專利名稱：一種高比活木聚糖酶xyn11f63及其基因和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活木聚糖酶XYN11F63及 其基因、包含該基因的重組載體和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
木聚糖(xylan)是植物細(xì)胞壁半纖維素的主要成分，它是自然界中含量僅次 于纖維素的第二豐富的多聚糖，幾乎占地球可更新有機(jī)碳含量的三分之一(Collins et al.FEMS Microbiology Reviews. 2005，29 :3_23.)。長期以來富含木聚糖的農(nóng)業(yè)副產(chǎn)物如 玉米芯、秸稈、甘蔗渣等難以得到有效的利用。與此同時(shí)在造紙制漿過程中富含木聚糖和氯 化物的工業(yè)廢料往往直接排入水體，導(dǎo)致水質(zhì)富營養(yǎng)化等水體污染從而嚴(yán)重破壞生態(tài)環(huán)境 (Polizeli et al· Applied Microbiology and Biotechnology· 2005，67 :577_59L )。木聚 糖酶是可將木聚糖降解成低聚糖和木糖的一類酶的總稱，在造紙、飼料、食品、紡織、能源科 學(xué)和環(huán)境保護(hù)等領(lǐng)域上都有著廣泛的應(yīng)用前景。據(jù)報(bào)道各種微生物如細(xì)菌和真菌等都能產(chǎn)生木聚糖酶。絲狀真菌因其易于 培養(yǎng)、分泌表達(dá)以及具有高木聚糖酶生產(chǎn)能力而成為木聚糖酶的理想來源(Tanaka et al. Journal of Bioscience and Bioengineering, 2005,100 :623_630·)。目前已有一 些青霉來源的木聚糖酶基因已經(jīng)得到克隆并實(shí)現(xiàn)了異源表達(dá)。包括來源于Penicillium citrium XynA(Tanaka et al. Journal of Bioscience and Bioengineering,2005, 100 :623-630. ) , Penicillium funiculosum XYNC(Fumiss et al.BBA-Proteins and Proteomics. 2002,1598 -.24-29. ), Penicillium sp. strain 40 XynA(Kimura et al.Bioscience, Biotechnology and Biochemistry. 2000,64 1230-1237. ), Penicillium purpurogenum XynB (Diaz et al.Gene. 1997,187 :247-251. ), and Penicillium janthinellum NCIM(Milagres and Prade, Enzyme and Microbial Technology. 199416 627-632.)。盡管如此，真菌來源的木聚糖酶因生產(chǎn)成本較高使其應(yīng)用受到限制。因此，獲得新 型具有優(yōu)良特性木聚糖酶的研究仍具有重大意義?？寺『头蛛x具有高比活的木聚糖酶可以 更好的應(yīng)用于飼料、食品和造紙工業(yè)，而且可以降低生產(chǎn)成本，都是木聚糖酶應(yīng)用于工業(yè)化 生產(chǎn)所必需的。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種能高效應(yīng)用的高比活木聚糖酶。本發(fā)明的再一目的是提供編碼上述高比活木聚糖酶的基因。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組載體。本發(fā)明的另一目的是提供包含上述基因的重組菌株。本發(fā)明的另一目的是提供一種制備上述高比活木聚糖酶的基因工程方法。本發(fā)明的另一目的提供上述高比活木聚糖酶的應(yīng)用。
本發(fā)明從青霉(Penicillium sp. F63)中分離得到一種新的高比活木聚糖酶 XYN11F63，該菌種保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū) 大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所，100101)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 1669，保藏日期2006 年4月5號(hào)，并且在申請?zhí)枮?00610080455. 4、申請日為2006年5月16日的專利申請文件
中。 本發(fā)明提供了一種高比活木聚糖酶XYN11F63，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。SEQ ID NO. 1 MVSFSNLFMAACAAVTAFALPNELDKRALTTSKQGTSDGYFYSFWTNGGGSVSYENGAAGQYSVTWKNCDSFTSGKGWATGSARNIKFSGSFKPSGNAYLAVYGWTTSPLVEYYIMESYGEYNPGSSMTFKGTVTSDGSVYDIYTHKQVNQPSIVADSSTFDQYWSIRRNKRSSGTVTTANHFNAWSKLGMGMGSHGYQIVSTEGYKSSGSSSITVS其中，該酶基因編碼217個(gè)氨基酸，N端19個(gè)氨基酸為其預(yù)測的信號(hào)肽序列 "mvsfsnlfmaacaavtafa" (SEQ ID NO. 3)。因此，成熟的高比活木聚糖酶XYN11F63的理論分子量為21. 5kDa，其氨基酸序列 如 SEQ ID NO. 2 所示LPNELDKRALTTSKQGTSDGYFYSFWTNGGGSVSYENGAAGQYSVTWKNCDSFT
SGKGWATGSARNIKFSGSFKPSGNAYLAVYGWTTSPLVEYYIMESYGEYNPGSSMTFKGTVTSDGSVYDIYTHKQVNQPSIVADSSTFDQYWSIRRNKRSSGTVTTANHFNAWSKLGMGMGSHGYQIVSTEGYKSSGSSSITVS本發(fā)明的木聚糖酶XYN11F63在酸性范圍內(nèi)均具有高活性、抗蛋白酶降解等特性。 本發(fā)明篩選到Penicillium sp. F63 CGMCC1669所產(chǎn)生的木聚糖酶，其最適pH值為4. 5，在 Ph4. 5 9. 0的范圍內(nèi)維持90%以上的酶活性；最適溫度為40°C，在30°C -50°C間均具有 60%以上的酶活力維持在60%以上；用胰蛋白、α -糜蛋白酶、蛋白酶K和枯草桿菌溶素A 處理60分鐘，酶活性維持在80%。這種性質(zhì)的木聚糖酶還未曾有過報(bào)道。本發(fā)明提供了編碼上述高比活木聚糖酶xynllF63。具體地，該基因的基因組序列 如 SEQ ID NO. 4 所示atggtctctttttcaaacctctttatggctgcctgtgcagcggtgactgcctttgcgctccccaatgag ttggataagcgggctctcaccacaagcaagcaaggaactagcgacggctacttctattccttctggaccaacggtgg tggtagtgtctcctacgagaacggtgctgcaggtcaatacagcgtcacctggaaaaactgcgactccttcacctccg gcaagggctgggctactggtagcgccgtaagtcgagcgtacgagttaatcttcggtaaatatacttattagtattct tactagcgaaacatcaaattctccggctctttcaagccctccggaaatgcttaccttgccgtttacggttggaccac tagccctcttgttgaatattatatcatggagagctacggcgaatacaaccccggcagcagcatgaccttcaagggaa ccgtgacttctgatggatccgtctacgatatctacacccacaagcaggtgaaccagccttctatcgtcgcagattcc tccaccttcgatcagtactggtccatccgccgcaacaagcgcagcagcggaactgtcaccactgctaaccacttcaa cgcttggtctaagcttggaatgggtatgggctcccacggctaccagatcgtcagcactgagggatacaagagcagtg gctcttcgtccatcactgtttcctaa本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了木聚糖酶基因xynllF63，DNA全序列分析結(jié)果 表明，木聚糖酶XYN11F63結(jié)構(gòu)基因xynllF63全長711bp，含有一個(gè)內(nèi)含子，cDNA長654bp， +250 +306bp為57bp的內(nèi)含子序列，其cDNA序列如SEQ ID N0. 5所示
Atggtctctttttcaaacctctttatggctgcctgtgcagcggtgactgcctttgcgctccccaatgag ttggataagcgggctctcaccacaagcaagcaaggaactagcgacggctacttctattccttctggaccaacggtgg tggtagtgtctcctacgagaacggtgctgcaggtcaatacagcgtcacctggaaaaactgcgactccttcacctccg gcaagggctgggctactggtagcgcccgaaacatcaaattctccggctctttcaagccctccggaaatgcttacctt gccgtttacggttggaccactagccctcttgttgaatattatatcatggagagctacggcgaatacaaccccggcag cagcatgaccttcaagggaaccgtgacttctgatggatccgtctacgatatctacacccacaagcaggtgaaccagc cttctatcgtcgcagattcctccaccttcgatcagtactggtccatccgccgcaacaagcgcagcagcggaactgtc accactgctaaccacttcaacgcttggtctaagcttggaatgggtatgggctcccacggctaccagatcgtcagcac tgagggatacaagagcagtggctcttcgtccatcactgtttcctaa其中，信號(hào)肽的堿基序列為ATGGTCTCTTT TTCAAACCTCT TTATGGCTGCCTGTGCAGCGGT GACTGCCTTTGCG(SEQ ID NO. 6)。成熟蛋白理論分子量為21. 5kDa。將木聚糖酶基因xynllF63 cDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對。該基因與來源于Penicillium chrysogenum 的木聚糖酶氨基酸序列一致性為85%。說明XYN11F63是一種新的木聚糖酶。本發(fā)明還提供了包含上述高比活木聚糖酶基因xynllF63的重組載體，優(yōu)選為 pPIC-XynllF63。將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間， 使其核苷酸序列可操作的與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方 案，優(yōu)選為將本發(fā)明的木聚糖酶基因插入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切 位點(diǎn)之間，使該核苷酸序列位于AOXl啟動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒 pPIC9-xynllF63。本發(fā)明還提供了包含上述高比活木聚糖酶基因xynllF63的重組菌株，優(yōu)選所述 菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或乳酸桿菌，優(yōu)選為重組菌株GS115/xynllF63。本發(fā)明還提供了一種制備高比活木聚糖酶XYN11F63的方法，包括以下步驟1)用上述的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組木聚糖酶表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XYN11F63。其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母細(xì)胞、啤酒酵母細(xì)胞或多型遜酵母細(xì)胞，優(yōu)選 將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞(Pichic past0ris)GS115，得到重組菌株GS115/ xynllF63。本發(fā)明還提供了上述高比活木聚糖酶XYNl 1F63的應(yīng)用。本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品、工業(yè)中應(yīng)用新的木聚糖酶。本發(fā)明的木聚糖酶最適PH為4. 5，在 Ph3. 5 5. 5都有較高的酶活性；pH穩(wěn)定性好；比活力為7988U/mg ；具有極好的抗蛋白酶的 能力。其高比活性，可降低木聚糖酶在工業(yè)生產(chǎn)上應(yīng)用成本。PH適應(yīng)范圍提高飼料消化能 和代謝能，降低配方成本，減少環(huán)境污染；提高谷物加工副產(chǎn)品的營養(yǎng)價(jià)值，提升飼料產(chǎn)品 品質(zhì)。本木聚糖酶可應(yīng)用于釀酒工業(yè)，降低物料粘度，可以有利于淀粉酶作用于淀粉層，提 高淀粉利用率，增加酒精的產(chǎn)率。還可以將造紙工業(yè)廢料及農(nóng)業(yè)廢棄物中的木聚糖可被轉(zhuǎn) 化為D-木糖單體，而D-木糖又可被細(xì)菌、酵母及真菌轉(zhuǎn)化成有價(jià)值的燃料。因此，本木聚 糖酶在能源工業(yè)中的應(yīng)用也顯示出其巨大的潛力。水解產(chǎn)物(木糖和低聚木糖)可應(yīng)用在食品行業(yè)，作為增稠劑、脂肪代替物和抗凍食品添加劑；在制藥工業(yè)中木聚糖與其它物質(zhì)結(jié) 合使用，可以延緩藥物成分的釋放。木聚糖的水解產(chǎn)物還可以進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為液體燃料、單細(xì) 胞蛋白、溶劑和低熱量甜味劑。


圖1在畢赤酵母菌中表達(dá)的重組木聚糖酶的SDS-PAGE分析，其中，1 低分子量蛋 白質(zhì)Marker ；2 含有木聚糖酶基因的畢赤酵母菌培養(yǎng)上清液濃縮液；3 純化的重組木聚糖 酶。圖2重組木聚糖酶的最適pH。 圖3重組木聚糖酶的pH穩(wěn)定性。圖4重組木聚糖酶的最適溫度。圖5重組木聚糖酶的熱穩(wěn)定性。圖6重組木聚糖酶的蛋白酶抗性。
具體實(shí)施例方式試驗(yàn)材料和試劑1、菌株及載體青霉Penicillium sp. F63 CGMCC1669，保存于中國微生物菌 種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(北京市朝陽區(qū)大屯路，中國科學(xué)院微生物研究所， 100101)，其保藏號(hào)為CGMCC No. 1669。畢赤酵母表達(dá)載體pPIC9及菌株GS115購自于 Invitrogen 公司。2、酶類及其它生化試劑內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司。 燕麥木聚糖購自Sigma公司，其它都為國產(chǎn)試劑(均可從普通生化試劑公司購買得到)。3、培養(yǎng)基(1)青霉Penicillium sp. F63 CGMCC1669培養(yǎng)基為馬鈴薯汁培養(yǎng)基IOOOmL馬鈴 薯汁，IOg葡萄糖，25g瓊脂，pH5. 0。(2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB (1%蛋白胨、0.5%酵母提取物、NaCl，ρΗ7·0)。(3) BMGY 培養(yǎng)基1 % 酵母提取物，2 % 蛋白胨，1. 34 % ΥΝΒ，0. 00004 % Biotin, 1 % 甘油(V/V)。(4)BMMY培養(yǎng)基除以0. 5%甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，ρΗ4. 0。說明以下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》(第三版)J-薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。實(shí)施例1 青霉 Penicillium sp. F63 CGMCC1669 產(chǎn)酶特性將青霉Penicillium sp. F63 CGMCC1669經(jīng)馬鈴薯汁培養(yǎng)基培養(yǎng)后，涂布于產(chǎn)酶培 養(yǎng)基((NH4)2SO4 5g/L, KH2PO4 lg/L，MgSO4 · 7H20 0. 5g/L，F(xiàn)eSO4 · 7Η200· 01g/L，CaCl2 0. 2g/ L，木聚糖1%，1. 5%瓊脂糖，pH5. 0)平板上，30°C培養(yǎng)5 6d，在產(chǎn)酶培養(yǎng)基平板可見透明 圈產(chǎn)生。證明其具有木聚糖酶活性。實(shí)施例2 青霉 Penicillium sp. F63 (CGMCC1669)木聚糖酶編碼基因 xynllF63 的
克隆
提取青霉Penicillium sp. F63 (CGMCC1669)基因組 DNA 將液體培養(yǎng)3天的菌絲體用無菌濾紙過濾放入研缽中，加入2mL提取液，研磨 5min，然后將研磨液置于50mL離心管中，65°C水浴鍋裂解20min，每隔IOmin混勻一次，在 4°C下IOOOOrpm離心5min。取上清于酚/氯仿中抽提除去雜蛋白，再取上清加入等體積異 丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下IOOOOrpm離心lOmin。棄上清，沉淀用70%的乙醇洗滌兩 次，真空干燥，加入適量TE溶解，置于-20°C備用。根據(jù)第十一家族木聚糖酶基因的保守(CYLG(A) VYGW和TFNQYWS)序列設(shè)計(jì)合成了 簡并引物P1，P2Pl 5' -TGCTACCTGG(C/G)CTT(A/C/G/T)TA(C/T)GG(A/C/G/T)TGG—3‘；P2 5' -ACCAGTA(C/T)TG(A/C/G/T)T(A/C/G/T) (A/G)AA(A/C/G/T)GT-3')。以青霉Penicillium sp. F63 CGMCC1669總DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)參 數(shù)為94°C變性5min ；然后94°C變性30sec，48°C退火30sec，72°C延伸lmin，30個(gè)循環(huán)后 72°C保溫lOmin。得到一約213bp片段，將該片段回收后與pEASY_T3載體相連送三博生物 技術(shù)有限公司測序。根據(jù)測序得到的核甘酸序列，設(shè)計(jì)上游和下游各三條TAIL-PCR特異性引物設(shè)計(jì) 方向?yàn)樾枰獢U(kuò)增的未知區(qū)域方向，sp2的位置設(shè)計(jì)在spl的內(nèi)側(cè)，sp3位于sp2的內(nèi)側(cè)。每 兩個(gè)引物之間的距離沒有嚴(yán)格規(guī)定，引物長度一般22 30nt，退火溫度在60 65°C。并 將它們分別命名為uspl，卿2，usp3(上游特異性引物)，dspl, dsp2, dsp3(下游特異性引 物)見表1。表1.木聚糖酶XYN11F63 TAIL-PCR特異性引物 通過反向TAIL-PCR得到已知基因序列的側(cè)翼序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博 生物技術(shù)有限公司測序。實(shí)施例3木聚糖酶基因的RT-PCR分析提取Penicillium sp. F63 (CGMCC166)的總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄酶得到cDNA的一條鏈，然后設(shè)計(jì)恰當(dāng)?shù)囊?Xy 11 OA F 5' -ATGGTCTCTTTTTCAAACCTCTTTATGGCTGCCTG-3 ‘， XyllOA R 5' -TTAGGAAACAGTGATGGACGAAGAGCCACT-3‘)擴(kuò)增該單鏈 cDNA，獲得木聚糖酶的cDNA序列，擴(kuò)增得到產(chǎn)物回收后送三博生物技術(shù)有限公司測序。通過比較木聚糖酶的基因組序列和cDNA序列后發(fā)現(xiàn)該基因有1個(gè)內(nèi)含子，cDNA 長654bp，編碼217個(gè)氨基酸和一個(gè)終止密碼子，N端19個(gè)氨基酸為其預(yù)測的信號(hào)肽序列。 所測出的基因xynllF63的成熟蛋白部分核甘酸序列與GeneBank上的木聚糖酶基因序列 進(jìn)行同源比較，最高一致性為86 %，氨基酸序列最高一致性為85 %，證明從Penicillium sp. F63 (CGMCC1669)中分離克隆得到的編碼木聚糖酶的基因?yàn)樾禄?。?shí)施例4重組木聚糖酶的制備。將表達(dá)載體pPIC9進(jìn)行雙酶切(EcoRI+NotI)，同時(shí)將編碼木聚糖酶的基因 xynllF63雙酶切(EcoRI+NotI)，切出編碼成熟木聚糖酶的基因片段與表達(dá)載體pPIC9 連接，獲得含有Penicillium sp. F63 CGMCC1669木聚糖酶基因xynllF63的重組質(zhì)粒 pPIC-xynllF63并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，獲得重組畢赤酵母菌株GS115/xynllF63。取含有重組質(zhì)粒的GSl 15菌株，接種于300mL BMGY培養(yǎng)液中，30°C 250rpm振蕩培 養(yǎng)48h后，離心收集菌體。然后于150mL BMMY培養(yǎng)基重懸，30°C 250rpm振蕩培養(yǎng)。誘導(dǎo)72h 后，離心收集上清。測定木聚糖酶的活力。重組木聚糖酶的表達(dá)量為516U/mL。SDS-PAGE 結(jié)果(圖1)表明，重組木聚糖酶在畢赤酵母中得到了表達(dá)。所表達(dá)的木聚糖酶經(jīng)過純化之 后，其蛋白質(zhì)的含量達(dá)到總蛋白的90%以上。實(shí)施例5重組木聚糖酶的活性分析DNS法具體方法如下在pH4. 5，40°C條件下，ImL的反應(yīng)體系包括100 μ L適當(dāng)?shù)?稀釋酶液，900 μ L底物，反應(yīng)lOmin，加入1. 5mL DNS終止反應(yīng)，沸水煮5min。冷卻后540nm 測定OD值。1個(gè)酶活單位(U)定義為在給定的條件下每分鐘釋放出Iymol還原糖的酶量。實(shí)施例6重組木聚糖酶XYNl 1F63的性質(zhì)測定1、重組木聚糖酶XYN11F63的最適pH和pH穩(wěn)定性的測定方法如下將實(shí)施例4純化的重組木聚糖酶在不同的pH下進(jìn)行酶促反應(yīng)以測定其最適pH。 底物木聚糖用不同PH的0. lmol/L檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液中55°C下進(jìn)行木聚糖酶活力 測定。結(jié)果(圖2)表明，XYN11F63的最適pH為4. 5，在Ph3. 5 5. 5的范圍內(nèi)，酶活性均 維持在最大酶活性的60%以上。木聚糖酶于上述各種不同pH的緩沖液中37°C處理60min， 再在pH4. 5緩沖液體系中40°C下測定酶活性，以研究酶的pH耐性。結(jié)果(圖3)表明木聚 糖酶在pH 4. 5-9. 0之間均很穩(wěn)定，在此pH范圍內(nèi)處理60min后剩余酶活性在90%以上，這 說明此酶具有較好的PH穩(wěn)定性。2、木聚糖酶的最適溫度及熱穩(wěn)定性測定方法如下木聚糖酶的最適溫度的測定為在檸檬酸_磷酸氫二鈉緩沖液(pH4. 5)緩沖液體 系及不同溫度下進(jìn)行酶促反應(yīng)。耐溫性測定為木聚糖酶在不同溫度下處理不同時(shí)間，再在 55°C下進(jìn)行酶活性測定。酶反應(yīng)最適溫度測定結(jié)果(圖4)表明其最適溫度為40°C。酶的 熱穩(wěn)定性性試驗(yàn)表明(圖5)，重組酶在40°C時(shí)穩(wěn)定性非常好。45°C下保溫60min，剩余酶活 性為44.6%。3、木聚糖酶的Km值測定方法如下ffif 同 農(nóng)貞的HH (4-0-Me-D-glucurono-D-xylan, Sigma From birchwood)為底物，在檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液(PH4. 5)緩沖液體系中，40°C下測定酶活性，計(jì)算出其 在40°C下的km值。經(jīng)測定，此木聚糖酶在40°C下以木聚糖為底物的km值為11.3mg/mL，最 大反應(yīng)速度 Vmax 為 10570. 8 μ mol/min · mg。4、不同金屬離子化學(xué)試劑對XYLlOA酶活的影響測定如下 在酶促反應(yīng)體系中加入不同濃度的不同的金屬離子及化學(xué)試劑，研究其對酶活性 的影響，各種物質(zhì)終濃度為1，5和lOmmol/L。在40°C、pH4. 5條件下測定酶活性。結(jié)果(表 2)表明，大多數(shù)離子和化學(xué)試劑在濃度為Immol時(shí)重組木聚糖酶的活力沒有明顯變化。但 是Hg2+幾乎可以完全抑制其活力，而SDS也強(qiáng)烈抑制其活力。當(dāng)Co2+，Cu2+，pb2+，F(xiàn)e3+濃度為 IOmmo時(shí)可以部分抑制rXYNllF63活力。β -巰基乙醇在5mmol和IOmmol時(shí)能分別使重組 酶活力增加到原來的1. 29和1. 35倍。表2.各種化學(xué)試劑對木聚糖酶XYNl 1F63活力的影響 注“_”代表無法檢測。5、木聚糖酶抗胃蛋白酶及胰蛋白酶能力測定如下用ρΗ 7. 00. lmol/L Tris-HCl將胰蛋白酶、α -糜蛋白酶配成lmg/mL的溶液；用 PH7. 50. lmol/L Tris-HCl將蛋白酶K、枯草桿菌蛋白酶A配成lmg/mL的溶液。將純化的 木聚糖酶與蛋白酶按10 l(w/w)在配制蛋白酶溶液的緩沖液中處理30min和60min后，按標(biāo)準(zhǔn)方法在最適溫度和最適PH下檢測已處理酶的剩余酶活。對照酶液用配制蛋白酶液 的相應(yīng)緩沖液處理相同的時(shí)間，以其酶活作為對照計(jì)算相對酶活。經(jīng)過各種蛋白酶處理的 XYN11F63酶活力變化結(jié)果(圖6)表明，用不同的酶蛋白37°C處理30min后XYN11F63的剩 余酶活力為92.7% (胰蛋白酶)，93· 1% (α-糜蛋白酶)，80· 1% (蛋白酶K)和86.8% (枯草桿菌溶素Α)；當(dāng)處理60min時(shí)酶活力還可保留80%以上。從以上結(jié)果可以看出 XYNl 1F63對這四種蛋白酶都有較好的抵抗能力。6、木聚糖酶降解燕麥木聚糖產(chǎn)物的分析如下 在500 μ L 的木聚糖中加入100 μ L純化的酶液，最適溫度下保溫3 4h。 用無水乙醇將酶蛋白沉淀，上清液用2500色譜儀，利用高效陰離子交換色譜-脈沖安培 (HPAEC-PAD)檢測方法，進(jìn)行產(chǎn)物中糖種類的分析。分析結(jié)果表明木聚糖酶XYN11F63降 解燕麥木聚糖的產(chǎn)物主要是木糖，木二糖，木三糖和木四糖。產(chǎn)物中木糖含量為7. 46%，木 二糖含量為28. 36%，木三糖的含量為25. 37%，木四糖含量為38. 81%。序列表<110> 申請人:？<120> 一種高比活木聚糖酶XYN11F63及其基因和應(yīng)用<160>6<210>1<211>217<212>PRT<213> 青霉(Penicillium sp)<400>1MVSFSNLFMA ACAAVTAFAL PNELDKRALT TSKQGTSDGY FYSFffTNGGGSVSYENGAAG60QYSVTffKNCD SFTSGKGffAT GSARNIKFSG SFKPSGNAYL AVYGffTTSPLVEYYIMESYG120EYNPGSSMTF KGTVTSDGSV YDIYTHKQVN QPSIVADSST FDQYffSIRRNKRSSGTVTTA180NHFNAffSKLG MGMGSHGYQI VSTEGYKSSG SSSITVS217<210>2<211>198<212>PRT<213> 青霉(Penicillium sp)<400>2LPNELDKRAL TTSKQGTSDG YFYSFffTNGG GSVSYENGAA GQYSVTffKNCDSFTSGKGffA60TGSARNIKFS GSFKPSGNAY LAVYGffTTSP LVEYYIMESY GEYNPGSSMTFKGTVTSDGS120VYDIYTHKQV NQPSIVADSS TFDQYffSIRR NKRSSGTVTT ANHFNAffSKLGMGMGSHGYQ180
IVSTEGYKSS GSSSITVS 198<210>3<211>19<212>PRT 〈213〉青霉(Penicillium sp)〈400>3MVSFSNLFMA ACAAVTAFA 19<210>4<211>711<212>DNA〈213〉青霉(Penicillium sp)<400>4atggtctctttttcaaacct ctttatggct gcctgtgcag cggtgactgc ctttgcgctc 60cccaatgagttggataagcg ggctctcacc acaagcaagc aaggaactag cgacggctac 120ttctattccttctggaccaa cggtggtggt agtgtctcct acgagaacgg tgctgcaggt 180caatacagcgtcacctggaa aaactgcgac tccttcacct ccggcaaggg ctgggctact 240ggtagcgccgtaagtcgagc gtacgagtta atcttcggta aatatactta ttagtattct 300tactagcgaaacatcaaatt ctccggctct ttcaagccct ccggaaatgc ttaccttgcc 360gtttacggttggaccactag ccctcttgtt gaatattata tcatggagag ctacggcgaa 420tacaaccccggcagcagcat gaccttcaag ggaaccgtga cttctgatgg atccgtctac 480gatatctacacccacaagca ggtgaaccag ccttctatcg tcgcagattc ctccaccttc 540gatcagtactggtccatccg ccgcaacaag cgcagcagcg gaactgtcac cactgctaac 600cacttcaacgcttggtctaa gcttggaatg ggtatgggct cccacggcta ccagatcgtc 660agcactgagggatacaagag cagtggctct tcgtccatca ctgtttccta a711<210>5<211>654<212>DNA〈213〉青霉(Penicillium sp)<400>5atggtctctttttcaaacct ctttatggct gcctgtgcag cggtgactgc ctttgcgctc 60cccaatgagttggataagcg ggctctcacc acaagcaagc aaggaactag cgacggctac 120ttctattccttctggaccaa cggtggtggt agtgtctcct acgagaacgg tgctgcaggt 180caatacagcgtcacctggaa aaactgcgac tccttcacct ccggcaaggg ctgggctact 240ggtagcgcccgaaacatcaa attctccggc tctttcaagc cctccggaaa tgcttacctt 300gccgtttacggttggaccac tagccctctt gttgaatatt atatcatgga gagctacggc 360gaatacaaccccggcagcag catgaccttc aagggaaccg tgacttctga tggatccgtc 420tacgatatct3-C3.CCC3.C3-c, gcaggtgaac cagccttcta tcgtcgcaga ttcctccacc 480ttcgatcagtactggtccat ccgccgcaac aagcgcagca gcggaactgt caccactgct 540aaccacttcaacgcttggtc taagcttgga atgggtatgg gctcccacgg ctaccagatc 600
gtcagcactg agggatacaa gagcagtggc tcttcgtcca tcactgtttc ctaa654<210>6<211>57<212>DNA<213> 青霉(Penicillium sp)<400>6atggtctctt tttcaaacct ctttatggct gcctgtgcag cggtgactgc ctttgcg 5權(quán)利要求
一種高比活木聚糖酶XYN11F63，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.如權(quán)利要求1所述的高比活木聚糖酶XYN11F63，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2 所示。
3.—種高比活木聚糖酶基因xynllF63，其特征在于，編碼權(quán)利要求1或2所述的高比 活木聚糖酶XYN11F63。
4.如權(quán)利要求3所述的高比活木聚糖酶基因xynllF63，其特征在于，其堿基序列如SEQ ID NO. 4或5所示。
5.包含權(quán)利要求3或4所述高比活木聚糖酶基因xynllF63的重組載體。
6.包含權(quán)利要求3或4所述高比活木聚糖酶基因xynllF63的重組載體 pPIC-xynllF63。
7.包含權(quán)利要求3或4所述高比活木聚糖酶基因xynllF63的重組菌株。
8.如權(quán)利要求7的重組菌株，其特征在于，所述菌株為大腸桿菌、酵母菌、芽孢桿菌或 乳酸桿菌。
9.一種制備高比活木聚糖酶XYN11F63的方法，其特征在于，包括以下步驟1)用權(quán)利要求5的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；2)培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組葡聚糖酶表達(dá)；以及3)回收并純化所表達(dá)的木聚糖酶XYN11F63。
10.權(quán)利要求1或2所述高比活木聚糖酶XYNl1F63的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體地，本發(fā)明涉及一種高比活木聚糖酶XYN11F63及其基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種來源于青霉屬Penicillium sp.F63CGMCC1669的木聚糖酶XYN11F63，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，且本發(fā)明提供了編碼上述木聚糖酶的基因組和cDNA編碼基因xyn11F63。本發(fā)明的木聚糖酶的具有以下性質(zhì)最適pH4.5，最適溫度40℃，比活為7988U/mg；極好的蛋白酶抗性以及易于工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)。做為一種新型的酶制劑，可廣泛用于動(dòng)物飼料、食品、造紙、能源工業(yè)等。
文檔編號(hào)C12N1/19GK101838636SQ200910086160
公開日2010年9月22日 申請日期2009年6月11日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月11日
發(fā)明者張慧君, 王娟娟, 石鵬君, 項(xiàng)有煒 申請人:江蘇奕農(nóng)生物工程有限公司