專利名稱：：真姬菇熱激蛋白HmHSP70的氨基酸序列、基因序列及其表達(dá)載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及一種真姬菇熱激蛋白HSP70的氨基酸序列、基因序列及其表達(dá)載體。
背景技術(shù)：
：真姬菇(/^/w'g;gwsmanwoTOus)是一種珍稀食用菌，屬于中偏低溫型食用菌，在自然條件下多于秋末、春初發(fā)生。菌絲生長(zhǎng)溫度530'C,最適2025'C，超過35'C或低于4。C時(shí)菌絲不再生長(zhǎng)，在45'C以上無法存活。原基形成需1016'C較低溫度刺激。子實(shí)體生長(zhǎng)溫度以1318'C最理想。催蕾時(shí)尤其要控制好溫度。溫度過高(》5'C)或過低(WC)時(shí),應(yīng)暫時(shí)停止出菇。當(dāng)溫度過高時(shí),菌蓋變薄且展開加快,菇體色澤變白,鮮菇品質(zhì)明顯下降。由于真姬菇生長(zhǎng)溫度的要求，限制了真姬燕的人工栽培。熱激蛋白(heatshockproteins,HSPs)，又稱熱休克蛋白，是細(xì)胞或生物體在一定時(shí)間(幾小時(shí)、幾分鐘、甚至幾秒鐘)內(nèi)遭受高于其正常生長(zhǎng)溫度812°C(—般成為亞致死溫度sub-lethaltemperature)以上的溫度時(shí)新合成的或含量增高的一類蛋白質(zhì)(劉玲玉，孟玉強(qiáng)，楊學(xué)冬.熱休克蛋白生物學(xué)作用的研究進(jìn)展[J].陰山學(xué)刊，2007，21(1):6164)，從原核生物到真核生物，從動(dòng)物、植物、微生物到人類整個(gè)生物界，無論培養(yǎng)細(xì)胞還是整個(gè)機(jī)體，熱激處理后，都有HSP的表達(dá)。許多體外及體內(nèi)的研究表明，HSPs在細(xì)胞中起分子伴侶的作用，作為"分子伴侶"，HSPs可以與正在合成的多肽結(jié)合，使其正確折疊；能夠引導(dǎo)新生肽穿過細(xì)胞器膜結(jié)構(gòu)，使蛋白定位于細(xì)胞的不同部位；在高溫脅迫下，可以阻止熱變性蛋白的聚集或阻止不可逆的蛋白變性，或有利于蛋白質(zhì)在高溫脅迫變性之后的復(fù)性，因此，熱激蛋白在生物抗高溫中的作用不言而喻。Edwards等的研究發(fā)現(xiàn)，許多細(xì)胞的耐熱能力取決于細(xì)胞內(nèi)熱激蛋白70(heatshockprotein70，HSP70)的合成，HSP70具有熱保護(hù)作用。熱激蛋白的出現(xiàn)與細(xì)胞耐熱潛力的發(fā)揮有關(guān)，它的出現(xiàn)為生物提供了一種暫時(shí)的保護(hù)機(jī)制。熱激條件下，大部分生物體正常蛋白合成受到抑制，熱激蛋白的合成開始出Sa。高溫下生物體產(chǎn)生的熱激蛋白可保護(hù)機(jī)體蛋白質(zhì)免遭損傷或修復(fù)已受損傷的蛋白質(zhì)，從而對(duì)生物體起到保護(hù)作用，熱激蛋白的誘導(dǎo)形成使生物體提高耐熱性。熱鍛煉過程中有大量熱激蛋白的表達(dá)，大量的熱激蛋白富集在膜組分上，具有阻止膜蛋白的變性、防止生物膜熱破碎的功能。許多研究表明HSP生成量與生物耐熱性呈正相關(guān),Lin等在1984年發(fā)現(xiàn)熱激下黃化大豆苗中smHSP合成與其生長(zhǎng)速度相關(guān)，推測(cè)smHSP參與幼苗獲得耐熱性過程。熱激條件下，大部分植物熱激蛋白的合成開始出現(xiàn)，例如無花果、大豆、黃瓜、煙草、蠶豆、番茄等，目前雖不清楚是否已檢測(cè)到的每一種HSP都為產(chǎn)生耐熱性所必需，但已證實(shí)某些HSP的確與植物體的抗熱能力有關(guān)系。例如大豆HSP可阻止經(jīng)熱誘導(dǎo)的大豆幼苗溶質(zhì)的滲漏，番茄及其它植物高溫下在細(xì)胞質(zhì)聚集形成的熱激顆粒能對(duì)蛋白質(zhì)的合成機(jī)器起保護(hù)作用。陳小軍等將克隆到的大豆熱激轉(zhuǎn)錄因子基因在大豆中過量表達(dá)，從而增加了幾個(gè)熱激因子的表達(dá)，提高了大豆的耐熱性。楊金瑩等(楊金瑩，孫穎，孫愛清等.番茄LeHspllO/Clb基因的分子克隆及其對(duì)植物耐熱性的影響[J].生物工程學(xué)報(bào)，2006，22(1):5257)利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法，將CaMV35S驅(qū)動(dòng)的反義LeHspllOPClpB的cDNA片段導(dǎo)入番茄，高溫下轉(zhuǎn)反義基因的番茄株系中LeHspllOPClpBmRNA水平明顯低于對(duì)照，轉(zhuǎn)基因株系的光系統(tǒng)II對(duì)高溫脅迫更加敏感HSPs具有高度保守性及應(yīng)激性，熱應(yīng)激蛋白家族是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最為保守的蛋白家族之一。原核生物和真核生物的HSP70有40%60%的同源性，而不同來源的真核生物其同源性為60%78%。如:從大腸桿菌、酵母、果蠅和人體分離的分子量為70KDa的HSPs，如果對(duì)它ff]進(jìn)行全氨基酸序列分析,就可發(fā)現(xiàn)它們具有80%以上的相似性。HSPs在進(jìn)化過程中的高度保守性，說明它們具有普遍存在的重要生理功能。HSPs的另一特征是應(yīng)激狀態(tài)合成增加，而且HSPs增加速度^T艮快，一般數(shù)分鐘，最多30min即可達(dá)到最高水平，而其它的蛋白質(zhì)合成則減少，物種及不同類型細(xì)胞產(chǎn)生的HSPs種類和數(shù)量是不同的，其中HSP70保守性較強(qiáng)，而小分子HSPs保守性較差。目前人們對(duì)植物和動(dòng)物體內(nèi)熱激蛋白已有較深刻的認(rèn)識(shí)，關(guān)于微生物熱激蛋白鮮有報(bào)道，而關(guān)于食用菌的熱激蛋白尚未見報(bào)道，如果能使真姬菇過量表達(dá)熱激蛋白70基因，提高真姬恭的耐受性，應(yīng)對(duì)生產(chǎn)過程中氣溫的突然變化，可以解除人們?cè)耘嗌a(chǎn)真姬菇的限制并為建立微生物熱激蛋白研究平臺(tái)奠定良好的基礎(chǔ)。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)上述領(lǐng)域的空白，提供一種真姬菇熱激蛋白HSP70的氨基酸序列及其基因序列、引物，將該基因與表達(dá)載體連接導(dǎo)入大腸桿菌后使大腸桿菌耐高溫的能力得到明顯提高。一種真姬菇熱激蛋白HmHSP70，具有SeqIDNo.6所示的氨基酸序列。編碼上述真姬燕熱激蛋白HmHSP70的基因序列。所述的基因序列，包含如SeqIDNo7所示的核苷酸序列。所述的基因序列，具有如SeqIDNO5所示的核苷酸序列。所述的基因序列，具有如SeqIDNO4所示的核苷酸序列。根據(jù)上述基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有如下核苷酸序列5'-CCCAAGCTTTCATGTTCACCGCCGCTG-3'，5，-CCGCTCGAGGATTTGTCATGCATGTGAG-3'。一種表達(dá)載體，包含有任一上述基因序列。所述基因序列如SeqIDNO5所示，所述表達(dá)載體命名為pET32a-c(+)/HmHSP70。轉(zhuǎn)入上述的表達(dá)載體的細(xì)胞、組織或微生物。所述基因序列的應(yīng)用。所述應(yīng)用是指上述基因序列轉(zhuǎn)入其他生物中使宿主獲得耐熱性。本發(fā)明以真姬菇品種白真姬菇為材料，根據(jù)GeneBank中異絲綿霉(AKU02504)，光滑假絲酵母(AY077689)，葡枝根霉(AY147869)等的熱激蛋白基因保守序列，使用PrimerPremier5.0結(jié)合DNAMAN6.0程序設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物P1/P2,從真姬菇基因組DNA中擴(kuò)增出HmHSP70基因中間片段，經(jīng)PCR鑒定后，將目的片段與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5感受態(tài)中，送交上海生工生物工程服務(wù)技術(shù)有限公司測(cè)序，片段長(zhǎng)度為690bp,如SeqIDNOl所示，編碼230個(gè)氨基酸；根據(jù)測(cè)序結(jié)果SeqIDNOl設(shè)計(jì)引物P3，P4，提取真姬菇菌絲體總RNA，利用PT-PCR和RACE技術(shù)相結(jié)合的方法，克隆測(cè)序出HmHSP70基因的3'末端序列，如S叫IDN02所示，和5'末端如S叫IDNO3所示；根據(jù)此兩端序列拼接得到的如SeqIDN04所示2308bp核苷酸序列設(shè)計(jì)引物HSPORF1/HSPORF2，以5'RACEcDNA為模板擴(kuò)增HmHSP70全長(zhǎng)基因，擴(kuò)增產(chǎn)物為2145bp的片段，測(cè)序結(jié)果如SeqIDNO5,分析結(jié)果顯示其開放閱讀框(openreadingframe,ORF)共2001bp如SeqIDNO7所示，編碼667個(gè)氨基酸如S叫IDN06所示。運(yùn)用生物信息學(xué)方法進(jìn)一步分析真姬菇HmHSP70基因的核酸序列和氨基酸序列，序列分析表明該基因?qū)儆贖SP70基因家族，多序列比對(duì)的進(jìn)化樹結(jié)果表明，如圖12所示，HmHSP70蛋白氨基序列與雙色蠟?zāi)?XP—001880175)、新型隱球菌(XP—567978)、棒曲霉(XP—001275300)、裂殖酵母(XP—002172864)的氨基酸序列同源性分別達(dá)87%、71%、67%、67%;HmHSP70蛋白分子量為72.2KDa，等電點(diǎn)(PI,isoelectricpoint)為5.63，不穩(wěn)定系數(shù)為36.67,疏水性分析為可溶性蛋白。將獲得的HmHSP70基因序列，如SeqIDNO5所示核苷酸序列與骨架載體pET32a-c(+)連接構(gòu)建得到原核表達(dá)載體pET32a-c(+)/HmHSP70，轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行異源表達(dá)，提取表達(dá)蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，結(jié)果顯示得到蛋白分子量約為92KDa的融合蛋白，與預(yù)期結(jié)果吻合。轉(zhuǎn)基因大腸桿菌經(jīng)高溫(50°C)熱激處理后，通過對(duì)大腸桿菌活力的測(cè)定和大腸桿菌可溶性蛋白SDS-PAGE電泳檢測(cè)，結(jié)果均表明，HmHSP70蛋白的異源表達(dá)可提高大腸桿菌耐高溫的能力，如圖ll所示，且對(duì)大腸桿菌中其它蛋白有較好的保護(hù)作用。由于密碼子的兼并性,在不改變氨基酸序列的情況下，將本發(fā)明獲得的如SeqIDNO5、SeqIDNO7所示的核苷酸序列作適當(dāng)?shù)恼{(diào)整可以獲得編碼熱激蛋白HmHSP70氨基酸序列的其他核苷酸序列，將這些調(diào)整后的核苷酸序列轉(zhuǎn)入宿主，仍然可以使宿主獲得耐熱性，因此，基于本發(fā)明獲得核苷酸序列SeqIDN05、7調(diào)整后獲得的能編碼如SeqIDN06所示的氮基酸序列的核苷酸系列也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。綜上所述，本發(fā)明獲得了真姬菇熱激蛋白HmHSP70基因的完整開放讀碼框及熱激蛋白的氨基酸序列，將含有該讀碼框的核苷酸序列轉(zhuǎn)入適合的宿主體內(nèi)，可使宿主表達(dá)熱激蛋白并使宿主細(xì)胞獲得耐熱性，實(shí)驗(yàn)證明轉(zhuǎn)基因大腸桿菌過量表達(dá)該熱激蛋白后獲得了耐熱性，推測(cè)該基因轉(zhuǎn)入其它生物中可是宿主獲得耐熱性。圖1.pMD18-Tvector質(zhì)粒圖譜；圖2.pET32a-c(+)質(zhì)粒圖譜；圖3.HmHSP70基因中間片段PCR產(chǎn)物分析；泳道1-3:PCR產(chǎn)物泳道M:Marker圖4重組pMD18-T質(zhì)粒電泳圖泳道1-3為重組載體，泳道4為無插入片段對(duì)照?qǐng)D5.重組pMD18-T質(zhì)粒PCR鑒定電泳泳道1-3為重組載體，泳道4為無插入片段對(duì)照?qǐng)D6A.3'RACE產(chǎn)物電泳檢測(cè)；圖6B.5'RACE產(chǎn)物電泳檢測(cè)；圖7.擴(kuò)展全長(zhǎng)HmHSP70基因PCR產(chǎn)物檢測(cè)；圖8.酶切pET-32a-c(+)/HmHSP70檢測(cè).圖9.pET-32a/HmHSP70重組表達(dá)蛋白產(chǎn)物的SDS-PAGE電泳圖M:蛋白質(zhì)Marker;泳道1:IPTG誘導(dǎo)pET-32a/HmHSP70轉(zhuǎn)化的菌液泳道2:未經(jīng)誘導(dǎo)的pET-32a/HmHSP70轉(zhuǎn)化的菌液；泳道3:IPTG誘導(dǎo)的pET-32a轉(zhuǎn)化的菌液圖10.高溫(5(TC)條件下轉(zhuǎn)HmHSP70基因的大腸桿菌存活率比較圖11.熱激條件下大腸桿菌表達(dá)目的蛋白SDS-PAGE分析泳道從左到右因此為Marker,50'C處理0,30,60,90,120,150,180min的HmHSP70基因的大腸桿菌表達(dá)的蛋白。圖12.熱激條件下非轉(zhuǎn)基因大腸桿菌表達(dá)蛋白SDS-PAGE分析泳道從左到右因此為Marker,50'C處理0，30,60,90，120,150，180min的對(duì)照大腸桿菌表達(dá)的蛋白。圖13.熱激蛋白HSP70系統(tǒng)進(jìn)化樹分析。具體實(shí)施方式所用材料及試劑1.1.1試驗(yàn)材料l丄l.l真姬菇菌株真姬菇菌株白真姬恭，可在市場(chǎng)中買到，公眾也可在青島農(nóng)業(yè)大學(xué)山東省農(nóng)業(yè)應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室得到)L1.1.2大腸桿菌菌株大腸桿菌(￡.co/Z)菌株DH&，為常用菌株，可在市場(chǎng)買到。U丄3克隆載體本試驗(yàn)采用T載體pMDTM18-TVector,購自大連TaKaRa公司，全長(zhǎng)2692bp，攜帶有氨芐青霉素抗性基因(Amp「)和LacZ基因，重組體可通過藍(lán)白斑和氨芐抗性雙重篩選鑒定，質(zhì)粒如圖1所示。本試驗(yàn)采用表達(dá)載體pET32a-c(+)，為常用載體，可在生物公司購買到，全長(zhǎng)5900bp,攜帶有卡那霉素(Kan)抗性基因。質(zhì)粒如圖2所示。l丄2試驗(yàn)培養(yǎng)基1丄2.1PDA固體培養(yǎng)基馬鈴薯200g，蔗糖20g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000mL，pH自然。U.2.2LB固體培養(yǎng)基蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaC110g，瓊脂20g，蒸餾水定容至1000mL，pH7.0。U.2.3LB液體培養(yǎng)基蛋白胨20g，酵母提取物5g，NaC110g，蒸餾水定容至lOOOmL,pH7.0。l丄3試劑總RNA提取試劑盒:Trizol試劑SK1311;DNA回收試劑盒EZ-10SpinColumnDNAGelExtractionKitBS353;Marker:GeneRulerDNALadderMix,購自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒RNAPCRKit(AMV)Ver3.0;TaqTM聚合酶TaKaRaTaq,購自大連TAKARA寶生物公司；RACE試劑盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit634914，購自Clontech公司；KOD-Plus酶，購自TOYOBO公司。l丄4儀器PCR儀，核酸蛋白檢測(cè)儀，凝膠成像系統(tǒng)，超低溫冰箱，低溫高速離心機(jī)，電泳儀，制冰機(jī)，恒溫振蕩培養(yǎng)箱，恒溫培養(yǎng)箱，超凈工作臺(tái)，自動(dòng)高壓蒸汽滅菌鍋，恒溫水浴鍋，微量移液器，超純水儀。U.5常用溶液的配制，參照《分子克隆》第三版。1丄5.1DNA提取用試劑提取緩沖液2.5%CTAB(100mMTris，pH8.0;20mMEDTA,pH8.0，1.4MNaCl)1丄5.2RNA提取用試劑0.1。/。DEPC水DEPC與去離子水1。/。(V/V)的比例混合，37'C放置2h輕搖后，121°C高壓滅菌30min;75%乙醇(VAO:取75mL無水乙醇加0."/。DEPC水定容至100mL，4。C儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?.1.5.350xTAE(Tris-乙酸)Tris24.2g冰乙酸5.71mL0.5mol.L.1EDTA(pH8.0)10mL加去離子水定容至100mL，使用時(shí)用去離子水作50倍稀釋，即為工作液。L1.5.4TEBuffer(8.0)Tris-堿1.21gEDTA-Na20.37g加去離子水800mL，用鹽酸調(diào)pH值至8.0，用去離子水定容至1L,高壓滅菌。1丄5.5氨芐青霉素儲(chǔ)存液將lg氨芐青霉素溶解于10mL去離子水中，終濃度100ni&mU1,用0.22pm微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20°€]儲(chǔ)存?zhèn)溆?。U.5.6X-gal:50mgX-Gal溶于lmL二甲基甲酰胺，終濃度為50mg'ml/1，分裝，-20。C避光保存。1,1.5.7IPTG:將IPTG配制成24mg'mL—1(100mM)的水溶液，用0.22^m微孔濾膜過濾除菌，分裝，-20°(:儲(chǔ)存?zhèn)溆?。L1.5.8質(zhì)粒DNA提取液溶液I:20mmol丄-1葡萄糖25mLlmolL"Tris-Cl(pH8.0)2.5mLSSOmmol'I/1EDTA(pH8.0)4mL加去離子水定容至lOOmL，12rC高壓滅菌15min，4'C貯存。溶液n:10mol-L'NaOH200^iL10%SDS(W/V)lmL臨用前加去離子水定容至10mL溶液III:乙酸鉀(5mo1.1/1)60mL冰乙酸11.5mL加去離子水定容至100mL，4'C貯存。l丄6菌種培養(yǎng)及保存1.1.6.1白真姬菇的培養(yǎng)及保存真姬燕菌種白真姬蔬在PDA固體培養(yǎng)基中25'C培養(yǎng)至滿管，菌株保存在4'C。1丄6.2大腸桿菌的培養(yǎng)及保存五.coZiDH5a在LB培養(yǎng)基中37'C培養(yǎng)過夜，菌株在含15%甘油的LB培養(yǎng)基中于-70'C保存。含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的￡.00//01^菌株在含有100嗎'mL"氨芐青霉素、15%甘油的LB培養(yǎng)基中于-40。C保存。實(shí)施例I:克隆真姬蔬HmHSP70基因中間片段步驟l.白真姬菇的母種(孢子)接種到PDA平板上，25'C培養(yǎng)至滿皿，收集菌絲。采用CTAB法提取基因組DNA，參照上官舟劍等的方法(上官舟建，謝寶貴，羅聯(lián)忠等.真姬燕三個(gè)選育菌株的RAPD分析[J].中國食用菌，2004,3(23):1214)，并保存?zhèn)溆?。步驟l.設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物登錄GenBank/DDBJ/EMBL數(shù)據(jù)庫，根據(jù)登錄的異絲綿霉(AKU02504)，光滑假絲酵母(AY077689)，葡枝根霉(AY147869)等的熱激蛋白基因保守序列，使用PrimerPremier5.0結(jié)合DNAMAN6.0程序設(shè)計(jì)一對(duì)簡(jiǎn)并引物P1:5，-GCTGTHRTYACHGTYCCAGCTTAYTTC-3'P2:5，-RGCDACRGCYTCRTCNGGRTTRAT-3'以上引物由上海生工生物工程公司合成，引物使用前由無菌雙蒸水稀釋到2(HimoR;1。步驟3.真姬菇HmHSP70基因中間片段的PCR擴(kuò)增以真姬菇基因組DNA為模板，采用簡(jiǎn)并引物P1，P2進(jìn)行PCR擴(kuò)增，獲得真姬燕HmHSP70基因中間片段。PCR體系為ddH2037.5jiLPCRbuffer5攀dNTP4攀P！l攀P2l攀DNA模板l攀Taq酶0.5(xLTotal50.0j_iLPCR程序94。C5min94。Clmin56。Clmin72°Clmin共30個(gè)循環(huán)72。C10min4'Cforever擴(kuò)增結(jié)束后，取2^PCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8^瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，觀察結(jié)果，如圖3所示，產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在700bp處有一條帶于預(yù)期結(jié)果基本吻合，初步判斷為目的條帶，回收約700bp的目的基因片段，用上海生工DNA凝膠回收試劑盒EZ-10SpinColumnDNAGelExtractionKit進(jìn)行回收純化。操作如說明書步驟4.回收的PCR產(chǎn)物，與T載體pMDTMl8-T構(gòu)建重組質(zhì)粒，按T載體使用說明操作。步驟5.重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化5.1CaCl2法制備大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，也可以直接在生物公司購買到。1)從LB平板上挑取五.co/Z單克隆，接種于50mLLB液體培養(yǎng)基中，37°C,200rpm搖菌過夜。2)按1:I00的比例將1mL菌液轉(zhuǎn)入IOOmL的新鮮LB液體培養(yǎng)基中，37'C,200rpm搖菌至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期(OD600=0.3~0.5)3)無菌條件下，將菌液轉(zhuǎn)入無菌冰冷的100mL的大離心管中，冰浴10min，使菌液冷至O'C。4)4°C，4000rpm離心10min，棄去上清，回收菌體。5)以10mL4'C預(yù)冷的0.1mol七—^的CaCl2重懸菌體，動(dòng)作要輕，操作在冰上進(jìn)行。6)4'C，4000rpm離心10min,棄去上清，回收菌體。7)每50mL初始培養(yǎng)物用2mL冰冷的0.1moH^的CaCl2重懸菌體。8)以每份200jiL分裝至無菌的1.5mL小離心管中，如不馬上用可加入終濃度為10%的甘油，置-20'C或-7(TC保存?zhèn)溆?。注意整個(gè)操作過程動(dòng)作要輕，要在冰上進(jìn)行，保持低溫。5.2.質(zhì)粒向大腸桿菌中的轉(zhuǎn)化(熱激法)1)取制備的5.coZ/感受態(tài)，每管中加入lnL質(zhì)粒DNA(約50ng)或10nL的連接產(chǎn)物。2)用槍輕輕混勻，或用手輕彈管壁混勻，置于冰浴30min。3)取出，置于42'C水浴，熱激卯s。4)快速將管移至冰浴，冷卻l2min，每管中加入600piLLB培養(yǎng)基，輕輕混勻。5)置于37'C，120rpm輕搖lh左右，使細(xì)菌復(fù)蘇。6)用彎頭玻棒將菌液均勻涂布于含Amp，X-gal和IPTG的LB瓊脂平板上，干燥510min后，37°C過夜培養(yǎng)至長(zhǎng)出單克隆菌落，然后于4'C冰箱放置34h，藍(lán)白斑顏色更加明顯。觀察菌落的生長(zhǎng)狀況，進(jìn)行藍(lán)白斑篩選。7)用滅菌牙簽挑取數(shù)個(gè)白色單菌落分別接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37'C、200rpm振蕩培養(yǎng)16h，提取質(zhì)粒進(jìn)行PCR檢測(cè)；采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA，對(duì)挑取的白斑菌落擴(kuò)繁產(chǎn)物采用堿裂解法提取重組質(zhì)粒DNA，電泳檢測(cè)，如圖4所示。5.3重組質(zhì)粒的PCR鑒定將重組質(zhì)粒作IOO倍稀釋，取lpL做為模板，在PCR薄壁管中依次加入下列試劑ddH2037,5pLPCRbuffer5攀dNTP4攀P,l攀P2l攀DNA模板l.OpLTaq酶0.5^LTotal50攀設(shè)滅菌的雙蒸水為對(duì)照。按以下設(shè)置程序擴(kuò)增94。C5min94。Clmin56。Clmin72°Clmin共30個(gè)循環(huán)72。Cl0min4。Cforever結(jié)束后取2pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳鑒定，觀察結(jié)果如圖5所示，在約700bp處有一條帶，將PCR鑒定為陽性的菌落進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果如SeqIDNol所示。實(shí)施例2.克隆真姬菇HmHSP70基因兩端片段。步驟l.設(shè)計(jì)特異性引物根據(jù)測(cè)序結(jié)果SeqIDNo1，使用PrimerPremier5.0結(jié)合DNAMAN6.0程序設(shè)計(jì)真姬菇HmHSP70基因兩端片段的特異性引物P3:5'-CAACGACAGGCTACTAAGGATGCTGG-3'P4:5，-ACACGGGGCACACGAGTCATACC-3'9以上引物由上海生工生物工程服務(wù)技術(shù)有限公司合成，引物使用前由無菌雙蒸水稀釋到20拜oI.L-1。步驟2提取真姬菇總RNA采用Trizol法提取真姬菇總RNA。操作如下。1.RNA提取前的準(zhǔn)備RNA提取前要對(duì)RNA提取所用的槍頭、EP管、研缽、藥匙和研棒進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)中用到的一切器具都用DEPC處理水(ddH20中含DEPC0.1。/。0.3。/。，v/v)處理。用DEPC(diethypyrocarbonate，焦碳酸二乙酯)處理水處理RNA提取所用的槍頭和EP管的方法1)用DEPC處理水在燒杯或廣口瓶中浸泡槍頭和EP管，DEPC易揮發(fā)且有毒，用一次性PE薄膜手套封口，用橡皮筋扎緊，置37'C溫箱內(nèi)12小時(shí)以上，倒去DEPC處理水(DEPC處理水回收后可重復(fù)使用)。2)槍頭和EP管仍留在燒杯或廣口瓶中，一次性PE薄膜手套改換成潔凈的牛皮紙，橡皮筋扎緊并進(jìn)行高壓蒸汽滅菌后，倒置燒杯或廣口瓶于80'C烤箱中烤干。EP管及玻璃器皿可同樣處理。3)研缽、藥匙和杵處理250'C烘烤3h以上。4)將DEPC處理水小心倒入廢液瓶中，高壓蒸汽滅菌。材料預(yù)處理將長(zhǎng)滿皿的菌絲，放入42。C恒溫培養(yǎng)箱中，熱激處理2h，刮取菌絲備用。2.RNA提取1)在液氮中將菌絲體研磨成粉末，趁液氮尚未揮發(fā)光時(shí)，將粉末轉(zhuǎn)移到1.5mLEP管中。每100mg組織加入l.OmL的Trizol。用槍頭反復(fù)抽吸混勻。注意如果組織量很少，在樣品中加入800jiL的Trizol。2)用lmL針筒，6#針頭抽吸勻漿液兩次以剪切基因組DNA，然后直接從針筒中將樣品轉(zhuǎn)移到無菌的1.5mLEP管中。3)加入200nL氯仿異戊醇(24:1)或氯仿，劇烈振蕩混勻30s。4)12000rpm，4°C,離心5min。5)將上清液轉(zhuǎn)移到RNase-free1.5mL離心管中，加入等體積的異丙醇，室溫下放置5min。(注意不要吸取任何中間層物質(zhì)，否則會(huì)出現(xiàn)染色體DNA污染。)6)12000rpm,4°C，離心5min。7)小心移去上清液，防止RNA沉淀丟失。8)用70%乙醇洗滌兩次，每次700nL，12000卬m，4'C，離心2min。9)盡可能徹底的吸走上清，防止RNA沉淀丟失。10)真空離心干燥35min，或放在室溫完全揮發(fā)。11)沉淀用3050pLDEPC處理水溶解。如發(fā)現(xiàn)沉淀難溶，68t:處理10min。3.提取RNA的分析和定量1)測(cè)定樣品在260nm和280nm的吸收值確定RNA的質(zhì)量。按IOD=40嗎RNA計(jì)算RNA的產(chǎn)率OD2柳2so在1.82.0視為抽提的RNA的純度很高。2)進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，確定RNA的完整性和污染情況。在瓊脂糖凝膠上可以清晰地看到28SrRNA和18SrRNA。如28SrRNA的量約為18SrRNA的兩倍，說明RNA完整性較好。步驟3反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈1)在兩個(gè)一經(jīng)DEPC處理水處理的0.2mLPCR薄壁管A、B中加入下列試劑A管5'RACE-cDNA第一鏈反應(yīng)管①2pL總RNA，②1(iL5，-RACECDSPrimer，③l^SMARTIIAoligonucleotide。(②、③(為試劑盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit634914中所帶成分》B管3'RACE-cDNA第一鏈反應(yīng)管①2^iL總RNA，②1^L3，-RACECDSPrimer,②(為試劑盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit634914中所帶成分)2)用無菌的RNaseFreeddH20補(bǔ)至終體積為5pL。3)混勻后，短暫離心。4)在預(yù)熱的PCR儀上，70。C溫育2min。(使用有熱蓋的PCR儀，以避免由于蒸發(fā)作用而減少反應(yīng)液的體積)。5)迅速在冰上冷卻2min。6)短暫離心使成分聚集管底。7)在0.5mLEP管中再加入下列試劑(試劑除①一④為試劑盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit634914所帶)①2nL5XFirst-StrandBuffer②lnLDTT(20mM)③lpLdNTPMix(10mM)l|_iL反轉(zhuǎn)錄酶PrimeScriptTMReverseTranscriptase(總體積為10|_iL)8)小心混合管內(nèi)組分，稍加離心。9)在預(yù)熱的PCR儀上，42'C溫育卯min。10)用卯^Tricine-EDTA緩沖液稀釋。(Tricine-EDTA為試劑盒SMARTRACEcDNAAmplificationKit634914中所帶)11)在預(yù)熱的PCR儀上，72'C加熱7min,以滅活反轉(zhuǎn)錄酶。12)得到A管的3'RACEcDNA與B管的5'RACEcDNA，于-20。C貯存。步驟4RACE-PCR反應(yīng)為所有的PCR反應(yīng)和1個(gè)額外的反應(yīng)準(zhǔn)備足夠的主混合液MasterMix,每個(gè)50}iLPCR反應(yīng)用41.5mL,分別為如下成分，均為為Clontech公司的試劑盒Advantage2PCRKit中所帶PCR-GradeWater34.5^L10xAdvantage2PCRBuffer2.5pLdNTPMixture(1OmM)1攀5QxAdvantage2polymeraseMix_I.O;jL總體積41.5mL1.3'RACE擴(kuò)增基因的3'末端按下表進(jìn)行PCR反應(yīng)的準(zhǔn)備，按順序在0.2mL滅菌的PCR薄壁管中加入各種成分，輕柔混合。表13'RACE-PCR反應(yīng)成分<table>tableseeoriginaldocumentpage11</column></row><table>4)3'RACEPCR反應(yīng)程序?yàn)?4。C5min，94°C30S68°C30S72°C2min共5個(gè)循環(huán)；94°C30S66。C30S72。C2min共5個(gè)循環(huán)；94'C30S64。C30S72°C2min共27個(gè)循環(huán)；72。C10min;4。C保存擴(kuò)增結(jié)束后取2pLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，EB染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照，觀察結(jié)果，如圖6A所示。II、5'RACE擴(kuò)增基因5'末端5'RACEPCR反應(yīng)體系如表3:表15'RACE-PCR反應(yīng)成分成分15'RACE樣品25'RACE陰性對(duì)照25'RACE陰性對(duì)照CompoentsSampeof5'RACENegativeNontrolNegativeNontrol5'RACEcDNA2，2，UPM5^L5jjLP4(10一)I^iLlpLMasterMix41.5fiL終體積50|iL50^iL50nL5'RACEPCR反應(yīng)程序?yàn)?94。C5min，94°C30S68°C30S72°C2min共5個(gè)循環(huán)；94°C30S66。C30S72。C2min共5個(gè)循環(huán)；94。C30S64。C30S72°C2min共27個(gè)循環(huán)；72°C10min;4。C保存擴(kuò)增結(jié)束后取2nLPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，EB染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照，觀察結(jié)果，如圖6BB所示。步驟5擴(kuò)增產(chǎn)物的回收、克隆對(duì)3'RACE的PCR產(chǎn)物和5'RACE的PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收純化，將回收純化的目的片段連入pMD18-T載體后，導(dǎo)入大腸桿菌DH5a進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，克隆測(cè)序步驟同實(shí)施例1的步驟5，測(cè)序結(jié)果3'末端，如SEQIDN02所示的核苷酸序列，5'末端，如SEQIDN03所示的核苷酸序列。實(shí)施例3.真姬菇HmHSP70基因完整讀碼框的擴(kuò)增步驟1設(shè)計(jì)全長(zhǎng)基因特異性引物擴(kuò)增全長(zhǎng)基因利用DNAMAN軟件對(duì)3'RACE和5'RACE產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果進(jìn)行分析，拼接成HSP70全序列，剔除RACE反應(yīng)加入的接頭序列，根據(jù)5'端和3'端的重疊序列，HSP70基因的全長(zhǎng)拼接得到一條2308bp的序列，如SEQIDN04所示；應(yīng)用NCBI的ORFfinder軟件對(duì)全長(zhǎng)cDNA序列進(jìn)行可讀框架分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可讀框架(ORF)位于342034位核苷酸之間，全長(zhǎng)2001bp,如SEQIDNO7，編碼667個(gè)氨基酸，如SEQIDN06所示。根據(jù)SEQIDN04,使用PrimerPremier5.0結(jié)合DNAMAN6.0程序設(shè)計(jì)全長(zhǎng)特異引物擴(kuò)增基因完整的讀碼框。引物設(shè)計(jì)序列為HSPORF1:5，-CCCAAGCTTTCATGTTCACCGCCGCTG-3'HSPORF2:5，-CCGCTCGAGGATTTGTCATGCATGTGAG-3'HSPORF1引物劃線處為HindIII的酶切位點(diǎn)，HSPORF2引物劃線處為Xhol的酶切位點(diǎn)，弓l物用無菌雙蒸水稀釋至20nM。以實(shí)施例2步驟3得到的5'RACE-cDNA為模板，采用TOYOBO公司的KOD-Plus高保真酶進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR體系如下ddH2033.5pL10xPCRbuffer5攀dNTP(2mM)5單MgS04(25mM)2單HSP0RF1l攀HSPORF21攀5'RACE-cDNAl單KOD-Plusl單Total50.0pLPCR程序如下94。C2min，94。C15S58。C15S68°C150s共30個(gè)循環(huán)；68°C7min;4。C保存擴(kuò)增結(jié)束后取2^LPCR擴(kuò)增產(chǎn)物在0.8%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳，EB染色后凝膠成像系統(tǒng)拍照,觀察結(jié)果，PCR擴(kuò)增出一條2200bp左右的條帶與預(yù)期結(jié)果相吻合，如圖7所示。將剩余48^iL產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，操作同實(shí)施例1步驟3。步驟2.構(gòu)建表達(dá)載體將上一步回收純化的產(chǎn)物和質(zhì)粒pET32a-c(+)分別用限制性內(nèi)切酶HindIII和Xhol進(jìn)行雙酶切。37'C酶切2h。反應(yīng)體系如下HindIII1.0pLXholl單DNA4攀10xHBuffer2攀ddH2012攀Total20%L將PCR酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠中電泳，切膠回收純4fc。將回收純化的PCR酶切產(chǎn)物和質(zhì)粒酶切產(chǎn)物用TaKaRa公司的T4DNALigase進(jìn)行連接，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-32a-c(+)/HmHSP70，體系步驟如下。16'C連接過夜。反應(yīng)體系如下-10xT4DNALigaseBuffer2.5pLDNA片段5單載體DNA3.0fiLT4DNALigase1.0pLdH2013.5nLTotal25單將構(gòu)建好的質(zhì)粒，導(dǎo)入感受態(tài)的大腸桿菌DH5a，克隆篩選陽性克隆，酶切鑒定如圖8所示，測(cè)序步驟同實(shí)施例1步驟5，測(cè)序結(jié)果如SEQIDN05所示，該cDNA片段全長(zhǎng)2145bp,含有完整開放性讀碼框長(zhǎng)2001bp，與拼接結(jié)果吻合，編碼的氨基酸序列全長(zhǎng)667個(gè)氨基酸殘基如SEQIDN06，分子量為72.2KD。步驟3.生物信息學(xué)分析通過Blastn對(duì)獲得的基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與HSP70基因相似度最大，初步鑒定為此基因?yàn)檎婕Ч紿mHSP70蛋白基因，該基因序列編碼的氨基酸序列，如SEQIDN06與GeneBank中已登陸生物的HSP70的序列，采用Blast進(jìn)行蛋白質(zhì)同源性檢索及DNAMAN親緣關(guān)系分析，發(fā)現(xiàn)所得氨基酸序列與雙色蠟?zāi)?XP_001880175)、新型隱球菌(XP—567978)、棒曲霉(XPJ)01275300)、裂殖酵母(XP—002172864)的氨基酸序列同源性分別達(dá)87%、71%、67%、67%。Protparam分析結(jié)果顯示，該蛋白分子量為72.214KDa，理論等電點(diǎn)為5.63，不穩(wěn)定系數(shù)為36.67，為穩(wěn)定蛋白質(zhì)。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示它含有a-螺旋(Alphahelix)27.0%，自由巻曲(Randomcoil)49.9%，伸展片段(Extendedstrand)23.1%。疏水性性分析表明該蛋白多數(shù)氨基酸為水溶性氨基酸，推斷該蛋白為可溶性蛋白質(zhì)。Prosite功能位點(diǎn)分析表明，該蛋白含有HSP70蛋白的特征功能序列，為HSP70家族蛋白，由上述分析結(jié)果推斷，我們所獲得的真姬菇基因序列HmHSP70為HSP70家族一員。實(shí)施例4真姬菇HmHSP70基因原核表達(dá)材料與試劑大腸桿菌(￡.co//)菌株BL21(DE3)，可在生物公司購買到。表達(dá)載體pET32a-c(+)，可在生物公司購買到。全長(zhǎng)5900bp，攜帶有卡那霉素抗性基因。SDS-PAGE電泳所用試劑1、30%丙烯酰胺單體貯存液(T=30%):丙烯酰胺(Acr)29.0g，亞甲基雙丙烯酰胺(Bis)l.Og。先用80mL雙蒸水?dāng)嚢枞芙?，直至溶液變成透明，再用雙蒸水定容至100mL。0.45拜濾膜去雜質(zhì)，于棕色瓶4'C保存。2、1.5MTris-HCl(pH8.8):Tris18.17g加ddH20溶解，濃鹽酸調(diào)pH至8.8，定容至100mL,4'C保存?zhèn)溆谩?、1.0MTris-HCl(pH6.8):Tris12.11g加ddH20溶解，濃鹽酸調(diào)pH至6.8,定容至100mL，4°C保存?zhèn)溆谩?、10%過硫酸銨(AP):lgAP加ddH20至10mL。5、5xSDS-PAGELoadingBuffer:1MTris-HCl(pH6.8)1.25mLSDS0.5gBPB25mg甘油2.5mL加去離子水溶解后定容至5mL，小份分裝后(50(HiL)于室溫保存。使用前將25pL的2-ME(p-巰基乙醇)加到每小份中。加入2-ME的LoadingBuffer可在室溫下保存一個(gè)月左右。6、10xTris-甘氨酸電極緩沖液(pH8.3)Tris30g甘氨酸94gSDS10g加ddH20,lmol.L"鹽酸調(diào)節(jié)pH值至8.3，定容至1000mL。7、考馬斯亮蘭染色液考馬斯亮蘭R250lg異丙醇250mL冰醋酸100mLddH2Q650mL濾紙濾去顆粒后，室溫保存。8、考馬斯亮蘭脫色液<table>tableseeoriginaldocumentpage15</column></row><table>步驟1.CaCl2法制作大腸桿菌BL21感受態(tài)，操作同實(shí)施例1步驟2.對(duì)實(shí)施例3步驟2中鑒定為含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌DH5a,提取質(zhì)粒，操作同實(shí)施例1。步驟3.將提取出來的pET-32a-c(+)/HmHsp70重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21(DE3)中，轉(zhuǎn)化步驟同實(shí)施例1步驟5中的轉(zhuǎn)化。步驟4.挑取生長(zhǎng)良好的陽性單菌落接種到5mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37'C振蕩培養(yǎng)過夜。取lmL活化后的培養(yǎng)液加到100mL含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中。37'C劇烈振蕩培養(yǎng)2.53h,待OD600達(dá)至lj0.40.6時(shí)，加入IPTG至終濃度lmM，37。C進(jìn)行誘導(dǎo)。同時(shí)將空載體pET-32a-c(+)轉(zhuǎn)化BL2I(DE3)作為對(duì)照。步驟4提取原核表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE電泳4丄蛋白質(zhì)樣品制備將lmL步驟4獲得的菌液于4'C8000rpm離心5min，收集菌體沉淀。在菌體沉淀中加入100pL的xSDS凝膠加樣緩沖液，100'C加熱3min,4'C8000rpm離心lrain,收集上清液，冰上放置。4.2、SDS-PAGE凝膠電泳參數(shù)為表4所列15ml12%分離膠，3mL5。/。濃縮膠；濃縮膠電壓80V，分離膠電壓100V電泳。電泳結(jié)果如圖9所示，于90KD處出現(xiàn)一條特異性條帶，與預(yù)期大小相符，而對(duì)照組相應(yīng)位置無此條帶。步驟6真姬菇HmHSP70蛋白耐熱功能的研究將步驟4中經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后的細(xì)菌分成六份進(jìn)行50'C高溫處理，分別處理0、30、60、90、120、180分鐘，分別取5(VL涂布到固體LB培養(yǎng)基上，通過菌落計(jì)數(shù)測(cè)定大腸桿菌的存活能力。提取每個(gè)處理的表達(dá)蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE分析。分析結(jié)果顯示處理60min后，轉(zhuǎn)基因大腸桿菌有21.7%的存活率，而對(duì)照大腸桿菌存活率僅為11%，180min后，對(duì)照全部死亡，而轉(zhuǎn)基因大腸桿菌仍然有1%的存活率，如圖10所示，說明HmHSP70基因可以提高大腸桿菌忍受高溫的能力。含有重組質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞中有過量表達(dá)的特異蛋白質(zhì)帶，隨高溫(5(TC)處理時(shí)間的延長(zhǎng)，大腸桿菌內(nèi)蛋白質(zhì)分解，含重組子的大腸桿菌的目的蛋白降解較少，如圖11所示，而對(duì)照降解較快較多，如圖12所示，表明HmHSP70蛋白對(duì)細(xì)胞有保護(hù)作用。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證明本發(fā)明獲得的完整基因開發(fā)讀碼框?yàn)檎婕Ч紿mHSP70基因的開放讀碼框，其在大腸桿菌中表達(dá)的蛋白能使大腸桿菌獲得耐熱性。附錄序列表<110〉青島農(nóng)業(yè)大學(xué)<120>真姬菇熱激蛋白HniHSP70的氨基酸序列、基因序列及其表達(dá)載體〈130>P09241/QDN<160>13<170>Paterrtlnversion3.3<210>1<211〉691〈212〉DNA<213>HmHSP70基因中間序列■>11GCTGTAGTCACCGTCCCAGCTTACTTCAATGACGCACAACGACAGGCTAC51TAAGGATGCTGGCCAGATTGCTGGCCTCGACGTCCTTCGAGTAATCAACG101AGCCCACGGCGGCCGCCCTTGCTTATGGCCTTGATCGTGCGGACTCGTCC151GTCATTGCCGTTTACGATCTTGGAGGAGGCACATTCGATATATCCATTCT201TGAGATGCAGAAGGGTGTGTTTGAGGTCAAGTCAACGAATGGTGACACCC251ATCTTGGTGGCGAGGATTTCGATGTCGTCCTGGTCGAGTTTATCTTGGCC301GAGTTCMGAAGGAGAGCGGTGTCGACCTCMAGGTGACCGAATGGCCAT351CCAGCGAGTCCGCGAGGCTGCTGAGAAGGCCMGATCGAATTGTCTTCGA401CTACTCAAACGGAAGTTAACTTGCCCTTCATAACTGCCGACGCTTCCGGA451CCCAAGCACATCAACATCAAGCTCATGCGGTC八CAATTCGAAGGACTTGT501TGGTCCCCTTATTCAACGCACCATTGAACCTTGCAAGAAGGCTCTCAGTG551ATGCTGGTGTTMAGCCAGTGAGATTGATGAGGTCATCCTTGTTGGCGGT601ATGACTCGTGTGCCCCGTGTTGTGGAGACGGTGA歸CCATCTTCGGCCG651TGMCCCAGCAMGGTATTAATCCTGAGGAAGCTGTGGCT<210〉2〈211>1716<212〉DNA<213>HraHSP70基因3'端序列〈400>21CGACAGGCTACTAAGGATGCTGGCCAGATTGCTGGCCTCGACGTCCTTCG51AGTAATCAACGAGCCCACGGCGGCCGCCCTTGCTTATGGTCTTGATCGTG101CGGACTCGTCCGTCATTGCCGTTTACGATCTTGGAGGAGGCACATTCGAT151ATATCCATTCTTGAGATGCAGAAGGGTGTGTTTGAGGTCAAGTCAACGAA201TGGTGACACCCATCTTGGTGGCGAGGATTTCGATGTCGTCCTGGTCGAGT251TTATCTTGGCCGAGTTCAAGAAGGAGAGCGGTGTCGACCTCAAAGGTGAC301CGAATGGCCATCCAGCGAGTCCGCGAGGCTGCTGAGAAGGCCAAGATCGA351ATTGTCTTCGACTACTCAAACGGAAGTTAACTTGCCCTTCATAACTGCCG401ACGCTTCCGGACCCMGCACATCAACATCAAGCTCATGCGGTCACMTTC451GAAGGACTTGTTGGTCCCCTTATTCAACGCACCATTGAACCTTGCAAGM501GGCTCTCAGTGATGCTGGTGTTMAGCCAGTGAGATTGATGAGGTCATCC551TTGTTGGCGGTATGACTCGTGTGCCCCGTGTTGTGGAGACGGTGAAGACC601ATCTTCGGCCGTGAACCCAGC嵐GGTGTCAACCCTGATGAGGCTGTCGC651CATTGGTGCGTCCATTCAAGGTGGTGTTTTGGCTGGCAATGTTACGGACA701TCCTACTCCTCGATGTTACTCCCCTATCCCTCGGTATCGAGACACTCGGT751GGTATCATGACCAAACTCATCAGCCGCAACACCACTATCCCTACGAAGAA801GTCTCAGACTTTCTCAACTGCTGCTGACGGCCAGACCGCGATTGAAGTCA851AGATATACCAGGGAGAGCGTGAGCTCGTTCGTGACAACAAACTTCTCGGC901AACTTCAACCTTGTTGGCATTCCTCCCGCACCCAAAGGTGTTCCGCAGAT951CGAAATCACCTTTGACATCGATGCTGACGGTATTGTCAATGTCTCGGCTA薩AGGACMGGCTACCGGCAAGGACCAATCCATGACCATTGCTTCTTCATCT1051GGGCTCAGTGACAAGGACATCGAGAAGATGGTTTCGGACGCCGAGGCATA1101TGCTGAGGATGATAAGGCTCGCAGGAATCTCATCGAAGAGGCTAACAAGG1151CCGACTCTGTCTGCGCTGATACCGAGAAGGCTATGGCTGAATTCAAGGAC1201CAACTCGACGCCACTGAGAAGGACMGGTCGCCAAGCTCGTCACAGAACT1251CCGGGAACTCGCTGTTAAGGGCCAGGCTTCAGAGACGACCATTACCGCCG1301AGGATATTCGGGAAAAGATCAACGAGACACAGCAGGCATCATTGGGACTT1351TTCCAAAAGGTTTATGAGMGCGCAGCCAAGAGAACCAGACTCAAGAGCA1401GCCCTCCGAGTCTGAGGAGAAGAAGGAGGAGAAGAAGGACTAAAGCCTTA1451ATTGACTTTCCCTTCGTTCCTTGCTTATCTCCTGCCGTCGCCCTCCCACC1501AATGTACCTCGCTTTTCGCCTCGTGCATATTCTGCCACGATACCATATCC1551TGGTCGGCCCACCACGCTCACATGCATGAC磁TCCCTTTCAAAAGTAGA腿GCCTGCCACGTCACGATTTACTTACATCTTACCTTAGCATATTTGTTAGT1651CGCAACGCCCCCCCCCTCAATCATTATCGACGTGTAACAAAAAAAMAAA1701MAAAMMAAAAAAA<210〉3<211〉1174<212>DNA<213〉HmHSP70基因5'端序列■〉31ACGCGGGGACCTTTCTCTCTATTCCCTACCATCATGTTCACCGCCGCTGG51TTCTCTACGGAAGTCCGTTGTACGGTTCCCCMGGGCCTTCCGCGCTCAC101TCATTGCGCGGAATATGAACTCAAAAGTTAACGGCCCAGTCATTGGTATT151GACTTGGGTACGACGAACTCATGCGTGTCCGTCATGGAGGGCAAGACATC201TCGGGTCATCGAGAACGCTGAGGGTGCACGGACAACACCCTCCGTCGTCG251CTTTCACAMGCATGGTGAACGTCTTGTCGGACTTCCTGCCAAACGGCAA301GCGGTCGTGAACTCGGCCAATACCGTGTTTGCATTCAAGCGGTTAATTGG351TCGGAAGTTCACGGATAAGGAGGTAAAGGAAGACATGAAACACTGGCCGT401TCACCGTCGTTGCCMGCCCGATGGGAGACCAGCCGTGGAGGTCGACAAC451GGTGGMAGCGTCAACAATTTTCGGCGGAGGMCTATCTTCTATGGTTCT501GGCAAAAATGCGTGAGACGGCAGAGCMTACCTGAACAAGAAAGTCAACC551ACGCTGTCATCACCGTTCCTGCATACTTCAATGACGCACAACGACAGGCT601ACTAAGGATGCTGGCCAGATTGCTGGCCTCGACGTCCTTCGAGTAATCAA651CGAGCCCACGGCGGCCGCCCTTGCTTATGGTCTTGATCGTGCGGACTCGT701CCGTCATTGCCGTTTACGATCTTGGAGGAGGCACATTCGATATATCCATT751CTTGAGATGCAGAAGGGTGTGTTTGAGGTCAAGTCAACGAATGGTGACAC801CCATCGTGGTGGCGAGGATTTCGATGTCGTCCTGGTCGAGTTTATCTTGG851CCCGAGTTCAAGAAGGAGAGCGGTGTCGACCTCAAAGGTGACCGAATGGG901CCATCCAGCGAGTCCGCGAGGCTGCTGAGAAGGCCAAGATCGAATTGTCT951TCGACTACTCAAACGGAAGTTAACTTGCCCTTCATAACTGCCGACGCTTC1001CGGACYCAAGCACATCMCATCAAGCTCATGCGGTCACAATTCGAAGGAC1051TTGTTGGTCCCCTTATTCAACGCACCATTGMCCTTGCAAGAAGGCTCTC1101AGTGATGCTGGTGTTAAAGCCAGTGAGATTGATGAGGTCATCCTTGTTGG1151CGGTATGACTCGTGTGCCCCGTGT<210>4<211>2308<212>DNA<213〉拼接序列<400>41ACGCGGGGACCTTTCTCTCTATTCCCTACCATCATGTTCACCGCCGCTGG51TTCTCTACGGMGTCCGTTGTACGGTTCCCCMGGGCCTTCCGCGCTCAC101TCATTGCGCGGMTATGAACTCAAAAGTTAACGGCCCAGTCATTGGTATT151GACTTGGGTACGACGMCTCATGCGTGTCCGTCATGGAGGGCMGACATC201TCGGGTCATCGAGAACGCTGAGGGTGCACGGACAACACCCTCCGTCGTCG251CTTTCACAAAGCATGGTGAACGTCTTGTCGGACTTCCTGCCAAACGGCAA301GCGGTCGTGAACTCGGCCAATACCGTGTTTGCATTCAAGCGGTTAATTGG351TCGGAAGTTCACGGATAAGGAGGTAAAGGAAGACATGAAACACTGGCCGT401TCACCGTCGTTGCCAAGCCCGATGGGAGACCAGCCGTGGAGGTCGACAAC451GGTGGMAGCGTCMCAATTTTCGGCGGAGGAACTATCTTCTATGGTTCT501GGCAAAAATGCGTGAGACGGCAGAGCAATACCTGAACMGAAAGTCAACC551ACGCTGTCATCACCGTTCCTGCATACTTCAATGACGCACAACGACAGGCT601ACTAAGGATGCTGGCCAGATTGCTGGCCTCGACGTCCTTCGAGTAATCM651CGAGCCCACGGCGGCCGCCCTTGCTTATGGTCTTGATCGTGCGGACTCGT701CCGTCATTGCCGTTTACGATCTTGGAGGAGGCACATTCGATATATCCATT751CTTGAGATGCAGAAGGGTGTGTTTGAGGTCAAGTCAACGAATGGTGACAC801CCATCGTGGTGGCGAGGATTTCGATGTCGTCCTGGTCGAGTTTATCTTGG851CCGAGTTCAAGMGGAGAGCGGTGTCGACCTCAAAGGTGACCGAATGGCC19901ATCCAGCGAGTCCGCGAGGCTGCTGAGAAGGCCAAGATCGAATTGTCTTC951GACTACTCAAACGGAAGTTAACTTGCCCTTCATAACTGCCGACGCTTCCG醒GACCCMGCACATCAACATCAAGCTCATGCGGTCACAATTCGAAGGACTT1051GTTGGTCCCCTTATTCAACGCACCATTGMCCTTGCAAGAAGGCTCTCAG1101TGATGCTGGTGTTAAAGCCAGTGAGATTGATGAGGTCATCCTTGTTGGCG1151GTATGACTCGTGTGCCCCGTGTTGTGGAGACGGTGAAGACCATCTTCGGC1201CGTGAACCCAGCAAAGGTGTCAACCCTGATGAGGCTGTCGCCATTGGTGC1251GTCCATTCAAGCTGGTGTTTTGGCTGGCAATGTTACGGACATCCTACTCC1301TCGATGTTACTCCCCTATCCCTCGGTATCGAGACACTCGGTGGTATCATG1351ACCAAACTCATCAGCCGCAACACCACTATCCCTACGAAGAAGTCTCAGAC1401TTTCTCAACTGCTGCTGACGGCCAGACCGCGATTGAAGTCAAGATATACC1451AGGGAGAGCGTGAGCTCGTTCGTGACAACAMCTTCTCGGCAACTTCAAC醒CTTGTTGGCATTCCTCCCGCACCCAAAGGTGTTCCGCAGATCGAAATCAC1551CTTTGACATCGATCCTGACGGTATTGTCAATGTCTCGGCTAAGGACAAGG臓CTACCGGCAAGGACCAATCCATGACCATTGCTTCTTCATCTGGGCTCAGT1651GACAAGGACATCGAGAAGATGGTTTCGGACGCCGAGGCATATGCTGAGGA1701TGATAAGGCTCGCAGGAATCTCATCGAAGAGGCTAACAAGGCCGACTCTG1751TCTGCGCTGATACCGAGAAGGCTATGGCTGAATTCAAGGACCAACTCGAC腿GCCACTGAGAAGGACAAGCTCGCCAAGCTCGTCACAGAACTCCGGGAACT1851CGCTGTTAAGGGCCAGGCTTCAGAGACGACCATTACCGCCGAGGATATTC1901GGGAAAAGATCAACGAGACACAGCAGGCATCATTGGGACTTTTCCAAAAG1951GTTTATGAGAAGCGCAGCCAAGAGAACCAGACTCAAGAGCAGCCCTCCGA2001GTCTGAGGAGAAGAAGGAGGAGAAGMGGACTAAAGCCTTAATTGACTTT2051CCCTTCGTTCCTTGCTTATCTCCTGCCGTCGCCCTCCCACCMTGTACCT2101CGCTTTTCGCCTCGTGCATATTCTGCCACGATACCATATCCTGGTCGGCC2151CACCACGCTCACATGCATGACAAATCCCTTTCAAAAGTAGAGCCTGCCAC2201GTCACGATTTACTTACATCTTACCTTAGCATATTTGTTAGTCGCAACGCC2251CCCCCCCTCAATCATTATCGACGTGTAACAAMAAAAAAAAAAAA嵐AA2301AAAAAAAA〈210>5<211>2145<212>MA<213>HmHSP70基因全長(zhǎng)序列<400>51TCATGTTCACCGCCGCTGGTTCTCTACGGAAGTCCGTTGTACGGTTCCCC51AAGGGCCTTCCGCGCTCACTCATTGCGCGGAATATGAACTCAAAAGTTAA101CGGCCCAGTCATTGGTATTGACTTGGGTACGACGAACTCATGCGTGTCCG151TCATGGAGGGCMGACATCTCGGGTCATCGAGAACGCTGAGGGTGCACGG201ACAACACCCTCCGTCGTCGCTTTCACAAAGCATGGTGAACGTCTTGTCGG251ACTTCCTGCC301CATTCAAGCG351GACATGAAAC401AGCCGTGGAG451AACTATCTTC501CTGAACAAGA551TGACGCACAA601ACGTCCTTCG651CTTGATCGTG701CACATTCGAT751AGTCAACGAA801CTGGTCGAGT851CAAAGGTGAC901CCAAGATCGA951ATMCTGCCG麵GTCACMTTC1051CTTGCMGAA1101GAGGTCATCC1151GGTGAAGACC1201AGGCTGTCGC1251GTTACGGACA醒GACACTCGGT1351CTACGAAGAA1401ATTGAAGTCA1451ACTTCTCGGC1501TTCCGCAGAT1551GTCTCGGCTA1601TTCTTCATCT1651CCGAGGCATA1701GCTAACAAGG1751ATTCAAGGAC讓TCACAGAACT1851ATTACCGCCG■ATTGGGACTT1951CTCAAGAGCA2001TAAAGCCTTA2051CCCTCCCACC2101TACCATATCC<210>6AMCGGCAAGCGGTCGTGAAGTTAATTGGTCGGAAGTTCAACTGGCCGTTCACCGTCGTTGTCGACAACGGTGGAAAGCGTATGGTTCTGGCAAMATGCAAGTCAACCACGCTGTCATCCGACAGGCTACTAAGGATGCAGTAATCAACGAGCCCACGGCGGACTCGTCCGTCATTGCCATATCCATTCTTGAGATGCATGGTGACACCCATCTTGGTGTTATCTTGGCCGAGTTCAAGCGAATGGCCATCCAGCGAGTATTGTCTTCGACTACTCAMACGCTTCCGGACCCAAGCACGMGGACTTGTTGGTCCCCTGGCTCTCAGTGATGCTGGTGTTGTTGGCGGTATGACTCGTATCTTCGGCCGTGAACCCAGCATTGGTGCGTCCATTCAAGTCCTACTCCTCGATGTTACTGGTATCATGACCAAACTCATGTCTCAGACTTTCTCMCTGAGATATACCAGGGAGAGCGTMCTTCAACCTTGTTGGCATCGAAATCACCTTTGACATCGAGGACAAGGCTACCGGCAAGGGGCTCAGTGACAAGGACATTGCTGAGGATGATAAGGCTCCCGACTCTGTCTGCGCTGATCAACTCGACGCCACTGAGAACCGGGAACTCGCTGTTAAGGAGGATATTCGGGAAAAGATCTTCCAAAAGGTCTATGAGAAGCCCTCCGAGTCTGAGGAGAATTGACTTTCCCTTCGTTCCAATGTACCTCGCTTTTCGCCTGGTCGGCCCACCACGCTCACTCGGCCAATACCGTGTTTGCGGATAAGGAGGTAAAGGAAGCCAAGCCCGATGGGAGACCTCAACMTTTTCGGCGGAGGGTGAGACGGCAGAGCAATACACCGTTCCTGCATACTTCAATGGCCAGATTGCTGGCCTCGCGGCCGCCCTTGCTTATGGTGTTTACGATCTTGGAGGAGGGAAGGGTGTGTTTGAGGTCAGCGAGGATTTCGATGTCGTCAAGGAGAGCGGTGTCGACCTCCGCGAGGCTGCTGAGAAGGCGGAAGTTAACTTGCCCTTCATCAACATCAAGCTCATGCGTATTCAACGCACCATTGAACTTAAAGCCAGTGAGATTGATGTGCCCCGTGTTGTGGAGACCAAAGGTGTCAACCCTGATGGTGGTGTTTTGGCTGGCAATCCCCTATCCCTCGGTATCGACAGCCGCAACACCACTATCCCTGCTGACGGCCAGACCGCGGAGCTCGTTCGTGACAACAATCCTCCCGCACCCAAAGGTGATGCTGACGGTATTGTCAATGACCAATCCATGACCATTGCCGAGAAGATGGTTTCGGACGGCAGGAATCTCATCGAAGAGACCGAGAAGGCTATGGCTGAGGACAAGGTCGCCAAGCTCGGCCAGGCTTCAGAGACGACCMCGAGACACAGCAGGCATCGCGCAGCCAAGAGAACCAGAAGAAGGAGGAGAAGAAGGACTTGCTTATCTCCTGCCGTCGTCGTGCATATTCTGCCACGACATGCATGACAAATC〈211〉667<212〉protein<213〉熱激蛋白HraHSP70的氨基酸序列<400>61MFTMGSLRKSVVRFPKGLPRSLIARNMNS薩GPVIGIDLGTTNSCVSV51MEGKTSRVIENAEGARTTPSVVAFTKHGERLVGLPA卿AWNSANTVFA101FKRLIGRKFTDKEVKE腿HWPFTVVAKPDGRPAVEVDNGGKRQQFSAEE151LSSMVLAKMRETAEQYLNKKVNHAVITVPAYF廳QRQAT飄GQIAGLD201VLRVINEPTA亂AYGLDRADSSVIAVYDLGGGTFDISILEMQKGVFEVK251STNGD麗GGEDFDVVLVEFILAEFKKESGVDLKGDRMAIQRVREAAEKA301KIELSSTTQTEVNLPFITADASGPKHINIKLMRSQFEGLVGPLIQRTIEP351CKKALSDAGVKASEIDEVILVGGMTRVPRVVETVKTIFGREPSKGVNPDE401AVAIGASIQGGVLAGNVTDILLLDVTPLSLGIETLGGIMTKLISRNTTIP451酉SQTFSTAADGQTAIEVKIYQGERELVRD亂LGNFNLVGIPPAPKGV501PQIEITFDIDADGIVNVSAKDKATGKDQSMTIASSSGLSDKDIE麗SDA551EAYAEDDKAR跳IEEANKADSVCADTEKAMAEFKDQLDATEKDKVAKLV601TELRELAVKGQASETTITAEDIREKINETQQASLGLFQKVYEKRSQENQT651QEQPSESEEKKEEKKD*〈210>了〈211〉2001<212>DNA〈213>HmHSP70基因完整讀碼框■>71ATGTTCACCGCCGCTGGTTCTCTACGGMGTCCGTTGTACGGTTCCCCAA51GGGCCTTCCGCGCTCACTCATTGCGCGGAATATGAACTCAMAGTTAACG101GCCCAGTCATTGGTATTGACTTGGGTACGACGAACTCATGCGTGTCCGTC151ATGGAGGGCAAGACATCTCGGGTCATCGAGAACGCTGAGGGTGCACGGAC201AACACCCTCCGTCGTCGCTTTCACMAGCATGGTGAACGTCTTGTCGGAC251TTCCTGCCAAACGGCAAGCGGTCGTGAACTCGGCCAATACCGTGTTTGCA301TTCAAGCGGTTAATTGGTCGGMGTTCACGGATMGGAGGTAAAGGAAGA351CATGAAACACTGGCCGTTCACCGTCGTTGCCAAGCCCGATGGGAGACCAG401CCGTGGAGGTCGACAACGGTGGAAAGCGTCAACAATTTTCGGCGGAGGAA451CTATCTTCTATGGTTCTGGCAA嵐TGCGTGAGACGGCAGAGCAATACCT501GAACAAGAAAGTCAACCACGCTGTCATCACCGTTCCTGCATACTTCAATG551ACGCACAACGACAGGCTACTAAGGATGCTGGCCAGATTGCTGGCCTCGAC601GTCCTTCGAGTAATCAACGAGCCCACGGCGGCCGCCCTTGCTTATGGTCT651TGATCGTGCGGACTCGTCCGTCATTGCCGTTTACGATCTTGGAGGAGGCA701CATTCGATATATCCATTCTTGAGATGCAGAAGGGTGTGTTTGAGGTCAAG751TCAACGAATGGTGACACCCATCGTGGTGGCGAGGATTTCGATGTCGTCCT22801GGTCGAGTTTATCTTGGCCGAGTTCAAGAAGGAGAGCGGTGTCGACCTCA851MGGTGACCGAATGGCCATCCAGCGAGTCCGCGAGGCTGCTGAGAAGGCC901AAGATCGMTTGTCTTCGACTACTCAAACGGAAGTTAACTTGCCCTTCAT951AACTGCCGACGCTTCCGGACCCAAGCACATCMCATCAAGCTCATGCGGT醒CACAATTCGAAGGACTTGTTGGTCCCCTTATTCAACGCACCATTGMCCT1051TGCAAGMGGCTCTCAGTGATGCTGGTGTTAAAGCCAGTGAGATTGATGA1101GGTCATCCTTGTTGGCGGTATGACTCGTGTGCCCCGTGTTGTGGAGACGG1151TGAAGACCATCTTCGGCCGTGAACCCAGCAAAGGTGTCAACCCTGATGAG1201GCTGTCGCCATTGGTGCGTCCATTCAAGGTGGTGTTTTGGCTGGCAATGT1251TACGGACATCCTACTCCTCGATGTTACTCCCCTATCCCTCGGTATCGAGA醒CACTCGGTGGTATCATGACC嵐CTCATCAGCCGCAACACCACTATCCCT1351ACGAAGAAGTCTCAGACTTTCTCAACTGCTGCTGACGGCCAGACCGCGAT1401TGAAGTCAAGATATACCAGGGAGAGCGTGAGCTCGTTCGTGACAACAAAC1451TTCTCGGCAACTTCAACCTTGTTGGCATTCCTCCCGCACCCAAAGGTGTT1501CCGCAGATCGMATCACCTTTGACATCGATGCTGACGGTATTGTCAATGT1551CTCGGCTAAGGACAAGGCTACCGGCAAGGACCMTCCATGACCATTGCTT腿CTTCATCTGGGCTCAGTGACAAGGACATCGAGAAGATGGTTTCGGACGCC1651GAGGCATATGCTGAGGATGATAAGGCTCGCAGGAATCTCATCGAAGAGGC1701TMCAAGGCCGACTCTGTCTGCGCTGATACCGAGAAGGCTATGGCTGAAT1751TCAAGGACCAACTCGACGCCACTGAGAAGGACAAGGTCGCCMGCTCGTC薩ACAGAACTCCGGGAACTCGCTGTTAAGGGCCAGGCTTCAGAGACGACCAT1851TACCGCCGAGGATATTCGGGA磁GATCAACGAGACACAGCAGGCATCAT1901TGGGACTTTTCCAAAAGGTTTATGAGAAGCGCAGCCAAGAGAACCAGACT1951CAAGAGCAGCCCTCCGAGTCTGAGGAGAAGAAGGAGGAGAAGAAGGACTA2001A〈210〉8〈211〉27<212>DNA〈213〉HmHSP70基因兼并上游引物■〉81GCTGT服TYACHGTYCCAGCTTAYTTC，〈210>9<211>24〈212〉DNA〈213>HmHSP70基因兼并下游引物<400>9RGCDACRGCYTCRTCNGGRTTRAT〈210>10<211>26〈212〉謹(jǐn)〈213〉HmHSP70基因3'RACE特異引物〈400>101CAACGACAGGCTACTAAGGATGCTGG〈210>11<211〉23〈212〉腿<213>MSP70基因5'RACE特異引物〈400〉II1ACACGGGGCACACGAGTCATACC〈210〉12<211>27<212〉DNA<213>全長(zhǎng)HmHSP70基因上游引物<400〉121CCCAAGCTTTCATGTTCACCGCCGCTG〈210〉13〈211>28<212>DNA<213>全長(zhǎng)HmHSP70基因下游引物〈柳>131CCGCTCGAGGATTTGTCATGCATGTGAG2權(quán)利要求1.一種真姬菇熱激蛋白HmHSP70，具有如SeqIDNo.6所示的氨基酸序列。2.編碼權(quán)利要求1所述的真姬菇熱激蛋白HmHSP70的基因序列。3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因序列，包含有如SeqIDNo7所示的核苷酸序列。4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因序列，具有如S叫IDNO5所示的核苷酸序列。5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因序列，具有如SeqIDNO4所示的核苷酸序列。6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的基因序列設(shè)計(jì)的引物，具有如下核苷酸序列-5，-CCCAAGCTTTCATGTTCACCGCCGCTG-3，，5，-CCGCTCGAGGATTTGTCATGCATGTGAG-3，。7.—種表達(dá)載體，包含有權(quán)利要求2至5任一所述的基因序列。8.轉(zhuǎn)入權(quán)利要求7所述表達(dá)載體的細(xì)胞、組織或微生物。9.權(quán)利要求2-5任一所述基因序列的應(yīng)用。10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，指將所述基因序列轉(zhuǎn)入其他生物細(xì)胞中使宿主獲得耐熱性。全文摘要本發(fā)明涉及“真姬菇熱激蛋白HmHSP70的氨基酸序列、基因序列及其表達(dá)載體”，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域，本發(fā)明通過RACE-PCR技術(shù)獲得熱激蛋白完整開放讀碼框，據(jù)此推測(cè)出其編碼的氨基酸序列，該基因在大腸桿菌中原核表達(dá)使大腸桿菌獲得明顯的耐熱性，證明獲得的基因序列為熱激蛋白基因；該基因的獲得為熱激蛋白的研究提供了新的元素，該基因可應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因工程中，使轉(zhuǎn)入該基因的宿主獲得耐熱性。文檔編號(hào)C12R1/19GK101560249SQ200910085438公開日2009年10月21日申請(qǐng)日期2009年5月22日優(yōu)先權(quán)日2009年5月22日發(fā)明者盧偉東,輝姜,徐麗麗,李翠翠,郭立忠申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)