專利名稱：一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類基因轉(zhuǎn)移載體及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及構(gòu)建一種基于魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子的基因轉(zhuǎn)移載體，同時還公開了該載 體涉及的轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒載體的構(gòu)建方法，及其在斑馬魚和養(yǎng)殖魚類中 的應(yīng)用。屬于魚類基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
隨著人民生活水平的提高，人們對包括魚、蝦、貝、藻在內(nèi)的優(yōu)質(zhì)水產(chǎn)品有較大需 求。通過轉(zhuǎn)基因來改良水產(chǎn)養(yǎng)殖對象的生長、抗逆和肉質(zhì)等方面的種質(zhì)是一種極其有效的 途徑。早在1984年我國朱作言等即研制出世界上第一批轉(zhuǎn)基因魚，建立了轉(zhuǎn)基因魚理論模 型。水產(chǎn)轉(zhuǎn)基因研究盡管成就斐然，但是，仍然存在許多不足之處，例如，魚類早期的轉(zhuǎn)基因 表達(dá)載體僅是帶有目標(biāo)基因的質(zhì)粒，該技術(shù)不僅難以做到定點整合，而且整合效率很低，在 后代的遺傳率通常低于5%，可供轉(zhuǎn)移的有效啟動子、功能基因和通用載體缺乏，很難應(yīng)用 于不同繁殖類型的水產(chǎn)養(yǎng)殖動物，如不能在浮性卵、黏性卵魚類、排卵量較少的魚類和卵子 較小的蝦類中進行有效轉(zhuǎn)基因育種。另外，與目標(biāo)性狀相關(guān)的功能基因缺乏，所轉(zhuǎn)的功能基 因或基因組合不能確實完成抗逆、肉質(zhì)改良和促生長目標(biāo)。因此，現(xiàn)階段仍需進一步建立簡 便、安全、高效和通用的轉(zhuǎn)基因和基因捕獲方法。轉(zhuǎn)座子主要分為兩類一類是具有類似反轉(zhuǎn)錄病毒結(jié)構(gòu)的I型轉(zhuǎn)座子，即逆轉(zhuǎn)錄 轉(zhuǎn)座子，采用“復(fù)制粘貼”機制，首先將DNA轉(zhuǎn)錄為RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下合成DNA，反轉(zhuǎn) 錄的DNA插人染色體的其他部位，結(jié)果在染色體上的位置發(fā)生了移動。另一類是II型轉(zhuǎn)座 子，即DNA轉(zhuǎn)座子，主要采用“剪切_粘貼”的轉(zhuǎn)座機制，將DNA從染色體上切下來后直接插 入到別的部位，由兩端較短的反向重復(fù)序列(inverted terminal r印eat，ITR)和編碼轉(zhuǎn)座 酶的基因組成。作為基因轉(zhuǎn)移和表達(dá)系統(tǒng)的DNA轉(zhuǎn)座子在細(xì)菌、真菌、植物、無脊椎動物和 脊椎動物中已有較多應(yīng)用。隨著McClintock于1951年在玉米中首次發(fā)現(xiàn)了 AC轉(zhuǎn)座子后， 利用轉(zhuǎn)座子在受體基因組的可整合性，構(gòu)建了果蠅P因子、hobo因子、piggyBac轉(zhuǎn)座子和 mariner因子，并已成功地轉(zhuǎn)化了多種外源基因。脊椎動物中也存在很多轉(zhuǎn)座子，但是此類 轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)座酶大多在漫長的進化中失活。直到1996年，日本學(xué)者Inagaki H和Koga A等 對青鏘的白化變種進行連鎖分析的時候發(fā)現(xiàn)了在白化變種的青鏘的酪氨酸酶基因插入了 一個4. 7kb左右的片段，他們經(jīng)過克隆和分析最終把其命名為Tol2，不久之后發(fā)現(xiàn)了 Το12 具有天然活性。這是在脊椎動物中第一個發(fā)現(xiàn)的天然有活性的轉(zhuǎn)座子。2008年，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)一個新的具有天然活性的hAT轉(zhuǎn)座子，該轉(zhuǎn)座子在我國一些 金魚品種中廣泛存在，命名為金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子。金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子是迄今發(fā)現(xiàn)的第二例脊 椎動物轉(zhuǎn)座子。與青鏘Tol2轉(zhuǎn)座子元件相同，金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子含有末段倒位重復(fù)、亞末端 重復(fù)、中間倒位重復(fù)和活性轉(zhuǎn)座酶基因，金魚Tgf2與青鏘Tol2轉(zhuǎn)座子在末段倒位重復(fù)和轉(zhuǎn) 座酶基因編碼上存在一定差異，這些差異為開發(fā)新的高效魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子提供了可能。本 發(fā)明所涉及的一種源于魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子的簡便、高效轉(zhuǎn)基因元件的構(gòu)建就是建立在金魚 Tgf2轉(zhuǎn)座子發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明就是為了解決上述問題，克服金魚Tgf2與青鏘Tol2轉(zhuǎn)座子在末段倒位重 復(fù)和轉(zhuǎn)座酶基因編碼上存在一定差異的問題，本發(fā)明的目的是提供一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子 的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，本發(fā)明還公開了所述載體的制備方法，具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高和 低成本的特點。該發(fā)明適用于魚類基因功能研究和轉(zhuǎn)基因育種的研究。本發(fā)明所需要解決的技術(shù)問題，可以通過以下技術(shù)方案來實現(xiàn)作為本發(fā)明的一方面，一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于， 包括Tgf2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和表達(dá)Tgf2轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒。其中，所述Tgf2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒包括Tgf2轉(zhuǎn)座子包含反向重復(fù)序列的左 右臂序列和魚類特異性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件。其中，所述輔助質(zhì)粒在魚類特異性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件指導(dǎo)下表達(dá)Tgf2轉(zhuǎn)座酶。其中，所述Tgf 2轉(zhuǎn)座子的左右臂序列及轉(zhuǎn)座酶選自金魚。進一步，所述供體質(zhì)粒的魚類特異性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件為斑馬魚krt8啟動子 序列。進一步，所述輔助質(zhì)粒的魚類特異性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件為斑馬魚β-actin啟 動子序列。作為本發(fā)明的另一方面，一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類基因轉(zhuǎn)移載體的制備方法， 包括以下步驟(1)魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的構(gòu)建運用PCR技術(shù)，分別克隆斑馬魚 krt8啟動子序列；構(gòu)建目的基因表達(dá)盒；通過基因克隆技術(shù)將上述構(gòu)建的包含啟動子和目 的基因表達(dá)盒克隆入Tgf2轉(zhuǎn)座子的左右臂序列所包含反向重復(fù)序列之間，構(gòu)建魚類Tgf2 轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒；(2)魚類Tgf2轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒的構(gòu)建將斑馬魚β -actin啟動子序列和Tgf2轉(zhuǎn) 座酶編碼基因連接，構(gòu)建能表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒。為了實現(xiàn)將目的基因穩(wěn)定整合到魚類基因組中，本發(fā)明轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒包含Tgf2 轉(zhuǎn)座子的左右臂，包含反向重復(fù)序列和亞末端重復(fù)序列，可由轉(zhuǎn)座酶識別，促進左右臂間 DNA片段的轉(zhuǎn)座。本發(fā)明利用DNA重組技術(shù)，目的基因表達(dá)盒克隆入Tgf2轉(zhuǎn)座子的左右臂 序列之間，構(gòu)建了魚類轉(zhuǎn)基因的供體質(zhì)粒。轉(zhuǎn)座子發(fā)生轉(zhuǎn)座除需Tgf2轉(zhuǎn)座子的左右臂序列之外，還需要Tgf2轉(zhuǎn)座酶的參與。 轉(zhuǎn)座酶識別左右臂內(nèi)的順式元件，并實現(xiàn)左右臂序列及其內(nèi)部的DNA片段發(fā)生轉(zhuǎn)座。為實 現(xiàn)轉(zhuǎn)座的基因穩(wěn)定整合到魚類基因組中，本發(fā)明將斑馬魚β -actin啟動子序列和Tgf2轉(zhuǎn) 座酶編碼基因連接，構(gòu)建能在胚胎細(xì)胞內(nèi)自主表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒。這種由魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因元件，不但可以在魚類中實現(xiàn)高效轉(zhuǎn)基因， 而且由于不含轉(zhuǎn)座酶mRNA的體外轉(zhuǎn)錄和注射，因此，具有操作簡便性和低成本特征。本發(fā)明的有益效果基于魚類高效Tgf2轉(zhuǎn)座子，構(gòu)建轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和Tgf2轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒，二者共 同構(gòu)成的魚類高效轉(zhuǎn)基因方法，確保外源目的基因在魚類基因組中的高效整合。本發(fā)明與 現(xiàn)有技術(shù)相比，具有簡便、高效和低成本特點，為魚類基因功能研究和轉(zhuǎn)基因育種提供了新
4方法。


以下結(jié)合附圖和具體實施方式
來進一步說明本發(fā)明。圖 1 是 pTgf2_zf3 -actin-eGFP 質(zhì)粒圖譜。圖2是pTgf2-zfKrt8_eGFP轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒圖譜。圖3是pCS2-CMV_gfTP載體質(zhì)粒圖譜。圖4是pCS2_zf β -actin-gfTP轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒圖譜。圖 5 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質(zhì)粒的斑馬魚36hpf胚胎的可見光透射照片。圖 6 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質(zhì)粒的斑馬魚36hpf胚胎的熒光照片。圖 7 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質(zhì)粒的草魚58hpf胚胎的可見光透射照片。圖 8 是共同注射 pTgf2-zfKrt8_eGFP 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和 pCS2_zf β -actin-gfTP 輔助質(zhì)粒的草魚58hpf胚胎的熒光照片。
具體實施例方式為了使本發(fā)明的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具 體圖示，進一步闡述本發(fā)明。下面結(jié)合具體實施案例，進一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī) 條件，未詳細(xì)說明的技術(shù)為常規(guī)技術(shù)。實施例1、轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒PTgf2-zfKrt8-eGFP的構(gòu)建剪取斑馬魚(Danio rerio，上海海洋大學(xué)水產(chǎn)與生命學(xué)院C202)尾鰭，提取基因 組DNA，于-20°C保存?zhèn)溆?。設(shè)計引物SEQ ID No :5 (帶BamHI酶切位點)和SEQ ID No:6(帶 XhoI酶切位點)在斑馬魚基因組進行PCR擴增，擴增反應(yīng)程序為94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72°C 150s，35個循環(huán)；72°C延長5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩 沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物分別連接至pMD-19T 載體(TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μ g/ mL的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200 μ L菌液甘油保存，并送往上海生工生物 工程有限公司進行測序。序列正確的陽性克隆質(zhì)粒，進行BamHI和XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物 經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片段， 獲得斑馬魚zfKrt8啟動子雙酶切DNA產(chǎn)物。對包含金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子左、右臂序列和綠色熒光蛋白eGFP基因的 pTgf2-zfi3 -actin-eGFP質(zhì)粒(圖1)進行BamHI、XhoI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝 膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片段，獲得pTgf2_eGFP 質(zhì)粒雙酶切產(chǎn)物，然后再與斑馬魚ZfKrtS啟動子雙酶切DNA產(chǎn)物用T4連接酶連接，并轉(zhuǎn) 入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，進行測序驗證獲得PTgf2-ZfKrt8-eGFP轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒(圖 2)。實施例2、Tgf2轉(zhuǎn)座酶(gfTP)輔助質(zhì)粒的構(gòu)建根據(jù)已獲得信息，Tgf2轉(zhuǎn)座子編碼的轉(zhuǎn)座酶(gfTP)在金魚(琉金金魚 Carassius auratus var.)成熟的卵巢中表達(dá)量最高，因此，取琉金金魚成熟卵巢，利用 TRIZOL (Invitrogen 公司)試劑提取總 RNA，用 TaKaRa RNA PCR Kit(AMV) Ver. 3. O 中的逆 轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)為3，端單鏈cDNA，于-20°C保存?zhèn)溆?。以正反引物SEQ ID No :1(帶XhoI酶切 位點)和SEQ ID No :2 (帶XbaI酶切位點)PCR擴增Tgf2轉(zhuǎn)座酶編碼區(qū)1734bp全長，擴增 產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片 段，將回收產(chǎn)物連接至PMD-19T載體(TaKaRa公司)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克 隆，接種到氨芐青霉素含量為50μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200 μ 1 菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司進行測序。測序結(jié)果與預(yù)期一致后，取回 收質(zhì)粒進行XhoI、XbaI雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的 電壓下電泳分離后，割膠回收目的片段，即獲得gfTP閱讀框DNA雙酶切產(chǎn)物，并于_20°C保 存?zhèn)溆?。對pCS2+載體質(zhì)粒(由美國密西根大學(xué)段存明教授惠贈)進行Xhol、XbaI雙酶 切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回 收目的片段，溶于無菌雙蒸水中。將回收載體片段與gfTP閱讀框DNA雙酶切連接，并轉(zhuǎn)入 大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，取200 μ 1菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公 司進行測序驗證。挑取陽性克隆接種到氨芐青霉素含量為50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基中， 37°C振蕩過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小抽試劑盒(北京天根公司)提取質(zhì)粒，即獲得pCS2-CMV-gfTP 載體質(zhì)粒(圖3)。設(shè)計引物SEQ ID No :3 (帶BamHI酶切位點)和SEQ ID No :4 (帶XboI酶切位 點)在斑馬魚基因組DNA中進行擴增，PCR反應(yīng)程序為94°C 5min ；94°C 30s, 55°C 30s, 72 °C 150s, 35個循環(huán)；72°C延長5min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液， 在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片段，將回收產(chǎn)物分別連接至PMD-19T載體 (TaKaRa)中，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，挑取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μ g/mL的 液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，取200 μ L菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程 有限公司進行測序。測序結(jié)果與預(yù)期一致后，取回收質(zhì)粒進行BamHI、XhoI雙酶切，酶切產(chǎn) 物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片 段，即獲得zf β -actin啟動子DNA雙酶切產(chǎn)物，并于_20°C保存?zhèn)溆?。對?52義1^飛^ 載體進行8膽!1^1101雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1. 2%瓊脂糖凝膠，以 TBE為緩沖液，在5V/cm的電壓下電泳分離后，割膠回收目的片段，溶于無菌雙蒸水中。將回 收的載體雙酶切產(chǎn)物與zf β -actin啟動子DNA雙酶切產(chǎn)物連接，并轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5 α，挑 取陽性克隆，接種到氨芐青霉素含量為50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)， 取200 μ L菌液甘油保存，并送往上海生工生物工程有限公司進行測序驗證。分別挑取陽性 克隆接種到氨芐青霉素含量為50 μ g/mL的液體LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，用質(zhì)粒小 抽試劑盒(北京天根公司)提取質(zhì)粒，即完成pCS2-zf β -actin-gfTP轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒(參 見圖4)的構(gòu)建。實施例3、Tgf2轉(zhuǎn)基因元件和輔助質(zhì)粒在斑馬魚中的轉(zhuǎn)基因效果
斑馬魚的飼養(yǎng)實驗用斑馬魚飼養(yǎng)于循環(huán)水族箱中，雌雄分開暫養(yǎng)，每日飼喂兩 次，一次為鹵蟲，一次喂人工飼料，培養(yǎng)溫度約為28°C，光照14h，黑暗10h。產(chǎn)卵前一晚將雌 魚與雄魚轉(zhuǎn)入產(chǎn)卵缸中，雌與雄用透明擋板隔開。實驗當(dāng)天早上抽去擋板，讓其自然產(chǎn)卵。顯微注射取PTgf2-zfKrt8-eGFP (參見圖2)轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和Tgf2轉(zhuǎn)座子編碼 的 Tgf2 轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒 pCS2-zf β -actin-gfTP (參見圖 4)，用 0. 3 XDanieau buffer (含 0. 酚紅)配制終濃度各為50ng/y L的混合溶液。將轉(zhuǎn)基因質(zhì)粒溶液與輔助質(zhì)粒的混合 溶液添加到顯微注射針中，采用美國WPI公司的PV830PneumatiC Pico Pump型號的顯微 注射儀進行顯微注射操作。注射位點為斑馬魚1 2細(xì)胞期胚胎的卵黃(靠近細(xì)胞部位) 中，每個胚胎注射lnlTgf2 mRNA溶液，轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和Tgf2轉(zhuǎn)座酶mRNA的注射劑量各 約為50pg。注射完畢后，將受精卵放置于28°C的胚胎培養(yǎng)液中正常發(fā)育，在熒光顯微鏡下 觀察不同時期胚胎的熒光表達(dá)情況和轉(zhuǎn)基因效果。結(jié)果顯示參見圖5和圖6，共同注射 PTgf2-zfKrt8-eGFP轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和pCS2_zf β -actin-gfTP輔助質(zhì)粒的胚胎36小時存 活358顆，有綠色熒光191顆(參見圖6)，熒光率為53. 4% ；6天后存活有熒光的斑馬魚仔 魚有172條(共348顆)，整合率為49. 4%。實施例4、輔助質(zhì)粒介導(dǎo)轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒在草魚中的轉(zhuǎn)基因效果實驗所用草魚(Ctenopharyngodon idellus)親魚取自上海海洋大學(xué)青浦魚類育 種試驗站。挑選發(fā)育良好的5齡以上親魚雌32尾，雄32尾。上午10點，給草魚雌親魚打 催產(chǎn)針，每kg魚體重注射促黃體素釋放激素類似物(LRH-A) 4 μ g，雄魚劑量減半。草魚雌雄 親魚放于產(chǎn)卵池中，流水刺激。10小時后，雌雄親魚開始發(fā)情，并開始追逐產(chǎn)卵，在產(chǎn)卵池收 卵口收集剛受精的草魚受精卵備用，在草魚發(fā)情后，草魚受精卵也可進行人工授精獲得。用 大口吸管吸取草魚受精卵約200顆，置于直徑為IOcm的塑料培養(yǎng)皿中，使受精卵平鋪在皿 底上，然后用吸管把皿中的水吸干，便可對受精卵進行顯微注射。顯微注射儀系統(tǒng)2套，由2 位熟練操作人員進行注射。注射位點為草魚受精卵1 2細(xì)胞期胚胎，具體位置為靠近細(xì)胞 部位的卵黃中，每個受精卵約注射Inl溶液，包含轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒(PTgf2-ZfKrt8-eGFP，參 見圖2)和Tgf2轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒(pCS2-zf β -actin-gfTP，參見圖4)劑量各約為50pg。注 射完畢后，在注射培養(yǎng)皿側(cè)面寫好注射質(zhì)粒、時間和劑量。每4小時用吸管換水和挑死卵， 直至出苗。將受精卵放置室溫下正常發(fā)育，定期(每隔6小時)在熒光顯微鏡下觀察熒光 表達(dá)情況。結(jié)果一參見圖7-圖8，注射草魚胚胎組58小時存活454顆，有綠色熒光450顆 (參見圖8)，熒光率為99. 1 %，8天后有熒光的草魚仔魚有245條，整合率為53.9%。結(jié)果 二 在另一注射草魚胚胎組58小時存活621顆，有綠色熒光603顆，熒光率為97. ;8天 后有熒光的斑馬魚仔魚有306條，整合率為49. 3%。以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點。本行業(yè)的技術(shù) 人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實施例的限制，上述實施例和說明書中描述的只是說明本 發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進，這些變 化和改進都落入要求保護的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護范圍由所附的權(quán)利要求書及其 等同物界定。
權(quán)利要求
一種基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，包括Tgf2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和表達(dá)Tgf2轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述Tgf2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供 體質(zhì)粒包括Tgf2轉(zhuǎn)座子包含反向重復(fù)序列的左右臂序列和魚類特異性表達(dá)蛋白的調(diào)控 元件。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述輔助質(zhì)粒在魚類特異 性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件指導(dǎo)下表達(dá)Tgf2轉(zhuǎn)座酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述Tgf2轉(zhuǎn)座子的左 右臂序列及轉(zhuǎn)座酶選自金魚。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述供體質(zhì)粒的魚類特異 性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件為斑馬魚krt8啟動子序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的魚類基因轉(zhuǎn)移載體，其特征在于，所述輔助質(zhì)粒的魚類特異 性表達(dá)蛋白的調(diào)控元件為斑馬魚β -actin啟動子序列。
7.—種如權(quán)利要求1基于Tgf2轉(zhuǎn)座子的魚類基因轉(zhuǎn)移載體的制備方法，包括以下步驟(1)魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒的構(gòu)建運用PCR技術(shù)，分別克隆斑馬魚krt8啟 動子序列；構(gòu)建目的基因表達(dá)盒；通過基因克隆技術(shù)將上述構(gòu)建的包含啟動子和目的基因 表達(dá)盒克隆入Tgf2轉(zhuǎn)座子的左右臂序列所包含反向重復(fù)序列之間，構(gòu)建魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子 轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒；(2)魚類Tgf2轉(zhuǎn)座酶輔助質(zhì)粒的構(gòu)建將斑馬魚β-actin啟動子序列和Tgf2轉(zhuǎn)座酶 編碼基因連接，構(gòu)建能表達(dá)轉(zhuǎn)座酶的輔助質(zhì)粒。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種源于魚類Tgf2轉(zhuǎn)座子的簡便、高效轉(zhuǎn)基因元件及制備方法。由轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒和輔助質(zhì)粒組成。轉(zhuǎn)基因供體質(zhì)粒由魚類啟動子序列，如斑馬魚Krt8啟動子、目的基因、以及金魚Tgf2轉(zhuǎn)座子左右臂序列構(gòu)建。輔助質(zhì)粒由斑馬魚β-actin啟動子序列和金魚Tgf2轉(zhuǎn)座酶編碼基因構(gòu)建。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有操作簡單、轉(zhuǎn)化效率高和低成本特點，為進行魚類轉(zhuǎn)基因研究提供了新方法。
文檔編號C12N15/66GK101962659SQ20101022317
公開日2011年2月2日 申請日期2010年7月9日 優(yōu)先權(quán)日2010年7月9日
發(fā)明者杜雪地, 沈睿杰, 蔣霞云, 袁劍, 鄒曙明 申請人:上海海洋大學(xué)