本發(fā)明涉及一種試劑盒，具體涉及一種腫瘤相關(guān)基因PDGFRA基因突變檢測(cè)試劑盒。
背景技術(shù)：
：胃腸道間質(zhì)瘤（GIST）是消化道最常見的間葉源性腫瘤。PDGFRA基因編碼的蛋白質(zhì)是血小板衍生生長(zhǎng)因子受體A(PDGFRA)，為一種單鏈跨膜糖蛋白，與C-KIT同屬III型酪氨酸蛋白激酶家族，且結(jié)構(gòu)相似，兩者的氨基酸序列有很高的同源性。PDGFRA與配體PDGF結(jié)合后形成受體配體復(fù)合物并活化PDGFRA，從而啟動(dòng)磷脂酰肌醇、cAMP及多種蛋白質(zhì)的磷酸化通路，通過各種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路將有絲分裂等信號(hào)傳遞入細(xì)胞核，誘導(dǎo)相應(yīng)基因表達(dá)，促進(jìn)DNA合成，細(xì)胞分裂和增殖。當(dāng)受體或配體發(fā)生異常突變，可導(dǎo)致惡性腫瘤。研究發(fā)現(xiàn)，PDGFRA基因D842V突變是導(dǎo)致GIST患者對(duì)格列衛(wèi)產(chǎn)生原發(fā)耐藥性的原因。PDGFRA突變與c-kit基因突變是相互獨(dú)立的。因此，檢測(cè)腫瘤患者PDGFRA基因突變的情況可用于判斷格列衛(wèi)(Imatinib/Glivec/Gleevec)治療是否有效。PDGFRA基因突變的檢測(cè)主要有Sanger測(cè)序法、ARMS、RT-PCR等。其中RT-PCR技術(shù)采用等位基因特異性擴(kuò)增法對(duì)樣本的基因突變進(jìn)行區(qū)分，該方法成本較低，但檢測(cè)率較高，容易出現(xiàn)假陰性結(jié)果；ARMS技術(shù)是目前國(guó)內(nèi)應(yīng)用最為廣泛的技術(shù)，但只能檢測(cè)已知的位點(diǎn)，且要將樣本分成多個(gè)管進(jìn)行實(shí)驗(yàn)才能實(shí)現(xiàn)分型，對(duì)樣本量要求高；而Sanger測(cè)序法是DNA序列分析的經(jīng)典方法，最直接的、可檢測(cè)已知和未知突變的一種方法。由于該方法可直接讀取DNA的序列，因此被認(rèn)為是基因分型的金標(biāo)準(zhǔn)，其主要優(yōu)點(diǎn)是測(cè)序長(zhǎng)度較長(zhǎng)，可發(fā)現(xiàn)新的變異位點(diǎn)，包括一些新的少見的突變形式及突變的確切類型，如點(diǎn)突變、片段缺失。所以探索一種可以采用Sanger測(cè)序法檢測(cè)PDGFRA基因的技術(shù)具有重要的臨床意義。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是為了解決上述問題，提供一種PDGFRA基因突變檢測(cè)試劑盒，可直接利用含人體某組織部位的石蠟包埋樣本通過Sanger測(cè)序法檢測(cè)出樣本中PDGFRA基因主要突變位點(diǎn)型別，檢測(cè)位點(diǎn)包括PDGFRA基因12和18兩個(gè)外顯子的主要突變位點(diǎn)，包括但不限于12號(hào)外顯子上c.1682T>A,p.V561D突變位點(diǎn)；18號(hào)外顯子上c.2525A>T,p.D842V突變位點(diǎn)。本發(fā)明的PDGFRA基因突變檢測(cè)試劑盒具體包括：（1）用于擴(kuò)增樣本中PDGFRA基因Exon12和18兩個(gè)外顯子的特異性引物，具體序列如下:（2）用于測(cè)序PCR的測(cè)序引物，分別用于對(duì)PDGFRA基因Exon12和18兩個(gè)外顯子進(jìn)行測(cè)序分析，具體序列如下：外顯子名稱序列號(hào)Reverse5’-3’12SEQ-PD12SEQIDNo.5GCAAGGGAAAAGGGAGTCTT18SEQ-PD18SEQIDNo.6ACCATGGATCAGCCAGTCTT（3）2個(gè)裝有PDGFRA野生型質(zhì)粒和突變型質(zhì)粒按1:1質(zhì)量比例混合的陽性質(zhì)控品管和1個(gè)裝有PCR反應(yīng)預(yù)混液的試管；其中突變型質(zhì)粒包括12號(hào)外顯子上c.1682T>A,p.V561D突變位點(diǎn)；18號(hào)外顯子上c.2525A>T,p.D842V突變位點(diǎn)；PCR反應(yīng)預(yù)混液由以下組份組成：組份體積（μl）10PCRbuffer2.55Qsolution525mMMgCl20.7525mMdNTPs0.4H2O11.1其中10×PCRbuffer中含有500mMKCl，100mMTris-HCl(pH8.3)，100mM(NH4)2SO4，和15mMMgCl2；5×Qsolution中含有1MTricine[pH8.7(withKOH)]，8%(v/v)Glycerol和5%(v/v)DMSO；25mMdNTPs中含有25mMdATPs、25mMdTTPs、25mMdCTPs和25mMdGTPs。本試劑盒主是根據(jù)PDGFRA基因的Exon12和18兩個(gè)外顯子的保守序列分別設(shè)計(jì)PDGFRA基因四個(gè)外顯子的特異性引物，分別將Exon12和18兩個(gè)外顯子使用PCR的方法進(jìn)行擴(kuò)增，純化回收擴(kuò)增產(chǎn)物。本發(fā)明的各種引物長(zhǎng)度在20-25個(gè)堿基之間，無特殊修飾。反應(yīng)液預(yù)混液采用獨(dú)特的配方及比例。不同外顯子的PCR擴(kuò)增條件一致，且能在樣本濃度較低時(shí)檢測(cè)到目的基因，結(jié)果無非特異性擴(kuò)增。具體操作流程包括：（1）引物設(shè)計(jì)：利用引物設(shè)計(jì)軟件，如PrimerPremier5，從PDGFRA基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互補(bǔ)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)PDGFRA基因Exon12和18兩個(gè)外顯子的特異性引物，用于擴(kuò)增樣本中DNA，引物序列分別是SEQIDNOs：1-4。。測(cè)序引物的設(shè)計(jì)與用于擴(kuò)增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計(jì)類似，不過測(cè)序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNOs：5-6。（2）PCR擴(kuò)增：利用試劑盒中含特定序列的引物PCR擴(kuò)增臨床樣本中的DNA。（3）瓊脂糖凝膠電泳及膠回收：將擴(kuò)增得到的目的基因PDGFRA的Exon12和18兩個(gè)外顯子片段回收用于測(cè)序。附圖說明以下是附圖的說明，以便于理解上述發(fā)明的目的和具體特征。圖1為PDGFRA基因的Exon12和18兩個(gè)外顯子的PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果。圖1中各標(biāo)號(hào)的具體表示如下：1：1號(hào)樣本；2：2號(hào)樣本；3：3號(hào)樣本；4：4號(hào)樣本；5：5號(hào)樣本；6：6號(hào)樣本；P12：PDGFRA基因第12號(hào)外顯子；P18：PDGFRA基因第18號(hào)外顯子；M：DNAmaker，從上到下大小依次為2000、1000、750、500、250和100。圖2-1為PDGFRA基因的Exon12外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為野生型。圖2-2為PDGFRA基因的Exon12外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為突變體。圖2-3為PDGFRA基因的Exon18外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為野生型。圖2-4為PDGFRA基因的Exon18外顯子的測(cè)序結(jié)果截圖，測(cè)序結(jié)果為突變體。具體實(shí)施方式1、引物設(shè)計(jì)根據(jù)PDGFRA基因在肺癌等疾病中的突變情況及個(gè)體化治療后產(chǎn)生的耐藥機(jī)制，利用引物設(shè)計(jì)軟件，如PrimerPremier5，從PDGFRA基因DNA序列中挑選特定的序列，然后根據(jù)堿基互補(bǔ)特點(diǎn)，設(shè)計(jì)PDGFRA基因Exon12和18兩個(gè)外顯子的特異性引物，用于擴(kuò)增樣本中DNA。引物序列分別是SEQIDNos：1-4。測(cè)序引物的設(shè)計(jì)與用于擴(kuò)增樣本中DNA的特異性引物的設(shè)計(jì)類似，不過測(cè)序引物只需要一段即可，引物序列分別是SEQIDNos：5-6。2、PCR擴(kuò)增2.1、質(zhì)控品準(zhǔn)備陽性質(zhì)控品為PDGFRA野生型和突變型質(zhì)粒按質(zhì)量比1:1的比例混合，陰性質(zhì)控品為無菌水。使用前室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時(shí)離心10秒。2.2、試劑配制提前將試劑取出，室溫融化，旋渦振蕩10秒，瞬時(shí)離心10秒。確定反應(yīng)數(shù)N，N=待檢樣本數(shù)（n）×2+質(zhì)控品數(shù)+1。計(jì)算加到反映混合物中的各個(gè)試劑的量，計(jì)算如下：組分PCRmix（即PCR反應(yīng)預(yù)混液）Taq酶體積（μl）19.75×N0.25×N取一個(gè)滅菌離心管配制上述反應(yīng)體系，試劑全部加入后旋渦振蕩10秒，瞬時(shí)離心。然后將上述混合液按20μl/管分裝至PCR反應(yīng)管中。2.3、加樣將PDGFRA陽性質(zhì)控品、陰性質(zhì)控品和樣本DNA分別取2.5μl加入到PCR反應(yīng)管中，其中樣本要稀釋至20ng/μl；然后再將相應(yīng)的引物加入到對(duì)應(yīng)的PCR反應(yīng)管中，每個(gè)樣本需要引物各加1.25μl（引物用之前先稀釋1/10至10μM），同時(shí)作好標(biāo)記，蓋緊管蓋后，瞬時(shí)離心15秒，將管壁上的液體全部甩至管底，消除氣泡，可重復(fù)離心至氣泡完全消除。然后立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。2.4、PCR擴(kuò)增配置完成后，將PCR管放入PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，PCR反應(yīng)程序如下：3、PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳及回收由于PCR產(chǎn)物長(zhǎng)度較短，配制2%（w/w）的瓊脂糖凝膠；電泳條件為120V，20min。電泳完成后，取出凝膠，使用Bio-Rad凝膠成像系統(tǒng)拍照，并記錄擴(kuò)增條帶情況。如果PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果良好，即可回收目的片段用于測(cè)序?；厥盏玫降漠a(chǎn)物即可用于測(cè)序。序列表<110>廣東凱普生物科技股份有限公司<120>PDGFRA基因突變檢測(cè)試劑盒<160>6<210>1<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx12-F<400>1tccagtcactgtgctgcttc20<210>2<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx12-R<400>2gcaagggaaaagggagtctt20<210>3<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx18-F<400>3accatggatcagccagtctt20<210>4<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>PDGFRAEx18-R<400>4tgaaggaggatgagcctgacc21<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-PD12<400>5gcaagggaaaagggagtctt20<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>SEQ-PD18<400>6accatggatcagccagtctt20當(dāng)前第1頁1 2 3