專利名稱：：環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(lamp)檢測鼠疫桿菌的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明屬于生物檢測領(lǐng)域，具體涉及一種改進的環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法及其在檢測鼠疫桿菌中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：鼠疫是一種以發(fā)病急、傳播快、病死率高、傳染性強為特征的自然疫源性傳染病，是《中華人民共和國傳染病防治法》規(guī)定的甲類傳染病。自從上個世紀(jì)90年代以來，全球鼠疫流行呈上升趨勢。世界范圍鼠疫疫情連年不斷，尤以非洲為重，亞洲次之，但也有大規(guī)模的爆發(fā)流行。與世界其它地區(qū)一樣，我國鼠疫自然疫源地進入活躍期，鼠疫疫情也明顯上升。鼠疫的病原體鼠疫桿菌在自然界中常表現(xiàn)為典型菌與非典型菌并存的狀況，非典型鼠疫菌是不具備典型鼠疫桿菌生物學(xué)特性一項或幾項特異特征的菌林。在鼠疫流行靜息期，非典型鼠疫桿菌是鼠疫桿菌在自然界中長期保存的主要形式，而典型菌是鼠疫流行期的主要菌群，典型菌和非典型菌在一定情況下可發(fā)生互相轉(zhuǎn)換。目前對鼠疫的4企測方法有常規(guī)四步檢測法，免疫學(xué)^r測法，分子生物學(xué)法，全自動微生物分析系統(tǒng)。我國對鼠疫菌的檢測主要采用血清學(xué)方法和鼠疫菌的四步檢測法。血清學(xué)方法只能作追溯性診斷，四步檢驗雖然可靠，但耗時過長。常規(guī)的檢測手段很容易檢出典型鼠疫菌,卻很難檢出非典型鼠疫菌，而且靈敏度及特異性不高。PCR技術(shù)多以存在于鼠疫菌質(zhì)粒上的毒力基因為靶位點進行檢測，對非典型鼠疫菌的調(diào)查缺乏特異性，且大多PCR擴增方法均局限在室內(nèi)，不適用于疫源地的監(jiān)測與現(xiàn)場初篩。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明涉及一種新的檢測鼠疫桿菌的方法，其中采用環(huán)介導(dǎo)等溫4擴增技術(shù)。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(LAMP)是日本學(xué)者Notomi發(fā)明的一種全新核酸擴增方法，它在保持PCR技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上，進一步增強了反應(yīng)的特異性和縮短了反應(yīng)時間，而且不需要昂貴的熱循環(huán)儀，等溫條件下即可完成反應(yīng)，擴增產(chǎn)物肉眼可見，-使于推廣應(yīng)用。LAMP是利用4個特殊設(shè)計的引物和具有鏈置換活性的DNA聚合酶，在恒溫條件下特異，高效，快速擴增DNA的新技術(shù)。LAMP反應(yīng)主要包括兩個階段循環(huán)擴增始發(fā)物的形成和循環(huán)擴增伸長延伸階#殳。耙序列6個特異區(qū)域和引物的結(jié)構(gòu)如圖1所示，F(xiàn)IP引物包括正向內(nèi)引物F2區(qū)段(與耙基因3,末端F2c互補)和Flc(與耙基因3，末端Flc序列相同)，正向外引物F3(與靶基因3，末端F3c互補)；BIP引物包括反向內(nèi)引物B2區(qū)段(與靶基因3,末端B2c互補)和Blc(與靶基因3，末端Blc序列相同)，反向外引物B3(與靶基因3，末端B3c互補)。循環(huán)擴增始發(fā)物形成DNA在60-65。C處于動態(tài)平衡，在具鏈置換活性BstDNA酶的作用下，任一引物與耙基因序列進行互補延伸時，另一條鏈就會解離。反應(yīng)以正向內(nèi)引物F2為起點，與耙序列F2c配對延伸擴增模板互補鏈，與此同時，正向外引物F3與把序列F3c互補延伸合成模板互補DNA鏈，并置換下由正向內(nèi)引物FIP引導(dǎo)合成的模板鏈。被置換下的模板單鏈5,末端Fl與Flc互補，發(fā)生自我堿基配對，形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，而反向內(nèi)引物BIP結(jié)合其另一端，引導(dǎo)合成互補鏈，緊接著由反向外引物B3與B3c結(jié)合延伸，解下BIP引導(dǎo)合成的模板DNA單鏈。BIP引導(dǎo)合成的DNA鏈兩端均有互補序列，發(fā)生自我配對，形成啞鈴狀模板DNA。循環(huán)擴增伸長延伸階段啞鈴狀模板DNA為循環(huán)反應(yīng)的起點，為后續(xù)反應(yīng)提供原料。啞鈴結(jié)構(gòu)的DNA通過自我引導(dǎo)延伸，生成雙鏈莖環(huán)結(jié)構(gòu)，在循環(huán)反應(yīng)中，引物FIP結(jié)合到莖環(huán)DNA的環(huán)狀結(jié)構(gòu)上，引導(dǎo)合成新的DNA雙鏈，同時置換出與W目同序列的鏈，形成一個過渡性莖環(huán)結(jié)構(gòu)DNA，在其莖上含有一耙序列反向拷貝，而另一端通過BIP形成一環(huán)狀結(jié)構(gòu)，在隨后自我引導(dǎo)的鏈置換DNA合成反應(yīng)中生成一條可填補缺口，長度為靶DNA兩倍的莖環(huán)DNA。經(jīng)過一系列自我引物置換延伸合成過程，在內(nèi)引物作用下進行循環(huán)反應(yīng)，莖的長度和環(huán)的個個數(shù)都逐漸增加，最后擴增產(chǎn)物為由DNA組成的混合物，即含有若干倍莖環(huán)結(jié)構(gòu)和類似花椰菜的結(jié)構(gòu)(含有在同一鏈上由退火形成的，在靶序列的交替反向重復(fù)序列之間的多重環(huán)狀結(jié)構(gòu))。LAMP擴增結(jié)果判定有三種(1)瓊脂糖電泳觀察是否產(chǎn)生連續(xù)的DNA擴增條帶。(2)反應(yīng)管離心肉眼觀察管底有無白色沉淀，陰性反應(yīng)無此現(xiàn)象，或采用濁度儀檢測管內(nèi)濁度變化，可進行實時定量檢測。(3)反應(yīng)產(chǎn)物中加SYBRGreenI,肉眼觀察顏色反應(yīng)，呈綠色為陽性反應(yīng)，橙紅色為陰性反應(yīng)。LAMP技術(shù)擴增以形成環(huán)狀模板DNA作為反應(yīng)的起點，因此成功形成此結(jié)構(gòu)是反應(yīng)的關(guān)鍵。對引物設(shè)計有其特殊要求(l)Tm:內(nèi)引物中Flc、Blc的Tm值要求在64-66°C，F(xiàn)lc、Blc的Tm值應(yīng)比B2、F2以及外引物F3、B3高約5。C是為了使Flc、Blc不會過早與模板鏈Fl、Bl結(jié)合，過早結(jié)合將導(dǎo)致環(huán)狀模板DNA形成失??；B2、F2以及外引物F3、B3的Tm值在59-6rC,B2、F2的Tm〈B3、F3的Tm值，以使反應(yīng)起始F2能首先與模板DNA結(jié)合進行擴增而并非F3、B3與模板鏈結(jié)合直接形成互補雙鏈。(2)內(nèi)外引物應(yīng)具備相當(dāng)?shù)姆€(wěn)定性，引導(dǎo)合成新DNA鏈的F2，B2，F(xiàn)3,B3的3，末端，涉及形成環(huán)狀DNA的Flc，Blc的5，末端AG《-4kcal/mo1。(3)GC含量內(nèi)外引物對GC含量在40-60%，以50-60%最佳。(4)二級結(jié)構(gòu)引物對之間與引物自身應(yīng)避免形成二級結(jié)構(gòu)，由于LAMP的大多數(shù)產(chǎn)物均為FIP和BIP所擴增，因此涉及內(nèi)引物時應(yīng)注意不形成引物二級結(jié)構(gòu)。(5)引物長度要求F2—B2:120-160bp,F1-F2、B1-B2:40-60bp,F2-F3/B2-B3:0-60bp。本發(fā)明涉及一種測定鼠疫桿菌的新方法，其中包括1、鼠疫桿菌疫苗抹EV76.DNA的提??；2、LAMP引物設(shè)計和合成，其中LAMP引物包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物，內(nèi)引物FIP(上端內(nèi)引物)包含F(xiàn)lc序列和F2(F2c區(qū)域的互補序列)，即5,-Flc-F2;內(nèi)引物BIP(下端內(nèi)引物)包含Blc(Bl區(qū)域的互補序列)和B2序列，即5，-Blc-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結(jié)合耙序列上的6個特異區(qū)域；3、在所選酶濃度、Mg2+條件、dNTPs濃度、反應(yīng)溫度條件下進6行反應(yīng)。經(jīng)過本發(fā)明人的大量研究，本發(fā)明所述的方法中，(1)釆用BstDNA聚合酶2~12U進行LAMP單因素，結(jié)果酶活性單位在5-12U中擴增效果優(yōu)良，在9-11U的范圍內(nèi)擴增效果好，更優(yōu)選酶濃度為IOU，此時效果最佳。(2)1xThermol緩沖液含有2畫1/LMg2+，本發(fā)明選擇Mg2+濃度在2mmol/L~10mmol/L進行LAMP擴增，優(yōu)選采用3-6mmol/L進行LAMP擴增，最優(yōu)選4mmo1/LMg2+。(3)采用dNTPseach濃度為100umol/L~600umol/L進行LAMP擴增，優(yōu)選200-500umol/L，更優(yōu)選300-450umol/L,最有優(yōu)選400umol/L處擴增。(4)比較不同反應(yīng)溫度對整個LAMP擴增體系的影響，本發(fā)明的方法優(yōu)選的溫度范圍在53°C~68°C,更優(yōu)選58-65°C，最優(yōu)選63。C。本發(fā)明所述方法中，所述鼠疫桿菌疫苗抹EV76DNA的提取利用煮沸法進行基因提取。例如，主要步驟如下1)取培養(yǎng)后液體增菌液于EP管，離心，收集細菌，棄上清；2)用dH20重懸洗滌細菌，離心，棄上清，重復(fù)一次，最后用dH20重懸;3)沸水浴處理裂解細菌，離心，使細菌蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀于底部，取上清于EP管；4)NnnoDrop法測定DNA濃度，保存于-20°C。本發(fā)明的鼠疫桿菌疫苗抹EV76DNA的提取利用煮沸法進行基因才是取，具體實例例如1)取培養(yǎng)48h后液體增菌液lml于1.5mlEP管，13.4x1000rpm離心30sec，收集細菌，棄上清；2)0.25mldH20重懸洗滌細菌，13.4x1000rpm離心30sec，棄上清，重復(fù)一次，最后用0.25mldH20重懸；3)沸水浴10min裂解細菌，8000g離心10min，4吏細菌蛋白質(zhì)等雜質(zhì)沉淀于底部，取上清于1.5mlEP管；4)NnnoDrop法測定DNA濃度，保存于-20°C。本發(fā)明的方法中，引物設(shè)計和合成過程中包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物的設(shè)計和合成，內(nèi)引物FIP(上端內(nèi)引物)包含F(xiàn)lc序列和F2(F2c區(qū)域的互補序列)，即5,-Flc—F2;內(nèi)引物BIP(下端內(nèi)引物)包含Blc(Bl區(qū)域的互補序列)和B2序列，即5，-Blc-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結(jié)合耙序列上的6個特異區(qū)域。1)第一套引物(YP0392)F3F2210ACAGTCAGGATCTGATCATCAAAGTGAAAGGTGTTGATGATCGGGAAGCCGC^-Flc262GAATTTACTGACTAATTGCGAAATTATCGTAGATTACAACTCCCTGCATTGGAABlc316GAGGATGATTACTACTGGAAAGACCTTATGGGTTGCCAAGTAGTAACCACCACB2B3369GGGTTATGAACTGGGTAAAATCATCGATATGATGGAAACCGGTTCTAACGATG4422TCATGGTCGTGAAGGCAAATCTGAAAGATGCATTCGGTATGA序列l(wèi).根據(jù)鼠疫桿菌YP0392基因設(shè)計的引物。用于引物設(shè)計的序列區(qū)域用箭頭表示，兩端的數(shù)字為對應(yīng)的YP0392的位置。2)第二套引物(YP2088)B3870CTTCCTCTTCAAAATCCAACTCAAG898序列2.根據(jù)鼠疫桿菌YP2088基因設(shè)計的引物。用于引物設(shè)計的序列區(qū)域用箭頭表示，兩端的數(shù)字為對應(yīng)的YP2088的位置。表1LAMP引物對<table>tableseeoriginaldocumentpage9</column></row><table>合成引物后，將內(nèi)引物FIP，BIP均稀釋為50uM,將外引物F3，B3稀釋為10uM，優(yōu)選在-10~-80。C下保存，更優(yōu)選在-1555。C保存，最優(yōu)選-2(TC-4(TC保存。通過LAMP預(yù)實一瞼，實—瞼結(jié)果表明，擴增產(chǎn)物主要在120-180bp間，在100-200bp間為主要產(chǎn)物，由實驗結(jié)果可知選4奪的引物對不同，對實驗菌擴增的結(jié)果不同，YP2088引物對LAMP擴增后DNA梯度條帶比YP0392細且多，但主要產(chǎn)物亮度比YP0392暗，見圖2a，肉眼觀察反應(yīng)管，陽性反應(yīng)管混濁，陰性對照未見混濁，如圖2b。本發(fā)明所述方法中，對酶濃度進行優(yōu)化，確定對于不同引物的最佳酶濃度。本發(fā)明所述的方法，確定YP0392與YP2088引物對對于BstDNA聚合酶要求的最優(yōu)值的一般性方法例如是PCR反應(yīng)管置于PCR擴增儀，63。C反應(yīng)60min，80°C4min，4'C保存；反應(yīng)產(chǎn)物于2%瓊脂糖電泳觀察結(jié)果。參考文獻中LAMP擴增反應(yīng)體系得用量進行鼠疫桿菌酶濃度條件實驗，例如，參見(TomokoHorisaka，KayokoFujita^tal,"SensitiveandSpecificDetectionofYersiniapseudotuberculosisbyLoop~MediatedIsothermal"Amplification.Journalofclinicalmicrobiology,2004,42(ll):5349-5352)實驗結(jié)果表明YP0392引物對擴增能力較強，對酶濃度無太大限制要求，酶活性單位2U以上即可出現(xiàn)擴增，6U以上擴增效果一致，選擇6U作為最優(yōu)濃度；YP2088引物對在6U開始出現(xiàn)擴增，擴增條帶不清晰，酶濃度越高，條帶越清晰，考慮到其他條件未優(yōu)化及成本問題，選擇IOU作為反應(yīng)工作濃度。圖l:靶序列上6個特異序列及引物設(shè)計；圖2a:LAMP預(yù)實驗結(jié)果B為空白對照，1、2、3孔為YP0392引物擴增結(jié)果，第4、5孔為YP2088引物擴增結(jié)果；圖2b:鼠疫耶爾森菌疫LAMP擴增渾濁度變化；上述圖2a和圖2b中，左空白對照，右陽性鼠疫菌EV76;圖3:不同Mg2+濃度LAMP檢測鼠疫菌電泳結(jié)果；圖4:不同濃度甜菜堿LAMP檢測鼠疫菌電泳結(jié)果；圖5:不同dNTPs濃度LAMP檢測鼠疫菌電泳結(jié)果；圖6:不同反應(yīng)溫度LAMP檢測鼠疫菌電泳結(jié)果；圖7a、圖7b:YP0392特異性實驗結(jié)果；圖7a所示順序依次為空白對照，鼠疫桿菌環(huán)境分離抹(+),中間耶爾森菌，克氏耶爾森菌，阿氏耶爾森菌，弗氏耶爾森菌；圖7b依次為空白對照，鼠疫疫苗林EV76,莫氏耶爾森菌，假結(jié)核耶爾森菌，小腸耶爾森菌，羅氏耶爾森菌，魯氏耶爾森菌；圖8a、圖8b、圖8c:YP2088特異性實^r結(jié)果；圖8a所示順序依次為空白對照，鼠疫桿菌環(huán)境分離林(+),中間耶爾森菌，克氏耶爾森菌，阿氏耶爾森菌，弗氏耶爾森菌，伯氏耶爾森菌；圖8b依次為空白對照，鼠疫疫苗抹EV76，莫氏耶爾森菌，假結(jié)核耶爾森菌，小腸耶爾森菌，羅氏耶爾森菌，魯氏耶爾森菌；圖8c，B:空白對照；M:DL2000DNAMarker;1:陽性對照鼠疫菌EV76;2-6:中蒙邊境陽性分離株；圖9:YP0392基因組靈敏度實-瞼結(jié)果，B:空白對照，M:DL2000DNAMarker;1:148.8ng;2:14.88pg;3:148.8pg;4:14.88pg;5:148.8fg;6:14.88fg;7:1.488fg;8:0.1488fg;圖10:YP2088基因組靈每文度實-驗結(jié)果；B:空白對照，M:DL200010DNAMarker;1:148.8ng;2:14.88pg;3:148.8pg;4:14.88pg;5:148.8fg;6:14.88fg;7:1.488fg;8:0.1488fg;圖11:YP0392細菌數(shù)靈敏度實驗結(jié)果(LAMP法)，B:空白對照，M:DL2000DNAMarker;1:20000cfu;2:2000cfu;3:200cfu;4:20cfu;5:2cfu;6:0.2cfu;圖12:YP2088細菌數(shù)靈敏度實驗結(jié)果(LAMP法)，B:空白對照，M:DL2000DNAMarker;1:20000cfu;2:2000cfu;3:200cfu;4:20cfu;5:2cfu;6:0.2cfu;圖13:不同反應(yīng)溫度LAMP檢測鼠疫菌電泳結(jié)果，B:空白對照；M:DL2000DNAMarker;1:53°C;2:55°C;3:60°C;4:63°C;5:65°C;6:68°C。具體實施例方式實施例l:YP0392內(nèi)外引物對的比例條件優(yōu)化實驗LAMP的大多數(shù)產(chǎn)物由FIP和BIP擴增，內(nèi)引物在引導(dǎo)DNA的反應(yīng)過程中起著重要作用，而外引物主要在環(huán)狀結(jié)構(gòu)DNA的形成起作用，內(nèi)引物對反應(yīng)的影響更大，固定外引物的量(0.2uM)，選擇外引物內(nèi)引物在k2-1:12的范圍內(nèi)進行條件優(yōu)化；具體內(nèi)外引物比例條件優(yōu)化反應(yīng)體系見表2，內(nèi)外引物比例用量見表3。表2YP0392內(nèi)外引物比例條件優(yōu)化反應(yīng)體系試劑總量(ul)超純水70.810x緩沖液20甜菜堿402.5mMdNTPs20F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶6總量164.8表3.YP0392內(nèi)外引物比例條件優(yōu)化內(nèi)引物用量表<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果YP0392引物對在1:2即可出現(xiàn)擴增，內(nèi)引物濃度過高抑制擴增反應(yīng)，外引物內(nèi)引物在1:8開始擴增強度開始減弱，因此，優(yōu)選外引物內(nèi)引物=1:2-1:10，優(yōu)選l:4-1:8，更優(yōu)選l:5-1:7，最優(yōu)選l:6，1:6.5。實施例2:YP2088內(nèi)外引物對的比例M優(yōu)化實驗使用酶濃度條件優(yōu)化后的值再進行YP2088內(nèi)外引物對比例條件實驗，內(nèi)外引物比例條件優(yōu)化反應(yīng)體系見表4，內(nèi)外引物比例用量同表3。表4.YP2088內(nèi)外引物比例條件優(yōu)化反應(yīng)體系<table>tableseeoriginaldocumentpage12</column></row><table>結(jié)果YP2088引物對在1:6開始出現(xiàn)擴增條帶，優(yōu)選外引物內(nèi)引物的比例范圍為l:6-1:10,更優(yōu)選l:7-1:9，最優(yōu)選1:8，1:8.5，1:8.8。實施例3:YP0392的Mg2+條件優(yōu)化實驗BstDM聚合酵酉己送的1xThermo1緩沖液含有2mMMg2+,為了保證反應(yīng)的有效性，增強實驗的靈敏度，選擇Mg2+濃度在2mM-10mM(空白B，2mM，4Mm，5mM，6mM,8mM，10mM)進行單因素條件實驗，反應(yīng)操作1.2.7.1,反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管15ul,注明標(biāo)號，反應(yīng)體系用量見表5，Mg2+加樣量見表6。表5.YP0392Mg2+條件實驗反應(yīng)體系用量<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>表6JVIgh條件實驗反應(yīng)Mgh用量表<table>tableseeoriginaldocumentpage13</column></row><table>實施例4、YP2088的Mg2+^Hf實驗選擇Mg2+濃度在2mM-lOmM(空白B,2mM，4Mm，5mM，6mM,8mM，lOmM)進行單因素條件實驗，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管15ul，注明標(biāo)號，反應(yīng)體系用量見表7，Mg2+加樣量同表6。表7.YP2088Mgh條件實驗反應(yīng)體系用量試劑名總量(ul)超純水9.210x緩沖液20甜菜堿402.5mMdNTPs20FIP引物6.4BIP引物6.4F3引物4B3引物4Bst,聚合酶10總量120結(jié)果Mg^作為BstDNA聚合酶的輔酶，對聚合酶的活性有著重要作用，緩沖液中Mg2+濃度為2mM，選擇2mmol/L10mmol/L進行LAMP擴增，結(jié)果見圖3，4mmol/LMg^擴增效果最佳。實施例5:YP0392的甜菜堿對比實驗YP0392甜菜堿對比實驗甜菜堿有穩(wěn)定DNA的作用，LAMP反應(yīng)涉及復(fù)雜的呈環(huán)過程，甜菜堿理論上有增強反應(yīng)強度的作用，但也做過對比試驗甜菜堿的加入不能很好的進行LAMP反應(yīng)，因此先進行甜菜堿對比實驗，再針對結(jié)果考慮進行甜菜堿單因素條件優(yōu)化的必要性。將鼠疫菌疫苗林EV76染色體DNA分別稀釋至1(T1，10—2,實驗分加入甜菜堿組(100，10匿1，10—2，Bl)，不加甜菜堿組(100，10-1,l(T2，B2)與空白對照，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管23ul。實施例6、甜菜堿條件優(yōu)化實驗選擇甜菜堿終濃度在0.2M-1.2M(B，0.2M,0.4M，0.6M,0.8M，1.0M,1.2M)范圍內(nèi)進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管23ul，反應(yīng)體系用量見表8。14表8.YP0392甜菜堿條件優(yōu)化反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水49.210xbuffer202.5函NTPs20Mg2+16FIP引物6.4BIP引物6.4F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶10總量136結(jié)果加入不同濃度甜菜堿，確定反應(yīng)最優(yōu)條件。實驗結(jié)果如圖4。兩引物對在甜菜堿濃度0.2M-1.2M均出現(xiàn)梯度擴增，YP2088在0.6M開始擴增亮度基本一致。實施例7:dNTPs濃度單因素優(yōu)化實驗1)YP0392dNTPs濃度單因素優(yōu)化實驗選擇dNTPs濃度在lOOuM-600uM(反應(yīng)管分別為空白B，100uM，200uM，300uM，400uM，500uM，600uM)進行單因素條件實驗，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管23ul，反應(yīng)體系用量見表9，dNTPs加樣量見表IO。表9.YP0392dNTPs濃度條件優(yōu)化反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水54.410xbuffer.20甜菜石成32Mg2+8FIP引物4.8BIP引物4.8F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶6總量13615表10.YPG392dNTPs條件優(yōu)化dNTPs加才羊量B123456dNTPs(ul)終濃度(uM)—110022003300440055006600ddH20(ul)654321—2)YP0288dNTPs濃度單因素優(yōu)化實驗選擇dNTPs濃度在100uM-600uM(反應(yīng)管分別為空白B，lOOuM，200uM,300uM,400uM,500uM,600uM)進行單因素條件實驗，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管23ul，反應(yīng)體系用量見表ll，dNTPs加樣量同表10。表11.YP2088dNTPs濃度條件優(yōu)化反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水45.210xbuffer20甜菜械24Mg2+16FIP引物6.4BIP引物6.4F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶10總量136結(jié)果dNTPs作為核酸反應(yīng)擴增的原料，濃度過低將降低反應(yīng)的靈敏度，出現(xiàn)假陰性，濃度過高將抑制反應(yīng)的進行或出現(xiàn)非特異擴增，在dNTPs濃度為100uM-600uM濃度范圍進行LAMP擴增，YP0392實驗結(jié)果見圖11,YP2088實驗結(jié)果見圖5;YP0392引物對在dNTPs濃度為lOOuM-500uM濃度間出現(xiàn)梯度擴增，400uM處條帶最清晰，YP2088引物對在dNTPs濃度為lOOuM-400uM濃度間出現(xiàn)梯度擴增，400uM條帶最清晰。實施例8、反應(yīng)溫度單因素優(yōu)化實驗1)YP0392反應(yīng)溫度單因素優(yōu)化實驗選擇在53。C-68°C(反應(yīng)管分別為空白B,53°C，55°C，58°C,60°C，63°C,68°C)進行單因素條件實驗，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管23ul，反應(yīng)體系用量見表12。表12.YP0932反應(yīng)溫度單因素優(yōu)化反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水68.410xbuffer20甜菜堿322.5mMdNTPs32Mg2+8FIP引物4.8BIP引物4.8F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶6總量1842)YP2088反應(yīng)溫度條件優(yōu)化實驗選擇在53°C-68°C(反應(yīng)管分別為空白B，53。C，55°C，58°C，60°C，63°C，68°C)進行單因素條件實驗，反應(yīng)體系配制好后進行分裝，每管23ul，反應(yīng)體系用量見表13。表13.YP2088反應(yīng)溫度單因素優(yōu)化反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水61.210xbuffer20甜菜堿242.5薩NTPs32Mg2+16FIP引物6.4BIP引物6.417F3引物4B3引物4BstDNA聚合酶10結(jié)果BstDNA聚合酶在80。C幾分鐘即可失活，且反應(yīng)不宜在高于70。C下進行，LAMP反應(yīng)在60°C-65。C均可反應(yīng)，在53。C-68。C范圍進行LAMP擴增，確定反應(yīng)最優(yōu)溫度，YP0392實驗結(jié)果見圖13，YP2088實驗結(jié)果見圖6，YP0392引物對在53-65。C均有擴增，58-63。C擴增強最高，YP2088引物對在60-65。C出現(xiàn)擴增條帶，63。C條帶最清晰。兩引物對均選擇63。C作為反應(yīng)最佳溫度。實施例9、特異性實驗用優(yōu)化結(jié)果分別檢測YP0392,YP2088引物對LAMP反應(yīng)的特異性，選擇耶爾森菌屬不同菌基因組DNA進行LAMP反應(yīng)，特異性實驗所用菌林共18抹(包括7林鼠疫耶爾森菌環(huán)境陽性分離抹，鼠疫桿菌疫苗抹EV76,假結(jié)核耶爾森菌，中間耶爾森菌，弗氏耶爾森菌，阿氏耶爾森菌，羅氏耶爾森菌，伯氏耶爾森菌，克氏耶爾森菌，魯氏耶爾森菌，莫氏耶爾森菌，小腸結(jié)腸炎耶爾森菌)；YP0392反應(yīng)體系用量如表14，YP2088反應(yīng)體系用量如表15。表14.YP0392特異性實驗反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水205.210xbuffer60甜菜械962.5mMdNTPs96Mg2+24FIP引物14.4BIP引物14.4F3引物12B3引物12BstDNA聚合酶18總量55218表15.YP2088特異性實驗反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水159.610xbuffer60甜菜石咸962.5mMdNTPs96Mg2+48FIP引物19.2BIP引物19.2F3引物12B3引物12Bst腿聚合酶30總量552結(jié)果使用建立的LAMP反應(yīng)體系進行特異性反應(yīng)，選擇耶爾森菌屬不同菌基因組DNA進行LAMP擴增，YP0392引物對實—瞼結(jié)果見圖7a，7b;YP2088引物對實驗結(jié)果見圖8a,8b,8c。YP0392引物對特異性不好，只能分辨一部分耶爾森菌屬細菌，YP0392引物對可用于LAMP分辨耶爾森菌屬；YP2088引物對特異性很好，無非特異性擴增。實施例10、方法靈敏度實驗為了檢驗LAMP反應(yīng)的靈敏性和LAMP反應(yīng)用于檢測所需要的最低模板量，對基因組DNA、細菌純培養(yǎng)物進行LAMP反應(yīng)，同時以外引物F3，B3作為常規(guī)PCR引物，對兩者結(jié)果進行比較分析。1)基因組DNA靈敏度實驗將鼠疫桿菌EV76基因組DNA10倍稀釋為10—^10—7，按兩套引物對各自反應(yīng)體系的優(yōu)化結(jié)果進行基因組DNA靈敏度實驗，鼠疫桿菌EV76基因組DNA原濃度經(jīng)ND法測定為74.4ng/ul，反應(yīng)操作同1.2.7.1，YP0392引物對基因組DNA靈萄文度實驗反應(yīng)體系量見表16，YP2088見表17,體系配制后分裝10管，每管23ul，模板DNA加入量2ul。2)細菌純培養(yǎng)物靈敏度實驗經(jīng)平板計數(shù)，原始菌液濃度為6.8xl09cfu/ml,將原液稀釋至lxl08cfu/ml。IO倍倍比稀釋菌液至10—1-1(T8進行LAMP檢測，反應(yīng)操作同1.2.7.1，YP0392引物對基因組DNA靈敏度實驗反應(yīng)體系量同表16，YP2088同表17,體系配制后分裝10管，每管23ul,模板DNA加入量為2ul。表16.YP0392基因組靈敏度實驗反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水85.510xbuffer25甜菜堿402.5mMdNTPs40Mg2+10FIP引物6BIP引物6F3引物5B3引物5Bst飄聚合酶7.5總量2308基因組靈敏度實驗反應(yīng)體系試劑名總量(ul)超純水72.510xbuffer25甜菜堿402.5mMdNTPs40Mg2+16FIP引物8BIP引物8F3引物4B3引物4Bst腿聚合酶12.5總量230結(jié)果1)基因組DNA靈敏度為檢測LAMP技術(shù)靈敏度，將鼠疫桿菌疫苗抹EV76DNA10倍稀釋至l(T1-10—7，取2ul上清液作為模板進行LAMP擴增進行LAMP反應(yīng)，反應(yīng)產(chǎn)物5ul進行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，YP0392引物實驗結(jié)果如圖9，YP2088引物實驗結(jié)果如圖10，鼠疫桿菌基因組DNA原液濃度74.4ng/ul。結(jié)果顯示YP0392引物出現(xiàn)實驗室污染，全部出現(xiàn)擴增條帶，查找污染原因；YP2088引物對空白對照沒有非特異擴增，電泳孔道1-4號出現(xiàn)擴增條帶，靈敏度達10—3,即148pg/tube。2)細菌培養(yǎng)物L(fēng)AMP靈敏度實驗將培養(yǎng)經(jīng)過計數(shù)調(diào)整為lxl07cfu/ml菌液，用煮沸法提:f又DNA然后依次稀釋至10—1-l(T，取2ul上清液作為模板進行LAMP擴增，反應(yīng)產(chǎn)物5ul進行2%瓊脂糖凝膠電泳4企測，IIOV，40min,電泳結(jié)果經(jīng)過凝膠成像系統(tǒng)處理后，YP0392引物實驗結(jié)果如圖11,YP2088引物實驗結(jié)果如圖12。結(jié)果顯示YP0392引物對出現(xiàn)污染現(xiàn)象，空白與第7號電泳管道沒有擴增條帶，其余均出現(xiàn)擴增條帶，YP2088引物對在1-3號電泳管道均出現(xiàn)擴增條帶，LAMP最低檢測值為105,經(jīng)平板計數(shù)可知，最低才企測量200cfu/tube。對染色體基因組DNA檢測限為14.88pg/tube,細菌純培養(yǎng)物為200cfu/tube,靈敏度較高，與常規(guī)PCR相當(dāng)，但略低于文獻[l]報道的10fg/tube和100cfu/tube，可能是文獻采用質(zhì)粒上的毒力基因的拷貝數(shù)比染色體高。LAMP技術(shù)可用于檢測土壤樣品的鼠疫菌，而常規(guī)PCR不能檢出。檢測靈敏度較低，可能是試劑盒提取率低，或土壤中含有干擾成分抑制核S吏擴增反應(yīng)。徐菲莉，孫石，趙飛.PCR檢測鼠疫pla基因的敏感性及特異性試驗.地方學(xué)通報，1998，13(1):18-20.(LAMP特異性與常規(guī)PCR一致)權(quán)利要求1、一種測定鼠疫桿菌的新方法，其中包括(1)鼠疫桿菌疫苗株EV76DNA的提取；(2)LAMP引物設(shè)計和合成，其中LAMP引物包括兩個外引物和兩個內(nèi)引物，內(nèi)引物FIP(上端內(nèi)引物)包含F(xiàn)1c序列和F2(F2c區(qū)域的互補序列)，即5，-F1c-F2；內(nèi)引物BIP(下端內(nèi)引物)包含B1c(B1區(qū)域的互補序列)和B2序列，即5，-B1c-B2。外引物為F3和B3序列，能特異結(jié)合靶序列上的6個特異區(qū)域；(3)在所選酶濃度、Mg2+條件、dNTPs濃度、反應(yīng)溫度條件下進行反應(yīng)。2、權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述引物設(shè)計為下列引物YP0392159TCCAGCAGGCGGGTAAGTGGCAGCATGTyGAGTTGGAAGACTGGAAG;GCCF3F2210ACAGTCAGGATCTGATCATCAAAGTGAA^GGTGTTGATGATCGGGAAGCCGCFlc262GAATTTACTGACTAATTGCGAAATTATCGTAGATTACAACTCCCTGCATTGGAABlc316GAGGATGATTACTACTGGAAAGACCTTATGGGTTGCCAAGTAGTAACCACCACB2B3369GGGTTATGAACTGGGTAAAATCATCGATATGATGGAAACCGGTTCTAACGATG4422TCATGGTCGTGAAGGCAAATCTGAAAGATGCATTCGGTATGA序列l(wèi).根據(jù)鼠疫桿菌YP0392基因設(shè)計的引物，用于引物設(shè)計的序列區(qū)域用箭頭表示，兩端的數(shù)字為對應(yīng)的YP0392的位置。3、權(quán)利要求l所述的方法，其中，所述引物設(shè)計為下列引物YP2088FlcBlc758AGCGCGGTAGTGACGATAATGTCTACTTCTGCGGCTTGCGCAGCAAACAGTTCCATB3870CTTCCTCTTCAAAATCCAACTCAAG898序列2.根據(jù)鼠疫桿菌YP2088基因設(shè)計的引物，用于引物設(shè)計的序列區(qū)域用箭頭表示，兩端的數(shù)字為對應(yīng)的YP2088的位置。4、權(quán)利要求l所述的方法，其中，對于YP0392引物，外引物內(nèi)引物=1:2-1:10。5、權(quán)利要求4所述的方法，其中，外引物內(nèi)引物=1:4-1:8。6、權(quán)利要求4所述的方法，其中，外引物內(nèi)引物=1:5-1:7。7、權(quán)利要求4所述的方法，其中，外引物內(nèi)引物=1:6。8、權(quán)利要求l所述的方法，其中，對于YP2088引物，外引物內(nèi)引物=比例范圍為1:6-1:10。9、權(quán)利要求8所述的方法，其中外引物內(nèi)引物=1:7-1:9。10、權(quán)利要求8所述的方法，其中，外引物內(nèi)引物=最優(yōu)選1:8。全文摘要本發(fā)明涉及一種新的檢測鼠疫桿菌的方法，其中采用環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)。本發(fā)明對環(huán)介導(dǎo)等溫擴增方法進行了實質(zhì)性改進，提高了檢測特異性和靈敏度。文檔編號C12Q1/68GK101665832SQ20091009003公開日2010年3月10日申請日期2009年7月29日優(yōu)先權(quán)日2009年7月29日發(fā)明者姚李四,孫肖紅,張曉龍,文海燕,宇楊,靜王,龍冬伶申請人:中國檢驗檢疫科學(xué)研究院