專利名稱：一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法及裝置的制作方法
技術領域：
本發(fā)明屬眼科醫(yī)學技術領域，涉及視網(wǎng)膜基因轉(zhuǎn)移的方法，具體涉及一種在體利 用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜色素上皮細胞層的方法。
背景技術：
研究顯示，以視網(wǎng)膜色素變性、增殖性玻璃體視網(wǎng)膜病變和老年性黃斑變性等為 代表的一類主要累及視網(wǎng)膜色素上皮細胞層的病變是目前世界上主要的致盲眼病之一。雖 然它們的發(fā)病機制各不相同，其包括基因缺陷，視網(wǎng)膜色素上皮細胞的異常增殖及代謝紊 亂等，但它們累及的病變部位都位于視網(wǎng)膜色素上皮細胞層。由于視網(wǎng)膜色素上皮細胞層存在于封閉的眼球后半球部視網(wǎng)膜的最內(nèi)層，視網(wǎng)膜 還具有血眼屏障阻斷來自血液的物質(zhì)傳輸，這些特殊的結(jié)構(gòu)限制了對于視網(wǎng)膜色素上皮細 胞病變的給藥途經(jīng)。臨床治療中，傳統(tǒng)的給藥方式，如眼表給藥，藥物無法到達球后部的病 變視網(wǎng)膜色素上皮細胞層；口服或者靜脈滴注藥物，藥物進入血液循環(huán)后，往往在血眼屏障 處被阻斷；通過手術，經(jīng)玻璃體腔注射藥物到視網(wǎng)膜前或經(jīng)鞏膜注射入視網(wǎng)膜下，藥物雖可 直接彌散到病變的視網(wǎng)膜，但受藥物半衰期的限制，對于上述的各類累及視網(wǎng)膜色素上皮 細胞層的慢性疾病來說，顯然不宜反復注射以維持藥物濃度，因而難以達到長效治療的目 的；況且，頻繁地玻璃體腔內(nèi)注射或視網(wǎng)膜下腔注射藥物，會引起諸多并發(fā)癥，如眼內(nèi)感染， 損傷晶狀體或者引起局部視網(wǎng)膜脫離等。所以，克服現(xiàn)有治療方式所存在的弊端是近年來 眼科亟待解決的難題。隨著生命科學與技術的飛速發(fā)展，以及人類對疾病的認識不斷深入，越來越多的 證據(jù)表明許多疾病都與基因的結(jié)構(gòu)或功能改變有關，因而從基因水平治療上述疾病引起研 究者的關注。基因治療是指通過操作遺傳物質(zhì)(無論是人類本身的或外源的)來干預疾病 的發(fā)生、發(fā)展和進程，包括替代或糾正人自身基因結(jié)構(gòu)或功能上的錯亂、殺滅病變的細胞或 增強機體清除病變細胞的能力等方法，從而達到治病的目的。目前國內(nèi)外研究者正在嘗試的方案有直接基因治療(包括病毒載體介導或非病 毒載體介導)和轉(zhuǎn)基因細胞移植(替代病變細胞和/或分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子)等。這些方案 已經(jīng)在眼病動物模型上取得了一定的研究進展，但是也不可避免的存在一些自身缺陷。本 領域公認，較為理想的輔助基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜色素上皮細胞層的方法，應該具有高效性，低潛 在致病性，較好的靶向性并且應能根據(jù)病變的性質(zhì)和嚴重程度不同，調(diào)控治療基因在適當 的組織器官內(nèi)以適當?shù)乃交蚍绞奖磉_，電穿孔方法是一種物理性、非病毒性的轉(zhuǎn)基因方法，其利用特定的脈沖電場瞬時 可逆性地改變細胞膜的通透性，形成膜上直徑20 IOOnm范圍的開孔通道，使基因物質(zhì)轉(zhuǎn) 入細胞。自Mir(I)報道電穿孔輔助基因治療在活體哺乳類動物骨骼肌的成功應用以來，該 方法已陸續(xù)在皮膚、肝腎等活體組織中得到運用。電穿孔方法具有操作簡單、安全、轉(zhuǎn)染率 不受細胞增殖性的影響、靶向性強等好處，但是由于不同組織細胞的電特性差異，細胞膜的 穿孔率和穿孔程度都有電場特征參數(shù)的依賴性，因此合理設計電極，確定合適的電脈沖條件，從而實現(xiàn)對目的細胞有效轉(zhuǎn)基因的同時盡量減少對周圍其他組織的損傷。對于皮膚肌 肉和肝腎組織來說，設計電極相對簡單。相比之下，其在眼部的設計應用卻較為困難，首先， 眼球本身的形狀意味著簡單的平板式電極將無法勝任；其次，視網(wǎng)膜組織內(nèi)細胞層次結(jié)構(gòu) 復雜，因此眼部的電穿孔轉(zhuǎn)染需要特制電極。有研究引入該方法輔助治療性基因轉(zhuǎn)染視網(wǎng) 膜神經(jīng)節(jié)細胞，設計了專用的勺鑷式電極，并成功地為大鼠眼球營造了適宜的電場刺激條 件，并獲得了國際同行的認可和支持(2 3)。這些研究動向，說明了電穿孔輔助基因治療 在視網(wǎng)膜及其他學科領域的應用日益得到推廣，是一項值得深入研究的新方法。與本發(fā)明相關的現(xiàn)有技術有下述文獻(分別被引用于上文中)。1. Mir LM, Bureau MF, Gehl J et al. High-efficiency gene transfer into skeletal muscle mediated by electric pulses. Proc Natl Acad Sci,1999,6(4) 508-5142. Mo XF, Yokoyama A, Oshitari T, et al. Rescue of axotomized retinal ganglion cells by BDNF gene electroporation in adult rats. Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(7) :2401_24053. Ishikawa H, Takano M, Matsumoto N, et al. Effect of GDNF gene transfer into axotomized retinal ganglion cells using in vivo electroporation with a contact lens-type electrode. Gene Therapy. 2005 ； 12 (4) :289_298

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是為克服現(xiàn)有技術的缺陷，提供一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方 法及裝置。尤其是一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)入視網(wǎng)膜色素上皮細胞層的專用電極裝置及 脈沖參數(shù)。本發(fā)明采用專用的電極裝置，確定最適宜的電刺激脈沖條件，利用電穿孔的方法 將含有綠色熒光蛋白(green fluorescence protein, GFP)的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細 胞層。本發(fā)明方法包括下述步驟1、設計和制作電極根據(jù)眼科常用實驗動物和臨床患者的角膜半徑和曲率參數(shù)制作一系列不同規(guī)格 的電極，本發(fā)明中，所述的實驗動物選自小鼠、大鼠、豚鼠、新西蘭大白兔、猴子。本發(fā)明中，根據(jù)每種動物不同周齡的角膜半徑變化，為每種動物設計制作3組電 極，具體規(guī)格如下(單位電極半徑mm)小鼠1. 25mm、L 5mm、L 75mm ；大鼠2· 5mm、3. 0mm、3. 5mm ；豚鼠3· 0mm、3. 5mm、4. Omm ；新西蘭大白兔4. 5mm、5. Omm、5. 5mm ；猴子12mm、14mm、16mm ；臨床電極8mm、10mm、12mm。2、構(gòu)建和制備含有目的基因的質(zhì)粒
4
從gene bank中查得目的基因序列并合成基因片段，設計并合成引物，利用PCR 反應擴增目的基因，電泳并回收得到目的基因的cDNA。然后按NT-GFP Fusion TOPO TA Expression Kits (Invitrogen公司)所提供的說明書進行目的基因cDNA與pcDNA3. 1/ NT-GFP-T0P0載體質(zhì)粒的連接，轉(zhuǎn)化，并PCR篩選菌落，然后對陽性菌落行質(zhì)粒小抽，測序； 將構(gòu)建的質(zhì)粒稀釋至2. 5 μ g/ μ 1濃度備用。3、設計電刺激脈沖條件在安全電場的范圍內(nèi)，設計電壓范圍從5V至35V的七組電脈沖刺激條件，通過視 網(wǎng)膜鋪片、切片、分子生物學等方法檢測，確定以電場10￥/讓，脈寬99!118，脈沖間期0.58，5 個脈沖為一組的參數(shù)條件為視網(wǎng)膜色素上皮細胞層最適宜電脈沖刺激條件。4、動物實驗實驗動物常規(guī)處理，0. 5%托吡卡胺滴眼散瞳，0. 4%鹽酸奧布卡因麻醉眼表組織， 分離上方結(jié)膜及Tenon’囊至球后區(qū)，手術顯微鏡直視下自下方角膜緣外Imm處刺入Iml無 菌注射器針頭，形成鞏膜上針孔大小的隧道，再用33G平鈍針頭微量進樣器沿鞏膜隧道進 入玻璃體腔，直至視乳頭上側(cè)2 3PD的視網(wǎng)膜時輕輕進入視網(wǎng)膜下腔，注射4μ 1質(zhì)粒或 TE Buffer。5、電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)染 將專用的電極裝置電極連接電刺激發(fā)生器，其正極處于實驗動物上方分離的球后 區(qū)的病變區(qū)，負極覆蓋角膜(圖2)，分別在上述電穿孔刺激模式下，將帶負電荷的質(zhì)粒在內(nèi) 正外負的電場作用下，轉(zhuǎn)染到視網(wǎng)膜色素上皮細胞層。本發(fā)明以在體電穿孔輔助BDNF-GFP基因轉(zhuǎn)染幼年RCS大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞 層作為實例，獲得最佳電脈沖刺激條件，即電場10V/mm，脈寬99ms，脈沖間期0. 5s，5個脈沖 為一組，并建立了相應的技術體系，能滿足高效率、低副作用轉(zhuǎn)基因研究的需求。本發(fā)明方法中所使用的專用電極裝置為雙勺型，采用金作為電極的導電接觸面材 料，銅鋁合金作為支撐材料，外層涂以樹脂作為絕緣層，并通過測量以保證所得電極形狀的 規(guī)格，雙勺型的電極(圖1)其兩極通過插頭與電刺激發(fā)生器連接，正、負極可以根據(jù)需要調(diào) 整。本發(fā)明中，雙勺型電極的角膜側(cè)電極主要與角膜面積、曲率相符；鞏膜側(cè)電極略小，為小 圓勺形，僅置于質(zhì)粒轉(zhuǎn)移部位，可以減少球后區(qū)的處理分離范圍并且降低對其他眼周組織 的損傷。本發(fā)明優(yōu)點在于(1)電極合適合適的電極是眼內(nèi)基因轉(zhuǎn)染成功的關鍵，與現(xiàn)有技術的電極比較， 已有報道的電極多為較簡單的平板狀電極，適用對象多為肌肉、皮膚等組織，因眼球結(jié)構(gòu)和 形狀特殊，為提高眼球組織間電場的穩(wěn)定性，本發(fā)明將電穿孔所需的電極設計為雙勺型，并 且將鞏膜側(cè)電極設計為小圓勺，能保證電極與眼球緊密帖覆的同時減少球后的處理分離區(qū) 域，從而降低副損傷。(2)確定最適電脈沖參數(shù)電穿孔是一種物理性轉(zhuǎn)基因方法，由于不同組織細胞 的電特性差異，細胞膜的穿孔率和穿孔程度都有電場特征參數(shù)的依賴性，本發(fā)明通過對多 組參數(shù)的檢測，確定了最適合視網(wǎng)膜色素上皮細胞的電脈沖參數(shù)，即10V/mm，脈寬99ms，脈 沖間期0.5s，5個脈沖為一組。本發(fā)明方法借助電場，能有方向性的控制基因眼內(nèi)轉(zhuǎn)染，同時避免了病毒轉(zhuǎn)基因所帶來的細胞免疫源性和潛在致病性、致瘤性等弊端。本發(fā)明方法具有操作便捷、高效等優(yōu) 點，并且可同時實現(xiàn)多種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，彌補了傳統(tǒng)轉(zhuǎn)基因方法的一些不足之處。本發(fā)明為眼 科研究的基因?qū)胩峁┝诵路椒?，并為眼病的基因治療提供了新思路?br>

圖1是本發(fā)明的雙勺式電極圖，其中，較大一側(cè)電極為角膜側(cè)電極，較小一側(cè)為鞏膜側(cè)電極。圖2是眼內(nèi)顯微手術和電極放置方法示意圖。圖3是視網(wǎng)膜切片觀察BDNF-GFP轉(zhuǎn)染層次，其中，A為正常對照組，B為基因轉(zhuǎn)染組，箭頭所示部位為視網(wǎng)膜色素上皮細胞層， 可見對照組視網(wǎng)膜色素上皮細胞層無特異性熒光表達，基因轉(zhuǎn)染組可見特異性熒光圖4為熒光顯微鏡下視網(wǎng)膜鋪片，可見熒光均勻清楚的分布于視網(wǎng)膜。圖5為TUNEL凋亡檢測可見基因轉(zhuǎn)染組抗凋亡效果明顯優(yōu)于對照組。
具體實施例方式本發(fā)明以在體電穿孔輔助BDNF-GFP基因轉(zhuǎn)染遺傳性視網(wǎng)膜色素變性動物模型幼 年RCS大鼠視網(wǎng)膜色素上皮細胞層作為實例，詳細闡述本發(fā)明。實施例1制備雙勺型專用電極裝置在常規(guī)眼科用電極裝置基礎上，采用金作為電極的導電接觸面材料，銅鋁合金作 為支撐材料，外層涂以樹脂作為絕緣層，并通過測量以保證所得電極形狀的規(guī)格，雙勺型的 電極(圖1)其兩極通過插頭與電刺激發(fā)生器連接，正、負極可以根據(jù)需要調(diào)整。雙勺型電 極的角膜側(cè)電極為大圓勺形，主要與角膜面積、曲率相符；鞏膜側(cè)電極略小，為小圓勺形，僅 置于質(zhì)粒轉(zhuǎn)移部位，可以減少球后區(qū)的處理分離范圍并且降低對其他眼周組織的損傷。實施例21.構(gòu)建質(zhì)粒載體已有質(zhì)粒pRc/CMV BDNF包含小鼠BDNF cDNA,片段長750bp。設計并合成序列1、 些歹丨J 2 的引物(5，-ATG ACC ATC CTT TTC CTT ACT ATG-3，及 5，-CCA CTA TCT TCC CCT TTT AAT GG-3，)。PCR 反應(94°C 30s，57°C 30s，72°C 40s，循環(huán) 30 次)擴增目的基因，電泳 并回收得到BDNF cDNA。然后按NT-GFP Fusion TOPO TA Expression Kits所提供的說明 書進行BDNF cDNA與pcDNA3. 1/NT-GFP-T0P0載體質(zhì)粒的連接，轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒小抽，測序。測序 證實后，用Endofree Plasmid Purification Maxi試劑盒大抽質(zhì)粒，檢測所得質(zhì)粒0D260/ 0D280值，該比值大于1. 8為合格，將合格的質(zhì)粒稀釋至2. 5 μ g/μ 1的濃度。2.實驗動物顯微手術實驗及電穿孔選取實驗動物右眼作轉(zhuǎn)然質(zhì)粒實驗眼，左眼轉(zhuǎn)然TE Buffer作為對照眼，用量均為 4μ 1，采用美國BTX公司的ECM830電穿孔儀，具體操作參照上述方法步驟部分。2.視網(wǎng)膜切片觀察BDNF-GFP轉(zhuǎn)染層次于試驗后1周處理大鼠后取眼球，在角膜緣相應部位用縫線標記質(zhì)粒轉(zhuǎn)然范圍， 采用眼球固定液固定1天，在視神經(jīng)平面水平剖開眼球，石蠟包埋后作常規(guī)切片，熒光顯微 鏡下觀察GFP主要分布于視網(wǎng)膜色素上皮細胞層(圖3)
3.視網(wǎng)膜鋪片觀察BDNF-GFP轉(zhuǎn)染范圍于術后1周行多聚甲醛灌注固定處理大鼠，取眼球后用4%多聚甲醛固定lh，剪除 角膜，取出晶狀體和玻璃體，完整剝離全視網(wǎng)膜平鋪于載玻片上，按照四個象限剪成4瓣， 甘油緩沖液封片，在熒光顯微鏡下可以觀察到GFP的表達(圖4)，主要分布于質(zhì)粒注射部位 的兩個象限。4. Western blot 檢測 BDNF 蛋白的表達于術后1周后取視網(wǎng)膜，加入裂解液，超聲粉碎，在4°C下12000rpm離心5min， 取上清，Bradford法測定蛋白濃度。樣品于100°C水浴8min。加樣后進行十二烷基硫酸 鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳后，轉(zhuǎn)移蛋白至PVDF膜上，麗春紅染色，見蛋白條帶，用含5%脫脂 奶粉的封閉液封閉lh，加一抗37°C孵育2h，洗膜，二抗37°C孵育lh，洗膜，DAB溶液顯色，水 洗膜終止反應，將膜用凝膠成像儀拍照并用天能GIS凝膠圖像處理系統(tǒng)進行數(shù)據(jù)分析，以 β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果顯示，實驗眼在14、41kDa處分別出現(xiàn)條帶(圖5)，前者為視網(wǎng) 膜內(nèi)源性BDNF表達，后者為電穿孔輔助外源性BDNF-GFP表達，并且外源基因表達量遠高于 內(nèi)源基因的表達。5. RT-PCR檢測視網(wǎng)膜內(nèi)BDNF mRNA的表達于術后3天將大鼠處死后取視網(wǎng)膜，采用RNA提取試劑盒提取總RNA， 按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進行逆轉(zhuǎn)錄，設計如下順序3、4、5、6序列引物上游 5，-GGAGAAGAGCGACCCACA-3，，下游5，-CGTTTCAGTGCCACATACC-3，，GAPDH 引物上游 ATCCTGTACCACCAACTGCC,下游CAGTGTAGGAAGCAGGCTGA, PCR 反應條件為94 "C 45s, 56 °C 45s, 72 °C lmin，72°C延伸10min，26個循環(huán)。取5μ1的PCR產(chǎn)物進行電泳，以3-磷酸 甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)作為內(nèi)參照。電泳 后用凝膠成像系統(tǒng)提取圖像，計算目的條帶與GADPH條帶的灰度相對比值，進行mRNA半定 量分析，結(jié)果顯示，實驗眼和對照眼均有BDNF mRNA表達，并且實驗眼表達量遠高于對照眼。6.視網(wǎng)膜光感受器細胞存活狀態(tài)的病理觀察于術后1、2、3、4、5周取大鼠雙眼作光鏡觀察，采用眼球固定液固定ld，石蠟包埋 后作常規(guī)切片、HE染色。選擇基因治療眼和對照眼后極部相同部位的視網(wǎng)膜，觀察光感受 器細胞核數(shù)目，經(jīng)統(tǒng)計學分析，在各時間點實驗眼均較對照眼保留更多的光感受器細胞。7. TUNEL 凋亡檢測于術后1周檢測各組視網(wǎng)膜外核層細胞凋亡情況，石蠟切片常規(guī)脫蠟，按照DAB凋 亡試劑盒說明步驟進行實驗，光學顯徽鏡下觀察每視野中陽性凋亡細胞數(shù)目，核內(nèi)出現(xiàn)棕 黃色顆粒為陽性標記，觀察認為治療眼視網(wǎng)膜細胞的凋亡情況明顯好于實驗組。結(jié)果顯示，采用雙勺式電極，在視網(wǎng)膜色素上皮細胞最佳電刺激模式電場IOV/ mm,脈寬99ms，脈沖間期0. 5s, 5個脈沖為一組作用下，將BDNF-GFP質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至RCS大鼠的 視網(wǎng)膜色素上皮細胞層，并通過包括視網(wǎng)膜切片HE染色計數(shù)、Western blot、RT-PCR、TUNEL 凋亡檢測等多種方法確定所述的轉(zhuǎn)基因治療可以有效延緩病程。本發(fā)明方法較現(xiàn)有技術， 具有省時省力省經(jīng)費、操作簡單、可重復性強、定向轉(zhuǎn)染、無毒副作用等優(yōu)勢。一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法及裝置序列表SEQUENCE LISTING<110>復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院<120> 一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法及裝置
<130>11
<160>6
<170>Patentln version 3. 1 <210>1 <211>24 <212>DNA <213>動物 <400>1
atg accatcc ttttccttac tatg24
<210>2 <211>23 <212>DNA <213>動物 <400>2
ccactatctt ccccttttaa tgg23
<210>3
<211>18
一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法及裝置序列表
<212>DNA
<213>動物
<400>3
ggagaagagc gacccaca18
<210>4
<211>19
<212>DNA
<213>動物
<400>4
cgtttcagtg ccacatacc 19
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>動物
<400>5
atcctgtacc accaactgcc 20 <210>6 <211>20 <212>DNA <213>動物
CN 10<400>6cagtgtagga agcaggctga 20
權(quán)利要求
一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，采用專用電極裝置，確定適宜的電刺激脈沖條件，利用電穿孔的方法將含有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細胞層，其包括下述步驟1)設計和制作電極，根據(jù)眼科常用角膜半徑和曲率參數(shù)制作系列不同規(guī)格的電極；2)構(gòu)建和制備含有目的基因的質(zhì)粒，3)設計電刺激脈沖條件在安全電場的范圍內(nèi)，設計電壓范圍5V至35V的七組電脈沖刺激條件；4)電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)染將電極連接電刺激發(fā)生器，在電穿孔刺激模式下，將帶負電荷的質(zhì)粒在內(nèi)正外負的電場作用下，轉(zhuǎn)染經(jīng)處理所得的視網(wǎng)膜色素上皮細胞層。
2.按權(quán)利要求1所述的利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述的適宜的 電刺激脈沖條件為以電場10V/mm，脈寬99ms，脈沖間期0. 5s，5個脈沖為一組。
3.按權(quán)利要求1所述的利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述的專用電 極裝置為雙勺型，采用金作為電極的導電接觸面材料，銅鋁合金作為支撐材料，外層涂以樹 脂作為絕緣層。
4.按權(quán)利要求3所述的利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述的雙勺型 電極裝置其兩極通過插頭與電刺激發(fā)生器連接，其正、負極根據(jù)需要調(diào)整；雙勺型電極的角 膜側(cè)電極為大圓勺形，與角膜面積、曲率相符；鞏膜側(cè)電極為小圓勺形，置于質(zhì)粒轉(zhuǎn)移部位。
5.按權(quán)利要求1所述的利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法，其特征在于，所述的步驟1) 的系列不同規(guī)格的電極為小鼠1. 25mm、1. 5mm、1. 75mm ；大鼠2. 5mm>3. 0mm>3. 5mm ；豚鼠:3. 0mm>3. 5mm、4. Omm ；新西蘭大白兔4· 5mm、5. 0mm、5. 5mm ；猴子12mm、14mm、16mm ；臨床電極8mm、10mm、12mm。
6.按權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述步驟2)的目的基因的質(zhì)粒為目的基因 cDNA 與 pcDNA3. 1/NT-GFP-TOPO 載體質(zhì)粒連接。
全文摘要
本發(fā)明屬眼科醫(yī)學技術領域，涉及一種利用電穿孔輔助基因轉(zhuǎn)移的方法及裝置，本發(fā)明采用雙勺型電極裝置，確定適宜的電刺激脈沖條件，利用電穿孔的方法將含有綠色熒光蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染視網(wǎng)膜色素上皮細胞層。本發(fā)明方法借助電場，能有方向性的控制基因眼內(nèi)轉(zhuǎn)染，同時避免了病毒轉(zhuǎn)基因所帶來的細胞免疫源性和潛在致病性、致瘤性等弊端，采用的雙勺型電極裝置能降低眼球的副損傷。本發(fā)明方法具有操作便捷、高效等優(yōu)點，并且可同時實現(xiàn)多種質(zhì)粒的轉(zhuǎn)染，彌補了傳統(tǒng)方法的不足之處。本發(fā)明為眼科研究的基因?qū)胩峁┝丝蓞⒖嫉姆椒ā?br> 文檔編號C12N15/85GK101955973SQ200910054738
公開日2011年1月26日 申請日期2009年7月14日 優(yōu)先權(quán)日2009年7月14日
發(fā)明者倪穎勤, 吳繼紅, 張萌, 徐格致, 莫曉芬, 董京艷 申請人:復旦大學附屬眼耳鼻喉科醫(yī)院