專利名稱：實時熒光定量檢測肺炎衣原體的方法及試劑盒的制作方法
實時熒光定量檢鑭肺炎衣原體的方法及試擁盒技術領域本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中肺炎、支氣管哮喘等疾病中的病原體肺炎衣原體(CP)存在 的方法及試劑盒，特別是涉及以實時熒光定量聚合酶鏈反應技術早期診斷CP感染以及診斷CP持續(xù)感染或反復感染的方法及所使用的試劑盒。 背聚技術肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae, CP)是1989年定名的衣原體屬中的一個新種，是 一種專性真核細胞內寄生物。CP廣泛分布于世界各地，是兒童和成人急性及慢性呼吸道感染 的常見病原體，不僅可引起咽炎、鼻竇炎、中耳炎以及下呼吸道感染如急性支氣管炎和肺炎(臨床表現以肺炎為主)，而且與支氣管哮喘、慢性阻塞性肺疾病(COPD)、結節(jié)病、心血 管疾病的發(fā)病有密切關系。由于CP感染沒有典型的臨床表現，診斷主要依靠實驗室，常規(guī)方法有病原體分離培養(yǎng)、 直接檢出和血清學實驗。(1) CP分離培養(yǎng)方法復雜，費時，而且敏感性不高，難于培養(yǎng)，一 般不用于臨床診斷。(2)病原體的直接檢出主要有免疫熒光試驗和酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)，采用熒光標記或酶標記抗體檢測標本中的衣原體，前者主要用于細胞培養(yǎng)中CP的 識別，但靈敏度差；后者所用抗體為抗衣原體屬特異性抗體，不能直接識別CP。均不適用于 臨床檢測。(3)檢測CP最常用的血清學方法是微量免疫熒光抗體檢測法(MIF)，被公認為CP 感染血清學診斷的金標準。人類感染CP后會出現抗CP血清抗體，初次感染時,大約在發(fā)病3周 后出現IgM抗體，6-8周出現IgG抗體。由于病原體從進入機體進行復制和抗原刺激到產生抗體 需要一段較長的窗口期(初次感染一般需要3周)，時間跨度長，不能滿足早期病原體確診的 需要，不利于病人的早期診斷和治療。近年來，國內外對于CP感染機理和致病機制有深入了解，血清流行病學調查證實約50% 的健康成人血清中肺炎衣原體IgG抗體陽性,而在呼吸道感染患者中陽性率更高。肺炎衣原體 感染在人群中非常普遍，提示一方面可能人類易反復感染，另一方面可能與人體內存在持續(xù)感 染有關。Maozed等發(fā)現(Moazed TC ，Kuo CC ,Grayston JT," a, .Evidence of systemic dissemination of C7z/函-"戸ew附om'fle via macrophages in the mouse[J] J Infect Dis ,1998 ，177(6):1322-1325.)，肺炎衣原體可以隱藏在血內單核細胞中，故機體感染肺炎衣原體后，可通過單核巨噬系統(tǒng)在體內播散，導致持續(xù)感染。血清學檢測是目前最常用的檢査方法，但在診斷肺炎衣原體 持續(xù)感染上的作用有限，需要測定比較前期和感染期血清抗體滴度，只能做回顧性診斷,不能有效確診CP感染。因此,需要有一種方法來診斷肺炎衣原體持續(xù)感染。目前國內外有部分實驗 室采用聚合酶鏈反應(PCR)擴增靶核酸來檢測外周血單核細胞(PBMC)中的CP，由于需要 對PCR產物進行電泳或雜交分析等后處理，極易造成PCR產物污染，導致假陽性，不宜用于 臨床診斷；但提示，PBMC中的肺炎衣原體DNA可作為持續(xù)感染的標志。實時熒光PCR技術是近年來發(fā)展迅速的一種核酸檢測技術，使用一種帶有核電偶聯(lián)裝置 (CCD)的PCR擴增儀，通過檢測熒光信號的動態(tài)變化實時反映PCR的每個循環(huán)的擴增水平。 CCD能夠按照一定的程序周期性地發(fā)出特定波長的激發(fā)光，收集檢測熒光信號，并通過軟件 分析匯總到工作站得到擴增曲線。TaqMan PCR技術是實時熒光PCR的一種(Mackay IM W a/. Real-time PCR in virology. Nucleic Acids Res. 2002 5;30(6):1292-1305; Lie, Y.S.， Petropoulos, C丄,Advances in quantitative PCR technology: 5' nuclease assays. Current Opinion in Biotechnology 1998. 9, 43~48.)。與傳統(tǒng)的PCR相對比，其在反應體系中增加了一條兩端分別 標記熒光報告基團和淬滅基團的探針。探針結構完整時，熒光報告基團發(fā)出熒光的能量轉移 給淬滅基團，呈現淬滅效應。如果擴增過程中有靶序列的存在，擴增的過程中探針分子逐漸 被水解切斷，熒光報告基團與淬滅基團相互解離，阻斷了二者間熒光共振能量轉移效應，熒 光報告基團發(fā)出熒光信號。隨著擴增的進行，熒光信號隨著目的片段的擴增而呈現線性增強。與普通PCR相比，TaqMan PCR技術具有如下優(yōu)點通過對擴增曲線以及對數增長期的 循環(huán)閾值(Ct)的分析，擯棄普通PCR方法受多種因素干擾的終點分析方法，能夠對檢測樣 品進行準確定量分析，從而有效監(jiān)測藥物治療的效果；將DNA擴增與檢測過程融合為一體， 可以實時、動態(tài)監(jiān)測DNA擴增的全過程，省掉了PCR后處理過程大大縮短了結果分析時間，使得該方法更加快捷、方便；由于采取一種封閉的檢測模式，從而減少了氣溶膠污染和由此 造成的假陽性；由于在普通PCR基礎上增加了一條可與模板互補配對的熒光探針，進一步提 高了檢測靶多核苷酸的特異性。因此，該技術在靶多核苷酸樣品的檢測和定量分析中，已逐 漸取代傳統(tǒng)的PCR方法，得到十分廣泛的應用。美國食品與藥品管理局(FDA)己經批準了一些定量檢測病原體的PCR診斷試劑盒，如 用于HIV、結核分枝桿菌、沙眼衣原體等的實時熒光PCR檢測的試劑盒。同樣，中國目前也 已批準了乙型肝炎、丙型肝炎、HIV和SARS等的實時熒光PCR檢測試劑盒的生產和臨床應用。 因此，現在需要發(fā)展一種能夠檢測CP的實時熒光PCR方法，滿足CP的檢測與監(jiān)測工作的需要。眾所周知，在使用已知的實時熒光定量PCR技術檢測和定量分析臨床樣品中某特定耙核酸的實踐中，為了減少和避免檢測結果的假陰性或假陽性，提高定量分析的準確性， 一個關 鍵性的基本技術環(huán)節(jié)是如何基于已知的靶多核苷酸序列設計并制備適當的引物和寡核苷酸探針。本發(fā)明人在以往多年從事PCR技術特別是實時熒光定量PCR技術研究的基礎上，將該技 術應用于肺炎衣原體的所有已知變異體之基因組多核苷酸的檢測和定量分析，成功地完成了 本發(fā)明。發(fā)明內容本發(fā)明的一個目的是提供一種使用實時熒光PCR技術實時定性與定量檢測樣品中CP的方 法，特別是涉及在CP感染的早期和反復感染期實驗室診斷中的應用?；驹硎抢靡粚Π?多核苷酸的特異性引物和一條靶多聚核苷酸的特異性探針，在耐熱DNA聚合酶、高質量的脫 氧核糖核苷三磷酸(dNTPs)以及Mg^等PCR反應緩沖液中，通過DA7600、 ABI 7000等熒光 PCR擴增儀實現靶多核苷酸的循環(huán)擴增，從而達到快速、實時、定量檢測靶多核苷酸的目的。 本發(fā)明提供的實時熒光定量PCR技術定性與定量檢測臨床樣品中CP存在的方法包括(1)提供包括(a)待檢樣品，(b)耐熱DNA聚合酶和(c) 2，-脫氧核苷三磷酸(dNTP)的 擴增反應體系，以及包括(a)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第一條互補鏈結合的正向引物，(b)能夠與待檢雙鏈靶多核苷酸的第二條互補鏈結合的反向引物，以及(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的任一條鏈結合并且兩末端分別標記有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針的熒光檢測體系；(2)通過一次或多次聚合酶鏈反應擴增所說的靶多核苷酸；(3)退火后使所說的熒光發(fā)生基團通過探針與靶多核苷酸結合并產生熒光信號；(4)檢測并確定熒光發(fā)生基團所產生的熒光量；(5)分析一次或多次擴增循環(huán)所發(fā)出的熒光量，以檢測靶多核苷酸的存在；特征在于其中所說的靶多核苷酸是CP基因組多核苷酸，所使用的正向和反向寡核苷酸引物分別是CP—F: 5，- get act gga aca aag tct gcg a -3， (SEQ ID NO: l)和CP—R: 5，隱cat tgt actccaatgtatggcacta-3，(SEQIDN0: 2)，以及由正向引物CP—F向5，端方向延伸5個堿基、向3，端方向延伸5個堿基范圍內得到的引物序列或能與這段范圍內的序列可以雜交的引物序列；以及由反向引物CP—R向5'端方向延伸5個堿基、向3'端方向延伸5個堿基范圍內所得到的引物序列或能與這段范圍內的序列可以雜交的引物序列；并且所使用的寡核苷酸探針是CP—P: 5'-tta tea tga atg gca agt agg age etc tct ate tt -3， (SEQ ID NO: 3)，特征在于所使用的寡核苷酸探針序列包括寡核苷酸探針CP—P: 5，- tta tea tga atg gca agt agg age etc tct ate tt -3， (SEQ ID NO:3)，以及由寡核苷酸探針CP—P向5'端方向延伸5個堿基、向3'端方向延伸5個堿基范圍內得到的探針序列或能與這段范圍內的序列可以雜交的探針序列。與基于擴增反應完成后進行單一終點檢測的傳統(tǒng)PCR方法不同，實時定量聚合酶鏈反應方法可以在擴增反應的進程中實時監(jiān)測擴增產物的產生，從而大大提高了定量檢測的準確性和精密度。如眾所周知，實時熒光定量PCR是在PCR擴增中，同時加入引物和5'、 3'末端分別 標記有熒光報告基團(例如6-FAMamidite羧基熒光素6)和熒光淬滅基團(例如6-羧基四甲基 若丹明)的特異性寡核苷酸探針。如果探針沒有與靶序列互補結合，其序列保持完整，報告 基團發(fā)射的熒光信號將被淬滅基團吸收，所以沒有熒光信號產生；而當PCR擴增反應進行時， DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性將降解熒光探針，導致熒光報告基團與熒光淬滅基團分離，因 而熒光監(jiān)測系統(tǒng)可接收并記錄到熒光信號。每擴增一條DNA鏈即有一個熒光分子產生，從而 實現熒光信號的累積與PCR產物形成完全同歩，實時地監(jiān)測整個PCR反應進程，并可借助標 準曲線對未知耙多核苷酸(模板)進行定量分析。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有CP，并能夠準確有效地將CP感染與 沙眼衣原體、畜類衣原體、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、呼吸 道合胞病毒、流感病毒等其他呼吸道感染相關病原體鑒別開來，設計并制備實現這些目的的 寡核苷酸引物和探針是一個非常重要的技術環(huán)節(jié)。為此，我們在使用適當的核酸分析軟件對 已知的CP變異體的基因組核苷酸序列進行同源性比較并找出保守區(qū)段的基礎上，進一步使 用適當的引物設計軟件(例如Primer Express 2)選擇和臨床樣本篩選出具有下示核苷酸序列 的寡核苷酸引物l: 5，-gctactggaacaaagtctgcga-3， (22 mrs) (SEQ ID NO: 1)，引物2: 5，誦 cattgtactccaatgtatggcacta-3， (25 mrs) (SEQ ID NO: 2);以及具有下示序列的寡核苷酸探 針5，-ttatcatgaatggcaagtaggagcctctctatctt-3， (35mrs) (SEQIDNO: 3)。引物所X才應 的擴增區(qū)段相當于CP外膜主要蛋白基因編碼序列的保守區(qū)，長度為103bp。其中，引物l互 補于CP基因組的第750—800位核苷酸；引物2互補于CP基因組的第830—880位核苷酸。 探針則互補與第780—840位核苷酸。由于所設計的這些引物和探針均具有互補于CP基因組 保守區(qū)的序列，而且與其他肺炎相關病原體的核苷酸序列沒有同源性，也不包括任何常見的 核酸內切酶，所以大大減少甚至避免了 CP檢測的假陰性和假陽性，提高了檢測的可靠性和 準確度?？墒褂肈NA合成裝置合成所需的寡核苷酸引物，用分子篩和快速蛋白質液相層析法 (FPLC)純化后進行氨解處理。同樣合成所需的探針序列，氨解處理后分別在其5'端標記作為 熒光發(fā)生基團(報道基團)的6-FAM amidite，并在其3，端標記借助活性連接臂偶聯(lián)上作為熒 光淬滅或抑制基團的TAMRA。以FPLC層析法純化熒光標記的探針。然后，可使用變性條件 下的聚丙烯酰胺凝膠(20%)電泳法和分光光度法物理鑒定所合成的引物和探針。使用常規(guī)DNA提取方法或市售的DNA提取試劑盒，從得自受試者的痰液、咽拭子、血清、 外周血單核細胞等樣品中提取DNA，然后在含有引物1和2 (各14pmo1)、 dNTP (10mM)、耐熱DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、PCR緩沖液和水的反應體系中，使用DA7600、 ABI 7500 型等其他結構類型的自動熒光檢測熱循環(huán)儀上對如上得到的DNA序列進行PCR擴增。所使用 的反應條件是93。C預變性2分鐘后，93 °C 45秒，55 °C l分鐘，進行10次循環(huán)后；93'C 30秒， 55°C 45秒，共進行30次循環(huán)。反應完成后，借助裝置上配置的自動分析系統(tǒng)分析結果。在本 研究中，如果循環(huán)閾(Ct)值等于或大于28，結果即為陰性；如果Ct值小于28，結果則為陽 性。其中以反應的前5 — 10個循環(huán)所產生的熒光信號作為熒光本底信號，熒光域值的缺省設置 為3-8個循環(huán)的熒光信號的標準偏差的10倍。 一般說來，每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝 數的對數呈線性關系。起始拷貝數越多，Ct值越小。因為在擴增反應的Ct值之前的階段，擴 增系統(tǒng)中的酶、引物、探針和dNTPs均大大過量，而且系統(tǒng)的pH值和離子濃度等也相對穩(wěn)定， 所以此時擴增反應的效率是一個與模板數無關的飽和定值。與Ct值相關的只有起始模板數(多 聚核苷酸樣品的濃度)和與樣品無關的PCR系統(tǒng)效率?？衫眉褐鹗糃P濃度的標準品制作標準曲線，其中以靶多核苷酸起始濃度(CP個數 /mL)的對數為橫坐標，并以如上測得的Ct值為縱坐標。獲得未知樣品靶多核苷酸的Ct值后， 即可從基于平行實驗得到的數據制作的標準曲線上得知其起始CP濃度的對數，然后計算出該 靶多核苷酸的起始CP濃度(當擴增循環(huán)達到Ct值即初始進入指數擴增期時，Ct值的重現性極 好，即同一耙多核苷酸在不同時間擴增或同一時間在不同管內擴增所得到的Ct值總是恒定 的)。也就是說，為了基于上述的擴增反應結果推算出靶多核苷酸的量(起始CP濃度)，本發(fā) 明的方法還進一歩包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經擴增后所產生的熒光達到基線以上 的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數；(2)將己確定的樣品中靶多核苷酸的閾循環(huán)次數與標準溶 液中己知量耙多核苷酸的閾循環(huán)次數相比較，從而計算出樣品中靶多核苷酸的量。本發(fā)明的另一個目的是提供一種使用實時熒光定量PCR技術定量檢測臨床樣品中CP的試 劑盒，該試劑盒包括(1)分別裝有DNA提取液、具有本領域已知的常規(guī)成分的PCR擴增反 應液、陰性參考品、陽性參考品和陽性標準品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并 集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。根據本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案，其中用于靶多核苷酸擴增體系的正向和逆向引物分別 是CP —F: 5，-gctactggaacaaagtctgcga-3,(SEQIDNO: l)和反向引物CP—R: 5'-cattgtact cca atg tat ggc act a -3， (SEQ ID NO: 2)，其中正向引物CP—F可向5，和3，端方向各延伸5個堿基， 反向引物CP—R可向5鄰3，端方向各延伸5個堿基。根據本發(fā)明的另一個優(yōu)選實施方案，其中用于靶多核苷酸擴增和監(jiān)測體系的寡核苷酸是 CP-P: 5，-ttatcatgaatggcaagtaggagcctctctatctt-3，(SEQIDNO: 3)，其中該寡核苷酵探針 序列可向5'和3'端方向各延伸5個堿基?？砂凑杖缟纤枋龅暮驮噭┖兄兴绞褂谜f明書中指出的方法使用本發(fā)明的試劑盒。如前所述，為了檢測出臨床樣品中可能存在的所有CP變異體，并能夠準確有效地將CP感染與沙眼衣原體、畜類衣原體、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、 呼吸道合胞病毒、流感病毒等其他呼吸道感染相關病原體鑒別開來，本發(fā)明基于對這些變異體和相關病毒基因組核苷酸序列的同源性比較，特別設計了適用本發(fā)明試劑盒的寡核苷酸引物和探針。使用這些引物和探針完成的實時定量檢測，大大減小了CP病毒多核苷酸檢測的假 陽性和假陰性。我們的實驗證明，本發(fā)明檢測CP基因組核苷酸的精確度幾乎為100M，靈敏度 達至[]1.0Xl()2個/ml。值得特別說明的是，為了確保本發(fā)明的CP檢測方法的準確性，我們還使用了來自美國 ATCC的CP純培養(yǎng)物(VR-2282)作為陽性參考品，并且，還利用麥氏比濁法測定上述CP純 培養(yǎng)物的濃度后10倍稀釋成濃度梯度后作為CP定量檢測標準品。借助這些額外參考品與定量 標準品，使用本發(fā)明的試劑盒在相同條件下進行平行檢測并制作所謂的外標定量標準曲線， 以進一歩驗證本發(fā)明試劑盒的檢測精確度和準確性，并作為生產本發(fā)明試劑盒的附加的質量 控制標準。另外，由于本發(fā)明試劑盒的擴增反應條件中所采用的退火溫度為55'C，距離預定的實際 退火溫度65'C相差達1(TC左右。所以，即使樣品中的靶核苷酸只有單個核苷酸的變異，也足 以保證熒光探針與靶核苷酸的結合及熒光信號的產生和釋放。本發(fā)明提供的實時熒光定量檢測方法及試劑盒可以檢測出1.0X 1(^個CP/ml的濃度，說明具有非常好的靈敏度。本發(fā)明針對CP的外膜主要蛋白編碼基因保守區(qū)設計特異引物探針，可檢測出CP病原體， 但不能檢測出非CP病原體，說明具有很好的特異性。本發(fā)明提供的實時熒光定量檢測方法及試劑盒可以檢測臨床外周血及其單核細胞、痰液、 咽拭子中的CP病原體，可為靈敏、快速早期診斷CP感染以及診斷CP持續(xù)感染或反復感染 提供可靠的實驗證據；同時由于能準確定量，所以可對臨床用藥進行有效監(jiān)測。附圍說明圖l顯示分析結果窗口下的標準曲線。針對模板數為1.0X10ll.0Xl(^個CP/ml的反應體 系進行TaqManPCR分析。當CP個數為1.0X 102時，檢測樣品的Ct值在26左右，即檢測下限靈 敏度可達到1.0Xl(^個CP/mL。繪制得到的標準曲線斜率為—3.29,在Y軸截距為33.33，相關 系數(R2) =0.9965。圖2顯示強中弱三份陽性標本的檢測曲線。三份標本的Ct值分別是22.04、 18.92和15.03;結合所繪制的擴增曲線呈S形，故可判定三份樣品均為陽性。圖3顯示陰性標本的檢測曲線。三個標本的擴增曲線為比較平直的折線，與熒光檢測閾 值線沒有交點，或者顯示Ct值在28 30之間的范圍內并且擴增曲線不具有S形特征。圖4顯示陽性標本重復性實驗的檢測曲線，可看出不同的曲線均在同一Ct值范圍，說明 試劑盒的重復性好。
具體實施方式
實施例l:肺炎衣原體檢測試劑的研制1、 引物探針的設計通過對Genbank數據庫己有的全部CP核酸序列以及國內外已發(fā)表文 獻中報導的核酸序列進行序列比對分析，選擇無二級結構且高度保守的區(qū)段，根據引物探針 設計的基本原則，利用軟件和人工設計多對引物和探針。2、 臨床樣本的選擇根據國內外相關文獻報到表明，對于初次感染CP或急性感染患者， 宜選擇清晨第一次痰液和咽拭子作為待檢標本；而對于反復感染或持續(xù)感染CP患者，宜選擇 外周血單核細胞作為待檢標本。3、 反應體系的建立與優(yōu)化樣品的準備以美國ATCC的標準株VR-2282作為CP檢測的陽性標準品；以與沙眼衣原體、 畜類衣原體、肺炎支原體、肺炎鏈球菌、巨細胞病毒、金黃色葡萄球菌、呼吸道合胞病毒、 流感病毒等作為陰性參考品。分別用DNA提取液煮沸法提取上述陽性標準品與陰性參考品的基因組DNA待用。引物探針的篩選以上述1中的3組引物探針分別檢測3.1中的陽性標準品與陰性參考品的 基因組DNA，經反復試驗，篩選出特異性好的最佳引物探針組合為組合l。引物探針濃度的優(yōu)化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.15umol/L至 0.5 u mol/L濃度梯度的引物和從0.075 w mol/L至0.25 P mol/L濃度梯度的探針進行PCR反應，經 多次重復試驗，最終確定最佳的引物濃度為0.35umol/L、探針濃度為0.21111101凡。鎂離子濃度的優(yōu)化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從lmmol/L至 2.5mmol/L濃度梯度的鎂離子進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的鎂離子濃度為 2mmol/L。酶用量的優(yōu)化在40u L反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從1U (酶單位)至8U濃度梯度的酶用量/人份進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的酶用量為3U/人份。dNTPs濃度的優(yōu)化在反應體系中其他組分不變的情況下，分別使用從0.1mmol/L至 0.25mmol/L濃度梯度的dNTPs進行PCR反應，經多次重復試驗，最終確定最佳的dNTPs濃度為 0.2mmol/L。反應溫度的優(yōu)化根據酶的活性和靶多核苷酸的長度，主要對退火溫度和延伸時間進行了優(yōu)化，經多次重復試驗，最終確定最佳的反應溫度和時間為93'C預變性2 min;然后93 。C 45s， 55°C lmin， IO個循環(huán)；最后93。C 30s， 55°C 45s， 30個循環(huán)。4、靈敏度實驗以麥氏比濁法測定上述ATCC的CP標準株純培養(yǎng)物的濃度為1.5X1(^個 /mL，先稀釋成1.0X10MVmL，然后10倍梯度稀釋成1.0X 10MVmL、 1.0X10MVmL、 1.0X 1()4個/mL、 1.0Xl()3個/mL、 1.0X10MVmL、 1.0X10'個/mL、 l.OX 10MVmL作為CP陽性定量 標準品，檢測結果表明，本發(fā)明方法的最低檢測下限為1.0Xl(^個/mL (參見圖l)。實tt例2:肺炎衣原^MI試劑M其^91、 制備包括下列組成成分的試劑盒DNA提取液(50(^1滑)2管、PCR反應液20管、 陰性參考品(10(Hil/管)l管、臨界陽性參考品(50nl/管)l管、陽性定量標準品(50pl/管) 4管。2、 標本采集、運送和保存(1) 標本采集(全血)用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血2毫升，注入含EDTA (乙 二胺四乙酸二鈉)或枸櫞酸鈉抗凝劑的玻璃管，立即輕輕顛倒玻璃管混合5 10次，使抗凝 劑與靜脈血充分混勻，密閉送檢。(2)標本保存和運送標本可立即用于測試，也可保存于-20。C待測，保存期為6個月。 標本運送時應采用O'C冰壺。 3、檢測步驟 (1)標本處理與DNA提取取全血1毫升至干燥玻璃試管中，加入生理鹽水l毫升輕搖混勻；并取干燥玻璃試管加 入500rt淋巴細胞分離液。然后將稀釋好的全血用移液器緩慢加入加有淋巴細胞分離液的試 管中(注意沿著管壁，速度要慢)；2,000 rpm離心20分鐘(建議用水平離心機)后，吸取 白細胞層(從上之下的第二層)，加入1.5ml離心管，12,000rpm離心5分鐘；去上清，沉淀 中加入50ii 1 DNA提取液充分混勻，IO(TC恒溫處理10±1分鐘，12, 000 rpm離心5分鐘，備用。(2) PCR反應與結果分析分別取陰性參考品、標本、臨界陽性參考品、定量標準品各5ul，加入PCR反應管中進行PCR擴增。PCR循環(huán)條件是93。C預變性2 min;然后93。C 45s， 55°C lmin， IO個循環(huán)； 最后93。C 30s， 55°C 45s， 30個循環(huán)。反應結束后保存檢測數據文件。根據PCR擴增結果所得到的曲線圖調節(jié)分析參數，使分 析結果窗口下的標準曲線達到最佳(即相關性數值R2〉0.97)(參見圖l所示)。由圖2和圖3可以 看出，陽性標本的熒光曲線與設定的閾值線有一交點，由交點所在位置得出Ct值；由于陰性 標本的熒光曲線低于閾值，故沒有Ct值。最后由儀器自動分析裝置計算出未知標本的測定數 值(Qty)，即標本中CP的濃度(參加圖2和圖3)。實施例3:臨床標本檢漏的重復性鑭試具體步驟同實施例2，不同的是所用標本為測序確定為CP陽性的標本。提取核酸后用本發(fā) 明的試劑盒進行PCR擴增，每一份標本設置多個復管。在擴增的同時由儀器自動監(jiān)測并收集 熒光信號的變化。反應結束后分析，應用本發(fā)明的試劑盒檢測結果顯示同一標本不同的曲線 均在同一Ct值范圍內，此結果表明試劑盒具有良好的重復性。(參見圖4)。序列表<iio>中山人學達安基W股份有限公'"j<120>實時熒光定量檢測肺炎衣原體的方法及試劑盒〈140〉<141〉〈160> 3<210> 1 <211> 22 <212> DNA <213>人T.序列 〈220〉<223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。 〈400> 1gctactggaa caaagtctgc ga<210> 2<211〉 25<212> DNA <213〉人丁序列 <220><223>根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的引物。<400〉 2cattgtactc caatgtatgg cacta<210> 3 <211〉 35 <212> DNA <213>人T序列 <220><223〉根據特定核苷酸序列設計，以用作PCR擴增的探針。<400> 3ttatcatgaa tggcaagtag gagcctctct atctt
權利要求
1. 一種使用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測樣品中肺炎衣原體(CP)存在的方法，該方法包括(1)提供包括樣品、核酸擴增體系，和熒光監(jiān)測體系的反應與檢測混合物，(2)通過擴增反應循環(huán)擴增所說的靶多核苷酸，(3)使所說的熒光發(fā)生基團與被擴增的靶多核苷酸間接結合，(4)確定熒光發(fā)生基團所產生的熒光量，(5)分析擴增循環(huán)后產生的熒光量以確定靶多核苷酸的存在及其相對量；其中核酸擴增體系包括可與靶多核苷酸結合的寡核苷酸引物，并且熒光監(jiān)測體系包括可與靶多核苷酸結合的寡核苷酸探針，特征在于所使用的寡核苷酸引物序列是正向引物CP-F5’-gct act gga aca aag tct gcg a-3’(SEQ ID NO1)和反向引物CP-R5’-cat tgt act cca atg tat ggc act a-3’(SEQ ID NO2)，由正向引物CP-F向5’端方向延伸5個堿基、向3’端方向延伸5個堿基范圍內得到的引物序列或能與這段范圍內的序列可以雜交的引物序列；以及由反向引物CP-R向5’端方向延伸5個堿基、向3’端方向延伸5個堿基范圍內所得到的引物序列或能與這段范圍內的序列可以雜交的引物序列。
2、 根據權利要求l中熒光監(jiān)測體系包括的寡核苷酸探針，特征在于所使用的寡核苷酸探 針序列包括寡核苷酸探針CP-P: 5，- tta tea tga atg gca agt agg age etc tct ate tt -3， (SEQ ID NO: 3)，以及由寡核苷酸探針CP-P向5'端方向延伸5個堿基、向3'端方向延伸5個堿基范圍內得到的 探針序列或能與這段范圍內的序列可以雜交的探針序列。
3、 根據權利要求1的方法，其中所說的樣品選自但不限于外周血、痰液、咽拭子及血清。
4、 根據權利要求l的方法，其中所說的核酸擴增體系包括(a)耐熱DNA聚合酶、(b) 2'-脫氧核苷三磷酸、(c)能夠與雙鏈靶多核苷酸的第一條鏈結合的正向引物，和(d)能夠與雙 鏈靶多核苷酸的第二條鏈結合的反向引物；其中所說的熒光檢測體系包括能夠與耙多核苷酸 結合并且兩末端分別結合的有熒光發(fā)生基團和熒光淬滅基團的寡核苷酸探針。
5、 根據權利要求l的方法，所說的方法進一步包括(1)確定樣品中的靶多核苷酸經擴增后所產生的熒光達到基線以上的固定閾值時所需的閾循環(huán)次數；(2)將已確定的樣品中耙多核苷酸的閾循環(huán)次數與標準溶液中已知量靶多核苷酸的閾循環(huán)次數相比較，以計算出樣品 中靶多核苷酸的量。
6、 根據權利要求l的方法，其中所說的肺炎衣原體選自肺炎衣原體的任何一種變異株； 其中所說的靶多核苷酸來自肺炎衣原體。
7、 一種使用實時熒光定量聚合酶鏈反應技術定量檢測臨床樣品中肺炎衣原體的試劑盒， 該試劑盒包括(1)分別裝有DNA提取液、PCR擴增反應液、稀釋液、陰性參考品、陽性 參考品和陽性標準品并加蓋密封的多個試劑瓶或管，和(2)分隔并集中包裝這些試劑瓶或管的包裝盒。
8、 根據權利要求7的試劑盒，其中用于靶多核苷酸擴增體系的正向和反向引物序列分別 是5，- get act gga aca aag tet gcg a陽3，禾卩5，- cat tgt act cca atg tat ggc act a -3，。
9、 根據權利要求7的試劑盒，其中用于靶多核苷酸擴增和監(jiān)測體系的寡核苷酸探針序列 是5，- tta tea tga atg gca喊嗎g age etc tct ate tt -3，。
全文摘要
本發(fā)明涉及檢測臨床樣品中肺炎、支氣管哮喘等疾病中的病原體肺炎衣原體(Chlamydia pneumoniae，CP)存在的方法及試劑盒，特別是涉及以實時熒光定量聚合酶鏈反應技術早期診斷CP感染以及診斷CP持續(xù)感染或反復感染的方法及所使用的試劑盒。
文檔編號C12Q1/68GK101235416SQ20071002660
公開日2008年8月6日 申請日期2007年1月30日 優(yōu)先權日2007年1月30日
發(fā)明者何蘊韶, 王偉毅, 鋼 程, 鄧中平, 娟 陳 申請人:中山大學達安基因股份有限公司