專利名稱：甲基化dna的濃縮方法和檢測(cè)方法以及試劑盒的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種甲基化DNA的濃縮方法和檢測(cè)方法，以及相應(yīng)的試劑盒，具體涉 及一種采用甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的甲基化DNA的濃縮 方法和檢測(cè)方法，以及相應(yīng)的試劑盒。
背景技術(shù)：
DNA甲基化是表觀遺傳學(xué)(Epigenetics)的重要研究?jī)?nèi)容，其在維持正常細(xì)胞功 能、遺傳印記、胚胎發(fā)育以及人類腫瘤發(fā)生中起著重要作用，是目前新的研究熱點(diǎn)之一 [1]。 甲基化狀態(tài)的改變是引起腫瘤發(fā)生的一個(gè)重要因素，這種變化包括基因組整體甲基化水平 的降低和CpG島局部甲基化水平的異常升高，導(dǎo)致基因組不穩(wěn)定從而誘發(fā)細(xì)胞癌變[2]。因 此，甲基化的研究為腫瘤的早期預(yù)測(cè)、分類、分級(jí)及預(yù)后評(píng)估提供了新的參考。隨著對(duì)甲基化研究的不斷深入，各種各樣甲基化檢測(cè)方法被開發(fā)出來以滿足不同 類型研究的要求。首先是直接測(cè)序法。直接測(cè)序是由Frommer等提出的研究DNA甲基化的 方法。經(jīng)重亞硫酸鹽處理，使DNA中的胞嘧啶脫氨基轉(zhuǎn)變成尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持 不變。再經(jīng)PCR擴(kuò)增所需片段，則尿嘧啶全部轉(zhuǎn)化成胸腺嘧啶，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序并 且與未經(jīng)處理的序列比較，判斷CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化[3]。此方法比較準(zhǔn)確，而且一次可 以測(cè)定多個(gè)位點(diǎn)，但是相對(duì)復(fù)雜。第二種方法是由Herman等在1996年提出的，它是在使用 重亞硫酸鹽處理的基礎(chǔ)上新建立的一種方法M。它將DNA先用重亞硫酸鹽處理，這樣未甲 基化的胞嘧啶轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏?，而甲基化的胞嘧啶不變，隨后用引物特異性PCR進(jìn)行測(cè)定。另 一種方法是抗體結(jié)合純化甲基化DNA法。甲基化的CpG基團(tuán)可以產(chǎn)生抗體。使用抗甲基化 DNA抗體可以純化甲基化DNA片段[5]。純化的甲基化DNA可以通過DNA寡核酸微陣雜交測(cè) 定。此方法準(zhǔn)確性較前者低。近來，根據(jù)甲基化DNA CpG結(jié)合結(jié)構(gòu)域(MBD)蛋白家族和甲基 化DNA CpG結(jié)合蛋白2(MeCP2)可以特異性地結(jié)合甲基化DNA的特性，Shiraishi、Masahiko 等人在2004年提出了一種新方法-MBD柱層析法，用于純化基因組中甲基化DNA并結(jié)合其 他方法加以測(cè)定[6]。這一類蛋白非常特異性地結(jié)合DNA中甲基化的CpG結(jié)構(gòu)。通過這種對(duì) 甲基化DNA的特異結(jié)合在細(xì)胞中達(dá)到基因表達(dá)調(diào)控的功能。在體外，甲基化DNA CpG結(jié)合 蛋白家族仍可以特異性地與甲基化DNA CpG結(jié)合，并可以用來純化甲基化DNA。但是，目前 所使用的這些方法，一般都要經(jīng)純化、處理、測(cè)定等步驟，比較復(fù)雜，尤其是對(duì)體積較大和/ 或DNA含量較低的生物樣品，上述方法的效果更差。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，采用本發(fā)明的固相化甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié) 合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白可以直接高效地結(jié)合生物樣品中的甲基化DNA，實(shí)現(xiàn)對(duì)生物樣品中甲 基化DNA的濃縮，這對(duì)于體積大或DNA濃度低的生物樣品尤為有利。將該技術(shù)應(yīng)用于甲基 化DNA的檢測(cè)，使得固相載體和甲基化DNA的復(fù)合物不經(jīng)分離，無需純化、處理就可以直接 完成轉(zhuǎn)化和脫硫等反應(yīng)，處理后的甲基化DNA可以直接用于PCR分析或序列測(cè)定。
因此，本發(fā)明的目的在于提供一種甲基化DNA的濃縮方法及相應(yīng)的試劑盒。用于實(shí)現(xiàn)上述目的的技術(shù)方案如下一種甲基化DNA的濃縮方法，該方法包括將生物樣品直接與固相化的甲基化DNA 結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白接觸，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID NO :2所示。在上述濃縮方法中，固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白的固相化 載體選自凝膠顆粒、磁珠、樹脂和膜系統(tǒng)中的一種或多種。上述濃縮方法還可以包括生物樣品預(yù)處理的步驟，例如將生物樣品進(jìn)行蛋白變性 預(yù)處理。一種用于濃縮甲基化DNA的試劑盒，該試劑盒包括固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白 和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示，編碼 所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID N0:2所示。本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種甲基化DNA的檢測(cè)方法，該方法包括以下步 驟(1)濃縮將生物樣品直接與固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白 接觸，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示，編碼所述甲基化DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID N0:2所示。(2)轉(zhuǎn)化使用重硫酸鹽處理步驟(1)濃縮到的甲基化DNA ；(3)脫硫使用堿性脫硫劑處理步驟(2)得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的甲基化DNA ；以及(4)測(cè)定步驟(3)得到的DNA序列。根據(jù)上述檢測(cè)方法得到DNA甲基化的信息可以直接用于試驗(yàn)室和臨床研究。在上述檢測(cè)方法中，固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白的固相化 載體可以選自凝膠顆粒、磁珠、樹脂和膜系統(tǒng)中的一種或多種。步驟(4)中的測(cè)定方法可以 選自PCR分析、定量PCR分析、基因序列分析和分子雜交分析中的一種或多種。生物樣品可 以選自血清、血漿、尿、痰、細(xì)胞提取物、組織提取物和糞便提取物中的一種或多種。上述檢測(cè)方法還可以包括生物樣品預(yù)處理的步驟，例如將生物樣品進(jìn)行蛋白變性 預(yù)處理。本發(fā)明還提供了一種用于檢測(cè)甲基化DNA的試劑盒，該試劑盒包括固相化的甲基 化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID NO :2所示。在上述試劑盒中，固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白的固相化載 體可以選自凝膠顆粒、磁珠、樹脂和膜系統(tǒng)中一種或多種。上述試劑盒還包括用于轉(zhuǎn)化甲基 化DNA的重硫酸鹽、用于脫硫的堿性脫硫劑和轉(zhuǎn)化后的DNA回收溶液。由于天然存在的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白經(jīng)基因 工程技術(shù)克隆并在大腸桿菌中表達(dá)[7]。重組的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白 的結(jié)構(gòu)域蛋白通過化學(xué)法，共價(jià)或非共價(jià)可以與凝膠顆?；虼胖檩d體相連[8]。因此，本發(fā)明 經(jīng)過大量的篩選實(shí)驗(yàn)獲得了編碼基因序列如SEQ ID NO :1所示的甲基化DNA結(jié)合蛋白以及 編碼基因序列如SEQ ID NO :2所示甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白，并將它們固相化，利 用這兩種固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白與甲基化DNA的特異性結(jié)合，從而高效地結(jié)合甲基化DNA，將甲基化DNA特異性地從生物樣品中濃縮，并 可以直接用于測(cè)定。本發(fā)明的固相化甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域 蛋白可以直接用于甲基化DNA的濃縮。生物樣品，比如細(xì)胞或組織提取物、血清、血漿、尿、 痰以及糞便提取物中的甲基化DNA可以在室溫條件下，與本發(fā)明的固相化的甲基化DNA結(jié) 合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白相結(jié)合。該復(fù)合物可以直接進(jìn)行DNA甲基化分 析，直接經(jīng)過重亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化處理及脫硫，濃縮的DNA樣品可以用于PCR測(cè)定或DNA序列分 析。本發(fā)明所提供的方法的整個(gè)技術(shù)過程連續(xù)進(jìn)行，操作簡(jiǎn)便，尤其適用于濃縮和/或測(cè)定 體積較大且DNA含量較低的生物樣品中的甲基化DNA?；诒景l(fā)明所提供的上述方法而制 備的試劑盒使得上述方法的實(shí)施更加簡(jiǎn)便快捷。


以下，結(jié)合附圖來詳細(xì)說明本發(fā)明，其中圖1為PCR擴(kuò)增甲基化DNA結(jié)合蛋白基因(MeCP2基因)和甲基化DNA結(jié)合蛋白 的結(jié)構(gòu)域基因(MBD基因)的電泳結(jié)果圖。圖2為表達(dá)得到的甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域基因的蛋白產(chǎn)物的SDS電泳鑒定 圖。經(jīng)誘導(dǎo)后甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的表達(dá)明顯增加(為28K道耳頓)。其中 1、2、3為三個(gè)不同大腸桿菌菌株。圖3為固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白樹脂的SDS電泳凝膠鑒定結(jié)果 圖。所有蛋白都已與樹脂(beads)相聯(lián)，上清液對(duì)照呈陰性(control)。用解析液可將樹脂 上的甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白分離純化加以證明(1至6為含蛋白的洗脫組份)。圖4為固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白樹脂的功能鑒定結(jié)果圖。其中， 樣品1為樹脂濃縮物，樣品2為上清液，樣品3為陽性對(duì)照。圖5為測(cè)定腸癌細(xì)胞中VIMENTIN基因的甲基化的電泳鑒定結(jié)果圖。其中VIMENTIN 基因的某些位點(diǎn)在人正常組織中是不被甲基化的(樣品1)，但在腸癌的組織中明顯的被甲 基化(樣品2、3、4、5、6分別來自五名病人)。
具體實(shí)施例方式下面通過實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所提供的甲基化DNA的濃縮和檢測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)說明。實(shí)施例1 制備甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白甲基化DNA結(jié)合蛋白基因(MeCP2)或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域基因(MBD) (Genebank No. NM_004992)首先由PRC擴(kuò)增，具體方法參見文獻(xiàn)[9]。甲基化DNA結(jié)合蛋白基因(MeCP2)所用引物MECP2F 5-CACCATGGTAGCTGGGATGTTAGGGCT ；MECP2R :5_GCTAACTCTCTCGGTCACGGGCGT。所擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物為1458個(gè)堿基(見SEQ ID NO 1)。甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域基因(MBD)所用引物MBDF 5-CACCATGCGCTCCATCATCCGTGA ；MBDR :5_TGGTTTCTGCTCTCGCCGGGA。所擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物為264個(gè)堿基(見SEQ ID NO :2)。
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的瓊脂糖電泳鑒定以上擴(kuò)增出的DNA產(chǎn)物，結(jié)果如圖1所示。再將互補(bǔ)的cDNA片段插入到DNA表達(dá)載體質(zhì)粒pBAD中(參見Invitrogen Corporation. 5791 Van Allen Way, Carlsbad, CA,92008, United States 產(chǎn)品說明)。在 大腸桿菌中表達(dá)(37°C培養(yǎng)3小時(shí)后經(jīng)阿拉伯糖誘導(dǎo)，再經(jīng)16小時(shí)培養(yǎng)并收獲細(xì)菌)。所 得到的蛋白產(chǎn)物可由SDS電泳鑒定，結(jié)果如圖2所示，甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白為 28KD(甲基化DNA結(jié)合蛋白為69KD，圖中未示出)。 實(shí)施例2 制備固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋 白從裂解后的基因工程大腸桿菌提取液中提取表達(dá)的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基 化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白。在培養(yǎng)的250毫升大腸桿菌提取液加入0. 5毫升的樹脂 (Qiagen，Ni-NTA，MBD 蛋白由鎳樹脂純化。參見 Qiagene 27220 Turnberry Lane, Suite 200,Valencia,CA 91355 USA. [10])?；旌衔镌?°C下混合1小時(shí)后，離心(600轉(zhuǎn)/分鐘， 3分鐘)，除去上清液。再經(jīng)磷酸緩沖液漂洗兩次。將5微升所得樹脂經(jīng)SDS樣品液直接處理，通過SDS電泳鑒定，結(jié)果如圖3所示， 表明甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白已吸附在樹脂上。實(shí)施例3 固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的 功能鑒定在本實(shí)施例中，對(duì)實(shí)施例2所制備出的固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白進(jìn)行功能鑒定，具體步驟如下(1)樣品的預(yù)處理血漿中DNA的含量在每毫升5到50納克左右。將500微升血 漿首先與500微升的6M胍溶液混合，然后將樣品用結(jié)合緩沖液(IOmM Tris-HCl pH 8.0， 3mM MgCl2, 50mM NaCl，0. ImM EDTA)稀釋至 2 毫升。(2)甲基化DNA的濃縮加入5微升固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié) 合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白樹脂，室溫并在搖動(dòng)下保持1小時(shí)。離心除去液體(6000轉(zhuǎn)/分鐘，3 分鐘)，樹脂再經(jīng)500微升的結(jié)合緩沖液漂洗兩次。(3)重硫酸鹽轉(zhuǎn)化加入90微升重硫酸鹽溶液在65°C條件下保溫3小時(shí)。然后， 在混合物中加入600毫升的平衡緩沖液并將混合物轉(zhuǎn)移至DNA提取的離心柱內(nèi)。經(jīng)離心后， DNA結(jié)合在離心柱上。(4)脫硫處理加入200微升的堿性脫硫劑(NaOH)，室溫保溫15分鐘。再經(jīng)淋洗 和10微升水洗脫，所得到的DNA中的未甲基化的胞嘧啶核苷酸全部轉(zhuǎn)變?yōu)槟蜞奏ず塑账帷?甲基化的胞嘧啶核苷酸仍為甲基化的胞嘧啶核苷酸。(5)PCR測(cè)定設(shè)計(jì)特異性的PCR引物，將甲基化的胞嘧啶核苷酸鑒定出來。 ADAR2基因中的CpG在正常細(xì)胞中是甲基化的[11]。在上述處理過的DNA樣品中，測(cè) 定出該甲基化基因，如圖4所示。該結(jié)果表明，固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA 結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白樹脂具有結(jié)合甲基化DNA的功能。并且此實(shí)驗(yàn)也證明利用甲基化 結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域蛋白對(duì)循環(huán)系統(tǒng)中游離的甲基化DNA進(jìn)行結(jié)合以實(shí)現(xiàn)甲基化DNA的濃 縮，進(jìn)而用于檢測(cè)。實(shí)施例4 腸癌細(xì)胞中VIMENTIN基因甲基化的鑒定腸癌組織中DNA發(fā)現(xiàn)有異常的甲基化變化。VIMENTIN基因特定位點(diǎn)的甲基化被看作腸癌的征兆[12’13’14]。甲基化的VIMENTIN基因片段可以在患者的循環(huán)系統(tǒng)中游離的DNA 中檢測(cè)到。也可以從患者的大便樣品DNA中測(cè)得。本實(shí)施例采用大便樣品(Ig)，首先溶于5毫升的6M胍溶液中并在70°C下保溫10 分鐘。再震蕩1分鐘。然后，加入15毫升的結(jié)合緩沖液，超聲波處理1分鐘。樣品經(jīng)離心 (6000轉(zhuǎn)/分鐘，10分鐘)后，除去沉淀。加入10微升的固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或 甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白樹脂，混合條件下室溫保持2小時(shí)。固相化的甲基化DNA 結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的樹脂再經(jīng)離心回收(5000轉(zhuǎn)/分鐘，3分 鐘)。經(jīng)500毫升結(jié)合緩沖洗兩次。得到的樹脂DNA混合物直接用于甲基化測(cè)定，其中設(shè)計(jì) 的特異性PCR引物為mVF 5-TCGTTTCGAGGTTTTCGCGTTAGAGAC,以及mVR 5-CGACTAAAACTCGACCGACTCGCGATA,通過電泳測(cè)定出腸癌細(xì)胞中VIMENTIN基因的甲基化(見圖5)。實(shí)施例5 血清或血漿中VIMENTIN基因甲基化的鑒定本實(shí)施例采用方法的具體步驟同實(shí)施例3，不同之處在于，將血清或血漿的量增加 至2毫升。胍溶液和結(jié)合緩沖液也分別增至2毫升和4毫升。最終得到的轉(zhuǎn)化的DNA直接 用VIMENTIN甲基化測(cè)定引物經(jīng)PCR測(cè)定。實(shí)施例6 尿液、痰液等生物樣品中VIMENTIN基因甲基化的鑒定本實(shí)施例采用的方法的具體步驟同實(shí)施例3和實(shí)施例5。尿液，痰液等生物樣品 首先加入等體積的胍溶液。保溫10分鐘后，加入兩倍體積的結(jié)合緩沖液和相應(yīng)體積的固相 化的甲基化DNA結(jié)合蛋白或甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白樹脂，混合條件下室溫保持 2小時(shí)。離心回收樹脂并直接進(jìn)行甲基化分析。實(shí)施例7 試劑盒的制備試劑盒包括凝膠顆粒300微升，轉(zhuǎn)化試劑1000微升，平衡液20毫升，堿性脫硫劑 4毫升，柱子50個(gè)。該試劑盒可供50個(gè)樣品分析。參考文獻(xiàn)1.Daniel Zilberman and Steven Henikoff(2007). "Genome-wideanalysis of DNA methylation patterns".Development 134,3959-3965(2007) doi :10.1242/ dev.001131 ；2. Partha Μ. Das, Rakesh Singal (2004) "DNA Methylation andCancer". Journal of Clinical Oncology, Vol 22, No 22 (November 15), pp.4632-4642 ；3. Frommer, Marianne ；McDonald, Louise E. ；Millar, Douglas S. ；Collis, Christina M. ；Watt, Fejiko ；Grigg, Geoffrey W. ；Molloy, Peter L. ；Paul, Cheryl L. (1992) "A genomic sequencing protocolthat yields a positive display of 5-methylcytosine residues inindividual DNA strands. "Proceedings of the National Academy ofSciences of the United States of America(1992),89(5),1827-31 ;4. J G Herman, J R Graff, S Myohanen, B D Nelkin, and S B Baylin (1996) MethyIation-specific PCR :a novel PCR assay for methylationstatus of CpG islands"PNAS September 3, vol. 93 no. 18 9821-9826 ；5. KAffARADA, Y. and 0KUHARA, E. (1986) "Antibodies Specificfor Methylated
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0091]atggtagctgggatgttagggctcagggaa gaaaagtcag aagaccagga cctccagggc600092]ctcaaggacaaacccctcaagtttaaaaag gtgaagaaag ataagaaaga agagaaagag1200093]ggcaagcatgagcccgtgcagccatcagcc caccactctg ctgagcccgc agaggcaggc1800094]aaagcagagacatcagaagggtcaggctcc gccccggctg tgccggaagc ttctgcctcc2400095]cccaaacagcggcgctccatcatccgtgac cggggaccca tgtatgatga ccccaccctg3000096]cctgaaggctggacacggaagcttaagcaa aggaaatctg gccgctctgc tgggaagtat3600097]gatgtgtatttgatcaatccccagggaaaa gcctttcgct ctaaagtgga gttgattgcg4200098]tacttcgaaaaggtaggcgacacatccctggaccctaatgattttgacttcacggtaact4800099]gggagagggagcccctcccggcgagagcagaaaccacctaagaagcccaaatctcccaaa5400100]gctccaggaactggcagaggccggggacgccccaaagggagcggcaccacgagacccaag6000101]gcggccacgtcagagggtgtgcaggtgaaaagggtcctggagaaaagtcctgggaagctc6600102]cttgtcaagatgccttttcaaacttcgccagggggcaaggctgaggggggtggggccacc7200103]acatccacccaggtcatggtgatcaaacgccccggcaggaagcgaaaagctgaggccgac7800104]cctcaggccattcccaagaaacggggccgaaagccggggagtgtggtggcagccgctgcc8400105]gccgaggccaaaaagaaagccgtgaaggagtcttctatccgatctgtgcaggagaccgta9000106]ctccccatcaagaagcgcaagacccgggagacggtcagcatcgaggtcaaggaagtggtg9600107]aagcccctgctggtgtccaccctcggtgagaagagcgggaaaggactgaagacctgtaag10200108]agccctgggcggaaaagcaaggagagcagccccaaggggcgcagcagcagcgcctcctca10800109]ccccccaagaaggagcaccaccaccatcaccaccactcagagtccccaaaggcccccgtg11400110]ccactgctcccacccctgcccccacctccacctgagcccgagagctccgaggaccccacc12000111]agcccccctgagccccaggacttgagcagcagcgtctgcaaagaggagaagatgcccaga12600112]ggaggctcactggagagcgaCggCtgCCCCaaggagccagctaagactcagcccgcggtt13200113]gccaccgccgccacggccgcagaaaagtacaaacaccgaggggagggagagcgcaaagac13800114]attgtttcatcctccatgccaaggccaaacagagaggagcctgtggacagccggacgccc14400115]gtgaccgaga gagttagc1458 <210>2
<211>264
<212>DNA
<213>人工序列
<400>2
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gtaggcgacacatccctggaccctaatgat tttgacttca cggtaactgg gagagggagc240
ccctcccggcgagagcagaaacca26權(quán)利要求
一種甲基化DNA的濃縮方法，該方法包括將生物樣品直接與固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白接觸，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID NO1所示，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID NO2所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的濃縮方法，其特征在于，所述固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和 /或其結(jié)構(gòu)域蛋白的固相化載體選自凝膠顆粒、磁珠、樹脂和膜系統(tǒng)中的一種或多種。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的濃縮方法，其特征在于，所述濃縮方法還包括生物樣品預(yù) 處理的步驟，例如將生物樣品進(jìn)行蛋白變性預(yù)處理。
4.一種用于濃縮甲基化DNA的試劑盒，該試劑盒包括固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和 /或其結(jié)構(gòu)域蛋白，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示，編碼所 述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID N0:2所示。
5.一種甲基化DNA的檢測(cè)方法，該方法包括以下步驟(1)濃縮將生物樣品直接與固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白接觸， 編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID NO :1所示，編碼所述甲基化DNA結(jié)合 蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ IDNO :2所示；(2)轉(zhuǎn)化使用重硫酸鹽處理步驟(1)濃縮到的甲基化DNA；(3)脫硫使用堿性脫硫劑處理步驟(2)得到的經(jīng)轉(zhuǎn)化的甲基化DNA；以及(4)測(cè)定步驟(3)得到的DNA序列。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和 /或其結(jié)構(gòu)域蛋白的固相化載體選自凝膠顆粒、磁珠、樹脂和膜系統(tǒng)中的一種或多種。
7.根據(jù)權(quán)利要求5或6所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(4)中的測(cè)定方法選自 PCR分析、基因序列分析和分子雜交分析中的一種或多種。
8.根據(jù)權(quán)利要求5至7中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述生物樣品選自血 清、血漿、尿、痰、細(xì)胞提取物、組織提取物和糞便提取物中的一種或多種。
9.根據(jù)權(quán)利要求5至8中任一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述檢測(cè)方法還包括生 物樣品預(yù)處理的步驟，例如將生物樣品進(jìn)行蛋白變性預(yù)處理。
10.一種用于檢測(cè)甲基化DNA的試劑盒，該試劑盒包括固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和 /或其結(jié)構(gòu)域蛋白，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID N0:1所示，編碼所 述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID N0:2所示。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的試劑盒，其特征在于，所述固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和 /或其結(jié)構(gòu)域蛋白的固相化載體選自凝膠顆粒、磁珠、樹脂和膜系統(tǒng)中一種或多種。
12. 根據(jù)權(quán)利要求10或11所述的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒還包括用于轉(zhuǎn)化甲 基化DNA的重硫酸鹽、用于脫硫的堿性脫硫劑和轉(zhuǎn)化后的DNA回收溶液。全文摘要
本發(fā)明提供一種甲基化DNA的濃縮方法和檢測(cè)方法以及試劑盒，濃縮方法包括將生物樣品直接與固相化的甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白接觸。檢測(cè)方法包括以下步驟濃縮將生物樣品直接與固相化甲基化DNA結(jié)合蛋白和/或其結(jié)構(gòu)域蛋白接觸；轉(zhuǎn)化使用重硫酸鹽處理濃縮到的甲基化DNA；脫硫使用堿性脫硫劑處理經(jīng)轉(zhuǎn)化的甲基化DNA；以及測(cè)定得到的DNA序列。上述方法中編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的基因序列如SEQ ID NO1所示，編碼所述甲基化DNA結(jié)合蛋白的結(jié)構(gòu)域蛋白的基因序列如SEQ ID NO2所示。上述方法采用固相化甲基化DNA結(jié)合蛋白或其結(jié)構(gòu)域直接高效結(jié)合甲基化DNA，對(duì)于體積大或DNA濃度低的生物樣品尤為有利。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK101906414SQ20091008587
公開日2010年12月8日 申請(qǐng)日期2009年6月3日 優(yōu)先權(quán)日2009年6月3日
發(fā)明者夏東元 申請(qǐng)人:博爾誠(chéng)(北京)科技有限公司