專利名稱：：用于不同亞型非小細胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種用于不同亞型非小細胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法。
背景技術(shù)：
：肺癌是最致命的癌癥之一，在組織學(xué)上分為小細胞肺癌和非小細胞肺癌，其中后者占肺癌病例的80%。非小細胞肺癌又分為腺癌，鱗癌和大細胞癌三類亞型。腺癌作為一種最主要的亞型，占非小細胞肺癌的40%。非小細胞肺癌的預(yù)后嚴重依賴于確診時疾病所處的分期，按照現(xiàn)有的治療水平，病人的5年生存率從1期的60%降到IV期的1。/。。盡管在肺癌的檢測方法上取得了較大進展，但目前仍有約70%的病人在確診時已處于肺癌晚期。對非小細胞肺癌不同亞型的治療施加相似的治療方法而沒有考慮亞型之間的異質(zhì)性是影響非小細胞肺癌治療效果的重要原因。盡管目前神經(jīng)元特異性烯醇化酶、細胞角蛋白片段21-1、癌胚抗原、糖類抗原等腫瘤標志物用于肺癌的檢測和術(shù)后評估，但是這些腫瘤標志物對肺癌，尤其是不同肺癌亞型的特異性和敏感性不夠。非小細胞肺癌的分型和診斷仍主要依靠細胞物理形態(tài)進行判斷，發(fā)展能從分子水平上反映非小細胞肺癌特征的新試劑，并用以進行亞型分類和早期診斷是降低非小細胞肺癌死亡率重要手段。核酸適體(Aptamer，又稱適配體，適配子)是能高親和性、高特異性的結(jié)合某種生物靶標的單鏈寡核酸分子(ssDNA或ssRNA)。已報道核酸適體的靶標包括金屬離子、有機小分子、多肽、蛋白質(zhì)、細胞甚至組織等。核酸適體的分子識別功能與抗體類似，但與抗體相比具有很多優(yōu)良的特性，如無免疫原性、容易合成與標記、快速的穿透組織、良好的代謝動力學(xué)、不同批次之間產(chǎn)品不會存在差異和具有很好化學(xué)穩(wěn)定性，在生物檢測、疾病診斷治療等領(lǐng)域具有重要的應(yīng)用前景。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種用于不同亞型非小細胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法。本發(fā)明提供的核酸適體，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。所述核酸適體具體可為序列表的序列1至序列16中任一所示的DNA片段。核酸適體1:5，-CGCGTGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAGCGCG-3';見序列表的序列10;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列l(wèi);核酸適體2:5'-CMTTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3，;見序列表的序列2;核酸適體3a:5，-ATGCCACAGTGGGGGGGTGGGTGGGTGGCAT_3，；見序列表的序列l(wèi)l;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列3;核酸適體3b:5，-TCGGATGCTGGGTGGGGGGGAAGAGCATCCGA-3，；見序列表的序列12;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列4;核酸適體3c:5，-CCACTACGAGGGTGGGCGGGTGGAGTAGTGG-3';見序列表的序列13;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列5;核酸適體3d:5'-GATCGGTGGGTGGGGGGGTTGGAGATC-3，；見序列表的序列14;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列6;核酸適體3e:5，-CGAACAGGTGGGTGGGTTGGGTGGATTGTTCG-3，；見序列表的序列15;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列7;核酸適體3f:5，-GATTAAGTGGGTGGGGGGGTGGAAGTTAATC-3，;見序列表的序列16;其中加粗下劃線標記的為目標序列，見序列表的序列8;核酸適體4:5，-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA-3，;見序列表的序列9。其中，每條DNA序列中目標序列以外的核苷酸可用其它互補的核苷酸代替。其中，核酸適體3a、核酸適體3b、核酸適體3c、核酸適體3d、核酸適體3e和核酸適體3f，包含一保守序列G^GGGTGGGG&GGTAGAe其中Gi可以刪除，T,可被核苷酸A取代，G2可以被核苷酸C或TT取代，T2可以被核苷酸A取代，G3可以被核苷酸A取代或刪除。還可將所述核酸適體進行修飾或改造，得到所述核酸適體的衍生物，所述核酸適體的衍生物可為a)將所述核酸適體刪除部分或增加部分互補的核苷酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。b)將所述核酸適體進行核苷酸取代或部分修飾，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。c)將所述核酸適體的骨架改造為硫代磷酸酯骨架，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。d)將核酸適體改造為肽核酸，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。e)將所述核酸適體連接上熒光、放射性和治療性物質(zhì)后，得到的與所述核酸適體具有相同功能的核酸適體的衍生物。本發(fā)明還保護所述核酸適體在不同亞型非小細胞肺癌細胞分型中的應(yīng)用。所述核酸適體與不同亞型的非小細胞肺癌細胞的親和性不同。將兩者孵育后可得到不同的結(jié)合信號，從而可以通過單個核酸適體信號或多個核酸適體分子圖譜的形式區(qū)分非小細胞肺癌不同亞型。還可將所述核酸適體進行熒光標記，然后對肺癌病人的組織切片進行染色，從而實現(xiàn)臨床樣本非小細胞肺癌不同亞型的區(qū)分。當(dāng)然，在核酸適體與不同亞型的非小細胞肺癌細胞的親和性不同的基礎(chǔ)上，可以再現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)上選擇任意方法，對不同亞型非小細胞肺癌細胞進行分型。所述不同亞型的非小細胞肺癌細胞可為腺癌亞型細胞、大細胞癌亞型細胞或鱗癌亞型細胞。所述腺癌亞型細胞具體可為A549細胞；所述大細胞癌亞型細胞具體可為HLAMP細胞或NCI-H460細胞；所述鱗癌亞型細胞具體可為NCI-H520細胞或NCI-H157細胞。本發(fā)明還保護篩選述核酸適體的方法，包括如下步驟用靶細胞對核酸文庫進行篩選，得到與靶細胞特異結(jié)合的核酸適體；所述核酸文庫為單鏈的隨機核苷酸序列的文庫；所述靶細胞為非小細胞肺癌細胞中的亞型細胞。所述篩選的方法具體包括如下步驟(1)以所述核酸文庫為起始核酸文庫；(2)將所述起始核酸文庫的溶液與靶細胞孵育，靶細胞與起始核酸文庫中部分核酸序列結(jié)合，分離，得到與靶細胞結(jié)合的核酸序列文庫；(3)將所述與靶細胞結(jié)合的核酸序列文庫的溶液與非耙細胞孵育，分離去除與所述非靶細胞結(jié)合的核酸序列，得到與靶細胞特異結(jié)合的核酸序列；(4)得到核酸適體。所述步驟(2)中，還可包括如下步驟在得到與靶細胞結(jié)合的核酸序列文庫后，PCR擴增所述與靶細胞結(jié)合的核酸序列文庫，并制備成單鏈。所述步驟(3)中，還可包括如下步驟在得到與耙細胞特異結(jié)合的核酸序列后，PCR擴增與靶細胞特異結(jié)合的核酸序列，并制備成單鏈。所述篩選的方法中，在所述步驟(3)之后、步驟(4)之前，包括至少1次以下操作以所述與靶細胞特異結(jié)合的核酸序列為起始核酸文庫，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的與靶細胞特異結(jié)合的核酸序列為起始核酸文庫。所述篩選方法中，可每一輪篩選逐步增加篩選壓力，以增進核酸適體的富集程度。所述增加篩選壓力可為線性減少核酸序列文庫和靶細胞的孵育時間和相應(yīng)的線性增加核酸序列文庫與非耙細胞的孵育時間。所述靶細胞具體可為腺癌亞型細胞；所述非靶細胞具體可為大細胞癌亞型細胞。肺癌的形成是一個多步的瘤形成過程。一些分子異常也伴隨腫瘤的形成而發(fā)生，如一些分子在腫瘤中表達或過表達，或發(fā)生改變。利用本發(fā)明的核酸適體，可在目前非小細胞肺癌腫瘤標志物未知的情況下，從分子響應(yīng)信號而不是從細胞物理形貌上實現(xiàn)非小細胞肺癌不同亞型的區(qū)分。利用本發(fā)明的核酸適體，對其結(jié)合靶標的鑒定，將有利于非小細胞肺癌不同亞型的腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)，有利于非小細胞肺癌更早的診斷和更準確的分型，有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用耙點。圖1為實施例1中核酸適體的隨篩選輪次的富集過程；峰形代表A549細胞與異硫氰酸熒光素(FITC)標記文庫，和第1輪、第6輪、第21輪產(chǎn)物結(jié)合的情況圖2為應(yīng)用四甲基羅丹明標記的核酸適體識別非小細胞肺癌組織切片的結(jié)果。具體實施例方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。腺癌A549細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心，產(chǎn)品目錄號為CCC0002。鱗癌NCI-H520細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心，產(chǎn)品目錄號為CCC0197。鱗癌NCI-H157細胞系購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所/中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院細胞中心，產(chǎn)品目錄號為CCC0113。大細胞癌HLAMP購自中山醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心。大細胞癌NCI-H460細胞系購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保,委員會細胞庫，產(chǎn)品目錄號為TCHu39。實施例1、用于不同亞型非小細胞肺癌分型的核酸適體的篩選一、隨機核酸文庫的設(shè)計與合成設(shè)計合成兩端包含20個核苷酸、中間包括45個核苷酸的隨機核酸序列文庫如下5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG(N45)CTCATGGACGTGCTGGTGAC-3，。二、核酸適體的篩選將隨機核酸文庫溶于結(jié)合緩沖液中(PBS，150mMNaCl，5mMMgCl2，lmg/ml酵母轉(zhuǎn)移RNA)，與肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞在冰上孵育1小時；經(jīng)洗滌緩沖溶液(PBS，150mMNaCl,5mMMgCl2)洗滌后，將A549細胞刮離下來，然后通過加熱將與細胞表面結(jié)合的麗A解離；解離的DNA與大細胞肺癌細胞系HLAMP細胞冰上孵育1小時，收集上清液并以其中的DNA為模板，利用引物(FITC-5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和Biotin-5，-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3，)進行PCR擴增；擴增后通過親和素包被的葡聚糖珠分離生物素標記的PCR產(chǎn)物，然后利用O.2M的氫氧化鈉使雙鏈DNA變性解鏈，收集FITC標記的DNA單鏈，這些DNA單鏈脫鹽后用于下一輪篩選。為了得到高親和性的區(qū)分不同非小細胞不同亞型的核酸適體，在篩選的過程中，通過逐步減少DNA文庫與靶細胞孵育的時間，增加洗滌次數(shù)和洗滌時間以及與對照細胞孵育的時間來增強篩選壓力。核酸適體隨篩選輪次的富集過程見圖1。25輪篩選后，以篩選產(chǎn)物為模板通過引物(5，-ACGCTCGGATGCCACTACAG-3，和5'-GTCACCAGCACGTCCATGAG-3')進行PCR擴增，將PCR產(chǎn)物進行測序，得到以下核酸適體序列核酸適體l:5，-CGCGTGTGGGGAGGGGGGTGGGTTTTATAGCGCG-3';核酸適體2:5，-CMTTGGGTGTAGGGGTGGGGATTGTGGGTTG-3，；核酸適體3a:5，-ATGCCACAGTGGGGGGGTGGGTGGGTGGCAT-3，；核酸適體3b:5，-TCGGATGCTGGGTGGGGGGGMGAGCATCCGA-3，；核酸適體3C:5，-CCACTACGAGGGTGGGCGGGTGGAGTAGTGG-3';核酸適體3d:5，-GATCGGTGGGTGGGGGGGTTGGAGATC-3';核酸適體3e:5，-CGAACAGGTGGGTGGGTTGGGTGGATTGTTCG-3，；核酸適體3f:5，-GATTAAGTGGGTGGGGGGGTGGMGTTAATC-3，；核酸適體4:5，-GCTATCTTATGGAAATTTCGTGTAGGGTTTGGTGTGGCGGGGCTA7將獲得的核酸適體分別在5'端標記熒光分子制成分子探針，分別取0、5、10、20、40、80、100、120、200nM的分子探針溶液，與5X105個肺腺癌細胞系A(chǔ)549細胞于冰上孵育50分鐘后，用結(jié)合緩沖液洗滌兩遍，然后用流式細胞儀測定細胞表面的熒光強度，如細胞能結(jié)合熒光標記的核酸適體，則以熒光強度對探針濃度作圖，用公式Y(jié)=BmaxX/(Kd+X)計算核酸適體的平衡解離常數(shù)Kd。結(jié)果表明，核酸適體的平衡解離常數(shù)均在納摩范圍內(nèi)。實施例2、應(yīng)用核酸適體對進行不同亞型的小細胞肺癌進行分型用異硫氰酸熒光素(FITC)標記實施例l得到的4條核酸適體。用異硫氰酸熒光素(FITC)標記實施例1的隨機核酸文庫。將培養(yǎng)的不同腫瘤細胞用PBS洗滌兩次、然后0.02%EDTA處理3分鐘、再用PBS洗滌兩次。每種腫瘤細胞分別進行以下四組處理，每個處理設(shè)置三個重復(fù)，結(jié)果取平均值處理一通過細胞記數(shù)分別取300，OOO左右的細胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記核酸適體l(最終濃度為100nM)。處理二通過細胞記數(shù)分別取300，OOO左右的細胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記核酸適體2(最終濃度為100nM)。處理三通過細胞記數(shù)分別取300，OOO左右的細胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記核酸適體3e(最終濃度為100nM)。處理四通過細胞記數(shù)分別取300，OOO左右的細胞分散于結(jié)合緩沖溶液中，然后加入異硫氰酸熒光素(FITC)標記核酸適體4(最終濃度為100nM)。四個處理的混合液在冰上孵育50分鐘，離心洗滌兩次后利用流式細胞儀檢測核酸適體和不同腫瘤細胞結(jié)合情況。將細胞與FITC標記的隨機文庫孵育后做流式細胞儀檢測，設(shè)定一熒光強度值大于95%的細胞熒光強度做為流式細胞儀背景熒光值。以細胞與核酸適體結(jié)合后熒光強度超過這一閾值的細胞百分數(shù)作為衡量核酸適體與細胞的結(jié)合能力強弱(0:<15%;+:15-30%;++:30-65%;+++:65-85%;++++〉85%)。結(jié)果見表l。<table>tableseeoriginaldocumentpage8</column></row><table><table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>對于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的核酸適體l，腺癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有65-85%，大細胞癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有15-30%，鱗癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度在閾值的細胞百分數(shù)小于15%;對于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的核酸適體2，腺癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有85%以上，大細胞癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有30-65%，鱗癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)小于15%;對于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的核酸適體3e，腺癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有85%以上，大細胞癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有65-85%，鱗癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有15-65%;對于異硫氰酸熒光素(FITC)標記的核酸適體4，腺癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有85%以上，大細胞癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)有65-85%，鱗癌亞型的細胞與其結(jié)合后的熒光強度高于閾值的細胞百分數(shù)小于15%。結(jié)果表明利用以上核酸適體與不同亞型非小細胞肺癌的結(jié)合強弱圖譜均可實現(xiàn)不同亞型非小細胞肺癌的區(qū)分。實施例3、檢測表1所列的核酸適體與肺癌組織切片的結(jié)合來自不同肺癌患者志愿者的甲醛固定石蠟包埋的組織切片浸于二甲苯中室溫脫蠟2次，每次20分鐘，隨后浸于系列乙醇中水化(100%，兩次，每次l分鐘；95%乙醇，l次，l分鐘；70%乙醇，l次，l分鐘)。隨后將水化的組織切片浸于緩沖溶液中95。C加熱15分鐘。待組織切片恢復(fù)室溫后，與含20%胎牛血清和小牛胸腺DNA的結(jié)合緩沖液室溫孵育1小時，組織切片經(jīng)洗滌后分別與四甲基羅丹名標記的核酸適體(200nM)在結(jié)合緩沖液中室溫孵育1小時。染色后用洗滌緩沖液洗滌組織切片3次，待干后封片檢測。結(jié)果見圖2。當(dāng)三種非小細胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標記的核酸適體1孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強度值為357.59，而大細胞癌和鱗癌分別為214.99和181.06。當(dāng)非小細胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標記的核酸適體2孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強度值為289.79，而大細胞癌和鱗癌分別為220.05和182.20。當(dāng)非小細胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標記的核酸適體3e孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強度值為492.38，而大細胞癌和鱗癌分別為203.48和212.54。當(dāng)非小細胞肺癌不同分型患者的組織切片分別與四甲基羅丹名標記的核酸適體4孵育后，腺癌亞型的組織切片的熒光強度值為482.83，而大細胞癌和鱗癌分別為219.33和218.31。實驗結(jié)果表明所得到的核酸適體能與肺腺癌高親和性結(jié)合，從而在臨床上可用于肺腺癌的檢測和診斷。序列表<110>中國科學(xué)院化學(xué)研究所〈120〉用于不同亞型非小細胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法<130>CGGNAY92234<160〉16<210>1〈211〉26<212>DNA〈213〉人工序列<220><223><400〉1tgtggggaggggggtgggttttatag26〈210〉2<211〉32<212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉2caattgggtgtaggggtggggattgtgggttg32〈210〉3〈211〉17〈212〉腿<213〉人工序列〈220〉〈223>〈400〉3agtgggggggtgggtgg17<210>4〈211〉16〈212>DNA〈213〉人工序列〈220>〈223>〈400>4tgggtgggggggaaga16〈210〉5〈211〉17〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉5gagggtgggcgggtgga〈210〉6〈211>19〈212〉DNA〈213>人工序列〈220〉<223〉〈400〉6ggtgggtgggggggttgga〈210〉7〈211〉20〈212〉DNA<213>人工序列<220><223〉說明書第11/15頁1719<400>7ggtgggtgggttgggtggat20<210>8<211〉19<212〉DNA<213>人工序列〈220>〈223〉<400>8gtgggtgggggggtggaag19〈210>9<211>45〈212>薩〈213〉人工序列〈220>〈223><400>9gctatcttatggaaatttcgtgtagggtttggtgtggcggggcta45〈210>10<211>34<212〉靈<213>人工序列<220><223><400>10cgcgtgtggggaggggggtgggttttatagcgcg34<210〉11〈211〉31<212>DNA<213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉11atgccacagtgggggggtgggtgggtggcat31<210〉12<211〉32<212〉DNA<213>人工序列<220>〈223〉〈400〉12tcggatgctgggtggggggga卿gcatccga〈210〉13<211〉31<212〉D隱〈213〉人工序列〈220〉〈223>〈400>13ccactacgagggtgggcgggtggagtagtgg3231〈210〉14<211〉27<212>DNA〈213〉人工序列<220>〈223〉〈400〉14gatcggtgggtgggggggttggagatc27〈210〉15〈211〉32〈212〉DNA<213〉人工序列<220〉〈223〉<400〉15cgaacaggtgggtgggttgggtggattgtteg32〈210〉16〈211〉31〈212〉DNA〈213〉人工序列〈220〉〈223〉〈400〉16gattaagtgggtgggggggtggaagttaatc3權(quán)利要求1、核酸適體，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。2、如權(quán)利要求l所示的核酸適體，其特征在于所述核酸適體為序列表的序列1至序列16中任一所示的DNA片段。3、權(quán)利要求1或2所述核酸適體在不同亞型非小細胞肺癌細胞分型中的應(yīng)用。4、如權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于所述不同亞型的非小細胞肺癌細胞為腺癌亞型細胞、大細胞癌亞型細胞或鱗癌亞型細胞。5、如權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述腺癌亞型細胞為A549細胞；所述大細胞癌亞型細胞為HLAMP細胞或NCI-H460細胞；所述鱗癌亞型細胞為NCI-H520細胞或NCI-H157細胞。6、篩選權(quán)利要求1或2所述核酸適體的方法，包括如下步驟用靶細胞對核酸文庫進行篩選，得到與靶細胞特異結(jié)合的核酸適體；所述核酸文庫為單鏈的隨機核苷酸序列的文庫；所述靶細胞為非小細胞肺癌細胞中的亞型細胞。7、根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于所述篩選的方法包括如下步驟(1)以所述核酸文庫為起始核酸文庫；(2)將所述起始核酸文庫的溶液與靶細胞孵育，靶細胞與起始核酸文庫中部分核酸分子結(jié)合，分離，得到與靶細胞結(jié)合的核酸文庫；(3)將所述與靶細胞結(jié)合的核酸文庫的溶液與非靶細胞孵育，分離去除與所述非靶細胞結(jié)合的核酸分子，得到與靶細胞特異結(jié)合的核酸分子；(4)得到核酸適體。8、根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于所述步驟(2)中，還包括如下歩驟在得到與靶細胞結(jié)合的核酸文庫后，PCR擴增所述與靶細胞結(jié)合的核酸文庫，并制備成單鏈；所述步驟(3)中，還包括如下步驟在得到與靶細胞特異結(jié)合的核酸分子后，PCR擴增與耙細胞特異結(jié)合的核酸分子，并制備成單鏈。9、根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述篩選的方法中，在所述步驟(3)之后、步驟(4)之前，包括至少l次以下操作以所述與靶細胞特異結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫，重復(fù)步驟(2)和(3)，每次操作均以前一次操作中得到的與靶細胞特異結(jié)合的核酸分子為起始核酸文庫。10、根據(jù)權(quán)利要求6至9中任一所述的方法，其特征在于所述耙細胞為腺癌亞型細胞；所述非靶細胞為大細胞癌亞型細胞。全文摘要本發(fā)明公開了一種用于不同亞型非小細胞肺癌分型的核酸適體及其篩選方法。本發(fā)明提供的核酸適體，是含有序列表的序列1至序列9中任一所示的核苷酸的DNA片段。所述核酸適體可應(yīng)用于不同亞型非小細胞肺癌細胞分型。利用本發(fā)明的核酸適體，可在非小細胞肺癌腫瘤標志物未知的情況下，從分子響應(yīng)信號上實現(xiàn)非小細胞肺癌不同亞型的區(qū)分。利用本發(fā)明的核酸適體，對其結(jié)合靶標的鑒定，將有利于非小細胞肺癌不同亞型的腫瘤標志物的發(fā)現(xiàn)，有利于非小細胞肺癌更早的診斷和更準確的分型，有利于發(fā)現(xiàn)腫瘤治療新的藥物作用靶點。文檔編號C12N15/10GK101538570SQ20091008307公開日2009年9月23日申請日期2009年4月28日優(yōu)先權(quán)日2009年4月28日發(fā)明者上官棣華,麗徐,方曉紅,譚蔚泓,趙子龍申請人:中國科學(xué)院化學(xué)研究所