脂質(zhì)納米顆粒及其應用
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種脂質(zhì)相關(guān)吲哚菁綠納米顆粒，用于改善淋巴管、淋巴結(jié)、淋巴系統(tǒng)異常、腫瘤，炎癥和血管造影的功能性高分辨率近紅外熒光醫(yī)學成像。
【專利說明】
脂質(zhì)納米顆粒及其應用
[0001] 相關(guān)申請的奪叉引用
[0002] 本申請要求2015年2月8日提交的美國臨時專利申請第62/113,480號的權(quán)益和 優(yōu)先權(quán)以及2015年4月7日提交的中國專利申請第201510160468. 1號的權(quán)益和優(yōu)先權(quán)， 上述美國臨時專利申請和中國專利申請的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本發(fā)明涉及包含諸如吲哚菁綠（ICG)之類的染料的脂質(zhì)納米顆粒的制備和使用， 用于增強吲哚菁綠近紅外熒光成像的強度和分辨率，并用于體內(nèi)正常或異常組織和細胞的 顯影及診斷。
【背景技術(shù)】
[0004] 為了對疾病進行有效治療和診斷，能夠?qū)κ苡绊懙钠鞴龠M行成像是比較有利的。 目前在本領(lǐng)域中已有多種被廣泛使用的成像技術(shù)；然而，這些技術(shù)往往不具有通用性或者 缺乏能夠識別脈管系統(tǒng)或淋巴系統(tǒng)的對比度。一種研究這些系統(tǒng)的新興技術(shù)是光成像技 術(shù)，其被稱為近紅外熒光（NIRF)成像（~700-900nm)，該技術(shù)因不涉及電離輻射而具有非 常高的安全性，具有最小的來自血液和組織自體焚光（~500-600nm) ( 即，背景信號/焚 光）的干擾，并且是無創(chuàng)的。熒光成像方法涉及使用光線激發(fā)熒光染料并且檢測從染料中 發(fā)射出的熒光，該熒光成像方法被廣泛用于各種類型的生物成像。該方法用于血管造影術(shù)， 并且可用于手術(shù)過程中對血管功能和/或腫瘤轉(zhuǎn)移的評估。不像其他技術(shù)那樣，NIRF成像 還具有使淋巴系統(tǒng)成像的能力，這為臨床醫(yī)師提供了關(guān)于患者體內(nèi)淋巴結(jié)構(gòu)和功能的重要 信息。盡管如此，NIRF成像由于無法使深層組織成像（因光散射問題僅能使~lcm深度的 組織成像）而面臨很多問題。
[0005] ICG是臨床上NIRF成像中所使用的染料（具有820nm發(fā)射波長）并且是美國食品 與藥品管理局（FDA)和歐洲藥物管理局（EMA)唯一批準的用于人體的NIRF分子。ICG被 批準用于心輸出量、肝臟功能和肝臟血流檢測，以及眼部血管造影術(shù)。ICG存在著大量的標 簽外和以研究為目的的使用情況，包括液體填充的解剖學結(jié)構(gòu)（例如，血液、腦脊液、淋巴 或尿液）的可視化，或作為對比劑用于血管、腎臟或其它排泄途徑的顯影（1)。在水性環(huán)境 中，ICG分子聚集并且ICG熒光強度容易衰減（降低整體熒光強度）（2-5)。在血液中，ICG 與血漿蛋白結(jié)合，部分且暫時地改善了其熒光強度，但是最終仍然會與血漿蛋白解離進入 水相環(huán)境中被降解。在體內(nèi)，ICG熒光強度和持續(xù)時間可隨血漿蛋白和脂蛋白濃度的波動 以及個體之間的差異而發(fā)生變化。
[0006] 最近關(guān)于具有多種不同的生理化學性質(zhì)的ICG和脂質(zhì)體的報道描述了將ICG包裹 在脂質(zhì)體內(nèi)的資源密集型制備步驟（多4個步驟）（8-12)。然而，這些具有不同組成的脂質(zhì) 體是在沒有完全理解ICG和脂質(zhì)之間的相互作用的條件下制備的。在一些條件下，當ICG 包裹在脂質(zhì)體的水性腔室內(nèi)時，ICG可能部分或通過物理鍵的形式與脂類分子膜發(fā)生相互 作用。根據(jù)這些方法結(jié)合的脂質(zhì)-ICG以及脂質(zhì)-ICG組合物是不完全且不穩(wěn)定的。這些制 劑不以使ICG插入或嵌入脂質(zhì)中為目的，從而導致ICG脂質(zhì)體組合物無論在產(chǎn)品穩(wěn)定性還 是在真正有效被穩(wěn)定組裝的ICG分子數(shù)目上均存在著很大的變異度，并且在其用作成像產(chǎn) 品方面的結(jié)果也各不相同。而且，哪怕僅一部分ICG可能被包裹進入脂質(zhì)體的水性腔室，也 需要在制備過程中除去游離的ICG，該步驟會增加潛在的污染，并且由于損耗和分離過程而 增加成本。
[0007] 本領(lǐng)域亟需對ICG遞送系統(tǒng)進行改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] -方面，本發(fā)明提供一種組合物，其包含（i)含有脂質(zhì)膜和水性核的脂質(zhì)納米顆 粒，以及（ii)多個吲哚菁綠（ICG)，其中，ICG中的一個或多個嵌入所述脂質(zhì)膜中。
[0009] 在一些實施方式中，脂質(zhì)分子包含1，2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷酸膽堿 (l，2-distearoyl-sn-glycer〇-3-phosphocholine，DSPC)和 1，2_ 二硬脂?；?_sn_ 丙三 基-3_磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二醇-2000 (1，2-distearoyl-sn-glycero_3-phosphoe thanolamine-N-methoxy-polyethylene glycol-2000, DSPEmPEG2000)〇
[0010] 在一些實施方式中，至少約95%的ICG嵌入脂質(zhì)膜中。在一些實施方式中，至少約 99%的ICG嵌入脂質(zhì)膜中。在一些實施方式中，基本約100%的ICG嵌入脂質(zhì)膜中。
[0011] 在一些實施方式中，低于5 %的ICG包裹在水性核中。在一些實施方式中，低于1 % 的ICG包裹在水性核中。在一些實施方式中，沒有可檢測量的ICG包裹在水性核中。
[0012] 在一些實施方式中，脂質(zhì)納米顆粒懸浮于鹽組合物中，所述鹽組合物包含生物相 容性緩沖液，例如，pH為5-8且滲透壓為約303m0SM的生物相容性緩沖液。這些緩沖液的 實例包括生理鹽水，林格氏溶液，5%葡萄糖水溶液或0.9%似(：1和約2〇1111似110) 3的緩沖 液。
[0013] 在一些實施方式中，納米顆粒的平均尺寸是50nm至100nm。
[0014] 在一些實施方式中，納米顆粒表面帶有負電荷。
[0015] 在一些實施方式中，納米顆粒在血清中穩(wěn)定，并且，在25°C下，在熱滅活的大鼠血 清中六小時后保留所述納米顆粒的初始熒光的約90%至約100%。
[0016] 在一些實施方式中，所述納米顆粒的熒光強度是水性溶液中游離ICG的熒光強度 的4倍至5倍。
[0017] 在一些實施方式中，在4°C下儲存0至約300天之后，所述納米顆粒的熒光強度是 水性溶液中游離ICG的熒光強度的4倍至100, 000倍。
[0018] 在一些實施方式中，所述組合物在低于約0. 5mg/kg體重的ICG劑量條件下有效。 在一些實施方式中，所述組合物在約0. 〇lmg/kg體重的ICG劑量條件下有效。
[0019] 另一方面，本發(fā)明提供一種試劑盒，所述試劑盒包含本文提供的組合物/LNP以及 任選地包含如何使用所述試劑盒的說明書。
[0020] 又一方面，本發(fā)明提供一種使受治者體內(nèi)的組織或器官成像的方法，所述方法包 括：將適量的本文提供的組合物給藥于需要進行成像的受治者，獲取所述受治者的組織或 器官的圖像。
[0021] 在一些實施方式中，所述組合物的給藥途徑選自全身給藥和局部給藥，其中，所述 全身給藥包括血管內(nèi)注射，所述局部給藥包括皮下注射、皮內(nèi)注射、粘膜下注射、漿膜下注 射、腫瘤內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、口服、經(jīng)鼻給藥和腫瘤內(nèi)注射。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中， 在通過血管內(nèi)注射的方式給藥的情況下，所述組合物的量等于約0.0 lmg/kg體重ICG劑量 至約0. 5mg/kg體重ICG劑量。在局部給藥本發(fā)明的組合物的情況下，所述組合物的單點注 射量等于約〇? lng至約0? lmg ICG劑量。
[0022] 在一些實施方式中，所述組織或器官選自：淋巴管、二級淋巴組織、血管、諸如動脈 粥樣硬化之類的內(nèi)皮病變，癌癥/腫瘤、諸如在炎癥位點的三級淋巴組織、肝臟、膽管、膽囊 和腸道。
[0023] 再一方面，本發(fā)明提供一種制備納米顆粒的方法，所述方法包括：(a)在有機溶劑 中混合吲哚菁綠（ICG)和脂質(zhì)分子；(b)蒸發(fā)所述有機溶劑以形成包含所述脂質(zhì)分子和ICG 的薄膜，以及（c)使用緩沖鹽水水合所述薄膜并減小顆粒尺寸。
[0024] 在一些實施方式中，所述脂質(zhì)分子包括1，2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷 酸膽堿（DSPC)和1，2_二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二 醇-2000(DSPEmPEG2000)。
[0025] 在一些實施方式中，所述有機溶劑包括乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或DMS0。
[0026] 在一些實施方式中，所述緩沖鹽水包含約0. 9% NaCl和約20mM NaHC03。
[0027] 在一些實施方式中，所述方法不包括過濾步驟，純化步驟或分離步驟或者它們的 組合。
[0028] 再一方面，本發(fā)明提供一種含吲哚菁綠的顆粒，所述顆粒包含吲哚菁綠以及含有 脂質(zhì)膜和水性核的顆粒，其中，所述吲哚菁綠嵌入所述脂質(zhì)膜中。
[0029] 在一些實施方式中，基本上100%的吲哚菁綠嵌入所述脂質(zhì)膜中。在一些實施方式 中，在所述水性核中沒有可檢測量的吲哚菁綠。
[0030] 另一方面，本發(fā)明提供一種用于光成像的對比劑，所述對比劑包含本文提供的含 吲哚菁綠的顆粒和用于分散所述含吲哚菁綠的顆粒的分散介質(zhì)。
【附圖說明】
[0031] 結(jié)合下文列出的示例性實施方式的具體描述可更好地理解本發(fā)明的特點和優(yōu)勢， 示例性的實施方式基于本發(fā)明的基本構(gòu)思，其中涉及的【附圖說明】如下：
[0032] 圖1顯不了二步制備過程的一種實例的不意圖。
[0033] 圖2顯示了通過肌肉組織檢測的ICG-LNP的熒光強度與游離ICG的熒光強度比 較。（A)填充了 30yM游離ICG (頂部）和ICG-LNP (底部）的毛細管的NIR熒光圖像強度。 (B)圖A中填充了不同ICG制劑的兩個相同的毛細管的白光圖像。（C)重疊于填充有游離 ICG (頂部）或ICG-LNP (底部）且放置于雞胸組織方塊下0. 5cm、1. 0cm和1. 5cm (分別從左 至右）的毛細管的可見光圖片上的NIR熒光圖像。（D)圖C中的雞胸組織方塊的可見光圖 像。（E)重疊于放置在雞胸組織方塊下0. 5cm、1. 0cm和1. 5cm的ICG-LNP毛細管的可見光 背景上的NIR熒光圖像。（F)組織方塊厚度的側(cè)視圖。
[0034] 圖3顯示了 ICG-LNP熒光強度以及熒光產(chǎn)量vs.游離ICG的熒光強度以及熒光產(chǎn) 量。（A)脂質(zhì)：ICG摩爾比對ICG熒光產(chǎn)量（每微摩爾ICG的熒光強度）的影響。制備具 有不同脂質(zhì)：ICG摩爾比的ICG-LNP，在標示的濃度條件下測量它們的每單位ICG的熒光強 度。為了清楚起見，只提供八個ICG-LNP制劑中的三個，根據(jù)它們的脂質(zhì)：ICG摩爾比標記它 們的數(shù)據(jù)點：（#)250:1脂質(zhì)：ICG摩爾比，（0 ) 350:1脂質(zhì)：ICG摩爾比，和（_)100:1 脂質(zhì)：ICG摩爾比以及（A)僅ICG。每個熒光強度數(shù)據(jù)點是八次重復測量的平均值土SD。 (B)脂質(zhì)：ICG摩爾比對熒光產(chǎn)量的影響。圖A中的數(shù)據(jù)用于計算斜率（每微摩爾ICG的熒 光強度）并且在不同摩爾比條件下相對于脂質(zhì)：ICG摩爾比繪圖：（〇）僅游離ICG和（魯） ICG-脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP)。每個數(shù)據(jù)點是六次重復測量的平均值土SD。
[0035] 圖4是腫瘤的檢測，顯示了分離的腫瘤的切片中ICG-LNP的熒光強度，所述腫瘤由 執(zhí)業(yè)病理學家表征為惡性纖維肉瘤（頂部）和鱗狀細胞癌（底部）。
[0036] 圖5顯示了來自兩只不同的小鼠左腿下方皮膚處的圖像。使用ICG-LNP檢測到兩 只鏈脲佐菌素（STZ)l型糖尿病小鼠的皮膚中的炎癥、淋巴管新生以及三級淋巴器官。
[0037] 圖6顯示了使用ICG-LNP在小鼠右腿中檢測到帶有血管周圍單核細胞（淋巴細胞 和組織細胞/巨噬細胞）累積的淋巴異常。該圖像中小鼠的皮膚被除去。
[0038] 圖7顯示了使用ICG-LNP檢測到小鼠的左膝后窩淋巴結(jié)的左淋巴輸入管中的淋巴 管新生、淋巴管擴張以及三級淋巴器官。這些圖像中的每一個中小鼠的皮膚已被除去。
[0039] 圖8顯示了使用ICG-LNP檢測到淋巴管中的淋巴管示蹤和淋巴管擴張，在兩只不 同的小鼠中，所述淋巴管將左髂骨下（腹股溝）的淋巴結(jié)連接至左腋淋巴結(jié)。
[0040] 圖9顯示了使用ICG-LNP檢測到小鼠中的髂骨肌淋巴結(jié)、乳糜池以及胸淋巴導管 的高分辨圖像。
[0041] 圖10顯示了皮下足部注射之后淋巴結(jié)中的ICG-LNP的NIR熒光與游離ICG的NIR 熒光比較。（A，B)腋窩淋巴結(jié)，（C，D)髂骨肌&胃淋巴結(jié)，（E，F(xiàn)，G，H)膝后窩&坐骨淋巴結(jié)。
[0042] 圖11顯示了足部皮下給藥ICG-LNP的小鼠腋窩淋巴結(jié)的組織切片的NIR熒光顯 微圖像。間斷的熒光表明ICG-LNP顆粒的體內(nèi)穩(wěn)定性以及從注射位點通過淋巴系統(tǒng)沿著廣 泛路徑進入淋巴結(jié)和淋巴組織的內(nèi)部。一些ICG-LNP是細胞內(nèi)的并且與巨噬細胞和樹突細 胞相關(guān)。
[0043] 圖12顯示了 ICG-LNP的儲存穩(wěn)定性。ICG-LNP和游離ICG在4°C下儲存于暗處持 續(xù)多達313天，并且在標記的時間點分析ICG熒光：（A )游離ICG和（魯）ICG-脂質(zhì)納米 顆粒（ICG-LNP)?；谥笖?shù)衰減模型分析時間過程數(shù)據(jù)，并且列出半衰期t1/2(天數(shù)）值和 速度常數(shù)k(天數(shù)的倒數(shù)）值。虛線表示檢測限。每個數(shù)據(jù)點是三次至八次重復測量的平 均值土標準差（SD)。
[0044] 圖13顯示了 ICG-LNP減少了由于暴露于光線引起的ICG熒光淬滅。ICG-LNP和游 離ICG暴露于頂部熒光光線持續(xù)12小時。在6小時和12小時記錄ICG熒光。黑色柱代表1CG-LNP數(shù)據(jù)，灰色柱數(shù)據(jù)表示僅ICG。每個數(shù)據(jù)點是八次重復測量的平均值土SD。
[0045] 圖14顯示了 ICG濃度依賴性LNP聚集以及表觀尺寸增加。圖A :ICG濃度對LNP 的90°光散射強度的影響。在固定液量中，使用不同濃度的ICG孵育固定濃度的LNP。在 第20分鐘，稀釋混合物以停止反應并且用熒光光度計測量90 °光散射強度。空心圓符號表 示只有空脂質(zhì)的納米顆粒，實心圓符號表示ICG脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP)，并且空心三角形 符號表示僅游離ICG。每個數(shù)據(jù)點是十次重復測量的平均值土SD。圖B:由與入射光（hv) 路徑呈90°的光電倍增管（PMT，黑色水平柱）檢測到的光散射效率隨LNP聚集和粒度直徑 增加而發(fā)生變化的示意圖。圖C:通過LNP光子相關(guān)光譜分析ICG濃度對粒度的影響。在 收集了圖A的數(shù)據(jù)之后，進行粒度分析?？招膱A符號表示只有空脂質(zhì)的LNP，實心圓符號表 示ICG脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP)。每個數(shù)據(jù)點是數(shù)據(jù)收集八分鐘之后由數(shù)字自動關(guān)聯(lián)計算 得到的平均值土 SD。
[0046] 圖15顯示了 ICG脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP)的熒光強度增加。在固定液量中，用不 同濃度的ICG孵育固定濃度的LNP。在第20分鐘，用緩沖液稀釋混合物20倍以停止反應 并用熒光光度計測量熒光強度，如實施例所描述的那樣。空心三角形符號表示僅有游離的 ICG，實心圓符號表示ICG脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP)。每個數(shù)據(jù)點是八次重復測量的平均值 土SD。
[0047] 圖16顯示了皮下注射之后小鼠體內(nèi)的ICG脂質(zhì)納米顆粒與游離ICG NIR圖像表 現(xiàn)的比較。圖A :皮下注射ICG脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP，左足）或游離ICG(右足）并且在 第六分鐘收集NIR熒光圖像。熒光圖像重疊于可見光圖像上，以用于解剖學表示。虛線圓 表示局部膝后窩結(jié)。以仰臥位觀察小鼠。在僅用游離ICG(圖B)或ICG-LNP(圖C)處理六 分鐘的另一組小鼠中，除去皮膚并進行進一步分析。圖B :可見光圖像是收集的在小鼠右足 用游離ICG處理的小鼠的右腿圖像。對應的熒光圖像重疊于其上。雙箭頭（>>)表示游離 ICG看起來擴散在整個肌肉組織中和膝后窩淋巴結(jié)（虛線圓）中的隱靜脈。以仰臥位觀察 小鼠。圖C:可見光圖像是收集的在小鼠右足用ICG-LNP處理小鼠的右腿圖像。將對應的 熒光圖像重疊于其上。虛線圓表示膝后窩淋巴結(jié)并且粗體箭頭表示腹部骨盆和生殖器/局 部淋巴結(jié)。以仰臥位觀察小鼠。
[0048] 圖17顯示了在小鼠足部皮下給藥后通過皮膚檢測到的在第二引流淋巴結(jié)（坐骨 淋巴結(jié)，從膝后窩坐骨淋巴結(jié)開始~2cm)中游離ICG和ICG-LNP的熒光強度的藥物動力 學。平均值土標準誤（SEM)。圖17顯示了采用用于使注射位點的第二下游淋巴結(jié)（坐骨 淋巴結(jié)）可視化的ICG-LNP實現(xiàn)了熒光強度的提高。使用ICG-LNP實現(xiàn)的熒光強度是游離 ICG實現(xiàn)的熒光強度的兩倍至三倍。僅采用ICG-LNP而不使用游離ICG還顯示出清楚的分 布和清除特特征。
[0049] 圖18顯示了在尾靜脈內(nèi)注射ICG-LNP之后通過皮膚檢測到的肝臟藥物動力學。當 在小鼠尾靜脈內(nèi)IV注射ICG-LNP時，ICG-LNP容易從肝臟中清除，且終末消除半衰期為1. 2 小時。因此，在大約8小時（約7個半衰期）內(nèi)ICG-LNP完全從肝臟中清除。這與傳統(tǒng)脂 質(zhì)體的表現(xiàn)完全不同，傳統(tǒng)脂質(zhì)體由于Kupffer巨噬細胞的攝取而殘留在肝臟中（Daemen T 1997H印atology 26(2) :416-423)。ICG-LNP從肝臟中通過膽管清除進入腸道。因此， ICG-LNP可用于評估肝-膽功能。
[0050] 圖19顯示了在正常小鼠、糖尿病小鼠或帶有實體腫瘤的小鼠的足部皮下注射游 離ICG和ICG-LNP之后，通過淋巴結(jié)（膝后窩和坐骨）的皮膚的體內(nèi)熒光強度。圖19顯示 了 ICG-LNP在正常小鼠和患?。ㄌ悄虿』蛘邘в心[瘤）小鼠中通過足部皮下注射位點檢測 膝后窩和坐骨淋巴結(jié)（分別檢測第一和第二引流淋巴結(jié)）的能力。如上圖1和表2、表3所 示，ICG-LNP可用于評估這些疾病模型中的淋巴功能。在正常小鼠中，由ICG-LNP獲得的比 游離ICG更亮的圖像表明獲得增強的熒光強度和更高的分辨率是可能的。
[0051] 圖20顯示了通過足部皮下給藥ICG-LNP的小鼠的膝后窩淋巴結(jié)附近的皮膚檢測 淋巴管異常。圖20顯示了 ICG-LNP通過皮膚檢測淋巴管異常的能力。左圖顯示了小鼠右 膝后窩淋巴結(jié)上方移動的異常淋巴管。在右圖的正常小鼠中，沒有檢測到這種淋巴管。這 些觀察結(jié)果在將皮膚去除之后使皮膚下方淋巴管成像而得到證實。
[0052] 通討引用的并入
[0053] 本發(fā)明說明書中提到的所有公開出版物、專利和專利申請在此通過引用并入本 文，其程度與具體且單獨地說明每個單獨的公開出版物、專利或?qū)＠暾埻ㄟ^引用并入本 文相同。
【具體實施方式】
[0054] 下文結(jié)合實例應用來描述本發(fā)明的幾個方面，用于舉例說明。應當理解的是，以下 通過列舉多種具體細節(jié)、相互關(guān)系以及方法以提供對本發(fā)明的全面理解。然而，本領(lǐng)域技術(shù) 人員易于意識到，本發(fā)明可不采用具體細節(jié)中的一種或多種來實施或者可采用其他方法來 實施。本發(fā)明不限于舉例說明的操作順序或事件順序，一些操作可以不同的順序發(fā)生和/ 或與其他操作或事件同時發(fā)生。
[0055] 而且，不要求將所有舉例說明的操作或事件都用于實施根據(jù)本發(fā)明的方法。
[0056] 術(shù)語"約"或"大約"意指由本領(lǐng)域技術(shù)人員確定的特定數(shù)值在可接受的誤差范圍 內(nèi)，所述可接受的誤差范圍部分取決于如何測定或確定所述數(shù)值，即，測量系統(tǒng)的限制。例 如，根據(jù)本領(lǐng)域的實踐，"約"可指在1或大于1的標準偏差范圍內(nèi)?？蛇x地，"約"可指給定 值的高達20%的范圍，優(yōu)選地，給定值的高達10%的范圍，更優(yōu)選地，給定值的高達5%的 范圍，以及更加優(yōu)選地，給定值的高達1 %的范圍?？蛇x地，尤其針對生物系統(tǒng)或過程，術(shù)語 "約"可指數(shù)值的某數(shù)量級范圍內(nèi)，優(yōu)選地，數(shù)值的5倍范圍內(nèi)，更優(yōu)選地，數(shù)值的2倍范圍 內(nèi)。在本申請和權(quán)利要求中描述具體數(shù)值時，除非另有說明，應當假設(shè)術(shù)語"約"是指該具 體數(shù)值在可接受的誤差范圍內(nèi)。
[0057] 除非另有說明，本文使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語總體上具有與本領(lǐng)域技術(shù)人員通 常理解的含義相同的含義。通常，本文使用的命名法和在細胞培養(yǎng)、細胞遺傳學、有機化學 和核酸化學以及雜交中的實驗步驟是本領(lǐng)域所熟知且常用的。標準技術(shù)用于核酸和肽合 成。技術(shù)和步驟通常根據(jù)本領(lǐng)域的常規(guī)方法和各種常用參考文獻來實施，這些常規(guī)方法和 常用參考文獻在全文中提供。本文使用的命名法和下文描述的分析化學和有機合成的實 驗步驟是本領(lǐng)域所熟知的并且是本領(lǐng)域常用的。標準技術(shù)或其改良用于化學合成和化學分 析。
[0058] I.組合物
[0059] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)學成像的組合物以及應用，更加具體而言，本發(fā)明涉及獨特的 制備方法、組合物和直徑為納米尺寸的用于近紅外熒光（NIRF)醫(yī)學成像的紅外熒光發(fā)光 顆粒，所述成像包括血液成像、組織成像以及淋巴脈管系統(tǒng)和淋巴結(jié)（LN)成像。
[0060] 一方面，本發(fā)明提供一種組合物，所述組合物包含：（i)含有脂質(zhì)膜和水性核的脂 質(zhì)納米顆粒（例如，球體）；和（ii)多個吲哚菁綠（ICG)，其中，多個ICG中的一個或多個嵌 入所述納米顆粒的脂質(zhì)膜。
[0061] A.脂質(zhì)納米顆粒
[0062] 總體而言，本文提供的組合物包含納米顆粒。
[0063] 本發(fā)明的納米顆粒的尺寸可為約20nm至20 ym，例如，約20nm至5 ym，約80nm至 2 y m，約80nm至1 y m。因此，雖然本文中稱為"納米顆粒"，但是微米尺度的顆粒也包括在 本文的范圍內(nèi)。對于靜脈內(nèi)或動脈內(nèi)注射給藥而言，顆粒尺寸優(yōu)選為約80nm至100nm。對 于其他給藥途徑而言，例如，經(jīng)鼻給藥，可使用較大的顆粒。在一些實施方式中，使用尺寸為 約20nm至300nm，例如，約20nm至lOOnm，20nm至50nm的顆粒。每種可能性代表本發(fā)明的 單獨的實施方式。
[0064] 在一些實施方式中，顆粒的粒度不受特定限制，條件是當所述顆粒用作對比劑時， 尤其是用于淋巴結(jié)的對比劑時，將所述顆粒的流體動力學平均粒度設(shè)定為1，〇〇〇nm或更小 可提高所述顆粒被淋巴管或組織攝取的容易性（組織滲透性）及其在淋巴結(jié)或組織中的保 持力。
[0065] 當粒度為1，OOOnm或更小時，相對于在生物體的正常位點的積累量，更大量的顆 ?？赏ㄟ^提高的滲透性和滯留效應（EPR)積累在生物體的腫瘤位點。腫瘤位點可通過檢測 具有各種不同的成像形態(tài)（例如，熒光和光聲學）的積累的顆粒而進行特異性成像。此外， 當粒度超過1，〇〇〇nm時，無法預期在諸如淋巴管之類的組織中的有效攝取。因此，平均粒度 優(yōu)選地設(shè)定為l〇nm或更大以及1，OOOnm或更小。平均粒度更加優(yōu)選地為20nm或更大以及 500nm或更小，尤為優(yōu)選地為20nm或更大以及200nm或更小，特別優(yōu)選地為20nm至lOOnm。 這是因為當顆粒的粒度為200nm或更小時，顆粒很難被血液中的巨噬細胞攝取，因此，可改 善顆粒在血液中的保持力。
[0066] 粒度可通過采用電子顯微鏡觀察測量或可通過基于動態(tài)光散射法的粒度測量方 法進行測量。當基于動態(tài)光散射法測量粒度時，采用動態(tài)光散射分析儀（Particle Sizing Systems, Port Richey, FL生產(chǎn)的PSS-NICOMP 380ZLS儀器）由動態(tài)光散射（DLS)法測量流 體動力學直徑。
[0067] 本文使用的術(shù)語"約"涉及諸如量或尺寸之類的可測量的數(shù)值時，意在包括特定值 的+/-10 %的變量，更加優(yōu)選地+/-5 %的變量，甚至更加優(yōu)選地+/-1 %的變量，以及尤為優(yōu) 選地+/-0. 1%的變量，這些變量適于實現(xiàn)所期望的目的。
[0068] 本文使用的納米顆粒的"尺寸"是指納米顆粒的最長維度（寬度、長度或直徑）在 指定的范圍內(nèi)。通常，含有納米顆粒的制劑中的平均粒度在指定范圍內(nèi)。所述納米顆?？删?有均一的形狀，例如，球形或細長形，或可具有多種形狀。優(yōu)選地，本文的納米顆粒是球形。
[0069] 在一些實施方式中，納米顆粒的平均尺寸為50nm至100nm，優(yōu)選地為50nm至 80nm〇
[0070] 總體而言，本文提供的組合物（例如，藥物組合物）中的納米顆粒具有約 50 ± 5nm,約 55±5nm,約 60±5nm,約 65±5nm,約 70±5nm,約 75±5nm,約 80±5nm,約 85±5nm,約90±5nm,約95±5nm,或約100±5nm的均一性。在一些實施方式中，LNP具有 ± lnm, ±2nm, ±3nm, ±4nm,或 ±5nm 的均一f生。
[0071] 本發(fā)明的納米顆?？蓭в姓姾苫蜇撾姾?。本文使用的納米顆粒的"電荷"是指 它們的表面電荷，稱為G電位。對于靜脈內(nèi)給藥或動脈內(nèi)給藥而言，帶有負電荷的顆粒目 前是優(yōu)選的。帶負電荷的顆粒的表面電荷電位）的范圍可為約-20mV至-55mV。
[0072] 粒度和G電位的測量可通過本領(lǐng)域已知的方法進行，例如，使用商售儀器（例如， Zetasizer NanoZS (Malvern, UK))通過動態(tài)光散射（DLS)進行粒度和G電位的測量。
[0073] 在一些實施方式中，納米顆粒帶有約_5mV至-100mV的表面負電荷。
[0074] 在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒是脂質(zhì)體。
[0075] 本發(fā)明中使用的脂質(zhì)顆?？杀恢苽涑砂ㄖ|(zhì)體成型脂質(zhì)和磷脂以及膜活性固 醇（例如，膽固醇）。脂質(zhì)體可包括其他不是脂質(zhì)體成型脂質(zhì)的脂質(zhì)和磷脂。
[0076] 磷脂可選自例如：卵磷脂（例如，雞蛋或大豆卵磷脂），磷脂酰膽堿（例如，雞蛋磷 脂酰膽堿），氫化的磷脂酰膽堿，溶血磷脂酰膽堿，二棕櫚?；字Ｄ憠A，二硬脂?；字?酰膽堿，二肉豆蔻?；字Ｄ憠A，雙月桂?；字Ｄ憠A，甘油磷脂（例如，磷脂酰甘油， 磷脂酰絲氨酸，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰肌醇，磷脂酰肌醇磷酸，磷脂酰肌 醇雙磷酸和磷脂酰肌醇三磷酸），鞘磷脂，心磷脂，磷脂酸，縮醛磷脂，或者它們的混合物。每 種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方式。
[0077] 可使用的其他脂質(zhì)的實例包括糖脂（例如，甘油糖脂，例如，半乳糖脂和硫代脂 質(zhì)，鞘糖脂，例如，腦苷脂，葡萄糖腦苷脂和半乳糖腦苷脂，以及糖基磷脂酰肌醇），鞘磷脂 (例如，神經(jīng)酰胺磷酸膽堿，神經(jīng)酰胺磷酰基乙醇胺和神經(jīng)酰胺磷?；视停?，或者它們的 混合物。每種可能性表示本發(fā)明的單獨的實施方式。
[0078] 帶負電荷或帶正電荷的脂質(zhì)納米顆?？衫缤ㄟ^使用陰離子或陽離子磷脂或脂 質(zhì)獲得。這些陰離子/陽離子磷脂或脂質(zhì)通常具有親脂基團，例如，固醇，酰基或二?；?并且其中，脂質(zhì)具有總體凈負電荷/正電荷。
[0079] 上述脂質(zhì)和磷脂可購買獲得或根據(jù)本領(lǐng)域公開的方法制備。
[0080] 脂質(zhì)顆?？赏ㄟ^本領(lǐng)域已知的方法制備，參見例如Scholar等 人,2012,International Journal of Pharmaceutical Studies and Research, 3 (2) : 14-20 ;Akbarzadeh 等人，2013, Nanoscale Research Letters, 8:102 中公 開的方法。示例性的方法在下文中描述。通過小孔膜（例如聚碳酸酯膜）擠出脂質(zhì)體是將 尺寸降低至相對明確界定的尺寸分布的有效方法。通常，使懸浮液循環(huán)穿過膜幾次（使用 孔徑遞減的膜），直至得到理想的脂質(zhì)體尺寸分布。連續(xù)通過孔較小的膜擠出脂質(zhì)顆粒能夠 逐步將脂質(zhì)體尺寸降低至理想尺寸。經(jīng)過尺寸降低處理的脂質(zhì)顆粒懸浮液可易于通過顆粒 識別尺寸為例如約0. 2 ii m的滅菌膜進行殺菌，例如常規(guī)0. 22 ii m厚的膜過濾器。如果需要 的話，脂質(zhì)體懸浮液可在存在合適的儲存用冷凍保護劑的條件下被凍干并在使用前通過簡 單水化而復溶。
[0081] 總體而言，如本文更加詳細地描述的，本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒通過將諸如ICG之 類的染料與脂質(zhì)分子混合，隨后產(chǎn)生顆粒來制備。
[0082] 在一些實施方式中，形成納米顆粒的脂質(zhì)分子包括兩種磷脂種類，1，2-二硬脂酰 基-sn-丙三基-3-磷酸膽堿（DSPC)和1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲 氧基-聚乙二醇-2000 (DSPEmPEG2000)。
[0083] B.熒光染料
[0084] 在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒包含至少一種嵌入脂質(zhì)中的近紅外（NIR) 熒光染料（或探針）。
[0085] 在一些實施方式中，結(jié)合是非共價結(jié)合。
[0086] 本文中的"近紅外（NIR)熒光染料"或"近紅外（NIR)熒光探針"是指適于成像 應用的分子或?qū)嶓w，其能夠在NIR光譜范圍內(nèi)吸收和發(fā)射光。具體而言，本文中的"近紅外 (NIR)熒光染料"或"近紅外（NIR)熒光探針"是具有在NIR光譜范圍內(nèi)，優(yōu)選地在約700nm 至900nm的范圍內(nèi)的激發(fā)光和發(fā)射光的熒光實體。NIR輻射通常限定為具有約700nm至 1400nm的波長。本發(fā)明的NIR熒光探針優(yōu)選地是那些吸收和發(fā)射在約700nm至900nm的范 圍內(nèi)的NIR光的NIR熒光探針，所述約700nm至900nm的范圍被認為是生物"NIR窗口 "。
[0087] 合適的NIR熒光探針的實例包括染料，例如，花青染料，例如，吲哚菁綠（ICG)， Cy5, Cy5. 5, Cy5. 18, Cy7 和 Cy7. 5 ; IRBYE?, ALEXA FLUOR? 染料，BODIPY? 染 料，ANGIOS TAMP?染料，SENTIDYE ?染料，XENOLIGHT DIR ?熒光染料，VIVOTRACK ?NIR 熒光顯像劑，KODAK X-SIGHT?染料和共輒物，DYLIGHT ?染料。NIR量子點也可用作探針 (NIR量子點的合成和功能化在例如Ma等人，2010，Analyst，135:1867-1877中描述）。每 種可能性代表本發(fā)明的單獨的實施方式。其他染料包括亞甲基藍、ProSense和MMPSense。 Figueiredo, J. L. , Alencar, H. , ffeissleder, R. &Mahmood, U. Near infrared thoracoscopy of tumoral protease activity for improved detection of peripheral lung cancer. Int.J.Cancer 118,2672 - 2677(2006)，以及 Nguyen，Q. T?，和 Tsien，R.Y. (2013) Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation:A new cutting edge. Nat. Rev. 13, 653-662。
[0088] 在一些實施方式中，熒光染料是親脂性（Log P>2)熒光染料，分子量為 300_1500g/mol，例如，吲噪普綠，亞甲基藍，ProSense和MMPSense。
[0089] 下表列出了可嵌入本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒中的其他NIR染料。任何發(fā)熒光的疏水 小分子可嵌入本發(fā)明的脂質(zhì)納米顆粒中。
[0090] 近紅外熒光染料列表。
[0091]
[0092]
[0093] 用于本發(fā)明的納米顆粒的NIR熒光探針的特定實施方式是吲哚菁綠（ICG)。
[0094] ICG是臨床上用于NIRF成像的染料（具有820nm的發(fā)射波長）并且是唯一由美國 食品和藥品管理局（FDA)和歐洲藥物管理局（EMA)批準的用于人體的NIRF分子。ICG被 批準用于心輸出量、肝臟功能和肝臟血流檢測，以及眼部血管造影術(shù)。ICG存在著大量的標 簽外和以研究為目的的使用情況，包括液體填充的解剖學結(jié)構(gòu)（例如，血液、腦脊液、淋巴 或尿液）的可視化，或作為對比劑用于血管、腎臟或其它排泄途徑的顯影（1)。在水性環(huán)境 中，ICG分子聚集并且ICG熒光強度容易衰減（降低整體熒光強度）（2-5)。在血液中，ICG 與血漿蛋白結(jié)合，部分且暫時地改善了其熒光強度，但是最終仍然會與血漿蛋白解離進入 水相環(huán)境中被降解。在體內(nèi)，ICG熒光強度和持續(xù)時間可隨血漿蛋白和脂蛋白濃度的波動 以及個體之間的差異而發(fā)生變化。
[0095] 本發(fā)明的納米顆?？砂ǜ哌_約10% (w/w)的NIR焚光探針，例如高達約5% (w/ W)的NIR熒光探針，高達約1% (w/w)的NIR熒光探針，高達約0. 5% (w/w)的NIR熒光探 針，約0? 005% -5% (w/w)的NIR熒光探針。
[0096] C. ICG-LNP
[0097] 另一方面，本發(fā)明提供ICG-LNP，其中，ICG中的一個或多個嵌入納米顆粒的脂質(zhì) 中。
[0098] 脂質(zhì)體包裹的ICG(即，ICG在脂質(zhì)體的水性核內(nèi)）（8-12)導致ICG和脂質(zhì)之間發(fā) 生弱相互作用。
[0099] 為了克服這些限制，嘗試將ICG加至疏水聚合物、血清白蛋白和脂質(zhì)體中。不是所 有脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆粒都具有類似結(jié)構(gòu)，一些脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆?？赡苡删哂胁煌^ 部基團和脂肪酰基鏈的磷脂構(gòu)成，而其他脂質(zhì)體和脂質(zhì)納米顆?？砂懝檀蓟蚱渌砑?物，所有這些均可改變脂質(zhì)體的生理化學性質(zhì)（6)。脂質(zhì)的極性頭部基團影響顆粒表面電荷 和水合程度，其影響體內(nèi)調(diào)理素作用的水平和引起清除的補體結(jié)合的水平，并且脂質(zhì)脂肪 酰基尾部的飽和量和鏈長通過改變脂質(zhì)雙層的剛性、厚度和均勻性影響脂質(zhì)相變溫度（Tc) (6)。因此，每個變量可能不僅僅影響ICG和脂質(zhì)之間的穩(wěn)定性和相互作用，并且還影響顆 粒的體內(nèi)行為。
[0100] 本發(fā)明提供具有很強（不可逆地結(jié)合）的ICG-脂質(zhì)相互作用的新型ICG-LNP，所 述ICG-脂質(zhì)相互作用由本發(fā)明提供的將ICG嵌入脂質(zhì)顆粒中而產(chǎn)生。制備脂質(zhì)體包裹的 ICG需要純化/過濾步驟以除去游離（未包裹的）ICG，在本發(fā)明中不需要進行所述純化/ 過濾步驟，因為在本發(fā)明中能夠達到脂質(zhì)中基本上完全100 %的嵌入效率。
[0101] ICG-LNP的一個重要特性是其減低或甚至消除與ICG的濃度依賴性自淬滅性質(zhì)有 關(guān)的缺陷。參見圖3。因為ICG的吸收光譜和發(fā)射光譜高度重疊，所以ICG表現(xiàn)出濃度依賴性 熒光淬滅（自淬滅）。因此，重要的是，不僅僅限定脂質(zhì)-ICG的相互作用，而且還限定脂質(zhì)中 ICG分子的最佳密度，所述最佳密度表現(xiàn)出每個ICG分子的最大焚光強度和最小自淬滅。參 見圖3。與大部分紅外染料的普遍熒光性質(zhì)相反，ICG在濃度低至幾微摩爾（y M) ICG時發(fā)生 自淬滅。雖然已對脂質(zhì)體和脂質(zhì)-ICG混合物進行了很多研究，但是沒有研究從整體上考慮 自淬滅性質(zhì)，該自淬滅性質(zhì)導致熒光穩(wěn)定性和強度發(fā)生改變，并且更加重要的是，實現(xiàn)本發(fā) 明的改進（通過最小化自淬滅）。本發(fā)明提供簡單的三步驟程序產(chǎn)生穩(wěn)定的ICG脂質(zhì)納米顆 粒產(chǎn)品，用于高分辨率的NIRF成像。Kraft JC, Ho RJ(2014) Interactions of indocyanine green and lipid in enhancing near-infrared fluorescence properties:the basis for near-infrared imaging in vivo. Biochemistry ;Mar 4 ;53 (8): 1275-83,該參考文南犬 的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
[0102] 在一些實施方式中，至少約90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97%，97. 5% ，98%，98. 5%，99%，99. 5%或99. 9%的ICG嵌入脂質(zhì)膜中。在一些實施方式中，偏差為+/ ~0. 1 % , +/-0. 2 % , +/~0, 3 % , +/-0. 4 % , +/~0, 5 % , +/-0. 6 % , +/-0. 7 % , +/-0. 8 %, +/-0. 9 % , +/- 10. 0%。在一些實施方式中，至少97. 8+/-0. 6%的ICG嵌入脂質(zhì)膜中。
[0103] 在一些實施方式中，基本上或全部100%的ICG嵌入脂質(zhì)膜中。
[0104] 在一些實施方式中，少于5%，4%，3%，2%，1%，0? 9%，0? 8%，0? 6%，0? 5%，0? 4 % ,0.3% ,0.2%，0. 1% ,0.01%或0.001%的ICG包裹在脂質(zhì)納米顆粒的水性核中。
[0105] 在一些實施方式中，沒有可檢測量的ICG包裹在脂質(zhì)納米顆粒的水性核中。
[0106] 嵌入脂質(zhì)膜或包裹在脂質(zhì)納米顆粒的水性核中的ICG的量或百分比使用本 領(lǐng)域已知的方法測量，例如，Bilayer/water partitioning studies by equilibrium dialysis, Joguparthi V, Feng S, Anderson BD. Determination of intraliposomal pH and its effect on membrane partitioning and passive loading of a hydrophobic camptothecin,DB-67.Int J Pharm. 2008Mar 20 ；352 (1-2):17-28.Epub 20070ctl2. PubMed PMID:18065174;PubMed Central PMCID:PMC2277365,該參考文獻的全部內(nèi)容通過 引用并入本文。
[0107] 在一些實施方式中，ICG與脂質(zhì)的比例為約0. 3至約0. 2mol/mol，0. 3至0. lmol/ mol，0. 3 至 0.09mol/mol，0. 3 至 0.08mol/mol，0. 3 至 0.07mol/mol，0. 3 至 0.06mol/mol， 0? 3 至 0? 05mol/mol，0. 3 至 0? 04mol/mol，0. 3 至 0? 03mol/mol，0. 3 至 0? 02mol/mol 或 0? 3 至 0. 001mol/mol。
[0108] 在一些實施方式中，在脂質(zhì)嵌入組合物中使用的ICG的劑量是水性ICG(臨床使 用）劑量的十分之一，如在每個患者/程序中使用的ICG-LNP的量中所反映的。
[0109] 在一些實施方式中，本發(fā)明的納米顆粒除了包括NIR熒光探針之外，還可包括至 少一種可由核磁共振成像（MRI)檢測的磁性探針。
[0110] 在一些實施方式中，所述磁性探針以共價或非共價的方式結(jié)合至納米顆粒的外表 面。在其他實施方式中，磁性探針被包含在或嵌入納米顆粒的內(nèi)核中或被納米顆粒包裹。
[0111] 磁性納米顆粒包括永久磁性顆粒和在暴露于外部磁場之后可磁化但是當外部磁 場移除時失去其磁性的那些顆粒。磁性材料或在暴露于磁場之后可磁化，當磁場移除時失 去其磁性的材料是指超順磁材料。合適的超順磁材料的實例包括但不限于：鐵、混合的鐵氧 化物（磁鐵礦）或y-三氧化二鐵（磁赤鐵礦）以及包括諸如鋅之類的其他元素的取代的 磁鐵礦。超順磁顆粒的尺寸可為約lnm至約20nm，例如約lnm至10nm，約5nm-20nm〇
[0112] 超順磁顆粒的制備以及包含這些超順磁顆粒的納米顆粒的制備可通過本領(lǐng)域 已知的方法進行，例如，在 De Cuyper et al.，1988, Eur Biophys J, 15:311-319 中所 描述的方法。其他方法例如在US 7，175,912，US 7，175,909和1^20050271745以及 TO2014002100A1中描述，這些參考文獻的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
[0113] D. ICG-LNP 的件質(zhì)
[0114] 總體上，本發(fā)明提供脂質(zhì)相關(guān)顆粒，例如，吲噪青綠顆粒，其具有提尚的穩(wěn)定性和 體內(nèi)性能（參見，例如圖12和圖13)，用于改善淋巴管、淋巴結(jié)、淋巴異常、腫瘤和炎癥的功 能性高分辨率近紅外熒光醫(yī)學成像（參見，例如，圖4-11和16-20)。
[0115] 本發(fā)明提供的顆粒所實現(xiàn)的熒光強度高于并超出先前含有吲哚菁綠（ICG)的脂 質(zhì)體或其他聚合物載體所實現(xiàn)的熒光強度。
[0116] 本發(fā)明提供研發(fā)用于生物相容性吲哚菁綠（ICG)納米顆粒的獨特的、簡單的和可 成比例擴大生產(chǎn)的組合物和制備方法，所述納米顆粒使ICG強度提高4. 5倍或更高，由此改 善成像分辨率和靈敏度，從而使用近紅外熒光（NIRF)生物成像檢測被掩蔽的組織和細胞。 這種4. 5倍或更高的ICG熒光強度的增大是前所未有的并且是新穎的。不像先前描述的包 裹有ICG的脂質(zhì)體組合物和有限的脂質(zhì)-ICG的偶然結(jié)合那樣（所述包裹有ICG的脂質(zhì)體 組合物和有限的脂質(zhì)-ICG的偶然結(jié)合涉及難處理的且資源密集型制備步驟），本文所述的 組合物和方法提供一種簡單而又有效的三步制備程序（參見，例如，圖1)，所述組合物和方 法絕對穩(wěn)定地將100% ICG嵌入脂質(zhì)中并且在生物液體和溶液中帶來潛在的最大強度。這 種由簡單且有效的制備程序產(chǎn)生的ICG熒光強度和穩(wěn)定性的提高的組合（參見，例如圖3， 圖12和圖13)先前并未實現(xiàn)。
[0117] 在一些實施方式中，本文提供的顆粒使ICG熒光強度相對于水性ICG(13)的熒光 強度提高至少2倍，3倍，4倍，4. 5倍，5倍，6倍或甚至更高倍，這是任何所報道的包含脂質(zhì) 體的載體未實現(xiàn)的。
[0118] 本領(lǐng)域技術(shù)人員已嘗試將ICG包裹在蛋白質(zhì)中或?qū)CG與蛋白質(zhì)結(jié)合，但是并未 實現(xiàn)這種熒光強度的提高以及伴隨產(chǎn)生的本發(fā)明的穩(wěn)定性（參見，例如，圖11-圖13)。許 多科學家已嘗試包裹過高濃度的ICG(10-12,14)，這實際上因熒光信號的濃度依賴性自淬 滅而使ICG的熒光強度降低。
[0119] 本文提供的納米顆粒產(chǎn)生的ICG熒光強度的大幅度增大使光線透射穿過厚度為 lcm或更厚的組織（參見，例如，圖2)。這相對于游離ICG所達到的光線透射穿過的組織厚 度產(chǎn)生了顯著改善（13)，游離ICG的熒光強度使光線僅僅滲透約0. 5cm的組織（參見，例如 圖2)。這種由熒光強度的增大而產(chǎn)生的提高的組織滲透深度是本發(fā)明另一非顯而易見且新 穎的元素。
[0120] 具體而言，在美國專利公開US2014/0341813A1中提供一種使用離散劑（例如，尿 素、胍、碘或其他離子）的pH-梯度方法，從而防止ICG的J-聚集并且使高濃度的單體形式 的ICG(多ImM ICG)包裹在脂質(zhì)體的水性核中。然而，本領(lǐng)域已知，在水中，ICG在濃度為 約5 y M ICG的條件下開始形成聚集體（2,15-17)。雖然離散劑用于降低水分子和ICG之間 的引起不穩(wěn)定和聚集的相互作用，但該專利申請中所述的濃度（比導致ICG聚集的那些濃 度高至少200倍）易于發(fā)生濃度依賴性淬滅并且易于損失熒光強度。實際上，雖然NIRF成 像是建議的應用/領(lǐng)域，但是發(fā)明人注意到在第0135段中公開了"在本發(fā)明中，由于染料的 累積而產(chǎn)生的淬滅是由抑制染料的泄露而產(chǎn)生的"。因此，這些顆粒中的熒光發(fā)射強度會非 常有限。
[0121] 在一些實施方式中，納米顆粒的熒光強度是水性ICG的熒光強度的2倍至10倍。
[0122] 在一些實施方式中，納米顆粒的熒光強度是水性溶液中的游離ICG的熒光強度的 4倍至5倍。
[0123] 本文提供的納米顆粒相對于本領(lǐng)域已知的顆粒具有優(yōu)異的穩(wěn)定性（參見，例如圖 11-13)〇
[0124] 除了優(yōu)化ICG-LNP制劑以實現(xiàn)最大熒光產(chǎn)量之外，相對于環(huán)境作用的穩(wěn)定性也是 必需的。光線使ICG產(chǎn)生單態(tài)氧，其通過二氧雜環(huán)丁烷反應化學分解ICG(ICG的聚甲炔鏈 裂解成兩種羰基產(chǎn)物，其可能具有細胞毒性）（18,19)。通常在光線充足的臨床環(huán)境和手術(shù) 視野中，這種光線分解是需要避免的問題。
[0125] 在其目前提供的形態(tài)中，水性溶液中的游離ICG因光線而在數(shù)秒內(nèi)分解。本發(fā)明 公開了將ICG嵌入脂質(zhì)中避免光線降解（參見，例如，圖13)。ICG-LNP可在室溫下暴露于 光線持續(xù)若干小時并且保持幾乎全部其原始熒光強度（參見，例如，圖13)。
[0126] 本文提供的納米顆粒保持熒光強度超過其他報道（例如，室溫下42天（9)以及 4°C下70天（20))中的那些熒光強度（參見，例如，圖12)。
[0127] 在一些實施方式中，當本文提供的ICG顆粒產(chǎn)品在黑暗、4°C條件下儲存于水性懸 浮液中時，保持其熒光強度持續(xù)至少約2個月，3個月，4個月，5個月，6個月，7個月，8 個月，9個月，10個月，11個月，或12個月或更長時間（參見，例如，圖12)?？傮w而言， 保持至少約50%至約60%，約50%至約65%，約50%至約70%，約50%至約75%，約 50%至約80%，約50%至約85%，約50%至約90%，約50%至約95%，或約50%至約 100%的熒光。
[0128] 在一些實施方式中，本文提供的ICG-LNP在血清中穩(wěn)定，并且在25°C下在熱滅活 的大鼠血清中6小時后保持其初始熒光的約50%至約60%，約50%至約65%，約50% 至約70%，約50%至約75%，約50%至約80%，約50%至約85%，約50%至約90%， 約50%至約95%，或約50%至約100%。在一些實施方式中，本文提供的ICG-LNP在血清 中穩(wěn)定，并且在25°C下，在熱滅活的大鼠血清中6小時后保持其初始熒光的94±0. 6%。
[0129] 在一些實施方式中，本文提供的ICG-LNP在血清中穩(wěn)定，并且在熱滅活的大鼠血 清中持續(xù)一段時間段保持其初始熒光的至少約90%，91%，92%，93%，94%，95%，96%，97 %，98%，99%，或 100%，所述時間段例如約 lhr, 2hr, 3hr, 4hr, 5hr, 6hr, 8hr, 10hr, 12hr, 1 4hr, 16hr, 18hr, 20hr, 24hr 或更長時間。
[0130] 在一些實施方式中，在黑暗中4°C下儲存超過300天之后，納米顆粒的熒光強度是 其初始熒光強度的50 %至100%。
[0131] 在一些實施方式中，納米顆粒的平均半衰期為0. 5hr至lhr，0. 5hr至2hr, 0. 5hr 至 3hr, 0. 5hr 至 4hr, 0. 5hr 至 5hr, 0. 5hr 至 6hr, 0. 5hr 至 7hr, 0. 5hr 至 8hr, 0. 5hr 至 9hr, 或0. 5hr至lOhr或者更長時間。
[0132] 本文提供的ICG顆粒產(chǎn)品的進一步穩(wěn)定通過用諸如海藻糖或蔗糖之類的冷凍保 護劑的冷凍干燥法實現(xiàn)，所述冷凍保護劑在ICG顆粒產(chǎn)品與水水合之后維持顆粒特性。
[0133] 綜上所述，所觀察到的光線、儲存和血清穩(wěn)定性表明ICG-LNP具有很強的臨床使 用穩(wěn)定性，尤其是用于淋巴系統(tǒng)的成像，所述淋巴系統(tǒng)中，淋巴包含的血清蛋白濃度比血液 中的血清蛋白濃度低大約兩倍。
[0134] 本文提供的LNP由于其較高的熒光強度而比本領(lǐng)域已知的其他ICG試劑更加有 效。本文中的"有效"是指在施用于組織或器官之后能夠通過相同或更少的ICG分子發(fā)射 更高的熒光，從而產(chǎn)生圖像用于期望的目的。
[0135] 在一些實施方式中，組合物按單位體重給藥劑量在小于約0. 5mg/kg, 0. 4mg/ kg, 0. 3mg/kg, 0. 2mg/kg, 0. lmg/kg, 0. 09mg/kg, , 0. 08mg/kg, 0. 07mg/kg, 0. 06mg/ kg, 0? 05mg/kg, 0? 04mg/kg, 0? 03mg/kg, 0? 02mg/kg,或 0? Olmg/kg ICG 劑量的條件下有效。
[0136] 在一些實施方式中，組合物按單位體重給藥劑量在約0.0 lmg/kg至約0. 5mg/kg, 約 0? Olmg/kg 至約 0? 4mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 3mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 2mg/kg, 約 0? Olmg/kg至約 0? lmg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 09mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 08mg/kg, 約 0? Olmg/kg 至約 0? 07mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 06mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 05mg/ kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 04mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 03mg/kg,或約 0? Olmg/kg 至約 0.02mg/kg ICG劑量（包括端點值）的條件下有效。
[0137] 在一些實施方式中，組合物在約0. 05mg/kg至0. 5mg/kg ICG劑量（包括端點值） 的條件下有效。
[0138] 本文提供的組合物或ICG-LNP的有效性通過使用本領(lǐng)域已知的方法測量。例如， 在公開的文獻值中，比較納米顆粒相對于水性ICG的熒光增強倍數(shù)。
[0139] 脂質(zhì)體的一種熟知特性是它們在肝臟組織中積累（7)。然而，本發(fā)明的ICG-LNP不 在肝臟中積累，但是其通過肝膽管幾乎被完全清除而進入腸道，這是這些ICG顆粒的不同 之處和新穎之處（參見，例如，圖19)。
[0140] 本文提供的ICG顆粒比任何報道過的組合物和方法都更加穩(wěn)定。而且，這些顆粒 可用于識別腫瘤（參見，例如，圖4)和帶有淋巴血管形成的炎癥位點（參見，例如，圖5-8 和圖20)。本發(fā)明研發(fā)的顆粒穩(wěn)定且特異性地將NIRF分子傳送至淋巴系統(tǒng)以進行NIRF成 像。
[0141] II.制備 ICG-LNP 的方法
[0142] 另一方面，本發(fā)明提供一種解決ICG的水不穩(wěn)定性、聚集和降解的限制的簡單方 案并且使更深層的組織水平以比單獨使用ICG更好的分辨率成像。在本發(fā)明提供的方法 中，由于ICG100% (或大約100% )嵌入脂質(zhì)中，因此不需要分離步驟，強ICG-脂質(zhì)結(jié)合相 互作用通過簡單的三步制備程序產(chǎn)生（參見，例如，圖1)，并且ICG自淬滅被降低以最大程 度增大ICG熒光強度產(chǎn)量（參見，例如，圖3)。
[0143] 本發(fā)明提供一種僅涉及三個步驟的簡單/流暢的制備方法：（1)在有機溶劑中混 合吲哚菁綠（ICG)與脂質(zhì)分子，（2)蒸發(fā)含有完全混合的脂質(zhì)和ICG的有機溶劑，以及（3) 降低水合的ICG-脂質(zhì)混合物的粒度，并且由于ICG完全嵌入ICG-脂質(zhì)納米顆粒而不需要 過濾/純化/分離步驟除去游離的未合并的ICG(參見，例如，圖1)。
[0144] 在一些實施方式中，制備納米顆粒的方法包括：(a)在有機溶劑中混合吲哚菁綠 (ICG)與脂質(zhì)分子；(b)蒸發(fā)有機溶劑以產(chǎn)生含有所述脂質(zhì)分子和所述ICG的薄膜；（c)使 用緩沖鹽水水合所述薄膜；（d)使用超聲能量或均質(zhì)步驟減小粒度，從而減小用所述緩沖 鹽水水合的薄膜的粒度。
[0145] 本文提供的方法與本領(lǐng)域已知的方法不同，本領(lǐng)域已知的方法忽略了在形成脂質(zhì) 薄膜之前的作為初始制備步驟的在有機溶劑中混合ICG和脂質(zhì)，該步驟是將ICG穩(wěn)定地嵌 入脂質(zhì)所必須的。相反，本領(lǐng)域已知的方法將ICG的水性溶液加至已形成的脂質(zhì)薄膜中，這 導致ICG無法有效包裹至脂質(zhì)體的水性核中。
[0146] 在一些實施方式中，脂質(zhì)分子包括1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸 膽堿（DSPC)和1，2_二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二 醇-2000(DSPEmPEG2000)。
[0147] 在一些實施方式中，有機溶劑包括乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或DMS0。
[0148] 在一些實施方式中，脂質(zhì)納米顆粒懸浮于包含生物相容性緩沖液的鹽組合物中， 所述生物相容性緩沖液例如pH為5-8且Osm為約303m0SM的緩沖液。這些緩沖液的實例 包括生理鹽水、林格氏溶液、5%葡萄糖水溶液或0. 9% NaCl和約20mM NaHC03的緩沖液。
[0149] 在一些實施方式中，緩沖鹽水包括約0. 9% NaCl和約20mM NaHC03。
[0150] 在一些實施方式中，所述方法不包括過濾步驟，純化步驟或分離步驟，或者它們的 組合。
[0151 ] 在一些實施方式中，所述方法不包括任何過濾步驟、純化步驟或分離步驟。
[0152] 美國專利公開US2014/0341813A1公開了一種使用離散劑（例如，尿素、胍、碘或其 他離子）的pH梯度方法以防止ICG的J-聚集并使高濃度的單體形式的ICG (彡ImM ICG) 包裹在脂質(zhì)體的水性核中。然而，該引用的專利申請中所描述的制備步驟鑒于下述多種其 他原因而非常繁瑣（多5個步驟），所述原因包括需要使用pH-梯度，ICG在水性溶液中不 穩(wěn)定（雖然存在離散劑）以及由于所有游離ICG的不完全包裹而需要進行過濾和純化（該 美國專利公開中報道了僅27. 4%的包裹率）。
[0153] 本文公開的制備方法簡單得多，因為其不涉及pH-梯度或純化步驟，其僅僅涉及 三個簡單步驟：混合、干燥和水合/尺寸減小。
[0154] 在一些實施方式中，脂質(zhì)納米顆粒懸浮于包含約0. 9% NaCl和約5_50mM(例如， 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45,或 50mM)的 NaH〇y9鹽組合物中。
[0155] 本文提供的方法和組合物基于意想不到地發(fā)現(xiàn)了簡單且可成比例擴大生產(chǎn)的3 步制備方法和組合物，其能夠使吲哚菁綠（ICG)幾乎100%地嵌入脂質(zhì)以形成穩(wěn)定的脂質(zhì) 納米顆粒（LNP)。
[0156] 這種使ICG與脂質(zhì)結(jié)合的獨一無二的方法極大地提高了 ICG的穩(wěn)定性和近紅外熒 光（NIRF)強度，超過了游離ICG所能達到的穩(wěn)定性和近紅外熒光強度，這使更深層的組織 能夠成像。雖然本發(fā)明的LNP制劑類似于脂質(zhì)體制劑，但是本發(fā)明公開了新的特性，這在早 期的脂質(zhì)體生理化學研究和體內(nèi)研究中是非顯而易見的，并且這些ICG-LNP表現(xiàn)出比其他 已報道的ICG脂質(zhì)體更加優(yōu)異的特性，即，（1)100%嵌入效率，這排除了任何純化步驟，（2) 產(chǎn)生高穩(wěn)定性顆粒的簡單的3步制備步驟，以及（3)優(yōu)化ICG光譜學性質(zhì)從而避免ICG熒 光發(fā)射的自淬滅并極大地提高ICG的熒光強度產(chǎn)量。將這些要素綜合在一個具有高度特異 性組成的系統(tǒng)中是非顯而易見的并且提供了前所未有的增加體內(nèi)NIR成像時間和分辨行 為的協(xié)同作用。具體而言，本發(fā)明的組合物特別適于用于淋巴結(jié)構(gòu)和淋巴網(wǎng)絡(luò)繪圖，識別淋 巴病理學和淋巴異常，識別帶有淋巴血管形成的腫瘤，識別帶有三級淋巴器官的炎癥位點， 以及將藥物遞送至淋巴系統(tǒng)以及與淋巴相關(guān)的病理學的淋巴管和淋巴結(jié)中的攝取、留滯和 廣泛分布。
[0157] 本發(fā)明提供的納米顆粒的制備方法提供了相對于本領(lǐng)域已知方法的各種新穎的 方面和優(yōu)勢，例如：（1)綜合組合物和三步制備方法生成物理上穩(wěn)定的帶有獨特性質(zhì)的產(chǎn) 品（穩(wěn)定且高ICG熒光產(chǎn)量），（2)綜合ICG光譜學性質(zhì)提高效力，（3)避免游離ICG的除去 的簡單三步過程，這降低了總體成本并且控制由于復雜的多步過程而產(chǎn)生的潛在污染，（4) 熒光分子（吲哚菁綠（ICG))嵌入ICG-脂質(zhì)納米顆粒（ICG-LNP)中，這提高了熒光強度，使 其大大超過包裹在脂質(zhì)體或脂質(zhì)囊泡中的水性ICG所能達到的熒光強度，（5)在嵌入脂質(zhì) 的組合物中使用的ICG劑量相對于用于體內(nèi)近紅外（NIR)成像的水性ICG(臨床使用）降 低了約10倍，這產(chǎn)生了更高的分辨率和熒光強度，以及（6)使ICG幾乎100%嵌入脂質(zhì)膜中 的獨特的組成、尺寸和表面性質(zhì)，提高的穩(wěn)定性（儲存和體內(nèi)這兩方面），以及對于淋巴系 統(tǒng)的體內(nèi)功能性醫(yī)學成像而言非常重要的性能。
[0158] III.藥物制劑和給藥方式
[0159] 本發(fā)明還涉及包含本發(fā)明的化合物或其藥學上可接受的鹽以及一種或多種藥學 上可接受的載體的藥物制劑。
[0160] A.對比劑
[0161] 本文提供的納米顆?？捎米鳠晒獬上窕蚬饴暢上竦膶Ρ葎?，因為該顆粒包含ICG 并且可吸收近紅外光以發(fā)射熒光或聲波。此外，該顆?？捎米饕曈X檢查的對比劑，因為ICG 具有綠色。
[0162] 本文中的"對比劑"是指能夠在想要觀察的組織或分子，存在于標本中的組織或分 子和所述組織或分子周圍的組織或分子之間進行比較產(chǎn)生不同以改善想要觀察的組織或 分子的形態(tài)信息或位置信息的檢測靈敏度的物質(zhì)。
[0163] 本文中的"熒光成像"或"光聲成像"是指通過例如熒光檢測設(shè)備或光聲信號檢測 設(shè)備成像的組織或分子。
[0164] 根據(jù)本實施方式的對比劑包括根據(jù)本文提供的顆粒和所述顆粒分散于其中的分 散介質(zhì)。所述分散介質(zhì)是用于分散顆粒的液體物質(zhì)并且其實例包括生理鹽水和注射用蒸餾 水。此外，對比劑可具有藥理學上可接受的諸如食鹽或葡萄糖之類的添加劑。所述對比劑可 以是如下對比劑：根據(jù)本實施方式的顆粒預先分散于分散介質(zhì)，或者可如下描述的那樣使 用。根據(jù)本實施方式的顆粒和分散介質(zhì)包裝在試劑盒中，并且所述顆粒在給藥于活體（例 如，人體）之前分散于分散介質(zhì)。
[0165] IV.本發(fā)_的試劑盒
[0166] 關(guān)于組合物的使用的說明總體上包括用于目標治療的劑量、給藥方案和給藥途徑 的信息。組合物的容器可以是單位劑量，批量包裝（例如，多劑量包裝）或子單位劑量。在 本發(fā)明的試劑盒中提供的說明書通常是在標簽上或包裝插入物上（例如，包括在試劑盒中 的紙頁）的書面說明，但是機器可讀的說明書（例如，磁盤或光盤中載有的說明）也是可接 受的。
[0167] V.醫(yī)藥用涂
[0168] 大多數(shù)熒光醫(yī)學成像（小于600nm-700nm)受到體內(nèi)血液、組織和脂肪的光吸收和 光散射的限制。因為吲哚菁綠（ICG)在820nm發(fā)射熒光，其在血液、水、組織和脂質(zhì)的光吸 收系數(shù)最低的700nm-900nm的范圍的中間，因此該近紅外（NIR)化合物克服了生物組織的 干擾。
[0169] 皮下注射之后，穩(wěn)定地嵌入ICG-LNP中的ICG被優(yōu)化為保留在淋巴系統(tǒng)中，而不會 如游離ICG那樣從淋巴管中滲出進入周圍組織（參見，例如，圖8和圖9)。
[0170] ICG-LNP可由臨床醫(yī)師使用，用于從手術(shù)至診斷和藥物遞送的一系列臨床應用中。 具體而言，ICG-LNP可用于在手術(shù)中識別淋巴管和淋巴結(jié)（LN)(參見，例如，圖9和圖10)， 用于識別淋巴異常（參見，例如，圖5-8)，使實體腫瘤中的前哨淋巴結(jié)顯現(xiàn)，使帶有淋巴血 管形成的腫瘤顯現(xiàn)（參見，例如圖4)，使帶有三級淋巴器官的炎癥位點顯現(xiàn)（參見，例如，圖 5-8)，將藥物遞送至淋巴管、淋巴結(jié)和病變位置。
[0171] 更加具體而言，ICG是唯一由美國食品和藥品管理局（FDA)和歐洲藥物管理局 (EMA)批準的用于人體的NIR熒光團。為了使淋巴脈管系統(tǒng)成像，目前臨床上通過將純ICG 溶質(zhì)溶解于水溶液并進行皮下注射來使用ICG。ICG與白蛋白的高結(jié)合親和力能夠使其被 攝取至淋巴管中，然而，這種白蛋白結(jié)合不穩(wěn)定并且是可逆的，ICG從白蛋白中解離并由于 濃度梯度驅(qū)動力從淋巴毛細管中滲漏出來，而暴露于使ICG降解的水性環(huán)境。通過將ICG 穩(wěn)定地嵌入LNP的脂質(zhì)中，這（1)通過不可逆的脂質(zhì)結(jié)合穩(wěn)定ICG，（2)提高其熒光產(chǎn)量和 高熒光強度的持續(xù)期，以及（3)避免ICG從顆粒中解離和由于脂質(zhì)納米顆粒的尺寸而從淋 巴脈管系統(tǒng)中漏出。
[0172] ICG-LNP保留在遠離注射位點的下游的淋巴脈管系統(tǒng)中并且在淋巴結(jié)（LN)中累 積，這產(chǎn)生對淋巴系統(tǒng)具有特異性的且比臨床使用的游離ICG組合物和其他ICG納米顆粒 制劑（例如包裹在脂質(zhì)體的水性核中的ICG(8-12,21) (US專利公開US2014/0341813A1)) 顯著更強和更穩(wěn)定的廣泛的高分辨率NIR熒光成像。
[0173] 而且，本發(fā)明公開的簡單且有效的制備步驟不涉及任何高成本和耗時的分離或純 化步驟，并且使幾乎100 %的ICG嵌入脂質(zhì)，其對于大規(guī)模生產(chǎn)是有用的。
[0174] 因為由本發(fā)明的獨特的且簡單的3-步制備方法和組合物而產(chǎn)生顆粒穩(wěn)定性，因 此，產(chǎn)生了淋巴結(jié)構(gòu)和血管結(jié)構(gòu)的一致的且廣泛的高分辨率成像（參見，例如圖5-10,16， 19和20)，所述成像可用于淋巴系統(tǒng)的疾病的診斷、評估和監(jiān)控以及區(qū)分正常與異常淋巴 結(jié)構(gòu)和功能。全身血液分布可使用這些顆粒維持，從而檢測高度灌注的組織和器官（例如， 肝臟）中的組織異常（參見，例如圖18)。
[0175] 一方面，本發(fā)明提供具有臨床用于人體NIRF成像的產(chǎn)品（ICG)的促進劑/穩(wěn)定劑 的納米顆粒，這樣，本發(fā)明的技術(shù)可用于提高ICG的穩(wěn)定性和熒光強度，從而改善已有NIR 成像儀器的NIRF成像。
[0176] ICG-LNP用作改善NIRF成像能力的新型診斷成像工具以在受治者體內(nèi)（例如人 類）識別/顯現(xiàn)（1)手術(shù)過程中的淋巴管和血管以及結(jié)節(jié)，（2)淋巴和血管異常，（3)實體 腫瘤的前哨淋巴結(jié)，（4)帶有淋巴血管形成或總血管形成的腫瘤，以及（5)帶有三級淋巴器 官的炎癥位點或組織中的炎癥位點。
[0177] 本文中的"受治者"是指人類或非人類動物，包括但不限于：諸如狗、貓、馬、牛、豬、 兔、豚鼠、綿羊、山羊、靈長類動物、大鼠和小鼠之類的哺乳動物。
[0178] 此外，ICG-LNP與其他諸如表6所列的分子之類的疏水分子的結(jié)合可用于提高它 們的穩(wěn)定性和用于遞送藥物至淋巴管、淋巴結(jié)和病變位置。
[0179] 在治療淋巴疾病中，NIRF成像是廣受歡迎的指導診斷和治療的工具。本發(fā)明公開 的ICG-LNP的使用通過在臨床環(huán)境中使NIRF成像的強度和實用性多元化和得到改進而改 善了 NIRF成像能力。
[0180] 本文提供的ICG-LNP具有各種各樣的比現(xiàn)有技術(shù)中已知的ICG制劑更加優(yōu)異的有 利性質(zhì)，例如（1)在皮下注射之后被快速攝取至淋巴中（參見，例如表5,圖17)，（2)在整 個淋巴系統(tǒng)中快速流動和廣泛分布（參見，例如圖9和圖10)，（3)在第一次流過淋巴系統(tǒng) 之后滯留于淋巴管和淋巴結(jié)中（參見，例如，圖11)，（4)在淋巴系統(tǒng)中具有非常高的體內(nèi)穩(wěn) 定性（參見，例如，圖9-11)，（5)在淋巴結(jié)組織中穩(wěn)定，如在淋巴結(jié)組織切片的近紅外顯微 成像下看到的通過間斷熒光所顯示的（參見，例如，圖11)，（6)分布于淋巴結(jié)組織中，如淋 巴結(jié)組織切片的近紅外顯微成像所顯示的（參見，例如，圖11)，（7)相對于游離ICG，使用 脂質(zhì)-結(jié)合ICG的不同的/提高的淋巴管和淋巴結(jié)的高分辨率成像（參見，例如，表2和圖 10)，（8)檢測注射位點的下游淋巴結(jié)，這是游離ICG無法實現(xiàn)的（參見，例如，表2,表5,圖 10,17,19)，（9)相對于游離ICG，使用脂質(zhì)-結(jié)合的ICG使淋巴管和淋巴結(jié)成像的持續(xù)期延 長（圖10、19)，（10)在淋巴結(jié)中累積和截留，尤其是在病變的淋巴結(jié)中累積和截留（圖6， 8,11，19,20)，（11)檢測帶有淋巴血管形成的腫瘤（圖4)，（12)檢測由于淋巴管新生和三 級淋巴器官而產(chǎn)生的炎癥位點（圖5-8)，和（13)主要通過膽管從肝臟清除進入腸道（圖 18) 〇
[0181] A.熒光成像方法
[0182] 本文提供的對比劑還可用于熒光成像方法。使用根據(jù)本實施方式的對比劑的熒光 成像方法包括至少下列步驟：將對比劑給藥于受治者或獲自受治者的樣本，用光輻照受治 者或獲自受治者的樣本，以及測量來自于從受治者或獲自受治者的樣本中存在的顆粒中衍 生的物質(zhì)的熒光。
[0183] 使用根據(jù)本實施方式的對比劑的熒光成像方法的實例在下文中描述。即，將根據(jù) 本實施方式的對比劑施加于標本，或加至諸如獲自標本的器官之類的樣本。應當注意的是， 所述標本是指所有活體，例如，實驗動物和寵物，沒有任何特定限制。標本或獲自標本的樣 本的實例可包括器官、組織、組織切片，細胞和細胞裂解物。在施加顆粒或添加顆粒之后，用 近紅外波長范圍內(nèi)的光輻照所述標本或類似物。
[0184] 成像可通過商售熒光IVIS成像設(shè)備（例如，IVIS Lumina成像系統(tǒng)）和ICG濾波 器進行。
[0185] 如上所述，許多光成像設(shè)備被設(shè)計為使用波長范圍并且IVIS也對應于ICG單體的 吸收波長，即，780nm (濾波器的激發(fā)通帶設(shè)定為4:705至780nm)。
[0186] 一方面，本發(fā)明提供一種用于使受治者體內(nèi)的組織或器官成像的方法，包括：將適 量的ICG-LNP給藥于需要成像的受治者，用合適頻率的光輻照所述受治者，以及通過檢測 ICG發(fā)射的光獲取所述受治者的組織或器官的圖像。Nguyen, Q.T.，and Tsien，R.Y. (2013) Fluorescence-guided surgery with live molecular navigation:A new cutting edge. Nat. Rev. 13, 653-662,該參考文獻的全部內(nèi)容通過引用并入本文。
[0187] 在一些實施方式中，所述方法包括：（1)通過皮下注射、皮內(nèi)注射、靜脈內(nèi)注射，肌 肉內(nèi)注射，腫瘤內(nèi)注射，腫瘤周圍注射的方式將包含本文提供的LNP的組合物給藥于受治 者，例如人類，以及（2)使用內(nèi)窺鏡上的近紅外光/照相機或手持式探針檢測來自組織內(nèi)的 ICG納米顆粒的熒光，由此獲取所述受治者的組織或器官的圖像。
[0188] 本文提供的成像方法可用于各種不同的應用，例如，（1)淋巴流和引流的繪圖，（2) 血管造影術(shù)，（3)檢測淋巴組織，（4)前哨淋巴結(jié)繪圖，（5)淋巴管結(jié)構(gòu)異常檢測，（6)通過 改變淋巴流型或靶向癌細胞的分子檢測淋巴轉(zhuǎn)移癌細胞，以及（7)可視化遞送包含在ICG 納米顆粒中的藥物（宏觀和微觀/組織學）。
[0189] 本文提供的作為產(chǎn)品的ICG-LNP在僅~0. 05mg/kg ICG劑量或更低的條件下有效 (相對于FDA推薦的靜脈內(nèi)劑量：0. 5-2mg/kg)(其由于強度提高了五倍并且獲得了藥物動 力學穩(wěn)定性而使劑量降低~10倍）。
[0190] 另一方面，本發(fā)明提供一種獲取受治者的組織或器官的圖像的方法，所述方 法包括按照單位體重計算在低于約〇? 5mg/kg, 0? 4mg/kg, 0? 3mg/kg, 0? 2mg/kg, 0? lmg/ kg, 0. 09mg/kg, 0. 08mg/kg, 0. 07mg/kg, 0. 06mg/kg, 0. 05mg/kg, 0. 04mg/kg, , 0. 03mg/ kg,0. 02mg/kg,或0.0 lmg/kg染料（例如，ICG)劑量的條件下將染料給藥于所述受治者，所 述染料例如，NIR染料（例如，ICG)。
[0191] 在一些實施方式中，所述劑量按照單位體重計算為約0.0 lmg/kg至約0. 5mg/kg， 約 0? Olmg/kg 至約 0? 4mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 3mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 2mg/kg, 約 0? Olmg/kg至約 0? lmg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 09mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 08mg/kg, 約 0? Olmg/kg 至約 0? 07mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 06mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 05mg/ kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 04mg/kg,約 0? Olmg/kg 至約 0? 03mg/kg,或約 0? Olmg/kg 至約 0.02mg/kg染料（例如，ICG)劑量，包括端點值。
[0192] 在一些實施方式中，劑量按照單位體重計算是約0. 01mg/kg至0. 5mg/kg染料（例 如，ICG)劑量，包括端點值。
[0193] 在一些實施方式中，所述方法包括將如下量的ICG-LNP給藥于受治者，所述量 按照單位體重計算小于約 〇? 5mg/kg, 0? 4mg/kg, 0? 3mg/kg, 0? 2mg/kg, 0? lmg/kg, 0? 09mg/ kg, 0? 08mg/kg, 0? 07mg/kg, 0? 06mg/kg, 0? 05mg/kg, 0? 04mg/kg, 0? 03mg/kg, 0? 02mg/kg,或 0?0lmg/kg ICG 劑量。
[0194] 在一些實施方式中，所述方法包括將如下量的ICG-LNP給藥于受治者，所述量按 照單位體重計算為約〇? 0lmg/kg至約0? 5mg/kg，約0? 0lmg/kg至約0? 4mg/kg,約0? 0lmg/kg 至約 0. 3mg/kg,約 0. 01mg/kg 至約 0. 2mg/kg,約 0. 01mg/kg 至約 0. lmg/kg,約 0. 01mg/kg 至 約 0? 09mg/kg,約 0? 01mg/kg 至約 0? 08mg/kg,約 0? 01mg/kg 至約 0? 07mg/kg,約 0? 01mg/kg 至約 0? 06mg/kg,約 0? 01mg/kg 至約 0? 05mg/kg,約 0? 01mg/kg 至約 0? 04mg/kg,約 0? Olmg/ kg至約0? 03mg/kg,或約0? 01mg/kg至約0? 02mg/kg ICG劑量，包括端點值。
[0195] 在一些實施方式中，所述組合物的給藥途徑選自全身給藥和局部給藥，其中，所述 全身給藥包括血管內(nèi)注射，所述局部給藥包括皮下注射、皮內(nèi)注射、粘膜下注射、漿膜下注 射、腫瘤內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、口服、經(jīng)鼻給藥和腫瘤內(nèi)注射。在本發(fā)明優(yōu)選的實施方式中， 在通過血管內(nèi)注射的方式給藥的情況下，所述組合物的量等于約0. 01mg/kg體重ICG劑量 至約0. 5mg/kg體重ICG劑量。在局部給藥本發(fā)明的組合物的情況下，所述組合物的單點注 射量等于約〇? lng至約0? lmg ICG劑量。
[0196] 使用本文提供的教導，可制定不會產(chǎn)生很大的毒性且又完全有效治療特定患者表 現(xiàn)出的臨床癥狀的有效治療方案。這種治療方案的制定應當涉及考慮了諸如化合物效力、 相對生物利用度、患者體重、存在的副作用以及副作用的嚴重程度，優(yōu)選的給藥模式以及所 選擇的藥劑的毒性特性之類的因素謹慎選擇活性化合物。
[0197] 雖然本文已經(jīng)顯示并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員 而言明顯的是，這些實施方式僅僅是以舉例說明的方式提供。在不背離本發(fā)明的條件下，本 領(lǐng)域技術(shù)人員可做出多種改變、變化和替代。應當理解的是，對本文所述的本發(fā)明的實施方 式的各種改變可在實施本發(fā)明時使用。后附的權(quán)利要求意在限定本發(fā)明的范圍，其所限定 的方法和結(jié)構(gòu)均在這些權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
[0198] 實施例
[0199] 通過下文和舉例說明本發(fā)明的化合物的制備的實施例進一步舉例說明本發(fā)明，但 不限于此。
[0200] 實施例1
[0201 ]化學試劑：P引卩朵音綠(ICG ;C43H47N2Na06S2;2-[7-[3, 3-一甲基_1_(4-橫丁基）苯并 [e]二氫吲哚-2-亞基]庚_1，3, 5-三烯-1-基]-3, 3-二甲基-1-(4-磺丁基）苯并鈉鹽） 購自 Sigma_Aldrich(St. Louis，M0)。1，2-二硬脂?；?_sn_ 丙三基-3-磷酸膽堿（DSPC)， 1，2-二硬脂酰基-sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙二醇-2000 (DSPEmPEG2。。。） 以及L-a-磷脂酰膽堿（Egg PC)購自Avanti Polar脂質(zhì)（Alabaster，AL)。其他試劑是分 析純級別或更高級別。
[0202] LNP制備：對照或苧LNP和ICG-LNP通討薄臘水合和聲波降解法制備。簡言之， 將溶于CHC13中的DSPC和溶于CHC1 3:CH30H(3: lv/v)中的DSPEmPEG2。。。在無菌試管中混合 (9: lmol/mol)。隨后在N2氣和減壓條件下干燥該混合物以形成薄膜，薄膜在室溫條件下過 夜真空干燥。用pH為7的0. 9% NaCl，20mM NaHCOgl沖液在60°C下重新水化所述薄膜持 續(xù)3小時（最終脂質(zhì)濃度20mM)。LNP的直徑通過55°C下的15分鐘的超聲波浴處理降低至 大約50nm至80nm。對于ICG-LNP而言，將溶于100% CH30H的ICG加至脂質(zhì)混合物中，隨 后干燥形成薄膜。ICG自淬滅（22)降低，并且對ICG在脂質(zhì)膜中的密度進行優(yōu)化（圖3)。 LNP 和 ICG-LNP 的平均直徑在 PSS-NICOMP 380ZLS 儀器（Particle Sizing Systems, Port Richey，F(xiàn)L)通過光子相關(guān)光譜（PCS)由粒度分析獲得。G電位在相同的儀器上測量。ICG 嵌入效率通過平衡透析由脂質(zhì)結(jié)合ICG和游離ICG的分離來估算。所有實驗在黑暗條件下 進行，避免光線暴露。
[0203] 吸附至LNP的ICG的90°光散射：溶于100% CH30H的ICG與LNP以25:1至500:1 的脂質(zhì)-ICG摩爾比在塑料micronic管中孵育20分鐘，隨后用pH為7的0. 9% NaCl，20mM NaHC03的緩沖液稀釋25倍以最小化ICG-脂質(zhì)相互作用。隨后在HitachiF-4500熒光分光 光度計（作 〇7，1)上測量九十度光散射。設(shè)定參數(shù)：\；!/6|11= 660/66〇11111狹縫寬度6：!/6|11 = 2. 5/5nm。在觀察過程中在室溫避光條件下保存樣品。
[0204] 勞光：使用100 U L平底未處理的96孔平板（Grenier Bio-one, Monroe, NC)中的 樣品，在帶有鎢-鹵素連續(xù)波燈（75W，光譜范圍320nm-800nm)和激發(fā)（769±41nm)和發(fā)射 (832±37nm)濾波器（Semrock, Rochester, NY)的 Victor3V 1420-040 多標記微孔板酶標儀 (Perkin-Elmer, Waltham, MA)上進行焚光測量。
[0205] 光暴露和儲存穩(wěn)宙件：對于光暴露穩(wěn)宙件而言(圖13)，將ICG濃度為2. 0 y M的 游離ICG和ICG-LNP的樣品暴露于頂部發(fā)光的熒光燈管持續(xù)12小時。在0小時、6小時和 12小時記錄熒光測量值。對于儲存穩(wěn)定性而言（圖12)，將樣品放置于黑暗中在4°C下持 續(xù)多達313天。在五個不同的時間點記錄游離ICG的熒光測量值，在10個不同的時間點 記錄ICG-LNP的熒光測量值。ICG熒光的時間依賴性衰減基于GraphPad Prism version 6. 0(GraphPad Software, San Diego, CA)的指數(shù)衰減模型進行分析。數(shù)據(jù)表示為tl/2(半 衰期）和k (速度常數(shù)）。
[0206] 組織滲誘深度：伸用三個不同深度(0? 5cm，1. 0cm，1. 5cm)的方塊雞胸組織體模評 價ICG熒光穿過組織的檢測（圖2)。組織方塊放置于填充有50 y L的30 y M游離ICG或 ICG-LNP 的毛細管[70 yL 容量，75mm 長度，1.2mm 內(nèi)徑（Fisher Scientific，Hampton，NH)] 上。白光和 NIR 圖像使用 Hamamatsu Photonics K.K. (Hamamatsu, Japan)制造的定制 NIR 電荷耦合元件（CCD)照相機在毛細管和組織方塊制備15分鐘內(nèi)捕獲。在0-255的范圍 (255為最大亮度）下，所選擇的區(qū)域的焚光強度平均值通過Adobe Photoshop CS4(Adobe Systems Inc.，San Jose, CA)中的分析函數(shù)獲得。
[0207] 小鼠體內(nèi)NIR淋巴成像：小鼠在無菌條件下飼養(yǎng)，暴露于12小時光暗循環(huán)，并且在 成像之前自由采食。
[0208] 用1.5%的異氟烷麻醉小鼠，刮除皮毛并且以仰臥位放置于IVIS Lumina II NIR CCD照相機（Perkin Elmer, Waltham, MA)下方的37°C熱盤上。獲取注入造影劑前的圖像 以確認不存在自發(fā)熒光。向兩個后足的頂部皮下注射四十微升（相當于〇.5nmol ICG) ICG-LNP或游離ICG。在注射之后，立即將雙足放置于輕微均勻壓力下。獲取圖像持續(xù)長達 120分鐘，隨后在麻醉條件下通過頸脫位安樂死，小鼠安樂死之后，通過手術(shù)打開皮膚進行 淋巴結(jié)成像。
[0209] 實施例2
[0210] 脂質(zhì)-ICG相互作用
[0211] 為了評價ICG和脂質(zhì)之間的相互作用，將空（不含ICG)LNP與各種不同濃度的ICG 一同孵育。如果溶液中的ICG分子與膜中的脂質(zhì)結(jié)合，那么這會導致LNP交聯(lián)和聚集，從 而引起可由90度光散射變化檢測的LNP表觀尺寸增加以及粒度增加。在初步試驗中，由 雞蛋衍生的磷脂酰膽堿（Egg PC)構(gòu)成的LNP (包含混合長度的脂肪?；湥┑墓馍⑸鋸姸?隨ICG濃度的增加而增加，這說明ICG誘導LNP聚集。接下來使用具有明確限定的磷脂組 合物一包含兩個對稱C18脂肪?；湹腄SPC和DSPEmPEG 2_ (9: lmol/mol) -的LNP進行系 統(tǒng)研究。使LNP中的濃度固定為10mM的脂質(zhì)與不同濃度的ICG在25°C下進行相互作用持 續(xù)20分鐘，用緩沖液稀釋25倍停止反應。對混合物進行90°光散射分析和光子相關(guān)光譜 (PCS)分析以估算粒度。
[0212] 預見到，九十度光散射強度在顆粒處于單個，非聚集形式時較低，并且隨著顆粒聚 集而增強。然而，當脂質(zhì)聚集體過大時，聚集體可能離開光通路或者顆粒中的電子可能不一 同同相擺動并且導致顆粒內(nèi)的破壞性干擾，這導致散射強度的明顯下降。如圖14A所示，空 LNP(只有脂質(zhì)）具有低散射強度，游離ICG(僅ICG)具有接近零的一致的散射強度，不論 ICG的濃度是否發(fā)生改變。當將LNP和ICG(ICG-LNP)混合時，在ICG濃度較低（20-30nM) 的條件下，檢測到類似于空LNP對照（只有脂質(zhì)）的最小光散射強度。當ICG濃度從30nM 增加至70nM時，ICG-LNP的光散射強度增加大約1. 5倍（圖14A)。在ICG濃度為40nM時， 散射強度發(fā)生較小的降低，然而，仍然顯著高于ICG濃度為20-30nM的散射強度。在高濃度 (100-400nM ICG)條件下，散射強度隨聚集體增大而下降。圖14B顯示了所設(shè)想的聚集體形 成的示意圖，該聚集體形成導致光散射強度開始增加隨后隨粒度大大增加而降低。這些數(shù) 據(jù)使用PCS的聚集體尺寸分析確認。如圖14C所示，在20nM ICG初始濃度下，顆粒直徑類 似于空LNP的直徑（~100nm)。表觀ICG-LNP尺寸隨ICG濃度從20nM增加至100nM而增 加約兩倍。在ICG濃度為30nM至100nM條件下表觀尺寸在直徑為300nm左右波動，并且隨 后在ICG濃度為400nM條件下增加至約400nm。在ICG濃度為30-400nM的范圍內(nèi)，檢測到 恒定直徑為60-90nm的較小但獨特的ICG-LNP的小聚集群（數(shù)據(jù)未顯示）。
[0213] 綜上所述，這些數(shù)據(jù)表明ICG結(jié)合至空的預先形成的LNP中存在的脂質(zhì)中并且導 致LNP聚集，檢測為粒度明顯增加，并且光散射強度不連續(xù)地增加?；谥|(zhì)濃度為10mM 且ICG濃度為20-50nM，這些數(shù)據(jù)使產(chǎn)生最大脂質(zhì)聚集和粒度明顯增加的脂質(zhì)-ICG摩爾比 估算為200:1至500:1。
[0214] 脂質(zhì)-ICG相互作用對ICG熒光的影響
[0215] 接下來，我們確定了由于ICG結(jié)合至脂質(zhì)而對熒光強度產(chǎn)生的影響。使用脂 質(zhì)-ICG摩爾比125:1至25, 000:1。由于ICG的自淬滅性質(zhì)，用緩沖溶液稀釋反應混合物20 倍至線性ICG濃度范圍0. 01-2. OmM。如圖15所示，混合物中脂質(zhì)的存在使相同ICG濃度下 的ICG熒光強度增加。當ICG濃度從0.0 lmM增加至1. OmM時，相對于對照，含有脂質(zhì)的混合 物的熒光強度逐漸增加。在ICG濃度為0. lmM，0. 5mM和1. OmM的條件下，熒光強度分別增加 了 10. 0 倍（65, 720vs. 6, 600)，4. 3 倍（261，640vs. 61，360)和 2. 8 倍（346, 610vs. 122, 530)。 在ICG濃度為2. OmM的條件下，脂質(zhì)介導的ICG熒光強度的提高較小，僅僅觀察到1. 4倍的 增加（275,820vs. 199,420)。在脂質(zhì)濃度固定為250 yM且ICG濃度為0. 5^]\1，1.〇1^和 2.0 yM的條件下，這些值的等同脂質(zhì)-ICG摩爾比分別為500:1，250:1和125:1(圖15)。因 此，表現(xiàn)出最大熒光強度的最優(yōu)脂質(zhì)-ICG摩爾比估計為125:1至500:1。該估算值與90° 光散射和PCS尺寸分析收集到的數(shù)據(jù)一致。從ICG和預先形成的LNP的相互作用衍生得到 的這些值用作后續(xù)ICG-LNP制備和性質(zhì)研究的目標范圍。
[0216] 將ICG并入LNP以穩(wěn)宙和最大化ICG熒光
[0217] 不同于將溶液中的ICG加至脂質(zhì)中作為緩沖溶液中的混合物，我們首先將ICG和 脂質(zhì)一同在有機溶劑中混合，隨后除去溶劑并在緩沖液中再次水合形成插入或嵌入有ICG 的LNP。ICG在吸收和發(fā)射光譜中具有顯著重合（數(shù)據(jù)未顯示）并且因此表現(xiàn)出在高濃度條 件下的自淬滅可能性。因此，我們制備嵌入或并入有不同濃度（密度）的ICG的LNP，所述 ICG嵌入脂質(zhì)中。如果ICG密度太大，ICG分子之間非常靠近可因濃度依賴性分子相互作用 而誘導自淬滅。而且，并入脂質(zhì)而非暴露于水的ICG可提供比暴露于水的ICG分子更高的 熒光，暴露于水會淬滅ICG熒光。評估從100:1至500:1范圍內(nèi)八個脂質(zhì)-ICG摩爾比。圖 3A表示三個脂質(zhì)-結(jié)合ICG樣品（等于100:1，250:1和350:lmol/mol)和溶解的ICG對 照的典型ICG濃度下ICG斜率的每單位熒光強度。在ICG濃度為0.0 lmM至2. OmM條件下， 熒光強度表現(xiàn)出線性增加。需要注意的是，250:1線的斜率是最陡的，隨后是350:1，然后是 100:1和僅ICG。為了確定最優(yōu)脂質(zhì)-ICG摩爾比，我們評估了每個制劑的線的斜率（清楚 起見，全部八條線中僅三條顯示在圖3A中）。
[0218] 斜率等于每yM ICG的熒光強度。如圖3B所示，由于ICG密度的降低和自淬滅，每 ICG的熒光強度（斜率）隨脂質(zhì)-ICG摩爾比從100:1增加至250:1而增加，在脂質(zhì)-ICG摩 爾比為250:1的點，每ICG的熒光強度達到最大。隨后，在300:1和350:1的條件下，每ICG 的熒光強度降低，隨后在500:1條件下顯著降低。因此，我們在脂質(zhì)-ICG摩爾比為250:1 的條件下觀察到每ICG的熒光強度峰值。
[0219] 因為250:1的脂質(zhì)-ICG摩爾比表現(xiàn)出每ICG的最大熒光強度，我們使用通過光子 相關(guān)光譜（PCS)的粒度分析和通過電泳光散射（ELS)的顆粒表面電荷電位）分析表 征250:1制劑。由直徑為56. 8±4. 4nm且G電位為-33. 1±3. lmV的顆粒的單分散群構(gòu)成 250:1制劑。平衡透析表明ICG合并效率為97. 8±0. 6%。由于ICG的并入的可重現(xiàn)性和 ICG的幾乎完全并入，選擇這種制劑無需進一步純化而用于后續(xù)的體內(nèi)和體外研究。
[0220] 脂質(zhì)并入對提高ICG暴露于光的穩(wěn)宙件和儲存穩(wěn)宙件的作用
[0221] 接下來，我們評估了 ICG-LNP在4°C下儲存和暴露于光線下的穩(wěn)定性，從而模擬 臨床設(shè)置的環(huán)境。如圖13所示，ICG-LNP的熒光強度在暴露于光線6小時之后降低至起 始值的87. 6±0. 5%，并且在12小時后沒有發(fā)生進一步降低（t1/2= 67. 5±11.8h，k = 0. 011±0. 002h 4。相反，溶液中的游離ICG的熒光強度在暴露于光線6小時之后降低至其 起始值的 2. 5±0. 5% (t1/2= 0? 036±0. 005h，k = 19. 2±2. 7h 這表明水溶液中的 ICG 光不穩(wěn)定性。
[0222] 為了評估長期儲存穩(wěn)定性，我們將ICG-LNP保存在4°C黑暗條件下并且在313 天中多次測量熒光強度。如圖12和表1所示，在儲存ICG-LNP八個月之后，記錄起始熒 光強度的約78.2±2.8%(七 1/2= 394 天[95%(：1:360,434]，1^=1.76\103天1[95% Cl: 1. 60 X 10 3, 1. 93 X 10 3])。然而，對于緩沖液中的游離ICG而言，在儲存八個月之后僅僅 觀察到起始 ICG 熒光的 0.3±0.2% (t1/2= 1. 19 天[95% CI:1. 14, 1.25]，k = 582X10 3 天1[95%CI:554X 10 3,609X 10 3])。
[0223] 表1?儲存穩(wěn)定性動力學a
[0225] 3在4°(：黑暗條件下儲存。b儲存八個月的樣品平均值土SD(每個樣品N = 2)。 ctl/2(95% CI)和 k(95% CI)由 313 天中的多個時間點（N= 10)計算。dtl/2(95% CI)和 k(95% CI)由239天中的多個時間點（N = 5)計算。
[0226] 體外增強的ICG-LNP的NIR成像
[0227] 為了比較ICG-LNP(脂質(zhì)-ICG摩爾比為250:1的制劑）和游離ICG之間的熒光 信號強度，我們制備了肌肉組織厚度增加的雞胸方塊，增加的肌肉組織厚度為〇. 5cm、1. 0cm 和1. 5cm (圖2F)。我們用50mL 30mM的ICG(1. 5nmol ICG)填充所有毛細管（長度為75mm， 內(nèi)徑為1. 2mm)(圖2B)。如圖2A所示，填充有ICG-LNP的毛細管的熒光強度比填充有游離 ICG的毛細管的熒光強度高3. 2倍（強度平均值分別為111. 7vs. 34. 5)。當將毛細管放置 于三個組織方塊下方時，隨著深度從左至右增加，游離ICG熒光（頂部三個組織方塊）僅僅 在穿過深度為0. 5cm的組織方塊中檢測到（左上方的組織方塊，強度平均值為9. 0)，但不會 穿過更厚的深度，ICG-LNP熒光（底部三個組織方塊）在穿過0. 5cm，1. 0cm和1. 5cm深度 的組織方塊中檢測到（強度平均值分別為112. 1，77. 3,10. 0)(圖2C)。進一步的分析表明 穿過1. 5cm的肌肉組織僅可檢測到毛細管中的ICG-LNP (0. 5cm，1. 0cm，1. 5cm深度的強度平 均值分別為100. 9,68. 0,15. 2)(圖2E和圖2F)。
[0228] ICG-LNP對小鼠體內(nèi)NIR淋巴圖像分辨率的影響
[0229] 使用穩(wěn)定且最優(yōu)的ICG-LNP制劑，我們在小鼠體內(nèi)進行光成像實驗原理的體 內(nèi)證明。為了比較游離ICG和ICG-LNP，我們將40 y L游離形式或與LNP結(jié)合的形式 的ICG(0. 5nmol ICG)皮下給藥于小鼠的左足或右足（圖16A)。在第六分鐘，只有接受 ICG-LNP(而不是游離ICG)的足部表現(xiàn)出穿過皮膚的可檢測的膝后窩結(jié)節(jié)（圖16A)。僅當 在皮膚下方收集到圖像時，兩個膝后窩淋巴結(jié)變得可檢測。接受游離ICG的膝后窩淋巴結(jié) 的ICG強度平均值為37. 0,相對而言，用ICG-LNP處理的膝后窩淋巴結(jié)的ICG強度平均值為 208. 1 (數(shù)據(jù)未顯示）。為了進一步比較游離ICG和ICG-LNP的淋巴圖像分辨率，在另一組 小鼠中，我們將游離形式的ICG或LNP形式的ICG以相同的劑量給藥于雙足。如圖16B所 示，在給藥后和除去皮膚之后六分鐘，接受游離ICG的動物表現(xiàn)出ICG擴散進入血液（隱靜 脈）。在這種情況下，ICG在局部膝后窩結(jié)節(jié)中可清楚地檢測（圖16B)。相反，在用ICG-LNP 處理的小鼠中，不僅膝后窩淋巴結(jié)強度高得多，而且通至腹部骨盆和生殖器/局部結(jié)節(jié)的 淋巴通路也是易于看見的（圖16C)。沒有觀察到游離ICG在該淋巴通路中的分布。
[0230] 淋巴繪圖和前哨淋巴結(jié)節(jié)檢測
[0231] 表2顯示了在小鼠足部的皮下注射位點的下游淋巴結(jié)和血管中通過ICG-LNP和游 離ICG檢測到的熒光強度（膝后窩輸入血管〉膝后窩淋巴結(jié)〉膝后窩輸出血管〉坐骨〉髂 骨肌〉胃〉腋窩）。在所有情況下，通過ICG-LNP檢測到的強度大于通過游離ICG檢測到的 強度。此外，因為用ICG-LNP檢測到的淋巴結(jié)的數(shù)量大于游離ICG檢測到的淋巴結(jié)的數(shù)量， 所以，由ICG-LNP獲得更高的分辨率。這表明ICG-LNP相對于游離ICG具有提高的強度和 更高的分辨率。
[0232] 表2.在皮下注射游離ICG和ICG-LNP之后小鼠體內(nèi)所選擇的淋巴結(jié)和血管中的 體內(nèi)熒光強度
[0234] a在各個淋巴結(jié)或血管中檢測到的最大近紅外熒光（NIRF)強度（任意單位， a.u.)。平均值土 SEM(N = 3-4)。NA，不可用。
[0235] *P 值〈0.05。
[0236] 表3表示ICG-LNP形式中ICG劑量為皮下給藥游離ICG使用的通常劑量的8%。 由于本發(fā)明的脂質(zhì)顆粒產(chǎn)生獨特的ICG穩(wěn)定性并使得熒光強度增強，所以脂質(zhì)納米顆粒中 的ICG劑量〈游離ICG所需的劑量的10%。
[0237] 表3.使用ICG-LNP和游離ICG的體內(nèi)淋巴成像中典型的吲哚菁綠（ICG)皮下劑 量。
[0238]
[0239] 表4表示基于ICG是游離形式或脂質(zhì)納米顆粒形式，相等劑量的ICG表現(xiàn)出不同 的體內(nèi)藥物動力學行為。ICG-LNP允許1. 4倍至幾乎2倍的更高的熒光強度暴露，最大強度 和更快的消除速率。這些性質(zhì)支持了使用ICG-LNP在體內(nèi)實現(xiàn)熒光強度增強。
[0240] 表4.小鼠足部皮下給藥之后通過皮膚檢測到的第一引流淋巴結(jié)（膝后窩淋巴結(jié)） 中的游離ICG和ICG-LNP的熒光強度的體內(nèi)藥物動力學。
[0242] *熒光強度=任意單位（a. u.)
[0243] 表5表示通過小鼠足部的皮下注射位點隨時間推移達到的第一和第二引流淋巴 節(jié)（分別為膝后窩和坐骨）中的熒光強度。兩小時后，第一引流淋巴節(jié)中的信號降低了幾乎 一半。第二引流淋巴節(jié)中的信號（其為第一淋巴節(jié)中的信號的約70%)降低了大約25%。 這說明使用ICG-LNP在體內(nèi)評估起始和下游引流淋巴結(jié)的淋巴結(jié)功能的能力。
[0244] 表5.皮下注射ICG-LNP之后來自小鼠淋巴結(jié)的體內(nèi)透皮焚光強度
[0245]
[0246] *焚光強度=任意單位（a. u.)
[0247] 實施例3
[0248] 腫瘤前哨淋巴結(jié)檢測/繪圖。實施一至十次腫瘤周闈深度灃射并目.實施一至十 次腫瘤周圍皮下注射。對于每次注射而言，給藥〇.〇l-l〇mL的ICG濃度為0. l-100yM的 ICG-LNP。按摩注射位點持續(xù)大約5分鐘。使用手持式、頭戴式或以其他方式設(shè)置的近紅外 成像系統(tǒng)進行淋巴繪圖。
[0249] 在健康個體或糖尿病、癌癥或其他疾病患者體內(nèi)表征淋巴功能和淋巴系統(tǒng)。在 健康或疾病個體中，在體內(nèi)的任何位置實施一至十次皮下注射。對于每次注射而言，給藥 0. 01-10mL ICG濃度為0. 1-100 y M的ICG-LNP。按摩注射位點大約5分鐘。使用手持式、 頭戴式或以其他方式設(shè)置的近紅外成像系統(tǒng)實施淋巴繪圖/成像/記錄。在其他功能性 特征、表型特征或描述性特征中，評價淋巴管（LV)結(jié)構(gòu)，淋巴管滲透性或滲漏性，淋巴管直 徑，淋巴管密度，淋巴流和其他淋巴動力學參數(shù)，淋巴結(jié)（LN)形態(tài)或尺寸，淋巴結(jié)滲透性或 滲漏性，淋巴結(jié)定位的變化。在使用通過淋巴檢測到的熒光信號的患者體內(nèi)，采用"疾病信 號"："正常信號"的比例計算表征患病和健康個體之間的淋巴差異的指數(shù)。
[0250] 腸道,血管和淋巴管中的淋巴管和淋巴結(jié)的內(nèi)窺鏡檢測。伸用帶有皮下灃射針和 近紅外成像能力的內(nèi)窺鏡，將〇.〇l-l〇mL的ICG濃度為0. l-100yM的ICG-LNP注射進入腸 上皮或血管內(nèi)皮或淋巴管內(nèi)皮。使用內(nèi)窺鏡近紅外成像系統(tǒng)實施淋巴繪圖。
[0251] 異常肝臟功能檢測。實施0? 01-100mL的ICG濃度為0? 1-100 yM的ICG-LNP的靜 脈內(nèi)推注或輸注。使用手持式、頭戴式或以其他方式設(shè)置的近紅外成像系統(tǒng)使來自肝臟的 熒光信號成像。測量來自肝臟的熒光信號的終末半衰期。與正常健康對照比較終末半衰期 以評估任何肝臟機能障礙。
[0252] 轉(zhuǎn)務件癌癥擴散路徑的檢測。實施一至十次皮下、腫瘤內(nèi)或腫瘤周闈灃射。對于 每次注射而言，給藥0.0 l-lOrnL的ICG濃度為0. 1-100 y M的ICG-LNP。如果注射位點可感 知的話，按摩注射位點大約5分鐘。使用手持式、頭戴式內(nèi)窺鏡、腹腔鏡或其他方式設(shè)置的 近紅外成像系統(tǒng)實施淋巴繪圖。評估淋巴管和淋巴結(jié)的擴大，管堵塞或滲漏或其他與癌細 胞的轉(zhuǎn)移性擴散有關(guān)的特征。
[0253] 血管和心血管病變檢測。實施0. 01-100mL ICG濃度為0. 1-lOOuM的ICG-LNP的 靜脈內(nèi)推注或輸注。使用內(nèi)窺鏡，手持式，頭戴式或以其他方式設(shè)置的近紅外成像系統(tǒng)使來 自血管或病理學改變的熒光信號成像以評估正常血管和心血管病變之間的差異。
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【主權(quán)項】
1. 一種組合物，其包含： (i) 含有脂質(zhì)膜和水性核的脂質(zhì)納米顆粒，和 (ii) 多個吲哚菁綠ICG， 其中，所述多個ICG中的一個或多個嵌入所述脂質(zhì)膜中。2. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)分子包括1，2-二硬脂?；?sn-丙三 基-3-磷酸膽堿DSPC和1，2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙 二醇-2000DSPEmPEG2000。3. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，至少約95%的ICG嵌入所述脂質(zhì)膜。4. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，至少約99%的ICG嵌入所述脂質(zhì)膜。5. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，基本約100%的ICG嵌入所述脂質(zhì)膜。6. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，少于5%的ICG包裹在所述水性核中。7. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，少于1 %的ICG包裹在所述水性核中。8. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，沒有可檢測量的ICG包裹在所述水性核中。9. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述脂質(zhì)納米顆粒懸浮于pH為5-8且滲透壓為 約303m0SM的生物相容性緩沖液中。10. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述納米顆粒的平均尺寸為50nm至100nm。11. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述納米顆粒表面具有負電荷。12. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述納米顆粒在血清中穩(wěn)定，在25°C下熱滅活 的血清中6小時后保留其初始熒光的約90%至約100%。13. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述納米顆粒的熒光強度是水溶液中游離ICG 的熒光強度的4倍至5倍。14. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，在儲存于4°C下0至約300天之后，所述納米顆 粒的熒光強度是水溶液中游離ICG的熒光強度的4倍至100, 000倍。15. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物在低于約0. 5mg/kg體重的ICG劑量 條件下有效。16. 如權(quán)利要求1所述的組合物，其中，所述組合物在約0. 01mg/kg體重的ICG劑量條 件下有效。17. -種使受治者體內(nèi)的組織或器官成像的方法，所述方法包括：將適量的權(quán)利要求1 所述的組合物給藥于需要成像的受治者；獲取所述受治者的組織或器官的圖像。18. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述組合物的給藥途徑選自全身給藥和局部給 藥。19. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述全身給藥包括血管內(nèi)注射。20. 如權(quán)利要求18所述的方法，其中，所述局部給藥包括皮下注射、皮內(nèi)注射、粘膜下 注射、漿膜下注射、腫瘤內(nèi)注射、肌肉內(nèi)注射、口服、經(jīng)鼻給藥和腫瘤內(nèi)注射。21. 如權(quán)利要求19所述的方法，其中，所述組合物的量等于約0. 01mg/kg體重至約 0· 5mg/kg體重的ICG劑量。22. 如權(quán)利要求20所述的方法，其中，所述組合物的單點注射量等于約0. lng至約 0. lmgICG 劑量。23. 如權(quán)利要求17所述的方法，其中，所述組織或器官選自：淋巴管、二級淋巴組織、血 管、諸如動脈粥樣硬化之類的內(nèi)皮病變、腫瘤、諸如在炎癥位點之類的三級淋巴組織、肝臟、 膽管、膽囊、腸、胃、腦、腎、乳腺、肺、心臟、眼、卵巢和前列腺。24. -種制備納米顆粒的方法，其包括： (a) 在有機溶劑中混合吲哚菁綠ICG和脂質(zhì)分子； (b) 蒸發(fā)所述有機溶劑以形成包含所述脂質(zhì)分子和ICG的薄膜；以及 (c) 用緩沖鹽水水合所述薄膜并減小粒度。25. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述脂質(zhì)分子包括：1，2-二硬脂酰基-sn-丙三 基-3-磷酸膽堿DSPC和1，2-二硬脂?；?sn-丙三基-3-磷酸乙醇胺-N-甲氧基-聚乙 二醇-2000DSPEmPEG2000。26. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述有機溶劑包括乙醇、甲醇、氯仿、乙酸乙酯或 二甲基亞砜DMSO。27. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述緩沖鹽水包括約0. 9 %的NaCl和約20mM的 NaHC03〇28. 如權(quán)利要求24所述的方法，其中，所述方法不包括過濾步驟、純化步驟或分離步驟 或者它們的組合。
【文檔編號】B82Y5/00GK105854030SQ201510404534
【公開日】2016年8月17日
【申請日】2015年7月10日
【發(fā)明人】何仁揚, 約翰·C·克拉夫特, 錢明心
【申請人】蘇州同力生物醫(yī)藥有限公司