原體(Ebs)，其敏感性受人群感染率的影響，且有判定結果帶有主觀性， 熒光易淬滅，不適于檢測大量標本。由于此法操作簡便、費用低廉、特異性較高，在不具備 分子生物學試驗條件的醫(yī)院，可用以檢測臨床標本，但需經驗豐富者操作。酶聯(lián)免疫吸附試 驗(EIA)用酶標記的單克隆或多克隆抗體檢測CT的脂多糖(LPS)或外膜蛋白(MOMP)， 酶反應生成有色產物，用酶標儀進行測定，其敏感性從64%到98%，特異性從93%到98%。 通常認為，其敏感性在高危人群中可得到滿意結果，而在新近感染及治療監(jiān)測中敏感性明顯 下降。膠體金法將酶與單克隆抗體用交聯(lián)劑結合起來，形成酶標抗體，檢測標本中有無CT 抗原，如有CT抗原，則與酶標抗體發(fā)生特異性反應，加入酶的底物，底物被酶催化生成可 溶性或不溶性產物，即為陽性?？捎萌庋刍蚍止夤舛扔嫸ㄐ曰蚨浚琁O分鐘可出報告。其最 大缺點在于，與其他常見微生物產生交叉反應，如金黃色葡萄球菌、A群及B群鏈球菌、淋病奈瑟菌等，從而使特異性不高。
分子生物學方法包括直接檢測核酸的技術(即基因探針技術)、PCR法、連接鏈式反應 (LCR)、鏈置換擴增技術(SDA法)、依賴核酸序列的擴增技術(NASBA法)、轉錄介導的 擴增(TMA法)，此類方法對于診斷泌尿生殖道沙眼衣原體感染敏感性和特異性均達90% 100%。'
最新發(fā)展的擴增是Gen-Probe公司的擴增CT的轉錄介導擴增法(TMA)，擴增并檢測 CT的rRNA。核酸擴增使用M-MLV反轉錄酶和T7 RNA多聚酶來同時實現(xiàn)，采用化學發(fā)光 法進行終點檢測。有學者報道TMA檢測女性尿標本的敏感性和特異性分別為93.8%和100%， 男性尿標本為95.6%和98.7%，提示TMA將成為另外一種能利用尿標本檢測CT的擴增方法， 但該方法使用的終點化學發(fā)光檢測，在污染控制上稍顯不足。
本公司已申請了專利核酸恒溫同步放大檢測方法(Simultaneous Amplification and Testing, SAT)(申請?zhí)?00810111479.0)以及利用磁珠-RNA富集技術提取純化靶標RNA的方法(申 請?zhí)?00810111478.6);在此兩項技術的基礎上，本發(fā)明沙眼衣原體核酸檢測試劑盒采用 的是SAT技術，核酸擴增使用M-MLV反轉錄酶和T7 RNA多聚酶來同時實現(xiàn)，反轉錄酶用 于產生靶標核酸(RNA)的一個DNA拷貝，T7 RNA多聚酶從DNA拷貝上產生多個RNA 拷貝，帶有熒光標記的優(yōu)化探針和擴增后產生的RNA拷貝特異結合，從而產生熒光，該熒光 信號可由檢測儀器捕獲。該試劑盒能夠檢測拭子和尿樣中的CTrRNA，具有特異性高、靈敏 度高和污染低(擴增產物RNA在自然環(huán)境下易于降解)的特點。

發(fā)明內容
本發(fā)明所要解決的技術問題是克服現(xiàn)有技術特異性、靈敏性不高，實驗污染不易控制的 缺點，提供一種利用磁珠-RNA富集技術提取純化靶標RNA及恒溫核酸同步放大檢測技術 (SAT)對沙眼衣原體(CT)進行檢測的試劑盒。
本發(fā)明所提供的沙眼衣原體檢測的試劑盒，包括下列組成
(1) 尿樣保存液為裂解和保存尿液或生殖道拭子洗滌液標本中沙眼衣原體(CT)RNA 的表面活性劑和HEPES緩沖液；
(2) 核酸提取液為oligodT包被的磁珠和特異性結合靶標核酸(CTRNA)的一段RNA 序列；
(3) 洗滌液為含SDS、 NaCl和乙醇的溶液；
(4) CT反應液為dNTPs和NTPs等擴增所需組份；
(5) CT檢測液為恒溫擴增時必需的引物和熒光探針，序列選自CT23s rRNA基因的
5保守區(qū)；
(6) SAT酶液為恒溫擴增時必需的多酶組分體系，含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反 轉錄酶及穩(wěn)定劑；
(7) CT陽性對照；為含CT23srRNA基因的體外轉錄RNA稀釋物；
(8) CT陰性對照為不含任何核酸的尿樣保存液及生理鹽水。 尿樣保存液主要有效成分是硫酸銨和去垢劑，高濃度去垢劑的存在能夠使RNase迅速失
活，有效保存RNA。另外，尿樣保存液中高濃度鹽離子及去垢劑的存在，通過蛋白質變性使 菌體細胞破裂，靶標RNA得到了釋放，樣本放在該保存液中，延長了樣本的保存時間，RNA 從細胞中釋放出來。
核酸提取液是利用了磁珠分離法進行核酸提取，其主要成分為磁性顆粒和捕獲探針。在 核酸提取過程中，細菌裂解釋放出的核酸與核酸提取液中的磁性顆粒特異結合，在不需要傳 統(tǒng)的離心操作的情況下，通過清洗磁性顆粒而獲得純凈的細菌靶標核酸(RNA)。病原體rRNA 的提取通過特異性吸附原理來實現(xiàn)。
核酸提取液中含有的標本提取捕獲探針，包含有以下一種或幾種序列序列見序列表 SEQ.ID.N01-5。
SAT酶液中所含的T7 RNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶，其穩(wěn)定性直接決定了擴增反應 的擴增效率和試劑盒的使用有效期。該SAT酶液中加有穩(wěn)定劑，經長期穩(wěn)定性試驗，穩(wěn)定性 可達10個月，保證了試劑盒有效期達6個月。
CT檢測液中CT熒光探針為分子信標，是一類高特異性、高敏感性的分子探針，由兩端
分別共價標記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈發(fā)夾型或莖環(huán)結構，分子信標的 環(huán)部分和耙標互補，兩頭由于互補而成為莖，分子信標探針與線性的TaqMan探針相比，因 其發(fā)夾結構的打開需要一定的力，因而特異性要好于線性探針。CT檢測液中CT引物，依照 SAT擴增的原理設計了 5'端帶有T7啟動子序列尾巴的下游引物和特異的上游引物，下游引 物特異序列與靶標完全互補，上游引物與靶標完全一致，保證了本試劑盒可準確進行CT檢 測的SAT反應。
CT檢測液中的引物包含有以下一對或幾對序列
CTT7:序列見序列表SEQ.ID.NO6-10;
CTnT7:序列見序列表SEQ.ID.N011-15。
CT檢測液中的探針包含有以下一種或幾種序列
CT probe:序列見序列表SEQ.ID.N016-20。
由于SAT擴增易受多種因素影響而使擴增失敗，使試劑盒使用人員判斷失誤得出錯誤的結論，本發(fā)明的試劑盒中的CT陽性對照和CT陰性對照，均含有本試劑盒已述及的尿樣保存 液及生理鹽水，其中CT陽性對照還含有CT RNA，是沙眼衣原體23srRNA體外轉錄產物的 稀釋物，定值約為107COpieS/ml。使用本試劑盒時，每次應同時做平行對照的質量控制，且結 果應同時滿足陽性對照dt《35，陰性對照dt無數(shù)值或為40，否則此次實驗視為無效。(dt表 示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(shù)，與一般實時熒光PCR實驗結果的ct值類似。)
CT陽性對照中的體外轉錄的CTRNA，可以通過多種方法制備所得，其中一種制備方法 如下
(1) 用化學合成法合成CT23srRNA基因的靶標片段，長度約500bp;
(2) 將片段克隆到pGEMb-T載體中，構建CT陽性對照質粒；
(3) CT陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5 a中，命名為pGEMb-T-CTl菌株，貯存于 -70 °C;
(4) 純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
CT陽性對照含有長約500bp的CT 23s rRNA基因序列，序列見序列表SEQ.ID.N021 。 本發(fā)明的檢測試劑盒檢測CTRNA的分析靈敏度為1(^copies/反應(沙眼衣原體1個菌內 約含3.2Xl(^個rRNA)，該靈敏度遠遠高于目前國內上市的同類產品，故本發(fā)明的檢測試劑 盒特異性高、靈敏度高，且擴增產物RNA在自然環(huán)境下易于降解而污染低。本發(fā)明試劑盒可 用于尿液標本的檢測，這種非侵入性采樣方式受到病人的歡迎。


圖l.實施例4本發(fā)明試劑盒檢測病人拭子標本的擴增圖； 圖2.實施例5本發(fā)明試劑盒檢測病人尿液標本的擴增圖。
具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不 用于限制本發(fā)明的范圍。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內容之后，本領域技術人員可 以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
實施例1 CT核酸RNA的提取
核酸提取具體步驟為
在樣品處理管(1.5 ml離心管)中加入100iU核酸提取液，加入400 " 1尿樣或者拭子洗 液，每加一個樣本換一個吸頭，渦旋混勻；60°C保溫5分鐘；室溫放置10分鐘；將樣品處理管置于磁珠分離裝置上，靜置5分鐘(如果在磁珠吸附過程中有個別磁珠難
以吸附至管壁則應適當延長吸附時間)；
待磁珠吸附于管壁后，保持樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠； 用洗滌液(洗滌液如果有白色絮狀沉淀物，用之前應先42r加熱，直至澄清)洗滌兩次，
每次加入lml洗滌液后取下樣品處理管震蕩30秒后置磁珠分離裝置上，靜置5分鐘；保持
樣品處理管于磁珠分離裝置上，吸棄液體，保留磁珠；
將樣品處理管移離磁珠分離裝置，管中的磁珠-核酸復合物備用(此步應清晰可見磁珠) 向每個樣品處理管中加入40ul擴增檢測液(40tUCT反應液+2.5ylCT檢測液)洗滌磁珠。
實施例2 SAT核酸擴增檢測
從震蕩混勻后的上述擴增檢測液中取30yl擴增檢測液(包含磁珠)至潔凈微量反應管， 6(TC保溫10分鐘，42'C保溫5分鐘；同時將SAT酶液也預熱到42°C;
向微量反應管中加入10"1已預熱的酶液(加樣tip頭不要接觸微量反應管，如有接觸請 務必更換tip頭)，加酶后蓋上管蓋1200rpm震蕩15秒鐘混勻；
將微量反應管快速轉至合適的恒溫熒光檢測儀器，42°C反應40分鐘，設定每l分鐘檢 測一次熒光，共檢測40次；
反應結束后，直接將微量反應管取出浸泡于10% 84消毒液中，取微量反應管應小心操作， 嚴禁打開反應管(防止污染反應區(qū))！實驗結束后用10°/。84消毒液清潔工作區(qū)及用具，最后 用清水擦拭干凈。
參考值
1. 闡值設定以閾值線剛好超過正常陰性對照擴增曲線的最高點。
2. dt《35的樣本為陽性；
3. 35<dt<40的樣本建議重新檢測，檢測結果dt〈40的樣本為陽性；
4. dt無數(shù)值或為40的樣本為陰性。
注dt表示樣本曲線與閾值線交點的橫坐標讀數(shù)(與一般實時熒光PCR實驗結果的ct 值類似)
質量控制每次檢測均設置陽性對照和陰性對照，且結果應同時滿足陽性對照dt《35， 陰性對照dt無數(shù)值或為40，否則此次實驗視為無效。
實施例3CT試劑盒各組份的配制和組裝 試劑盒分為2 30。C儲存的A盒(標本處理單元)和-15 -35'C儲存的B盒(核酸擴增檢
測單元)。
8A盒(標本處理單元)組成為 尿樣保存液O.IM硫酸銨；0.15MHEPES;
核酸提取液0.15uM捕獲探針和磁性顆粒250mg/L; 洗滌液 0.1%SDS。
B盒(核酸擴增檢測單元)組成為
CT反應液4mM dNTPs和16mM NTPs; SAT酶液 M-MLV2000U; T7 RNA聚合酶500 U; CT檢測液主要含3.5uMCT特異引物、2.7uM特異熒光探針； CT陽性對照主要含107copies/ml CT RNA;
CT陰性對照不含任何核酸，用于檢驗操作過程及試劑的有效性。
實施例4 應用模式之臨床樣本尿液的檢測 本檢測模式為本發(fā)明的最佳體現(xiàn)試劑的制備同實施例3，試劑的生產在GMP車間進行, 沙眼衣原體尿液臨床樣本為上海皮膚病性病醫(yī)院提供的臨床實驗樣品，編號為CT尿液標本 1 8，另設陰性對照、陽性對照各一個。標本的核酸提取同實施例1， SAT擴增檢測及判定 同實施例2，所使用的熒光PCR儀為Bio-RadiQ5。結果見附圖l，與金標準培養(yǎng)法檢測結果 完全相同。
實施例5 應用模式之臨床樣本拭子的檢測 本檢測模式為本發(fā)明的另一個應用試劑的制備同實施例3，試劑的生產在GMP車間進 行，沙眼衣原體拭子臨床樣本為上海皮膚病性病醫(yī)院提供的臨床實驗樣品，編號為CT拭子 標本1 8 (與尿液標本編號為一一對應)，另設陰性對照、陽性對照各一個。標本的核酸提 取同實施例l， SAT擴增檢測及判定同實施例2，所使用的熒光PCR儀為Bio-RadiQ5。結果 見附圖2，與金標準培養(yǎng)法檢測結果完全相同，與實施例4結果也完全一致。
根據(jù)本發(fā)明的公開內容，本領域的熟練技術人員無須過多實驗即可對本發(fā)明所要求保護 的沙眼衣原體(CT)核酸檢測試劑盒(RNA恒溫擴增)進行實施，并達到預期效果。本發(fā)明公 開的實施例僅是對本發(fā)明進行詳細描述，但并不是構成對本發(fā)明限制。本領域的熟練技術人 員用顯而易見的相似替代物或改造，或用某些在化學上或生物上結構功能相關的制劑替代在 此描述的制劑，或對本發(fā)明相關內容進行變動，但不超出本發(fā)明的精神、范圍和思想，均落 入本發(fā)明要求保護的范圍。
權利要求
1. 一種利用RNA恒溫擴增的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于包括下列組成(1)尿樣保存液為裂解和保存尿液或生殖道拭子洗滌液標本中沙眼衣原體(CT)RNA的表面活性劑和HEPES緩沖液；(2)核酸提取液為oligodT包被的磁珠和特異性結合靶標核酸(CT RNA)的一段RNA序列；(3)洗滌液為含SDS、NaCl和乙醇的溶液；(4)CT反應液為dNTPs和NTPs等擴增所需組份；(5)CT檢測液為恒溫擴增時必需的引物和熒光探針，序列選自CT 23s rRNA基因的保守區(qū)；(6)SAT酶液為恒溫擴增時必需的多酶組分體系，含T7 RNA聚合酶、M-MLV反轉錄酶及穩(wěn)定劑；(7)CT陽性對照；為含CT 23s rRNA基因的體外轉錄RNA稀釋物；(8)CT陰性對照為不含任何核酸的尿樣保存液及生理鹽水。
2. 根據(jù)權利要求l所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的尿樣保存液含 有硫酸銨和去垢劑。
3. 根據(jù)權利要求l所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的核酸提取液是利用磁珠分離法進行核酸提取，含有磁性顆粒和捕獲探針。
4. 根據(jù)權利要求3所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的捕獲探針包含有以下一種或幾種序列序列見序列表SEQ.ID.N01-5。
5. 根據(jù)權利要求l所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的CT檢測液中CT 熒光探針為分子信標，由兩端分別共價標記有熒光染料和淬滅劑的單鏈核酸分子組成，呈 發(fā)夾型或莖環(huán)結構，分子信標的環(huán)部分和靶標互補，兩頭由于互補而成為莖。
6. 根據(jù)權利要求5所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的CT檢測液中 的探針包含有以下一種或幾種序列CTprobe:序列見序列表SEQ.ID.NO16-20。
7. 根據(jù)權利要求1所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的CT檢測液中 CT引物為5'端帶有T7啟動子序列尾巴的下游引物和特異的上游引物，下游引物特異序 列與靶標完全互補，上游引物序列與靶標完全一致。
8. 根據(jù)權利要求7所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的CT檢測液中 的引物包含有以下 一對或幾對序列CTT7:序列見序列表SEQ.ID.NO6-10;CTnT7:序列見序列表SEQ.ID.N011-15。
9. 根據(jù)權利要求1所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的CT陽性對照 中體外轉錄的CTRNA，制備方法包括下列步驟(1) 用化學合成法合成CT23srRNA基因的靶標片段，長度約500bp;(2) 將片段克隆到pGEMb-T載體中，構建CT陽性對照質粒；(3) CT陽性對照質粒轉化到大腸桿菌DH5a中，命名為pGEMb-T-CTl菌株，貯 存于-7(TC;(4) 純化去除DNA，并定量、鑒定RNA。
10. 根據(jù)權利要求1或9所述的沙眼衣原體核酸檢測試劑盒，其特征在于所述的CT陽 性對照含有長521bp的CT23s rRNA基因序列，序列見序列表SEQ.ID.N021 。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種利用磁珠-RNA富集技術提取純化靶標RNA及恒溫核酸同步放大檢測技術(SAT)對沙眼衣原體(CT)進行檢測的試劑盒，包含尿樣保存液、核酸提取液、洗滌液、CT反應液、CT檢測液、SAT酶液、CT陽性對照、CT陰性對照。本發(fā)明的檢測試劑盒特異性高、靈敏度高，且擴增產物RNA在自然環(huán)境下易于降解而污染低。
文檔編號C12Q1/68GK101509041SQ20091004790
公開日2009年8月19日 申請日期2009年3月20日 優(yōu)先權日2009年3月20日
發(fā)明者于明輝, 居金良, 張常娥, 亮 方, 敏 王 申請人:上海仁度生物科技有限公司