專利名稱：一種lamb1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用的制作方法
一種LAMB1基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)
用
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體地說關(guān)于一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒及 其檢測方法和應(yīng)用
背景技術(shù)：
2005年美國衛(wèi)生研究院、癌癥研究院、疾控中心等多家單位做了一個年度報告， “認(rèn)為人類在抗癌大戰(zhàn)中是失敗”，也就是說癌癥死亡率沒有降低，其列舉出造成抗癌大戰(zhàn) 失敗的幾個因素是1、腫瘤細(xì)胞異質(zhì)性；2、腫瘤細(xì)胞耐藥性；3、抗癌藥物設(shè)計思路不完善 等。同時，該報告中亦提出應(yīng)重新審視現(xiàn)有診治癌癥的措施。本發(fā)明人在研究中發(fā)現(xiàn)，導(dǎo)致 癌癥死亡率不降的另二個重要原因是1、不能做到真正的早期診斷；2、轉(zhuǎn)移的病理機(jī)制不 清楚。依照傳統(tǒng)的醫(yī)學(xué)影像及和其它生化(如蛋白標(biāo)記物)指標(biāo)來診斷癌癥，認(rèn)為占位性 癌塊在2公分下是屬于早期癌癥的診斷(更小些有時無癥狀體征)，這一臨床概念值得認(rèn) 真討論。影像醫(yī)學(xué)的2公分以下癌塊屬早期這一界定科學(xué)性是不夠嚴(yán)謹(jǐn)?shù)?，從?xì)胞學(xué)角度， 1公分的腫塊約有一億個腫瘤細(xì)胞，2公分的腫塊其三維空間的細(xì)胞疊加數(shù)遠(yuǎn)不止2億個腫 瘤細(xì)胞，從癌變前期到單克隆癌細(xì)胞產(chǎn)生及形成2公分的癌塊，其病理演變過程相當(dāng)長，可 能是一年或兩年、甚至三年以上，很難證實的是在這個過程中，腫塊是癌癥唯一的發(fā)生地和 單獨的病灶。臨床上已證實一旦形成腫塊的同時，其他癌細(xì)胞通過不同途徑遷移到其他 部位克隆生長；一旦切除原發(fā)灶后，其他器官復(fù)發(fā)灶或多發(fā)癌塊灶先后形成或轉(zhuǎn)移。因此， 在臨床上以2公分以下的腫塊大小來界定早期與否，不夠嚴(yán)謹(jǐn)(有些病例，在發(fā)現(xiàn)原發(fā)病灶 時，同時發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移病灶，不在我們表述的內(nèi)容中)，這時已經(jīng)是晚期了，這是導(dǎo)致癌癥死亡率 不降的真正原因。層粘連蛋白及其受體，層粘連蛋白(laminin，LN)是基底膜基質(zhì)的一種多功能 結(jié)構(gòu)性糖蛋白，與其受體(LNR)結(jié)合參與細(xì)胞的黏著、運動、增殖、生長和分化等多種功 能。層粘連蛋白受體是存在于許多不同細(xì)胞表面的跨膜糖蛋白，又稱層粘連蛋白結(jié)合蛋白 1 (laminin-binding protein-1，LBP1、LAMB1)。在腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移中，具侵襲特性的癌細(xì) 胞LNR較多并分布于細(xì)胞的整個表面，且大多被LN所飽和，因而使正常細(xì)胞能結(jié)合更多的 LN，這樣為腫瘤細(xì)胞的黏著和侵襲過程提供了分子基礎(chǔ)。LN的作用是通過細(xì)胞膜上的LNR 而發(fā)揮，不同轉(zhuǎn)移潛能腫瘤細(xì)胞表面LNR數(shù)目不同，高轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞比低轉(zhuǎn)移癌細(xì)胞LNR表達(dá) 水平高，LNR過度表達(dá)與HCC的轉(zhuǎn)移有關(guān)。LN、LNR在HCC中的表達(dá)均顯著高于癌旁組織， 且與HCC分級呈正相關(guān)，浸潤型生長、有轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑> 3cm者LN、LNR及增殖細(xì)胞核抗 原(PCNA)的高表達(dá)，而膨脹型生長、無轉(zhuǎn)移、腫瘤直徑< 3cm者多表達(dá)低，細(xì)胞內(nèi)LN、LNR 及PCNA可作為評判肝細(xì)胞癌惡性程度及臨床預(yù)后的良好指標(biāo)。在其他上皮細(xì)胞腫瘤，如乳 癌、腸癌、卵巢癌腫同樣證明LNR的表達(dá)水平與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力及預(yù)后密切相關(guān)。 LAMBl 基因，NM_002291，5866bp mRNA，7q22〃，cds :336…5696bp。隨著分子生物技術(shù)日益完善，功能基因組學(xué)，癌癥基因組學(xué)等研究的深入展開，至今，我們已有可能在基因水平上做更精確的早期診斷，在癌變前期或癌細(xì)胞形成(單克隆 時)就能做到早期預(yù)測診斷。本發(fā)采用核酸原位雜交技術(shù)檢測LAMBl基因，對癌細(xì)胞的早 期轉(zhuǎn)移有非常重要的臨床意義。原位雜交技術(shù)(in situ hybridization)是將分子生物學(xué)與細(xì)胞化學(xué)技術(shù)結(jié)合起 來，以標(biāo)記的核酸分子為探針，在組織細(xì)胞原位檢測特異性核酸分子的技術(shù)。其原理是使含 有特異序列、經(jīng)過標(biāo)記的核酸單鏈(即探針)，在適宜條件下與組織細(xì)胞中的互補核酸單鏈 即靶核酸發(fā)生雜交，再以放射自顯影或免疫細(xì)胞化學(xué)方法對標(biāo)記探針進(jìn)行探測，從而在細(xì) 胞原位顯示特異的DNA或RNA分子。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種LAMBl基因的原位雜交檢測試 劑盒的用途。本發(fā)明的再一的目的是，提供一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒。本發(fā)明的另一的目的是，提供一種LAMBl基因的原位雜交檢測方法。為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)疾病藥物 中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。所述的癌癥是肝癌、乳腺癌、腸癌或卵巢癌。所述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示的RNA序列。所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素 中的一種。所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。所述的試劑盒還包括增效劑，所述的增效劑是堿性磷酸酶抗體。為實現(xiàn)上述第二個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其中所述的雜交 探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。為實現(xiàn)上述第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是一種LAMBl基因的原位雜交檢測方法，該方法包括以下步驟a、將試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。本發(fā)明的診斷試劑盒的組份是由雜交探針，雜交液，顯色劑，增效劑等組成。本試 劑盒的核酸雜交原理是分子生物學(xué)業(yè)內(nèi)人士均熟知，具體操作步驟是標(biāo)本處理、預(yù)雜交、雜 交、免疫組化染色、鏡下進(jìn)行定量分析、結(jié)果報告，其中雜交的具體步驟包括儀器操作1).將待測標(biāo)本放入反應(yīng)槽中；2).儀器自動棄去液體，自動加消化液；3).儀器自動棄去液體，自動后固定；
4).儀器自動棄去液體，自動預(yù)雜交(42°C )；5).儀器自動棄去液體，自動清洗；6).儀器自動棄去液體，自動雜交(42°C )；7).儀器自動棄去液體，自動清洗；8).儀器自動棄去液體，自動與DIG抗體培養(yǎng)(室溫)；9).儀器自動棄去液體，自動清洗，顯色；10).取出封片鏡檢。本發(fā)明優(yōu)點在于1、本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點。2、本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。3、本發(fā)明的診斷試劑盒與臨床上其它檢測癌胚蛋白標(biāo)志物，以及影像醫(yī)學(xué)檢查有 顯著不同。本發(fā)明可以在基因水平上檢測LAMBl基因異常表達(dá)，在影像醫(yī)學(xué)檢查未發(fā)現(xiàn)占 位性癌病灶復(fù)發(fā)之前，癌癥生化指標(biāo)未產(chǎn)生異常之前，亦未形成腫瘤之前，能及早做到以上 基因表達(dá)異常的信息采集，給臨床癌癥病患一個真正的早期診斷以及治療后轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)及早 預(yù)測。這樣才有可能實施癌癥的早期診斷、早期預(yù)防、早期治療，有可能從源頭上徹底根治 癌癥惡疾。

圖1是本發(fā)明實施例中肝癌轉(zhuǎn)移病人LAMBl基因表達(dá)圖片。圖2是本發(fā)明實施例中乳腺癌轉(zhuǎn)移病人LAMBl基因表達(dá)圖片。圖3是本發(fā)明實施例中腸癌轉(zhuǎn)移病人LAMBl基因表達(dá)圖片。圖4是本發(fā)明實施例中卵巢癌轉(zhuǎn)移病人LAMBl基因表達(dá)圖片。圖5是本發(fā)明實施例中正常人LAMBl基因表達(dá)圖片。
具體實施方式下面結(jié)合附圖對本發(fā)明具體實施方式
作詳細(xì)說明。實施例1一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物、增效劑，其中，所 述的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示。雜交探針用地高辛標(biāo)記。試劑盒中的其它液體和 標(biāo)本組成如下消化液100 μ 1/管:1管”^ 無色透明液體
保護(hù)液100 μ 1/管1管”^ 無色透明液體
預(yù)雜交液1300 μ 1/ 1f 2管"^ 無色透明液體
正義雜交液10μ 1/管1管”^ 無色透明液體
反義雜交液10μ 1/管1管”^ 無色透明液體
封閉液1000 μ 1/ 1f 1管”^ 無色透明液體
堿性磷酸酶抗體ι μ 1/管1管”^ 無色透明液體
顯色劑A175 μ 1/|r 1 管/:盒 黃色液體
顯色劑B320 μ 1/ ιr ι管/:盒 無色透明液體緩沖液I IOx90ml,/瓶1瓶/iE 淺]黃色或無色透明液體緩沖液II IOx80ml,/瓶1瓶/iE 淺]黃色或無色透明液體緩沖液III IOx20m/瓶3瓶/盒淺 t色或無色透明液體緩沖液IV IOx90ml,/瓶1瓶/盒淺 t色或無色透明液體固定液90ml/'瓶1瓶/盒無色透明液體陽性對照標(biāo)本6片/ιπτ.
上述試劑成分說明(所有試劑購自SIGMA)
1、消化液:20mg/ml蛋白酶 K，IOOmg 蛋白酶 K，加 DEPC-H2O 5ml ；
2、保護(hù)液0.2g的glycine加入Iml的IX緩沖液I ；
3、預(yù)雜交液1X緩沖液II7. 5ml 50XD 3ml
10mg/ml yest t-RNA 750ul llmg/ml SALMON TESTES DNA 682ul 0.04M EDTA 3ml 50% formamide 15ml
4、封閉液0.03g的bloking(購買自羅氏公司)加入ImlIX緩沖液III ；
5、IOx緩沖液 I (PH7. 1-7. 4) NaCl 80g
Na2HPO4. 12H20 360g KCl 2g KH2PO4 2g
加三蒸水至11，并高壓滅菌；
6、IOx緩沖液 II (PH7. 0) NaCl 175.3g 檸檬酸鈉88. 2g HCl幾滴
加三蒸水至11，并高壓滅菌；
7、緩沖液III (PH7. 9) Tris 121.Ig NaCl 87.66g HCl 60ml 左右 加三蒸水至11，并高壓滅菌；
8、緩沖液IV:
IM Tris-HCl (PH9. 5) =Tirs 121. Ig 加 HCl 3ml 左右，加水 900ml，調(diào) PH 至 9. 5，加 11，并高壓滅菌；
IM NaCl =NaCl 58. 44加水至11，并高壓滅菌； 0. 5M MgCl2 101. 65g MgCl2. 6H20 加水至 11，并高壓滅菌;
9、固定液多聚甲醛40g加IX緩沖液I至11，稍加熱(約50-60度)攪拌至溶
10、顯色劑 A =NBT Ig 加 70% DMFl 1. 44ml ；11、顯色劑 B =BCIP Ig 加 100% DMF30ml。本發(fā)明的試劑盒可以多人份使用或一人份使用。實施例2一種LAMBl基因原位雜交檢測方法及其試劑盒應(yīng)用一、標(biāo)本處理1、用IOml的離心管，裝4. 5ml淋巴細(xì)胞分離液，再將3ml抗凝血緩慢加入含有淋 巴細(xì)胞分離液(血淋巴細(xì)胞分離液=1 1.5)的離心管中，2000r/min離心IOmin ；2、吸取中間層白細(xì)胞至另一離心管中，再在此管中加入約兩倍的IX緩沖液I，混 勻，1500g/min 離心 IOmin ；3、棄上清.沉淀加入約兩倍的1 X緩沖液I，混勻，1500g/min離心IOmin ；4、棄上清，并把試管口多余的液體用擦手紙吸去。再將沉淀制成懸液，滴在玻片上 推片，自然干燥。(有條件的醫(yī)院可以用制片機(jī)制片。)3ml血，可以做4張片子；5、用40ml 4%固定液，在玻璃缸中，固定30min，再用IX緩沖液I洗5min。每缸 可以放16片；6、標(biāo)本可保存在_20°C，或繼續(xù)做實驗。二、將試劑盒中試劑配制成使用濃度1、將IOX緩沖液I用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液I ；2、將20X緩沖液II用三蒸水按1 10稀釋成2X緩沖液II ；按1 100稀釋成0. 2X緩沖液II ；按1 200稀釋成0. 1 X緩沖液II ；3、將IOX緩沖液III用三蒸水按1 10稀釋成IX緩沖液III;4、10X緩沖液IV用三蒸水按1 10稀釋成X緩沖液IV (取1#，2#，3#各10ml， 加水至IOOml既可)。三、實驗步驟1、取每位待檢者標(biāo)本兩張，(另外兩張留作復(fù)查用)及陽性對照標(biāo)本兩張(每次 實驗做一對陽性對照)；2、在玻璃缸里加消化液(消化液IOOul加IX緩沖液199.9ml，即為使用濃 度)20ml。37°C水浴預(yù)熱10分鐘。放進(jìn)16張玻片，37°C處理12min，再用1 X緩沖液I洗 5min ；3、用0. 2%的保護(hù)液(保護(hù)液Iml加IX緩沖液I99ml即為使用濃度)洗IOmin, 三蒸水洗5min，以上過程都在玻璃缸進(jìn)行。玻片自然干燥；4、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加預(yù)雜交液20ul/片.蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在 42°C恒溫水浴箱中3h以上；5、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)，用70%，90%，95%的乙醇各洗 2min,自然干燥；6、將玻片放入保濕盒內(nèi)，每位病人標(biāo)本兩張，一張加正義雜交液20ul/片，另一張 加反義雜交液20ul/片，蓋上蓋玻片，蓋緊保濕盒，放在42°C恒溫水浴箱中16-24h ；7、取出玻片，棄去蓋玻片，將玻片放入玻璃缸內(nèi)在42°C恒溫水浴箱中用2X緩沖液II洗兩次，每次15min
在42°C恒溫水浴箱中用0. 2X緩沖液II洗一次，每次15min在42°C恒溫水浴箱中用0. 1 X緩沖液II洗兩次，每次15min ；8、用IX緩沖液III洗30s，取出玻片，自然干燥；9、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加0.5% 1封閉液(Iml封閉液加5ml IX緩沖液 III) IOOul/片，蓋緊保濕盒，在室溫下作用30min ；10、取出玻片，用IX緩沖液III洗30s，自然干燥；11、將玻片放入保濕盒內(nèi)，加堿性磷酸酶抗體(加入1.8ml 1 X緩沖液III) IOOul/ 片，蓋緊保濕盒在室溫下作用30min ；12、取出玻片，用IX緩沖液III洗3次，每次15min;13、IX緩沖液IV洗2min，加顯色劑(顯色劑A73. 3ul，顯色劑B157. 5ul加到30ml 1 X緩沖液IV中，混勻)，室溫避光12h以上；14、用三蒸水洗5min，自然干燥，(用甘油加10%的IX緩沖液I混勻)封片鏡檢。四、結(jié)果判斷在光鏡下計數(shù)100-300個細(xì)胞，計算染上紫色細(xì)胞的百分比。陽性對照標(biāo)本加反義雜交液的應(yīng)該80%以上染上紫色。所有加正義雜交液的陰性內(nèi)對照應(yīng)無色。地高辛標(biāo)記的cDNA、RNA和寡核苷酸探針，不但探針的具有生物素標(biāo)記優(yōu)點，還克 服了生物素標(biāo)記的探針在原位雜交過程中受組織內(nèi)源性生物素干憂等缺點)，將該雜交探 針與人體血液白細(xì)胞的待測RNA核酸進(jìn)行雜交，再用免疫組化的方法顯色，在光鏡下觀察 mRNA的存在和定位，根據(jù)染色的細(xì)胞數(shù)，判斷目的基因的表達(dá)量。本發(fā)明方法是目前常用的核酸原位雜交技術(shù)，該方法通過檢測底物細(xì)胞中的 LAMBl基因表達(dá)量，用來確定癌癥是否發(fā)生和/或轉(zhuǎn)移。臨床研究表明，LAMBl基因具有廣譜性，因為LAMBl基因在正常人中表達(dá)低或零表 達(dá)。如果LAMBl基因高表達(dá)，說明癌癥已經(jīng)復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移、擴(kuò)散，從而獲得癌癥的診斷信息。當(dāng) 檢測到LAMBl基因的表達(dá)高于正常對照時，則可預(yù)測受試者為癌癥早期轉(zhuǎn)移或癌癥轉(zhuǎn)移易 感者，這些癌癥包括肝癌、乳腺癌、腸癌或卵巢癌。本發(fā)明實施例采樣為肝癌轉(zhuǎn)移病人5名，乳腺癌轉(zhuǎn)移病人5名，腸癌轉(zhuǎn)移病人5 名，卵巢癌轉(zhuǎn)移病人5名，正常對照組5名。抽所有待檢人的外周血3-5毫升(分離白細(xì) 胞)做原位雜交。結(jié)果表示，所有癌癥轉(zhuǎn)移病人LAMBl基因有過度表達(dá)，細(xì)胞染色；正常對 照組LAMBl基因不表達(dá)，細(xì)胞無染色。具體結(jié)果請見圖1，圖2。實施例3用LAMBl基因試劑盒檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移疾病與用CA125基因試劑盒檢測乳腺癌轉(zhuǎn)移 疾病之間平行實驗。為了科學(xué)評價上述基因各自在乳腺癌轉(zhuǎn)移疾病的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性。我們 用平行試驗的方法，同時檢測上述基因的mRNA，檢測技術(shù)采用核酸原位雜交技術(shù)，用同一 例乳腺癌轉(zhuǎn)移疾病患者的外周血，同時檢測LAMBl基因和CA125(CA125(腫瘤標(biāo)記物)， NM-024690)基因的mRNA(進(jìn)行核酸原位雜交、免疫組化染色、鏡下記數(shù)、結(jié)果報告等均采用 實施例1和實施例2的原位雜交技術(shù)的相同方法和步驟及試劑)。發(fā)現(xiàn)LAMBl基因在乳腺 癌轉(zhuǎn)移疾病病人中表達(dá)量比CA125基因在同一疾病病人的表達(dá)量要高。結(jié)果表明，LAMBl基因?qū)θ橄侔┺D(zhuǎn)移疾病診斷的特異性、敏感性、準(zhǔn)確性比CA125基因更好，原位雜交基因表達(dá) 圖顯示，LAMBl基因的表達(dá)量是75%，CA125基因的表達(dá)量是46%。本發(fā)明的試劑盒作于乳 腺癌轉(zhuǎn)移疾病診斷的指標(biāo)有非常重要的臨床意義。SEQUENCE LISTING<110>芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司<120> 一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒及其檢測方法和應(yīng)用<130>/<160>1<170>PatentIn version 3. 3<210>1<211>5866<212>DNA<213> 智人(Homo sapiens)<400>1
0152]gggacctggaagcgccccagccccgcagcgatcgcagattcggctttcaaacaaaagagg600153]CgCCCCggggggtgggaccgggacctcacccggtcctcgcagagttgcggccgcccgccc1200154]cttcagccccggctctccgtatgcgcatgagcagaggcgcctccctctgttcctcccaag1800155]gctaaactttctaattcccttctttgggctcgggggctcccggagcagggcgagagctcg2400156]cgtcgccggaaaggaagacgggaagaaagggcaggcggctcggcgggcgtcttctccact3000157]cctctgccgcgtccccgtggctgcagggagccggcatggggcttctccagttgctagctt3600158]tcagtttcttagccctgtgcagagcccgagtgcgcgctcaggaacccgagttcagctacg4200159]gctgcgcagaaggcagctgctatcccgccacgggcgaccttctcatcggccgagcacaga4800160]agctttcggtgacctcgacgtgcgggctgcacaagcccgaaccctactgtatcgtcagcc5400161]acttgcaggaggacaaaaaatgcttcatatgcaattcccaagatccttatcatgagaccc6000162]tgaatcctgacagccatctcattgaaaatgtggtcactacatttgctccaaaccgcctta6600163]agatttggtggcaatctgaaaatggtgtggaaaatgtaactatccaactggatttggaag7200164]cagaattccattttactcatctcataatgactttcaagacattccgtccagctgctatgc7800165]tgatagaacgatcgtccgactttgggaaaaCCtggggtgtgtatagatacttcgcctatg8400166]actgtgaggcctcgtttccaggcatttcaactggccccatgaaaaaagtcgatgacataa9000167]tttgtgattctcgatattctgacattgaaccctcaactgaaggagaggtgatatttcgtg9600168]ctttagatcctgctttcaaaatagaagatccttatagcccaaggatacag3.3. 3. 3.3.10200169]aaattaccaacttgagaatcaagtttgtgaaactgcatactttgggagataaccttctgg10800170]attccaggatggaaatcagagaaaagtattattatgcagtttatgatatggtggttcgag11400171]gaaattgcttctgctatggtcatgccagcgaatgtgcccctgtggatggattcaatgaag12000172]aagtggaaggaatggttcacggacactgcatgtgcaggcataacaccaagggcttaaact12600173]gtgaactctgcatggatttctaccatgatttaccttggagacctgctgaaggccgaaaca13200174]gcaacgcctgtaaaaaatgtaactgcaatgaacattccatctcttgtcactttgacatgg13800175]ctgtttacctggccacggggaacgtcagcggaggcgtgtgtgatgactgtcagcacaaca14400176]ccatggggcgcaactgtgagcagtgcaagccgttttactaccagcacccagagagggaca1500
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aatgctcttcaaaataaaacatcacctatttaatgtttttaatcacattttgtatggagt5820
taaataaagtacagtgcttttgtataaaaa586權(quán)利要求
一種LAMB 1基因的原位雜交檢測試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)疾病藥物中的應(yīng)用，所述的試劑盒包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的癌癥是肝癌、乳腺癌、腸癌或卵巢癌。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于所述的雜交探針序列如SEQID NO. 1所 示的RNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的標(biāo)記物選自放射性核素或 非放射性標(biāo)記物。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的放射性核素選自3H、35S、125I或32P 中的一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物選自生物素、地高 辛、堿性磷酸酶、辣根過氧化酶或熒光素中的一種。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于所述的非放射性標(biāo)記物優(yōu)選自地高辛。
8.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的應(yīng)用，其特征在于所述的試劑盒還包括增效劑，所述 的增效劑是堿性磷酸酶抗體。
9.一種LAMBl基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，其特征在于，所述 的雜交探針序列如SEQ ID NO. 1所示，所述的標(biāo)記物選自放射性核素或非放射性標(biāo)記物。
10.一種LAMBl基因的原位雜交檢測方法，其特征在于，該方法包括以下步驟a、將權(quán)利要求9所述試劑盒中的雜交探針與底物中待測RNA接觸，形成雜交復(fù)合體；b、檢測a步驟得到的雜交復(fù)合體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的檢測方法，其特征在于a步驟中形成雜交復(fù)合體的條件 為核酸雜交的溫度為42°C;核酸雜交的時間為16-24小時，所述的底物選用血液細(xì)胞標(biāo)本 或組織細(xì)胞標(biāo)本。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種LAMB1層粘連蛋白結(jié)合蛋白1(laminin-bindingprotein-1，LBP1、LAMB1)基因的原位雜交檢測試劑盒，包括雜交探針、標(biāo)記物，所述的雜交探針序列如SEQ ID NO.1所示。本發(fā)明還提供了一種LAMB1基因原位雜交檢測方法。另外，本發(fā)明還提供了試劑盒在制備檢測癌癥早期轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)疾病藥物中的應(yīng)用。本發(fā)明優(yōu)點在于本發(fā)明提供的試劑盒具有靈敏度高、特異性強(qiáng)的特點。本發(fā)明的檢測方法操作方便、簡單，能在區(qū)級以上醫(yī)院普遍使用和推廣。
文檔編號C12Q1/68GK101993927SQ20091005616
公開日2011年3月30日 申請日期2009年8月10日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月10日 公開號200910056163.0
發(fā)明者張云福, 裘建英 申請人:芮屈生物技術(shù)(上海)有限公司