專(zhuān)利名稱(chēng)：促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液及其配制方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種組織工程皮膚研究中的生物試劑類(lèi)，特別是涉及一種促進(jìn)組織工程皮膚 脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液及其配制方法。
背景技術(shù)：
皮膚是人體最大的器官，它由三部分即表皮層、真皮層和皮下層構(gòu)成。表皮層位于皮膚 的最外層，厚度介于0.06 0.8mm之間，其微結(jié)構(gòu)由基底層、棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角質(zhì) 層構(gòu)成。角質(zhì)層是角質(zhì)形成細(xì)胞分化的最后產(chǎn)物，其組成中75% 80%為蛋白質(zhì)，5% 15% 為脂類(lèi)，由10 15層細(xì)胞構(gòu)成厚度大約10pm的結(jié)構(gòu)。角質(zhì)層許多重要的生理功能與脂質(zhì)結(jié) 構(gòu)相關(guān)，能夠有效阻擋外界毒性化合物對(duì)皮膚活性細(xì)胞的損傷，特別是對(duì)化妝品成分中潛在 可能產(chǎn)生的細(xì)胞毒性有著極為重要的屏障作用。
組織工程皮膚經(jīng)歷了從表皮替代物、真皮替代物到雙層結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚替代物的階 段，其基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究有了廣泛的進(jìn)步。應(yīng)用研究涉及體內(nèi)應(yīng)用和體外應(yīng)用，體內(nèi)應(yīng)用 集中在各種皮膚創(chuàng)傷的治療，體外主要運(yùn)用于化合物的毒性檢測(cè)，如化合物的腐蝕性、剌激 性、光毒性、生殖毒性等的檢測(cè)。體外毒性檢測(cè)方面，歐洲替代方法驗(yàn)證中心(ECVAM)主導(dǎo) 的對(duì)各種動(dòng)物替代方法進(jìn)行的驗(yàn)證工作是一項(xiàng)系統(tǒng)工程，引起了世界范圍的關(guān)注。以組織工 程皮膚為例，進(jìn)行的化合物腐蝕性檢測(cè)目前只有EpiDerm和EpiSkin兩種產(chǎn)品通過(guò)驗(yàn)證，刺 激性檢測(cè)目前有EpiSkin、 SkinEthic RHE和EpiDerm SIT通過(guò)了驗(yàn)證。通過(guò)驗(yàn)證的組織工程 皮膚產(chǎn)品數(shù)量之所以如此少，很大程度上是因?yàn)闃?gòu)建的組織工程皮膚的角質(zhì)層成熟和分化后 脂質(zhì)結(jié)構(gòu)不完全甚至是缺乏所致。因?yàn)榻琴|(zhì)層成熟和分化的不完全，沒(méi)有形成具有良好的脂 質(zhì)結(jié)構(gòu)，造成檢測(cè)化合物對(duì)活性細(xì)胞產(chǎn)生的毒性與其本身體內(nèi)產(chǎn)生毒性的數(shù)據(jù)不符，導(dǎo)致誤 判率偏高，不能達(dá)到要求的預(yù)測(cè)精確度。
目前，市場(chǎng)上還沒(méi)有商業(yè)化的促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液，現(xiàn)有實(shí)驗(yàn)室進(jìn) 行的組織工程皮膚研究所使用的培養(yǎng)液在試劑穩(wěn)定性、細(xì)胞培養(yǎng)效果和促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞分 化能力方面存在不足，而且使用過(guò)程操作繁瑣。經(jīng)檢索，具有穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞培 養(yǎng)效果和促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成能力優(yōu)的培養(yǎng)液，至今尚未見(jiàn)公開(kāi)資料。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種穩(wěn)定性高、操作簡(jiǎn)便、細(xì)胞培養(yǎng)效果和促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì) 結(jié)構(gòu)形成能力優(yōu)的促進(jìn)組織工程表皮脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液，以及其配制方法，和用其培養(yǎng) 角質(zhì)形成細(xì)胞后得到的組織工程皮膚。
一種促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液，其組分及各組分的用量為 (1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液由以下體積百分比的物質(zhì)混配而成
DMEM培養(yǎng)液 F12培養(yǎng)液
胎牛血清
(2)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì) 氫化可的松 表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 異丙基腎上腺素 胰島素 轉(zhuǎn)鐵蛋白 三碘甲狀腺氨酸 腺嘌呤 維生素C 維甲酸
L-絲氨酸
L-肉毒堿
軟脂酸
亞油酸
花生四烯酸
牛腦垂體提取物
牛血清白蛋白
氯化鈣
兩性霉素B
60 70% 20 25% 5 20%
0.4~0.5 pg/mL 5 15 ng/mL l 3xl(T6mol/L 5 15ng/rtiL 5 10 j^g/mL 2 6xlO-9mol/L 1 3xl0"4 mol/L 50 100 jag/mL 4 10 pg/mL 0.1 1 nmol/L 1 3xi(T2 mol/L 1 5x10-5 mol/L 15 35 (imol/L 5 25 jimol/L 5 10拜ol/L 10 50嗎/mL 2 7xl(T5 mol/L 1 3 mmol/L 100 U/mL 100 mg/mL 1 4 mg/mL
5PH值調(diào)整為7.2 7.4。
本發(fā)明的培養(yǎng)液的配制方法，由以下步驟組成
(1) 將購(gòu)買(mǎi)的商用DMEM和F12粉劑分別按照說(shuō)明書(shū)的要求配制成溶液；
(2) 取步驟(1)配制的DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清充分混合，使其體積百分比 分別為總體積的60 70%、 20 25%和5 20%，三者體積份數(shù)和為100%,制成基礎(chǔ)培 養(yǎng)液；
(3) 將氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、維生素C、維甲酸、霍亂毒素、L-絲氨酸、 L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、氯化鈣、 青霉素、鏈霉素、兩性霉素B按照所述用量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)PH值7.2 7.4;
(4) 將步驟(3)得到的溶液用0.2 pm濾器過(guò)濾、分裝，即得所述培養(yǎng)液。 本發(fā)明所述的培養(yǎng)液可以廣泛應(yīng)用在制備組織工程皮膚中。
本發(fā)明還提供一種組織工程皮膚，在其制備過(guò)程中，采用所述的培養(yǎng)液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞 進(jìn)行培養(yǎng)。
本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn) 一是本發(fā)明培養(yǎng)液的穩(wěn)定性強(qiáng)，保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月左右，而現(xiàn)有 實(shí)驗(yàn)室配制的培養(yǎng)液一般只能現(xiàn)配現(xiàn)用，可以產(chǎn)業(yè)化工業(yè)化生產(chǎn)；二是本發(fā)明培養(yǎng)液促進(jìn)組 織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的能力強(qiáng)，1周的培養(yǎng)時(shí)間可使角質(zhì)形成細(xì)胞分化為明顯的基底層、 棘細(xì)胞層、顆粒細(xì)胞層和角質(zhì)層構(gòu)成，形成約10 15個(gè)細(xì)胞厚度的層次，角質(zhì)層也有8 10 個(gè)細(xì)胞厚度的層次，脂質(zhì)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)膽固醇、神經(jīng)酰胺和游離脂肪酸成分與天然皮膚在種類(lèi)和 含量百分比上非常接近；三是本發(fā)明培養(yǎng)液配制方法簡(jiǎn)便，添加物均溶于液體，便于產(chǎn)品的
合成和規(guī)模生產(chǎn)。
利用本發(fā)明的培養(yǎng)液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，制備出的組織工程皮膚，角質(zhì)層成熟和 分化完全，形成了具有良好的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，在檢測(cè)化合物對(duì)活性細(xì)胞產(chǎn)生的毒性時(shí)，可以達(dá)到 基本與皮膚本身體內(nèi)產(chǎn)生毒性的數(shù)據(jù)相符，可達(dá)到要求的預(yù)測(cè)精確度。
具體實(shí)施例方式
為進(jìn)一歩說(shuō)明本發(fā)明，結(jié)合以下實(shí)施例具體闡述 一、培養(yǎng)液的配制 其組分及各組分的用量為 (1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液由以下體積百分比的物質(zhì)混配而成DMEM培養(yǎng)液 65%
F12培養(yǎng)液 25%
胎牛血清 10% (2)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)-
氫化可的松 0.4 0.5 pg/mL
表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 5 15ng/mL
異丙基腎上腺素 l 3xl0—6mol/L
胰島素 5 15pg/mL
轉(zhuǎn)鐵蛋白 5 10pg/mL
三碘甲狀腺氨酸 2 6xlO—9mol/L
腺嘌呤 1 3xl()4mol/L
維生素C 50 100pg/mL
維甲酸 4 10ng/mL
霍亂毒素 0.1 1 nmol/L
L-絲氨酸 l 3xl(T2mol/L
L-肉毒堿 l 5xl0-5mol/L
軟脂酸 15 35pmol/L
亞油酸 5 25 nmol/L
花生四烯酸 5 10pmol/L
牛腦垂體提取物 10 50 pg/mL
牛血清白蛋白 2 7xl(T5mol/L
氯化f丐 l 3mmol/L
青霉素 100U/mL
鏈霉素 100mg/mL
兩性霉素B l 4mg/mL
PH值調(diào)整為7.2 7.4。 其配制方法為-
(1) 將購(gòu)買(mǎi)的商用DMEM和F12粉劑分別按照說(shuō)明書(shū)的要求配制成溶液；
(2) 取歩驟(1)配制的DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清充分混合，三者體積份數(shù)和 為100%,其中三者的體積百分比分別可在60 70%、 20 25%和5 20%范圍內(nèi)自由選擇，制成基礎(chǔ)培養(yǎng)液；
(3) 將氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、維生素C、維甲酸、霍亂毒素、L-絲氨酸、L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、氯化鈣、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B按照所述用量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)PH值7.2 7.45
(4) 將步驟(3)得到的溶液用0.2 濾器過(guò)濾、分裝，即得所述培養(yǎng)液。
二、 培養(yǎng)并得到組織工程皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞和其他皮膚細(xì)胞與生物材料支架復(fù)合后，用此培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，經(jīng)歷液下和氣液面培養(yǎng)一定周期，液下培養(yǎng)3 7d，接著氣液面培養(yǎng)7 14d，即得組織工程皮膚。
三、 此組織工程皮膚的脂質(zhì)檢測(cè)結(jié)果薄層色譜和質(zhì)譜對(duì)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的檢測(cè)顯示膽固醇、神經(jīng)酰胺和自由脂肪酸種類(lèi)和含量與天然皮膚非常接近。
以上所述的實(shí)施例僅僅是對(duì)本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式進(jìn)行描述，并非對(duì)本發(fā)明的范圍進(jìn)行限定，在不脫離本發(fā)明設(shè)計(jì)精神的前提下，本領(lǐng)域普通工程技術(shù)人員對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作出的各種變形和改進(jìn)，均應(yīng)落入本發(fā)明的權(quán)利要求書(shū)確定的保護(hù)范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1. 一種促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液，其特征在于其組分及各組分的用量為(1)基礎(chǔ)培養(yǎng)液由以下體積百分比的物質(zhì)混配而成DMEM培養(yǎng)液60～70％F12培養(yǎng)液 20～25％胎牛血清 5～20％(2)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)氫化可的松0.4～0.5μg/mL表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子 5～15ng/mL異丙基腎上腺素1～3×10-6mol/L胰島素5～15μg/mL轉(zhuǎn)鐵蛋白 5～10μg/mL三碘甲狀腺氨酸2～6×10-9mol/L腺嘌呤1～3×10-4mol/L維生素C 50～100μg/mL維甲酸4～10μg/mL霍亂毒素 0.1～1nmol/LL-絲氨酸 1～3×10-2mol/LL-肉毒堿 1～5×10-5mol/L軟脂酸15～35μmol/L亞油酸5～25μmol/L花生四烯酸5～10μmol/L牛腦垂體提取物10～50μg/mL牛血清白蛋白 2～7×10-5mol/L氯化鈣1～3mmol/L青霉素100U/mL鏈霉素100mg/mL兩性霉素B 1～4mg/mLPH值調(diào)整為7. 2～7.4。
2. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液的配制方法，其特征在于由以下步驟組成(1) 將購(gòu)買(mǎi)的商用DMEM和F12粉劑分別按照說(shuō)明書(shū)的要求配制成溶液；(2) 取步驟(1)配制的DMEM培養(yǎng)液、F12培養(yǎng)液和胎牛血清充分混合，使其體積百分比 分別為總體積的60 70%、 20 25%和5 20%，三者體積份數(shù)和為100%，制成基礎(chǔ)培 養(yǎng)液；(3) 將氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、 轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、維生素C、維甲酸、霍亂毒素、L-絲氨酸、 L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、氯化鈣、 青霉素、鏈霉素、兩性霉素B按照所述用量添加到基礎(chǔ)培養(yǎng)液中，調(diào)節(jié)？11值7.2 7.4;(4) 將步驟(3)得到的溶液用0.2 pm濾器過(guò)濾、分裝，即得所述培養(yǎng)液。
3. 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液在制備組織工程皮膚中的應(yīng)用。
4. 一種組織工程皮膚，其特征在于所述組織工程皮膚在制備過(guò)程中，采用權(quán)利要求l所述 的培養(yǎng)液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
全文摘要
一種促進(jìn)組織工程皮膚脂質(zhì)結(jié)構(gòu)形成的培養(yǎng)液，其在基礎(chǔ)培養(yǎng)液中添加氫化可的松、表皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子、異丙基腎上腺素、胰島素、轉(zhuǎn)鐵蛋白、三碘甲狀腺氨酸、腺嘌呤、維生素C、維甲酸、霍亂毒素、L-絲氨酸、L-肉毒堿、軟脂酸、亞油酸、花生四烯酸、牛腦垂體提取物、牛血清白蛋白、氯化鈣、青霉素、鏈霉素、兩性霉素B等，用此培養(yǎng)液對(duì)角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，得到角質(zhì)層成熟和分化完全、具有良好的脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的組織工程皮膚；此培養(yǎng)液穩(wěn)定性強(qiáng)，保質(zhì)期長(zhǎng)達(dá)12個(gè)月左右，配制方法簡(jiǎn)便，便于產(chǎn)品的合成和規(guī)模生產(chǎn)。
文檔編號(hào)C12N5/071GK101486994SQ20091007830
公開(kāi)日2009年7月22日 申請(qǐng)日期2009年2月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年2月24日
發(fā)明者王軍兵, 艷 程, 董益陽(yáng), 鄒運(yùn)動(dòng) 申請(qǐng)人:中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院