專利名稱：：經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞，其制法、應用、試劑盒及包括其的疫苗的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及樹突狀細胞及其制備方法、該樹突狀細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用、制備該樹突狀細胞的試劑盒，以及包括該樹突狀細胞的疫苗。特別地，本發(fā)明涉及經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞及其制備方法、該經(jīng)耐受性篩選的肺瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用、制備該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的試劑盒，以及包括該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的疫苗。
背景技術(shù)：
：目前腫瘤的治療方法包括手術(shù)治療、放射治療和化療。但現(xiàn)有的腫瘤治療方法不能根治腫瘤。主要原因是構(gòu)成腫瘤的細胞中含腫瘤干細胞，其具有干細胞的生物學特性，即自我更新、多潛能分化、高耐受性(例如對化療藥物的高耐藥性及對放射治療的高耐輻射性)及極少數(shù)的肺瘤千細胞還驅(qū)動腫瘤的形成。因此腫瘤干細胞是腫瘤發(fā)生和發(fā)展(腫瘤的生長、腫瘤產(chǎn)生耐受性、腫瘤復發(fā)和腫瘤轉(zhuǎn)移等)的真正元兇?，F(xiàn)有技術(shù)已嘗試使用樹突狀細胞免疫治療方法來治療癌癥，即從患者腫瘤中將腫瘤干細胞分離出來，通過裂解該腫瘤干細胞得到抗原，并將該抗原負載到患者的樹突狀細胞上。如此得到的靶向腫瘤干細胞的樹突狀細胞，可以用于治療癌癥。例如WO2008/039874中公開了從腦腫瘤中分離出干細胞樣胂瘤細胞(stem-likecell),然后將由其制備得到的抗原負載到樹突狀細胞上，并用所得樹突狀細胞治療癌癥的方法?，F(xiàn)有技術(shù)僅公開了如何得到相關(guān)胂瘤千細胞，但并未教導對獲取的腫瘤干細胞進行處理。并且，現(xiàn)有技術(shù)的上述方法雖然以腫瘤干細胞為靶標，但是該方法仍然存在腫瘤在放療和化療后耐藥性、復發(fā)率和轉(zhuǎn)移率高的問題
發(fā)明內(nèi)容為了克服現(xiàn)有以普通胂瘤千細胞為靶標的癌癥免疫治療方法仍然存在腫瘤在放療和化療后耐藥、復發(fā)和轉(zhuǎn)移的問題，本發(fā)明的目的是提供一種經(jīng)耐受性篩選的胂瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞及其制備方法、該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用、制備該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的試劑盒，以及包括該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的疫苗?，F(xiàn)有技術(shù)認為經(jīng)射線照射和/或與大劑量化療藥物接觸后，腫瘤干細胞會被全部殺死，但是本發(fā)明的發(fā)明人意外地發(fā)現(xiàn)，在一定范圍內(nèi)經(jīng)射線照射和/或與大劑量化療藥物接觸后，腫瘤干細胞不但不會被完全殺死，而且還會產(chǎn)生具有很強耐受性的腫瘤干細胞。一般劑量的射線照射和/或化療藥物很難殺滅所述經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞。本發(fā)明提供了一種經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法，該方法包括通過裂解經(jīng)耐受性篩選的肺瘤千細胞得到腫瘤干細胞抗原組合物，將樹突狀細胞與經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原組合物接觸得到負載腫瘤抗原的抗癌樹突狀細胞，其中，所述經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞通過以下方法制備，該方法包^r:對腫瘤干細胞進行射線照射和/或化療藥物篩選的步驟，所述射線照射篩選通過將腫瘤干細胞暴露于射線的照射源下完成，所述射線選自由X射線、P射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物篩選通過使胂瘤千細胞與化療藥物接觸完成，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基千肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鉑、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中。本發(fā)明還提供了由上述的方法得到的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了一種經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其特征在于，所述樹突狀細胞為本發(fā)明所述的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤千細胞抗原負載的樹突狀細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括1)腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基；2)放射治療同位素源和/或化療藥物；3)消化細胞的酶；4)B27、N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素的至少一種；5)樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基；6)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子；7)白介素-4、千擾素a和腫瘤壞死因子a的至少一種；以及6)使用"i兌明書；其中，所述》文射治療同位素源選自由X射線、p射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基節(jié)肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鉑、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中；所述使用說明書包括本發(fā)明所述的樹突狀細胞的制備方法。由于本發(fā)明的腫瘤干細胞經(jīng)過了射線照射和/或化療藥物的篩選，由此得到的腫瘤干細胞產(chǎn)生了與腫瘤干細胞不同的變化(比如特異表達了許多不同于腫瘤干細胞的蛋白)，更接近接受過放療和/或化療的腫瘤內(nèi)的腫瘤千細胞，因此，由本發(fā)明提供的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞以及由該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞得到的抗原組合物制備的藥物，能夠在體內(nèi)和體外殺死引起腫瘤復發(fā)的肺瘤干細胞，從而為胂瘤的根治提供了可能。圖1為制備例1的腦膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)Y射線輻射篩選后的存活率曲線；圖2為制備例5的肺癌干細胞經(jīng)Y射線輻射篩選后的存活率曲線；圖3為重復制備例1的腦膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)9Gy的Y射線輻射篩選后的存活率曲線；圖4顯示腦膠質(zhì)瘤千細胞經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后耐受性蛋白表達western印跡照片；圖5顯示了制備例1腦膠質(zhì)瘤千細胞、制備例3的乳腺癌干細胞和制備例6的肝癌干細胞經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后耐受性蛋白RT-PCR后表達電泳照片；圖6:經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載樹突狀細胞，流式細胞儀檢測負載DC表型變化情況。圖7顯示了由表8所示經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后的制備例1、經(jīng)總劑量為9Gy、劑量率為200cGy/min和距離為50cm的射線照射篩選的制備例5以及表4所示經(jīng)化療藥物篩選后的制備例6所得抗原組合物負載樹突狀細胞，得到細胞毒性T淋巴細胞(CTL),由該CTL細胞產(chǎn)生的對相應肺瘤干細胞的應答結(jié)果；圖8顯示了由表8所示經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后的制備例2和未經(jīng)篩選的制備例2所得兩種抗原組合物分別負載樹突狀細胞，得到兩種細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，由該兩種CTL細胞分別對經(jīng)射線照射和化療藥物篩選的以及未經(jīng)射線照射和化療藥物篩選的乳腺癌干細胞產(chǎn)生的應答結(jié)果對比圖。具體實施例方式本發(fā)明提供了一種經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞的制備方法，其中，該方法包括對腫瘤干細胞進行射線照射和/或化療藥物篩選的步驟，所述射線照射篩選通過將腫瘤千細胞暴露于射線的照射源下完成，所述射線選自由X射線、P射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物篩選通過使腫瘤干細胞與化療藥物接觸完成，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基節(jié)肼、氮烯咪胺、順鉑、卡柏、草酸柏、丙亞胺和羥基脲所組成的組中。其中，Gy為射線照射的總劑量單位，1Gy-100md，cGY為組織吸收放射線的劑量單位，lcGy=lrad,即lGy=100rad=100cGy。所述劑量率是指射線照射的速度，cGy/min為劑量率的單位。射線照射的時間=總劑量/劑量率。優(yōu)選地，所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為10cm-5m，所述射線照射的總劑量為2Gy-10Gy，所述射線照射的劑量率為0.4-1200cGy/min。更優(yōu)選所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為20cm-2m,所述射線照射的總劑量為3Gy-9Gy，所述射線照射的劑量率為2-600cGy/min。優(yōu)選地，本發(fā)明所述射線可以為X射線和/或Y射線。所述射線可以由各種常用的放射治療同位素金屬提供，例如Co60、Irl92、Cs-137、Am-241及Se75能夠放出Y射線等。優(yōu)選地，所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍可以為0.1-100mg/mL,所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為lh-72h。更優(yōu)選所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-50mg/mL，所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為12h-36h。接觸時間過長或化療藥物劑量過大，會殺死所有腫瘤干細胞，從而得不到具有經(jīng)耐受性篩選的的腫瘤千細胞；反之，起不到篩選腫瘤干細胞的作用。本發(fā)明可以使用現(xiàn)有的任何化療藥物完成對腫瘤干細胞的篩選。優(yōu)選所述烷化劑化療藥物選自由氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氮曱、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥和漆替派所組成的組中；所述亞硝脲類化療藥物選自由卡氮芥、環(huán)已亞硝脲、曱環(huán)亞硝脲、嘧啶亞硝脲、白消安和雌二醇氮芥所組成的組中；所述抗代謝藥化療藥物選自由曱氨喋呤、氟尿嘧啶、喃氟啶、優(yōu)福啶、卡莫氟、脫氧氟尿苷、氟尿脫氧核苷、環(huán)胞苷、阿糖胞苷和雙氟胞苷所組成的組中；所述抗生素化療藥物選自由放線菌素D、絲裂霉素、博來霉素、平陽霉素、阿霉9素、吡喃阿霉素、表-阿毒素、去甲氧柔紅霉素和米托蒽醌所組成的組中；所述植物化療藥物選自由長春新堿、長春花堿、長春地辛、長春瑞賓、鬼臼乙叉戒、鬼臼噻吩甙、羥基喜樹堿、伊立替康、托泊替康、紫杉醇、泰素帝、三尖杉酯堿和羥基紫杉醇所組成的組中；所述激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物選自由潑尼松、地塞米松、丙酸睪丸素、乙烯雌酚、氟硝丁酰胺、孕酮、曱地孕酮、他莫昔芬、雌激素受體拮抗劑、托瑞米芬、氨魯米特、福美司坦、來曲唑和促性腺激素釋放激素拮抗劑所組成的組中；所述抗體阻斷劑化療藥物選自由表皮生長因子抑制劑吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗和尼妥珠單抗所組成的組中。最優(yōu)選，所述化療藥物選自由4-羥-環(huán)磷酰胺、吉非替尼、厄洛替尼、五氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇和順鉑所組成的組中。本發(fā)明提供的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞的制備方法可以僅包括對腫瘤干細胞進行射線照射篩選的步驟，而不包括化療藥物篩選的步驟。在此情況下，所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離優(yōu)選為20cm-2m，所述射線照射的總劑量優(yōu)選為3Gy-9Gy，所述射線照射的劑量率優(yōu)選為2-600cGy/min;進一步優(yōu)選所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為50cm-lm，所述射線照射的總劑量為6Gy-9Gy，所述射線照射的劑量率為2-200cGy/min。本發(fā)明提供的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞的制備方法可以僅包括對腫瘤干細胞進行化療藥物篩選的步驟，而不包括射線照射篩選的步驟。在此情況下，優(yōu)選所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-50mg/mL，所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為12-36h;進一步優(yōu)選所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-20mg/mL，所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為12-24h。更優(yōu)選地，本發(fā)明提供的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞的制備方法包括對腫瘤干細胞進行射線照射和化療藥物篩選的步驟，在此情況下，所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為20cm-2m,所述射線照射的總劑量為3Gy-9Gy，所述射線照射的劑量率為2-600cGy/min，所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-50mg/mL,所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為12-36h;進一步優(yōu)選所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為50cm-lm，所述射線照射的總劑量為6Gy-9Gy，所述射線照射的劑量率為2-200cGy/min,所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-20mg/mL，所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為12-24h。此外，進一步優(yōu)選所述射線照射的照射源及所述化療藥物與患者接受的射線照射和/或化療藥物相同。本發(fā)明適用于所有能夠從中分離出腫瘤干細胞的各種腫瘤。例如，所述腫瘤可以選自由乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、腦癌、鼻咽癌、肝細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、骨肉瘤、腎細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、急性骨髓白血病、多發(fā)性骨髓瘤胰腺癌和轉(zhuǎn)移瘤性癌所組成的組中。其中，所述轉(zhuǎn)移瘤性癌可以選自腦部轉(zhuǎn)移瘤、肺部轉(zhuǎn)移瘤、肝部轉(zhuǎn)移瘤和頸部轉(zhuǎn)移瘤所組成的組中。所述方法還包括從離體腫瘤組織和/或腫瘤細胞系中分離肺瘤干細胞。手術(shù)從患者體內(nèi)取出的腫瘤組織，屬于廢棄的離體腫瘤組織。本發(fā)明可以適用常規(guī)的方法得到肺瘤細胞，并從中分離出腫瘤干細胞(參見WO2008/039874)。此外，由現(xiàn)有商業(yè)上能夠買到的細胞系培養(yǎng)物也能從中分離出相應的腫瘤干細胞。例如，下表1列出的就是可以從美國典型物保藏中心(ATCC)買到、并且能夠從中分離出相應的腫瘤肝細胞的細胞抹系。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>本發(fā)明還提供了由上述的方法得到的腫瘤干細胞。腫瘤干細胞在經(jīng)過本發(fā)明的篩選后，所述腫瘤干細胞的所表達的蛋白發(fā)生了變化。例如，所述腫瘤干細胞特異表達選自由表皮生長因子受體、p-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變基因編碼的蛋白、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥Rad3相關(guān)蛋白和低氧誘導因子所組成的組中的蛋白。反過來，通過檢測這些蛋白的在篩選前后的變化，可以檢測出所述篩選過程是否成功。子標志，如白血病干細胞的表面標志為CD34+/CD38-,乳腺癌干細胞的標志為CD44+/CD24-,神經(jīng)膠質(zhì)瘤干細胞和黑素瘤的標志為CD133+。本發(fā)明的方法可以采用現(xiàn)有的側(cè)群(Sidepopulation,SP)方法富集腫瘤細胞系中腫瘤干細胞樣的細胞。SP細胞是細胞群體中極少的一部分，它們可將進入細胞核的熒光染料排出胞外，在熒光顯微鏡下觀察或流式細胞檢測時表現(xiàn)為不著色，故稱為SP細胞。SP細胞表達腫瘤干細胞相關(guān)的分子標志，如nestin、CD90、CD44、Musashi-1(Msi-1)、母體胚胎亮氨酸拉鏈激酶(maternalembryomicleucinezipperkinase，MELK)、神經(jīng)月交質(zhì)細月包瘤相關(guān)抗原-1(glioma-associatedantigen-l，Gli-1)基質(zhì)細胞衍生因子、B細胞特異性莫洛氏鼠白血病病毒插入位點-1(B-cell-specificMoloneyleukemiavirusinsertionsite-1，Bmi-1)、斑紋基因同源物PTCH、磷酸絲氨酸磷酸化酶(phosphoserinephosphatase,PSP)、乳腺癌抗藥蛋白1(Breastcancer-resistantprotein1，BCRP1)、06-甲基鳥嘌呤掘A曱基轉(zhuǎn)移酶(06-methylguanine-DNAmethyltransferase，MGMT)，基質(zhì)細胞衍生因子受體(CXCR4)、整聯(lián)蛋白(integrin)、表皮生長因子受體(EGFR)、存活素(survivin)、核干細胞因子(nucleostemin，NS)等。月中瘤千細胞通常借用正常干細胞標志和/或胂瘤細胞標志進行檢測。例如NS可確定細胞分化程度，是干細胞標志的重要核蛋白。此外，腫瘤干細胞常表現(xiàn)出基因組不穩(wěn)定性，經(jīng)放射治療和/或化療藥物后，盡管可消滅絕大多數(shù)腫瘤細胞，使瘤體變小甚至消失，但是殘留的極少數(shù)腫瘤細胞可能已被賦予干細胞樣的生物學特性，易發(fā)生惡性突變，產(chǎn)生藥物抵抗和放射抵抗。本發(fā)明還4是供了一種腫瘤干細胞抗原組合物的制備方法，該方法包括用生理鹽水洗滌并重懸腫瘤干細胞，然后裂解腫瘤干細胞的步驟，其中，所述腫瘤千細胞本發(fā)明的腫瘤干細胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決定。將本發(fā)明的腫瘤干細胞抗原組合物在注射給患者時殘留的培養(yǎng)基組分以及可能殘留的化療藥物不會引起患者不適即可。裂解本發(fā)明的腫瘤干細胞可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的各種裂解方法實現(xiàn)。出于不在裂解腫瘤干細胞后增加新的物質(zhì)的考慮，優(yōu)選所述裂解腫瘤干細胞的步驟包括熱休克和/或反復凍融；所述熱休克裂解的條件包括在3745'C下保持lh-6h，優(yōu)選包括在3843。C下保持2h-4h;所述反復凍融的次數(shù)為3-5次，每兩次的間隔時間是10min-2h,優(yōu)選為30min-lh，所述冷凍的溫度范圍是零下120。C-零下196。C(可以使用液氮、干冰等來實現(xiàn))，優(yōu)選零下15(TC-零下196°C，所述融化的溫度范圍是10°C-37°C,優(yōu)選為2(TC-37°C。由于經(jīng)熱休克后，本發(fā)明的腫瘤干細胞會產(chǎn)生熱休克蛋白，裂解后仍然存在所述熱休克蛋白。熱休克蛋白的存在有助于負載后的樹突狀細胞免疫應答。因此，更優(yōu)選所述裂解腫瘤干細胞的步驟包括熱休克和反復凍融；所述熱休克裂解的條件包括在37-45。C下保持lh-6h;所述反復凍融的次數(shù)為3-5次兩次的間隔時間是10min-2h,所述冷凍的溫度范圍是零下120。C-零下196°C，所述融化的溫度范圍是20。C-37。C。裂解完成后，通常通過離心和過濾的步驟除去裂解液中過大的細胞碎片，例如，通過600rpm離心lmin除去，然后上清用0.45pm濾膜過濾。所述組合物的基本成分包括生理鹽水。裂解得到的本發(fā)明的抗原組合物可以在-80'C中保存。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤千細胞以及本發(fā)明的腫瘤干細胞抗原組合物在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括1)腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基；2)放射治療同位素源和/或化療藥物；3)消化細胞的酶；4)細月包因子以及；5)使用說明書；其中，所述》文射治療同位素源選自由X射線、p射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基芐肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鉑、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中；所述使用說明書包括制備本發(fā)明的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞方法。其中，所述腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)腫瘤干細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述腫瘤干細胞培養(yǎng)體系包括腫瘤干細胞和3mL-50mL的腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基，在37。C、5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述放射治療同位素源可以實現(xiàn)與腫瘤干細胞的直線距離為1Ocm-5m、射線照射的總劑量為2Gy-10Gy以及所述射線照射的劑量率為0.4-1200cGy/min。所述化療藥物能夠提供上述本發(fā)明的方法所限定的有關(guān)化療藥物條件，例如以終濃度0.5-20mg/mL處理12-24h等。所述消化細胞的酶可以為本領(lǐng)域常規(guī)的消化細胞的酶，優(yōu)選為胰酶和/或阿尤替酶。其中，在腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基達3mL-50mL的時，所述胰酶和/或阿尤替酶(Accutase)優(yōu)選作為腫瘤組織分離腫瘤千細胞所4吏用試劑，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的用量，例如一般用量為1倍濃度的0.5mL-lOmL來消化細胞，即動物血清與消化細胞的酶液的體積比為1:l至l:5。所述細胞因子選自由B27、N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素所組成的組中。其中，所述B27在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤千細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。其中所述B27和N2是商業(yè)上可供的細月包培養(yǎng)添加劑(即細月包因子)，例如，美國biotech^^司、美國Gibco^A司生產(chǎn)的B27和N2。所述表皮細胞生長因子在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤千細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述堿性成纖維細胞生長因子在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述胰島素在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤千細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為lmg/mL畫50mg/mL。所述試劑盒還可以包括非必要的動物血清。所述動物血清可以是人血清。所述血清可以作為消化酶的終止劑，其用量為現(xiàn)有技術(shù)中作為消化酶終止劑的常規(guī)用量，例如，與消化細胞的酶液相當O.lmL-lOmL,即動物血清與消化細胞的酶液的體積比為1:l至l:5。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明所述的腫瘤干細胞抗原組合物的試劑盒，其中，所述試劑盒包括1)腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基；2)力文射治療同位素源和/或化療藥物；3)消化細胞的酶；4)細月包因子；以及5)使用說明書；其中，所述放射治療同位素源選自由X射線、(3射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基芐肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鉑、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中；所述使用說明書包括制備本發(fā)明所述的腫瘤干細胞抗原組合物所述的方法。其中，所述腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)腫瘤干細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述肺瘤干細胞培養(yǎng)體系包括腫瘤干細胞和3mL-50mL的腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基，在37。C、5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述放射治療同位素源可以實現(xiàn)與腫瘤干細胞的直線距離為10cm-5m、射線照射的總劑量為2Gy-10Gy以及所述射線照射的劑量率為0.4-1200cGy/min。所述化療藥物能夠提供上述本發(fā)明的方法所限定的有關(guān)化療藥物條件，例如以終濃14度0.5-20mg/mL處理12-24h等。所述消化細胞的酶可以為本領(lǐng)域常規(guī)的消化細胞的酶，優(yōu)選為胰酶和/或阿尤替酶。其中，在腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基達3mL-50mL的時，所述胰酶和/或阿尤替酶(Accutase)優(yōu)選作為腫瘤組織分離肺瘤干細胞所〗吏用試劑，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的用量，例如一般用量為1倍濃度的0.5mL-lOmL來消化細胞。所述細胞因子選自由B27、N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素所組成的組中。其中，所述B27在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述表皮細胞生長因子在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-1OOng/mL。所述堿性成纖維細胞生長因子在培養(yǎng)胂瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-lOOng/mL。所述胰島素在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為lmg/mL畫50mg/mL。所述試劑盒還可以包括非必要的動物血清。所述動物血清可以是人血清和/或牛血清。所述血清可以作為消化酶的終止劑，其用量為現(xiàn)有技術(shù)中作為消化酶終止劑的常規(guī)用量，例如，與消化細胞的酶液相當O.lmL-lOmL，即動物血清與消化細胞的酶液的體積比為1:1至1:5。所述組合物來自細胞濃度為lxl()S到lxl()S細胞/mL、優(yōu)選為lxl(^到5xl07細胞/mL的本發(fā)明的腫瘤干細胞。細胞濃度過大可能會引起患者過度的免疫應答反應，反之細胞濃度過小，則不足以引起患者的免疫應答反應。所述組合物還包括人血白蛋白；其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％，優(yōu)選為2-3重量體積％。本發(fā)明還提供了一種抗癌樹突狀細胞的制備方法，該方法包括將正常樹突狀細胞與腫瘤干細胞抗原組合物接觸，得到負載腫瘤干細胞抗原的樹突狀細胞，其中，所述腫瘤干細胞抗原組合物為本發(fā)明所述的腫瘤千細胞抗原組合物。優(yōu)選所述正常樹突狀細胞與制備胂瘤干細胞抗原組合物的腫瘤干細胞來自同一個體。這樣可以最大限度地避免由于免疫排斥反應而引起的副作用。其中在裂解腫瘤干細胞制備被負載的所述抗原組合物前，所述腫瘤干細胞經(jīng)用于培養(yǎng)樹突狀細胞的培養(yǎng)基洗滌三次。所述樹突狀細胞負載腫瘤干細胞抗原時，正常樹突狀細胞與腫瘤干細胞抗原組合物接觸的時間可以是本領(lǐng)域常規(guī)使用的任意的接觸時間，優(yōu)選是l-24h,更優(yōu)選是2-12小時。本發(fā)明還提供了由上述的方法得到的抗癌樹突狀細胞。本發(fā)明還提供了一種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其中，所述樹突狀細胞為本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞。在制備樹突狀細胞疫苗之前，用生理鹽水洗滌并重懸所述抗癌樹突狀細胞。所述生理鹽水的洗滌次數(shù)可以通過測定洗出液中殘留的培養(yǎng)基組分來決S的化療藥物不會引起患者不適即可:所i組合物包括lxl^到5xl07;/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞；優(yōu)選為5xl()S到lxlO卩個/mL。所述組合物還包括人血白蛋白；其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％，優(yōu)選為2-3重量體積％。本發(fā)明還提供了本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。本發(fā)明還提供了一種制備本發(fā)明所述的抗癌樹突狀細胞的試劑盒，其中，所述試劑盒包括1)腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基；2)放射治療同位素源和/或化療藥物；3)消化細胞的酶；4)B27、N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素的至少一種；5)樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基；6)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子；7)白介素-4、千擾素a和腫瘤壞死因子a的至少一種；以及6)使用說明書；其中，所述放射治療同位素源選自由X射線、P射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基千肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鉑、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中；所述使用說明書包括本發(fā)明制備所述抗癌樹突狀細胞的方法。其中，所述腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)腫瘤干細胞的培養(yǎng)基，例如DMEM/F12等。所述腫瘤干細胞培養(yǎng)體系包括腫瘤干細胞和3mL-50mL的腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基，在37。C、5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。所述放射治療同位素源可以實現(xiàn)與腫瘤干細胞的直線距離為1Ocm-5m、射線照射的總劑量為2Gy-10Gy以及所述射線照射的劑量率為0.4-1200cGy/min。所述化療藥物能夠提供上述本發(fā)明的方法所限定的有關(guān)化療藥物條件，例如以終濃度0.5-20mg/mL處理12-24h等。所述消化細胞的酶可以為本領(lǐng)域常規(guī)的消化細胞的酶，優(yōu)選為胰酶和/或阿尤替酶。其中，在腫瘤千細胞基礎培養(yǎng)基達3mL-50mL的時，所述胰酶和/或阿尤替酶(Accutase)優(yōu)選作為鐘瘤組織分離腫瘤干細胞所使用試劑，可以使用本領(lǐng)域常規(guī)的用量，例如一般用量為1倍濃度的0.5mL-10mL來消化細胞，即動物血清與消化細胞的酶液的體積比為1:l至l:5。其中，所述B27在培養(yǎng)肺瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述N2在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為2ng/mL-50ng/mL。所述表皮細胞生長因子在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述堿性成纖維細胞生長因子在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向胂瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為5ng/mL-100ng/mL。所述胰島素在培養(yǎng)腫瘤干細胞時，向腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基(例如DMEM/F12)中添加，達終濃度為lmg/mL誦50mg/mL。所述試劑盒還可以包括非必要的動物血清。所述動物血清可以是人血清。所述血清可以作為消化酶的終止劑，其用量為現(xiàn)有技術(shù)中作為消化酶終止劑的常規(guī)用量，例如，與消化細胞的酶液相當0.1mL-1OmL，即動物血清與消化細胞的酶液的體積比為1:l至l:5。所述腫瘤干細胞抗原組合物來自細胞濃度為lxl()S到lxl()S細胞/mL，優(yōu)選為lxl()S到5xl(^細胞/mL的本發(fā)明的腫瘤干細胞。所述細胞濃度過大造成浪費，反之細胞濃度過小，則不足以使樹突狀細胞負載上足夠的抗原。所述樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基可以是本領(lǐng)域任何能夠用于培養(yǎng)樹突狀細胞的培養(yǎng)基，例如RPMI/1640等。所述樹突狀細胞培養(yǎng)體系包括腫瘤干細胞和lmL-100mL、優(yōu)選30-80mL的樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基，在37。C、5%(:02培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。其中，所述巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)在腫瘤千細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-2500IU/mL。所述白介素-4在腫瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-1500IU/mL。所述干擾素a在胂瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度100IU/mL-2000IU/mL。所述腫瘤壞死因子a在腫瘤干細胞抗原負載樹突狀細胞時添加到樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基中，終濃度0.5ng/mL-100ng/mL。所述組合物還包括人血白蛋白；其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為1-5重量體積％，優(yōu)選為2-3重量體積％。本發(fā)明還提供了一種治療癌癥的方法，其包括給患者施用選自由本發(fā)明的腫瘤干細胞、本發(fā)明的腫瘤干細胞抗原組合物、本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞以及本發(fā)明的樹突狀細胞疫苗所組成的組中的藥物。17優(yōu)選所述施用的方式為注射。具體地，施用腫瘤干細胞抗原組合物的方式選自由胂瘤組織內(nèi)注射、靜脈注射、皮下注射和皮內(nèi)注射中的一種或幾種；施用所述樹突狀細胞疫苗的方式為在淋巴結(jié)部位皮下或皮內(nèi)注射。優(yōu)選施用所述樹突狀細胞疫苗的方式為在腹部溝或腋下進行皮下或皮內(nèi)注射。所述腫瘤干細胞抗原組合物優(yōu)選來自細胞濃度為lxl()S到lxl()S細胞/mL的本發(fā)明的腫瘤干細胞，其有效量為0.1mL-5mL/個體；所述樹突狀細胞疫苗優(yōu)選包括1><105到5xl(^個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞，其有效量為0.1mL-2mL/個體。更優(yōu)選所述腫瘤干細胞抗原組合物優(yōu)選來自細力包濃度為"105到lxl()S細胞/mL的本發(fā)明的腫瘤干細胞，其有效量為0.2mL-2mL/個體；所述樹突狀細胞疫苗優(yōu)選包括1x105到5x107個/mL本發(fā)明的抗癌樹突狀細胞，其有效量為0.5mL-2mL/個體。以上所述肺瘤干細胞抗原組合物和所述樹突狀細胞疫苗都是一次注射的劑量，一個療程四次注射，間隔一周。兩種組合物一般在注射完第一針后的第三天到第七天起效。所述有效的標準是起免疫促進的細胞因子如白介素2、白介素12、干擾素Y和腫瘤壞死因子a等的升高；起免疫抑制的細胞因子如白介素6、白介素IO、轉(zhuǎn)化生長因子卩和表皮細胞生長因子等的降低；以及T淋巴細胞亞群變化，即CD3、CD4、CD8的陽性率的升高或改善，CD16/56陽性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三陽性率的降低。一個療程結(jié)束后，可以間隔三個月后繼續(xù)給藥，可以治療兩個或四個療程；如有必要，間隔時間為六個月或1年還可繼續(xù)再治療，只要患者一直存活在。其中，所述有效標準還可以分為以下三個等級1.患者血液細胞因子檢測起免疫促進的細胞因子如白介素2、白介素12、干擾素Y和腫瘤壞死因子a等的升高；起免疫抑制的細胞因子如白介素6、白介素IO、轉(zhuǎn)化生長因子卩和表皮細胞生長因子等的降低；以及T淋巴細胞亞群變化，即CD3、CD4、CD8的陽性率的升高或改善，CD16/56陽性率的升高，以及CD4CD25FoxP3三陽性率的降低等。2.患者腫瘤標志物;險測，如曱胎蛋白、癌胚抗原、糖蛋白等腫瘤特異抗原的表達的降低，主要是通過酶免和化學發(fā)光檢測等。3.影像學檢測，如CT、核磁共振和B超檢測，能檢測到治療前后腫瘤細月包縮小。。優(yōu)選所述肺瘤干細胞和/或所述樹突狀細胞來自于同一患者，這樣可以最大限度地避免免疫排斥反應造成的副作用。此外，本發(fā)明提及的細胞可以是商業(yè)上可供的細胞系。并且現(xiàn)有長期冷凍保藏細胞的技術(shù)已經(jīng)非常成熟，比如在液氮(零下196°C)下凍存細胞，例如臍帶血細胞保藏。本領(lǐng)域技術(shù)人員完全可以利用上述技術(shù)保藏本發(fā)明涉及的腫瘤組織、腫瘤細胞系和樹突狀細胞，樹突狀細胞可以來源外周血、骨髓和臍帶血等。以下，對本發(fā)明的具體實施例進行說明，但本發(fā)明的技術(shù)范圍不限于這些示例。制備例1:腦膠質(zhì)瘤組織中的腫瘤干細胞的分離和培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤組織來自50歲男性患者，該患者經(jīng)病理4企查確診為星形腦膠質(zhì)瘤。與該患者簽署了知情同意書，在進行手術(shù)時采集其腫瘤組織。用眼科剪將腦膠質(zhì)瘤組織剪碎成為約lmn^的小塊。所得剪碎的組織小塊用0.25%胰酶溶液以l克0.5mL的重量體積比消化5分鐘后，加入是胰酶溶液體積五分之一的小牛血清(美國Hyclone公司)終止，以1000rpm離心收集消化好的組織小塊，傾去胰酶溶液上清，然后用含0.1%dispase(分散酶，美國西格瑪)(lIU/mg)和0.01。/。DNAse(DNA酶，上海生工)的HBSS(漢斯緩沖液，上海生工)以1克lmL的重量體積比洗滌三次，所得離心沉淀用Accutase(阿尤替斯酶，美國西格瑪)以l克lmL的體積比在37。C下混勻接觸IO分鐘，然后在1000rpm下離心5min收集細胞，用以1克lmL的重量體積比用杜爾貝可改良伊格爾-F12培養(yǎng)基重懸。所得重懸液用40-mm分子篩(美國BD公司)過濾。用所述孔徑的分子篩過濾，截留的是大片細胞碎片和未被消化的細胞團，濾出的是細胞懸液。取1份50pL(2xl(^個)上述得到細胞懸液分別添加到有20pLFITC-CD44和20pLPE-CD24(BD公司)的離心管中。置于4。C冰箱染色30分鐘，然后用lmL的lx磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0.5mL的lxPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD133+且Nestin+的腦膠質(zhì)瘤干細胞占所得洗滌后的細胞的2.1%。收集剩余的所述細胞懸液后，向其中含有5ng/mLB27、40ng/mL人表皮生長因子(epidermalgrowthfactor,EGF)、40ng/mL堿性成纖維細胞生長因子(bEGF)和30mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(Dulbecco，smodifiedEagle'smedium-F12)(DMEM/F12)培養(yǎng)基(美國Hyclone公司)使細胞懸液濃度被稀釋為2xl05細胞/mL。然后將每5mL所得稀釋的細胞懸液轉(zhuǎn)移至25cm2滅菌塑料培養(yǎng)瓶中在37°C、5%0)2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。培養(yǎng)所得細胞呈神經(jīng)球狀貼壁生長，傾去培養(yǎng)基，然后用5mLHBSS洗滌一次，傾去洗滌液。所述洗滌過程去掉了懸浮的細胞碎片和未貼壁生長的細胞。并添加新鮮的含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基。當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90%匯合時，用Accutase19消化后，用含有8ng/mLB27、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)(1瓶傳幾個瓶，每瓶起始培養(yǎng)的細胞密度為2xl05細胞/mL)。按照上述傳代條件再傳4代，得到神經(jīng)球狀的細胞。取1瓶培養(yǎng)到5代的腫瘤干細胞，經(jīng)accutase消化，離心后細胞沉淀用lmLlxPBS重懸，計數(shù)。取l份50pL(2xl()S個)上述的傳代得到細胞懸液分別添加到有20^LFITC-CD44(BD公司)和20pLPE-CD24(BD公司)的離心管中。置于4。C水箱染色30分鐘，然后用lmL的lx磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0.5mL的lxPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD133+且Nestin+的腦膠質(zhì)瘤干細胞占所得洗滌后的細胞的71.1%。制備例2-3按照制備例1的方法分別制備結(jié)腸癌、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤的腫瘤千細胞。其中，不同點如下結(jié)腸癌組織來自40歲男性患者，該患者經(jīng)病理檢查確診為中分化結(jié)腸腺癌。與該患者簽署了知情同意書，在進行手術(shù)時釆集其腫瘤組織。乳腺癌組織來自39歲女性患者，該患者經(jīng)病理檢查確診為乳腺癌。與該患者簽署了知情同意書，在進行手術(shù)時采集其腫瘤組織。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage20</column></row><table>制備例4:從乳腺癌細胞系MCF-7中分離乳腺癌干細胞將購自美國ATCC的腫瘤細胞系的乳腺癌MCF-7細胞，取1份50pL(2xl06個)細胞懸液分別添加到有20^LFITC-CD44(BD公司)和20jaLPE-CD24(BD公司)的離心管中。置于4。C水箱染色30分鐘，然后用lmL的lx磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0.5mL的lxPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果未檢出CD44+且CD24-的乳腺癌干細胞。將上述購自美國ATCC的胂瘤細胞系的乳腺癌MCF-7細胞，用添加了5ng/mLN2、25ng/mL人表皮生長因子、40ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和30mg/mL胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基在37°C、5%(302培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。培養(yǎng)所得細胞呈神經(jīng)球狀貼壁生長，傾去培養(yǎng)基，然后用5mLHBSS洗滌一次，傾去洗滌液。所述洗滌過程去掉了懸浮的細胞碎片和未貼壁生長的細胞。并添加新鮮的含有15ng/mLN2、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基。當細胞生長達到培養(yǎng)瓶底面的90%匯合時，用Accutase消化后，用含有15ng/mLN2、30ng/mL人表皮生長因子、30ng/mL堿性成纖維細胞生長因子和20mg/mL胰島素的杜爾貝可改良伊格爾-F12(DMEM/F12)培養(yǎng)基進行傳代培養(yǎng)。按照上述傳代條件再傳4代，得到神經(jīng)球狀的細胞。取1瓶培養(yǎng)到5代的肺瘤干細胞，經(jīng)accutase消化，離心后細胞沉淀用lmLlxPBS重懸，計數(shù)。取l份50(iL(2xl(^個)上述的傳代得到細胞懸液分別添加到有20|iLFITC-CD44(BD公司)和20^LPE-CD24(BD公司)的離心管中。置于4。C冰箱染色30分鐘，然后用lmL的lx磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌三次，最后用0.5mL的lxPBS重懸洗滌后的細胞，所得洗滌后的細胞用FACSCalibur基本型流式細胞儀檢測。結(jié)果顯示，CD44+且CD24-的乳腺癌干細胞占所得洗滌后的細胞的50%。制備例5-6按照制備例5的方法分別制備肺癌和肝癌的腫瘤干細胞。其中，不同點如表3所示表3腫瘤細胞系(ATCC)腫瘤干細胞標志物分離后原代培養(yǎng)前細胞流式儀檢測結(jié)果(干細胞占所得的細胞％)傳代完成后細胞流式儀檢測結(jié)果(千細胞占所得的細胞％)肺癌NCI-H460CD34+/Sca-1+3.1148.61肝癌HepG2CD133+1.2755.73實施例1:經(jīng)耐放射篩選的胂瘤干細胞的制備取8瓶25cm2塑料培養(yǎng)瓶，其中，每4瓶分別培養(yǎng)有制備例1和制備例5的腫瘤干細胞。所述培養(yǎng)瓶中的細胞已生長到直徑大于IOO微米細胞球程度。以照射總劑量分別為OGy、3Gy、5Gy和9Gy、照射源與胂瘤干細胞照射距離在50cm、射線照射的劑量率為200cGy/min的y射線照射所述培養(yǎng)并瓦中的細胞。照射后更換為含5ng/mLB27、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰島素的新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基，在37。C、5%(:02培養(yǎng)箱培養(yǎng)20天，每3天更換一次所述培養(yǎng)基。培養(yǎng)結(jié)束后，經(jīng)accutase消化，離心得到的細胞沉淀用lmLDMEM/F12重懸，計數(shù)。采用集落形成法測定細胞存活率，即用新鮮DMEM/F12培養(yǎng)基加入0.6重量體積％的瓊脂糖(熔點為40。C)，制得培養(yǎng)基瓊脂糖溶液，置40。C保溫。每瓶取經(jīng)上述篩選且消化重懸的0.5mL細胞懸液(4xl()S細胞/mL)與0.5mL所述培養(yǎng)基瓊脂糖溶液混合均勻，立即倒入6孔細胞培養(yǎng)板的孔中，固化后，置37。C、5。/。c02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1周。在顯孩H竟下計數(shù)Mmm的集落數(shù)目，計算集落形成存活率=(0Gy集落數(shù)-3Gy、5Gy或9Gy的集落數(shù))/0Gy集落數(shù)，從而檢測腫瘤干細胞在不同放射劑量照射下的細胞存活率。以細胞存活率為縱坐標、以照射后的天數(shù)為橫坐標繪制腫瘤千細胞經(jīng)y射線輻射篩選后的存活率曲線。如圖1-2所示，腫瘤干細胞在經(jīng)3Gy、5Gy或9Gy的Y射線照射篩選后，都有部分死亡，但培養(yǎng)一段時間后又能生長很好。其中在總劑量9Gy照射后，腫瘤干細胞在照射后第15天存活率很低(小于20%),但繼續(xù)培養(yǎng)，腫瘤干細胞的存活率重新恢復，甚至存活率與未經(jīng)照射的腫瘤干細胞相當。并且，恢復后的腫瘤干細胞的增殖速率遠高于未經(jīng)照射的腫瘤干細胞。例如，經(jīng)9Gy照射后15天的乳腺癌干細胞增值速率為16°/。/天，而未經(jīng)照射的乳腺癌干細胞增值速率一直維持在1%/天。此外，取3瓶培養(yǎng)有制備例1的腦膠質(zhì)瘤干細胞。所述培養(yǎng)瓶中的細胞已生長到直徑大于100微米細胞球程度。重復上述9Gy的y射線照射篩選，所得存活率結(jié)果見圖3與上述圖1的結(jié)果類似。此外，取16瓶25cm2塑料培養(yǎng)瓶，其中，每4瓶分別培養(yǎng)有制備例2-4和制備例6的腫瘤干細胞。重復上述實驗過程，得到類似的結(jié)果，即經(jīng)3Gy、5Gy或9Gy照射后，腫瘤干細胞在照射后第15天存活率很低(小于20%),但繼續(xù)培養(yǎng)，腫瘤干細胞的存活率重新恢復，甚至存活率與未經(jīng)照射的腫瘤干細胞相當。實施例2:經(jīng)高濃度間歇誘導法化療藥物篩選的腫瘤干細胞的制備取1瓶25cm2塑料培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)有制備例3的乳腺癌干細胞，經(jīng)accutase消化，離心后細胞沉淀用lmLDMEM/F12培養(yǎng)基重懸計數(shù)，得到2xl()S細胞/mL的細胞懸液。1)將所述乳腺癌干細胞接種10mL于75ci^培養(yǎng)瓶中，生長至瓶底80%匯合時，加用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解的4-羥-環(huán)磷酰胺，直至終濃度5mg/mL，在37。C、5。/。C02條件下培養(yǎng)12h。傾去含4-羥-環(huán)磷酰胺的培養(yǎng)液，"PBS洗2次，加含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37。C、5%c02條件下培養(yǎng)乳腺癌干細胞生長至80%匯合。2)再加入用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解的4-羥-環(huán)磷酰胺直至終濃度5mg/mL,在37。C、c02條件下培養(yǎng)24h，傾去含4-羥-環(huán)磷酰胺的培養(yǎng)液，lxPBS洗2次。3)再重復上述步驟2)培養(yǎng)4次，由此獲得經(jīng)耐藥性篩選的乳腺癌干細胞。按照上述乳腺癌干細胞的耐化療藥篩選制備例3、5、7的腫瘤干細胞，不同之處如表4所示表4<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>實施例3:經(jīng)藥物濃度遞增法化療藥物篩選的肺瘤千細胞的制備取1瓶25cm2塑料培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)有制備例1的腦膠質(zhì)瘤干細胞，經(jīng)accutase消化，離心后細胞沉淀用lmLDMEM/F12培養(yǎng)基重懸計數(shù)，得到2xl()S細胞/mL的細胞懸液。1)將所述腦膠質(zhì)瘤干細胞接種10mL于75cn^培養(yǎng)瓶中，生長至瓶底80%匯合時，加用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解的厄洛替尼，直至終濃度lmg/mL，在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24h。傾去含厄洛替尼的培養(yǎng)液，lxPBS洗2次，加含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37。C、5%032條件下培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤干細胞生長至80%匯合。2)重復步驟1)的操作4次，不同的是厄洛替尼的終濃度分別為2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL。3)加用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解的厄洛替尼，直至終濃度10mg/mL,在37°C、5%C02條件下培養(yǎng)24h。傾去含厄洛替尼的培養(yǎng)液，lxPBS洗2次，加含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰島素的DMEM/F12培養(yǎng)基，在37。C、5%002條件下培養(yǎng)腦膠質(zhì)瘤干細胞生長至80%匯合。4)重復上述步驟3)培養(yǎng)1次。5)加用DMEM/F12培養(yǎng)基溶解的厄洛替尼，直至終濃度10mg/mL，在37°C、5。/。C02條件下培養(yǎng)24h。由此獲得在終濃度10mg/mL厄洛替尼中穩(wěn)定生長的經(jīng)耐藥性篩選的腦月交質(zhì)瘤干細胞。按照上述腦膠質(zhì)瘤干細胞的耐化療藥篩選下面的腫瘤干細胞，不同之處如表5所示表5<table>tableseeoriginaldocumentpage23</column></row><table>此外，取1瓶培養(yǎng)制備例2的前列腺癌干細胞。重復上述終濃度lmg/mL、2mg/mL、4mg/mL、8mg/mL和10mg/mL乙烯雌酚篩選，所得結(jié)果見表7。實施例4:MTT檢測經(jīng)耐藥篩選的腫瘤干細胞的藥物敏感性將實施例2和實施例3所得的腫瘤干細胞以1x104/mL細胞濃度分別接種于96孔培養(yǎng)板，所述培養(yǎng)的培養(yǎng)基為含5ng/mLN2、40ng/mLEGF、40ng/mLbEGF和30mg/mL胰島素的DMEM/F12，在37。C、5%(302的條件下，培養(yǎng)24h后傾去培養(yǎng)液，分別按照下表6分別加入相應的化療藥物，所述藥物以溶解在培養(yǎng)基中的形式加入表6<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>表6中每種細胞在每個梯度下重復3個孔，以每種未經(jīng)化療藥物篩選的腫瘤干細胞作為相應細胞的空白對照。繼續(xù)培養(yǎng)48h，每孔加入終濃度5mg/mL的MTT的lxPBS溶液20^L,4h后加入二曱基亞砜(DMSO)lOO^L,振蕩混勻15min,用酶標儀(K=570nm)測定每孔吸光度值(A值)，其中吸光度值與活細胞數(shù)成正比)，取3個孔的平均值，計算藥物對腫瘤干細胞的抑制率。腫瘤干細胞的抑制率=(l-藥物A值/對照A值)xl00%。采用對數(shù)計量作圖法計算各種藥物對細胞達50%抑制率時的藥物濃度(IC50),并計算相對耐藥度(RF)。相對耐藥度=IC50經(jīng)耐藥篩選的腫瘤干細胞/IC50未經(jīng)化療藥物篩選的腫瘤干細胞。測試結(jié)果如表7所示。表7<table>tableseeoriginaldocumentpage24</column></row><table>2.83±1.517.75±2.122.73±1.62肝癌TSC經(jīng)耐藥篩選的肝癌TSCIC50(嗎/mL)IC50(嗎/mL)RF15.31±2.1641.61±4.222.72±3.31制備5的乳腺癌TSC經(jīng)耐藥篩選的制備5的乳腺癌TSCIC50(mg/mL)IC50(mg/mL)RF2.11±0.336.42±0.623.04±0.55實施例5:射線照射和化療藥物耐受篩選的腫瘤干細胞的制備使用制備例的腫瘤干細胞根據(jù)實施例1-3的描述，按照下表8將兩種篩選過程并用:表8制備例照射射線照射參數(shù)化療藥物化療藥物用量用法制備例1Y射線照射總劑量為9Gy、照射源與腫瘤干細胞照射距離在50cm、劑量率為200cGy/min厄洛替尼實施例3制備例2Y射線照射總劑量為9Gy、照射源與腫瘤千細胞照射距離在lm、劑量率為350cGy/min阿霉素實施例2制備例3y射線照射總劑量為7Gy、照射源與腫瘤干細胞照射距離在40cm、劑量率為300cGy/min4-羥-環(huán)磷酰胺實施例2制備例4Y射線照射總劑量為6Gy、照射源與腫瘤干細胞照射距離在80cm、劑量率為200cGy/min4-羥-環(huán)磷酰胺實施例2制備例5x射線照射總劑量為9Gy、照射源與腫瘤干細胞照射距離在50cm、劑量率為200cGy/min紫杉醇實施例3制備例6Y射線照射總劑量為10Gy、照射源與腫瘤干細胞照射距離在lm、劑量率為200cGy/min5氟尿嘧啶實施例3圖4顯示了制備例1腦膠質(zhì)瘤干細胞經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后耐受性蛋白表達western印跡照片，其中，卩-肌動蛋白(卩-actin)為檢測內(nèi)標，為細胞增殖時常表達蛋白；表皮生長因子受體(EGFR)為促進腫瘤增殖、新生血管發(fā)生、抑制腫瘤經(jīng)胞凋亡的特異性表達蛋白，并且促進HIF-la表達，提高細胞對低氧的耐受。從圖5可以看出，在厄洛替尼作用的前提下，隨著y射線照射劑量增加(例如由5Gy增加到9Gy)，EGFR表達量也隨著增加。圖5顯示了制備例1腦膠質(zhì)瘤干細胞、制備例4的乳腺癌干細胞和制備例6的肝癌干細胞經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后耐受性蛋白RT-PCR后表達電泳25照片，其中，甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為檢測內(nèi)標，為細胞能量代謝常表達物。CD133和nestin是腫瘤干細胞特異性表達的蛋白質(zhì)。如圖5所示，制備例1腦膠質(zhì)瘤干細胞、制備例4的乳腺癌干細胞和制備例5的肝癌干細胞經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后能特異表達CD133和nestin。Glioma表示經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后的腦膠質(zhì)瘤干細胞。制備例3乳腺癌干細胞、制備例2的結(jié)腸癌干細胞、制備例5的肺癌干細胞經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后能分別特異表達干細胞標志物，與圖5類似，表達產(chǎn)物高于未經(jīng)射線照射和化療藥物篩選相應的腫瘤干細胞。實施例6:經(jīng)耐受篩選的胂瘤干細胞的抗原組合物的制備取上述制備例1-6的未經(jīng)篩選的腫瘤干細胞以及實施例1-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤干細胞，在液氮中和室溫(25°C)下反復凍融5次，通過倒置顯微鏡檢測到所述細胞完全裂解。所得裂解液在600rpm下離心lmin，收集上清用0.45pm濾膜過濾，收集濾液。所述裂解液即腫瘤干細胞的抗原組合物，儲存在-8(TC中備用。此外，另取實施例1-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤千細胞在42"C水浴下熱休克2小時后，再重復上述反復凍融步驟。用western印跡^r測發(fā)現(xiàn)如此所得的腫瘤干細胞抗原組合物中熱休克蛋白的表達。實施例7:樹突狀細胞獲取取100mL外周血經(jīng)Ficoll-Hypaque密度梯度離心，得到單個核細胞。夕卜周血單個核細胞用RPMI1640培養(yǎng)基重懸，并加入6孔壽反中貼壁。在37。C、5。/oC02培養(yǎng)箱中孵育90min后，未貼壁細胞洗滌收集下來，用于誘導CIK細胞。貼壁細胞加入完全培養(yǎng)基RPMI1640誘導培養(yǎng)，含有5%的自體血清、2000IU/mL重組人粒細胞巨噬集落刺激因子和1500IU/mLIL-4。在培養(yǎng)到第三天時細胞更換新鮮培養(yǎng)基(含2000IU/mLGM-CSF和1500IU/mLIL-4)。培養(yǎng)到第五天收獲未成熟樹突狀細胞(DCs),成熟DCs采用完全RPMI1640培養(yǎng)基在誘導到第七天得到，含0.1pg/mL脂多糖和20ng/mL腫瘤壞死因子a。在第五天時添加特殊抗原(如腫瘤干細胞抗原)，負載DCs。實施例8:經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載DCs培養(yǎng)5天后，3xl(^個未成熟DCs用實施例6所述的未經(jīng)或經(jīng)篩選的腫瘤干細胞裂解抗原組合物(得自lxlO^中瘤干細胞)在37°C、5%(302培養(yǎng)箱中負載4小時?？乖撦d的DCs通過離心(10min，1000rpm)收獲得到。所得DCs經(jīng)生理鹽水洗滌3次，后重懸到生理鹽水中，至濃度為3xl()S成熟DC/mL，并添加終濃度為質(zhì)量體積比2%的人血白蛋白，從而制備成腫瘤干細胞裂解抗原組合物負載的DC疫苗。經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載樹突狀細胞通過CD86-FITC、26CD80-FITC、CD83-PE和CDllc-Percp(BD公司)染色，流式細胞儀檢測負栽后DC表型變化。從左到右，經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載樹突狀細胞的比例為1:9、1:6和1:3，CDllc/CD83、CDllc/CD86和CDllc/CD80的雙陽性率變化比較明顯，雙陽性率不斷升高，促進了樹狀細胞的成熟度，如圖6所示。效果實施例1:經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載DC疫苗體外殺瘤試驗在6孔板內(nèi)，仍以含5%小牛血清的RPMI1640為培養(yǎng)基，按上述抗原負栽的成熟樹突狀細胞T細胞=1:20的比例混合上述抗原負栽的成熟樹突狀細胞和T細胞，同時加入GM-CSF(終濃度為800U/mL)和IL-4(終濃度為20ng/mL),共培養(yǎng)7天，期間每隔1天均半量換液(含5%小牛血清、終濃度為800U/mL的GM-CSF和終濃度為20ng/mL的IL-4的RPMI1640培養(yǎng)基)，得到CTL細胞。選擇相應的腫瘤干細胞作為耙細胞，用"Cr標記，即靶細胞(2xl06/mL)通過與300pCi51Cr在RPMI1640培養(yǎng)基中37。C孵育2小時。標記好的耙細胞用lxPBS洗滌三次，并最終用RPMI1640(含10%小牛血清)重懸到2xl05的濃度。以每孔2xl04個標記的靶細胞(0.1mL)添加到％孔板的孔中。將上述產(chǎn)生的CTL細胞(效應細胞)分別以2.5:1、5:1、10:1、20:1和40:1的效靶比加入對應的孔中，在37。C孵育4小時。孵育后，取上清75pL組分用Y放射計數(shù)器計數(shù)。持異的"Cr釋放的百分比根據(jù)下述的公式進行計算。(檢測的每分脈沖數(shù)H自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù))%特異裂解率=-x!oo%(最大釋放的每分脈沖數(shù)卜(自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù))其中，自發(fā)釋放的每分脈沖數(shù)通過單獨培養(yǎng)靶細胞(未加效應細胞)獲得，最大釋放的每分脈沖數(shù)是用終濃度2%NP-40(表面活性劑，上海生工)處理的單獨培養(yǎng)靶細胞后獲得的。檢測的每分脈沖數(shù)通過添加效應細胞的耙細胞培養(yǎng)獲得的。圖7顯示了由表8所示經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后的制備例1、經(jīng)總劑量為9Gy、劑量率為200cGy/min和距離為50cm的射線照射篩選的制備例5以及表4所示經(jīng)化療藥物篩選后的制備例6所得抗原組合物負載樹突狀細胞，得到細胞毒性T淋巴細胞(CTL)，由該CTL細胞產(chǎn)生的對相應肺瘤干細胞的應答結(jié)果。如圖7所示，隨著效靶比不斷提高，對腫瘤干細胞產(chǎn)生的CTL應答也特異升高。并且由表8所示經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后的制備例1效果最佳。圖8顯示了由表8所示經(jīng)射線照射和化療藥物篩選后的制備例3和未經(jīng)篩合物分別負載樹突狀細胞，得到兩種細胞毒性T淋巴細胞(CTL),由該兩種CTL細胞分別對經(jīng)射線照射和化療藥物篩選的以及未經(jīng)射線照射和化療藥物篩選的乳腺癌千細胞產(chǎn)生的應答結(jié)果對比圖。其中，RBTSC-DC1表示經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌千細胞抗原負載的樹突狀細胞對經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞的毒性活性，BTSC-DC1表示未經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞對經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞的毒性活性，RBTSC-DC2表示經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞對未經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞的毒性活性，BTSC-DC2表示未經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞對未經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞的毒性活性。如圖8所示，經(jīng)耐受性篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞(RBTSC-DC)對耐受性乳腺癌干細胞和乳腺干細胞的細胞毒性活性要分別高于乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞(BTSC-DC)對耐受性乳腺癌干細胞和乳腺干細胞的細胞毒性活性。所述耐受性乳腺癌干細胞按照實施例5表8制備。有關(guān)實施例1-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的細胞毒性活性，遠遠好于有關(guān)制備例l-6的未經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的細胞毒性活性。此外有關(guān)熱休克結(jié)合反復凍融裂解實施例l-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的細胞毒性活性，遠遠好于有關(guān)單純反復凍融裂解實施例1-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的細胞毒性活性。效果實施例2:經(jīng)篩選的腫瘤干細胞在體內(nèi)殺瘤實驗中的作用以含5%小牛血清的RPMI1640為培養(yǎng)基，將3><106個的未成熟樹突狀細胞用上述實施例6所得的未經(jīng)或經(jīng)篩選的腫瘤干細胞裂解抗原組合物(得自lxlO"中瘤干細胞)在37。C、5。/oC02培養(yǎng)箱中負載4小時?？乖撦d的成熟樹突狀細胞通過1000rpm離心10min得到。將所述抗原負載的成熟樹突狀細胞用生理鹽水洗滌3次，然后重懸至lxl(^個/mL的濃度，4'C下保存?zhèn)溆谩Ｖ苽淅齦的乳腺癌干細胞建立荷乳腺癌瘤鼠模型(參見"人結(jié)腸癌細胞在免疫缺陷小鼠中能誘發(fā)腫瘤的生長，，，O'BrienCA等人，自然，第445巻，第106-110頁，2008年2月3日；O'BrienCA，PollettA,GallingerS,etal.Ahumancoloncancercellcapableofinitiatingtumourgrowthinimmunodeficientmice.Nature,2007,445(7123):106-110.)，隨機分為A、B和C3組，每組10只，A組為經(jīng)耐受篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞治療組，B組為未經(jīng)耐受篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞為對比組(注射液制備方法與A組相同),C組為同體積生理鹽水空白組。A和B兩組在第0天荷瘤鼠才莫型皮下^T注0.5-2xl(^個/mL樹突狀細胞，各0.5mL，半個月后再同樣劑量免疫l次。注射28后分別于7、14、21、28、35d計算鼠模型荷瘤大小，C組于相同時間點在皮下注射0.5mL生理鹽水并計算鼠模型荷瘤大小。經(jīng)耐受篩選的乳腺癌干細胞抗原負載的樹突狀細胞疫苗對荷瘤鼠才莫型的抑制生長情況(mm3，5±s)見表9。表9々B2、1腫瘤大，J組力'J治療后7d治療后14d治療后21d治療后28d治療后35d治療組22.4±2.119.6±3.3*ff12.1±1.4*#7.6±3.4*ff6.2±2.7*ff對比組28.2±0.825.1±1.316.8±2.410.5±3.59.4±3空白組31.2±1.237.4±241.2±1.246.7±2.156.3±2.3〉主*玄白組與治療組相比P遠小于0.01;#對比組與治療組相比P<0.01。此外，有關(guān)實施例l-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤千細胞的體內(nèi)殺瘤活性，遠遠好于有關(guān)制備例l-6的未經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的體內(nèi)殺瘤活性。此外有關(guān)熱休克結(jié)合反復凍融裂解實施例1-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的體內(nèi)殺瘤活性，遠遠好于有關(guān)單純反復凍融裂解實施例1-3和5所得經(jīng)篩選的腫瘤干細胞的體內(nèi)殺瘤活性。29權(quán)利要求1.一種經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的制備方法，該方法包括通過裂解腫瘤干細胞得到腫瘤干細胞抗原組合物，將正常樹突狀細胞與腫瘤干細胞抗原組合物接觸得到負載腫瘤抗原的抗癌樹突狀細胞，其特征在于，所述腫瘤干細胞通過以下方法制備，該方法包括對腫瘤干細胞進行射線照射和/或化療藥物篩選的步驟，所述射線照射篩選通過將腫瘤干細胞暴露于射線的照射源下完成，所述射線選自由X射線、β射線、α射線和γ射線所組成的組中，所述化療藥物篩選通過使腫瘤干細胞與化療藥物接觸完成，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、甲基芐肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鉑、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為10cm-5m,所述射線照射的總劑量為2Gy-10Gy，所述射線照射的劑量率為0.4-1200cGy/min。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其中，所述射線照射的照射源與腫瘤干細胞的直線距離為20cm-2m，所述射線照射的總劑量為3Gy-9Gy,所述射線照射的劑量率為2-600cGy/min。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述射線為X射線和/或Y射線。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.1-100mg/mL,所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為lh-72h。6.據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其中，所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-50mg/mL，所述化療藥物與腫瘤干細胞接觸的時間為12h-36h。7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述烷化劑化療藥物選自由氮芥、環(huán)磷酰胺、異環(huán)磷酰胺、氮曱、苯丙氨酸氮芥、苯丁酸氮芥和噻替派所組成的組中；所述亞硝脲類化療藥物選自由卡氮芥、環(huán)已亞硝脲、曱環(huán)亞硝脲、嘧啶亞硝脲、白消安和雌二醇氮芥所組成的組中；所述抗代謝藥化療藥物選自由曱氨喋呤、氟尿嘧啶、喃氟啶、優(yōu)福啶、卡莫氟、脫氧氟尿苷、氟尿脫氧核苷、環(huán)胞苷、阿糖胞苷和雙氟胞苷所組成的組中；所述抗生素化療藥物選自由放線菌素D、絲裂霉素、博來霉素、平陽霉素、阿霉素、他喃阿霉素、表-阿毒素、去曱氧柔紅霉素和米托蒽醌所組成的組中；所述植物化療藥物選自由長春新堿、長春花堿、長春地辛、長春瑞賓、鬼臼乙叉甙、鬼臼噻吩甙、羥基喜樹堿、伊立替康、托泊替康、紫杉醇、泰素帝、三尖杉酯44和羥基紫杉醇所組成的組中；所述激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物選自由潑尼松、地塞米松、丙酸睪丸素、乙烯雌酚、氟硝丁酰胺、孕酮、曱地孕酮、他莫昔芬、雌激素受體拮抗劑、托瑞米芬、氨魯米特、福美司坦、來曲唑和促性腺激素釋放激素拮抗劑所組成的組中；所述抗體阻斷劑化療藥物選自由表皮生長因子抑制劑吉非替尼、厄洛替尼、西妥昔單抗和尼妥^K單抗所組成的組中。8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述化療藥物選自由4-羥-環(huán)磷酰胺、吉非替尼、厄洛替尼、五氟尿嘧啶、阿霉素、紫杉醇和順鉑所組成的組中。9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法包括對腫瘤干細胞進行射線照射篩選的步驟，所述射線照射的照射源與腫瘤千細胞的直線距離為20cm-2m,所述射線照射的總劑量為3Gy-9Gy,所述射線照射的劑量率為2-600cGy/min。10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法包括對腫瘤干細胞進行化療藥物篩選的步驟，所述化療藥物在腫瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-50mg/mL,所述化療藥物與腫瘤干細"包4矣觸的時間為12-36h。11.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，該方法包括對腫瘤千細胞進行射線照射和化療藥物篩選的步驟，所述射線照射的照射源與腫瘤千細胞的直線距離為20cm-2m,所述射線照射的總劑量為3Gy-9Gy,所述射線照射的劑量率為2-600cGy/min。所述化療藥物在肺瘤干細胞培養(yǎng)基中的終濃度范圍為0.5-50mg/mL，所述化療藥物與腫瘤干細"包4妄觸的時間為12-36h。12.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述腫瘤選自由乳腺癌、膠質(zhì)瘤、肺癌、腦癌、鼻咽癌、肝細胞癌、胃癌、結(jié)腸癌、黑素瘤、骨肉瘤、腎細胞癌、前列腺癌、卵巢癌、急性骨髓白血病、多發(fā)性骨髓瘤胰腺癌和轉(zhuǎn)移瘤性癌所組成的組中。13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中，所述轉(zhuǎn)移瘤性癌選自腦部轉(zhuǎn)移瘤、肺部轉(zhuǎn)移瘤、肝部轉(zhuǎn)移瘤和頸部轉(zhuǎn)移瘤所組成的組中。14.根據(jù)權(quán)利要求1-13中任意一項所述的方法，其特征在于，所述方法還包括從離體腫瘤組織和/或腫瘤細胞系中分離腫瘤干細胞。15.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述腫瘤干細胞特異表達選自由表皮生長因子受體、P-糖蛋白、多藥耐藥相關(guān)蛋白、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥突變基因編碼的蛋白、共濟失調(diào)毛細血管擴張癥Rad3相關(guān)蛋白和低氧誘導因子所組成的組中的蛋白。16.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解腫瘤干細胞的步驟包括熱休克和/或反復凍融；所述熱休克裂解的條件包括在3745t:下保持lh-6h;所述反復凍融的次數(shù)為3-5次兩次的間隔時間是10min-2h,所述冷凍的溫度范圍是零下120。C-零下196°C，所述融化的溫度范圍是10°C-37°C。17.根據(jù)權(quán)利要求16所述的方法，其特征在于，所述裂解腫瘤干細胞的步驟包括熱休克和反復凍融；所述熱休克裂解的條件包括在37-45'C下保持lh-6h;所述反復凍融的次數(shù)為3-5次兩次的間隔時間是10min-2h,所述冷凍的溫度范圍是零下120。C-零下196°C,所述融化的溫度范圍是2(TC-37。C。18.權(quán)利要求l所述的方法，其特征在于，所述腫瘤干細胞抗原組合物裂解自細胞濃度為1x105到1x108細胞/mL的腫瘤干細胞。19.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述正常樹突狀細胞與制備腫瘤干細胞抗原組合物的肺瘤干細胞來自同一個體，或肺瘤干細胞來自腫瘤細胞系培養(yǎng)獲得的。20.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中，所述正常樹突狀細胞與腫瘤干細胞抗原組合物接觸的時間是l-12h。21.由權(quán)利要求1-20中任意一項所述的方法得到的抗癌樹突狀細胞。22.—種樹突狀細胞疫苗，所述樹突狀細胞疫苗包括樹突狀細胞，其特征在于，所述樹突狀細胞為權(quán)利要求24所述的抗癌樹突狀細胞。23.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其中，所述疫苗包括lxl()S到5xl07個/mL所述抗癌樹突狀細胞。24.根據(jù)權(quán)利要求22所述的疫苗，其特征在于，所述組合物還包括人血白蛋白；其中，以所述組合物為基準，所述人血白蛋白的含量為l-5重量體積%。25.權(quán)利要求21所述的抗癌樹突狀細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用。26.—種制備權(quán)利要求21所述的抗癌樹突狀細胞的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括1)腫瘤干細胞基礎培養(yǎng)基；2)》文射治療同位素源和/或化療藥物；3)消化細胞的酶；4)B27、N2、表皮細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和胰島素的至少一種；5)樹突狀細胞基礎培養(yǎng)基；6)巨粒細胞-噬細胞集落刺激因子；7)白介素-4、干擾素a和腫瘤壞死因子a的至少一種；以及6)使用說明書；其中，所述放射治療同位素源選自由X射線、卩射線、a射線和Y射線所組成的組中，所述化療藥物選自由烷化劑化療藥物、亞硝脲化療藥物、抗代謝化療藥物、抗生素化療藥物、植物化療藥物、激素及內(nèi)分泌藥物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、植物化療藥物、抗體阻斷劑化療藥物、門冬酰胺酶、曱基千肼、氮烯咪胺、順鉑、卡鈾、草酸鉑、丙亞胺和羥基脲所組成的組中；所述使用說明書包括權(quán)利要求1-23中任意一項所述的方法。27.根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，所述消化細胞的酶為胰酶和/或阿尤替酶。28.根據(jù)權(quán)利要求26所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括動物血清。全文摘要本發(fā)明提供一種經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞及其制備方法、該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞在制備抗腫瘤藥物中的應用、制備該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的試劑盒，以及包括該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的疫苗。由本發(fā)明提供的經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞以及包括該經(jīng)耐受性篩選的腫瘤干細胞抗原負載的樹突狀細胞的免疫組合物制備的藥物，能夠在體內(nèi)和體外殺死引起腫瘤復發(fā)的腫瘤干細胞，從而為克服腫瘤耐受性、根治腫瘤的復發(fā)和轉(zhuǎn)移提供了可能。文檔編號C12Q1/02GK101560496SQ20091008308公開日2009年10月21日申請日期2009年4月30日優(yōu)先權(quán)日2009年4月30日發(fā)明者麗沈,王亞軍,郝麗敏,馬艷玲,黃啟明申請人:北京弘潤天源生物技術(shù)有限公司