鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子的發(fā)現(xiàn)，特別是涉 及鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 鼠疫是由鼠疫耶爾森菌（Yersinia pestis，簡稱鼠疫菌）引起的一種自然疫源性 疾病。主要通過蚤類為傳播媒介在嚙齒動物間傳播，偶爾會通過帶菌跳蚤叮咬或接觸病畜 侵入人體，引發(fā)腺鼠疫、肺鼠疫和敗血癥型鼠疫。鼠疫發(fā)病急、傳播快和病死率高。歷史上曾 發(fā)生過3次鼠疫的世界性大流行，至少造成一億六千萬人死亡。自1980至1999年間，在內(nèi) 蒙古、云南、西藏、甘肅、青海、新疆和四川等西部7個省區(qū)發(fā)生了人間鼠疫473例，死亡104 例。自上世紀90年代以來，鼠疫的發(fā)病呈上升趨勢，2000年是近年來我國發(fā)生人間鼠疫最 多的一年，共213例。2009年，青海再次爆發(fā)人間鼠疫，導致3人死亡。2000年被WHO列為 重新抬頭的傳染病（Reemerging disease)。此外鼠疫菌是標準的細菌性生物戰(zhàn)劑，如湖南 常德曾遭受日軍的細菌戰(zhàn)，還可用于生物恐怖。因此對鼠疫病原體及致病機制進行深入研 究，對國家的經(jīng)濟發(fā)展、人民健康和社會安全有著深遠的影響。
[0003] 在鼠疫菌致病過程中，有多種機制能幫助鼠疫菌完成蚤體內(nèi)生存、形成菌栓、在宿 主體內(nèi)粘附、侵襲、抗吞噬以及宿主細胞毒性等功能。鼠疫菌為胞內(nèi)致病菌，鼠疫菌在感染 早期主要在巨噬細胞中繁殖，而后期以胞外生存為主，因此鼠疫菌需要各種毒力因子抵御 細胞內(nèi)與細胞外宿主免疫清除機制的作用以維持其在宿主體內(nèi)的生存。目前已知的毒力因 子由鼠疫菌染色體或質(zhì)粒編碼產(chǎn)生。染色體編碼的毒力因子包括：pgm位點（血紅素貯存系 統(tǒng)和耶氏桿菌素系統(tǒng)）、PH6抗原（PsaA基因編碼）、脂多糖、Phop/Q二元調(diào)控系統(tǒng)、鐵調(diào)節(jié) 攝取系統(tǒng)（Yfe操縱子）、壓力反應(yīng)蛋白（HtrA)、過氧化氫酶活性、侵襲素和黏附素等。此外 染色體外的三種質(zhì)粒也能編碼產(chǎn)生毒力因子：如P⑶1質(zhì)粒編碼的T3SS (III型分泌系統(tǒng)）， 由4個成簇基因構(gòu)成的操縱子和效應(yīng)蛋白及其伴侶分子構(gòu)成。該系統(tǒng)通過改變宿主細胞骨 架結(jié)構(gòu)、抵抗吞噬作用、干擾信號轉(zhuǎn)導通路，從而抑制宿主正常的免疫反應(yīng)。PPCP1質(zhì)粒編碼 血漿酶原激活因子（Pla蛋白酶），pMTl質(zhì)粒編碼F1莢膜蛋白和鼠毒素。此外，細菌的抗酸 性跟毒力密切相關(guān)，也是其賴以生存的重要機制。在巨噬細胞內(nèi)生存和繁殖是鼠疫菌感染 機體早期的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。而巨噬細胞的吞噬溶酶體的pH在5. 0左右酸性環(huán)境，面對巨噬細胞 內(nèi)的酸性選擇壓力，鼠疫菌需進化多種抗酸機制才能更好的生存和繁殖。然而，目前對鼠疫 菌抗酸性研究鮮有報道。
[0004] 目前認為巨噬細胞內(nèi)存活與繁殖獲得致病能力是鼠疫菌得以最終致病的關(guān)鍵階 段。鼠疫菌感染機體早期能在巨噬細胞內(nèi)存活并繁殖，不可避免地遭遇巨噬細胞內(nèi)多個環(huán) 境信號（如酸、過氧化物、高滲透壓、多種溶酶體和多種抗菌肽等）的協(xié)同刺激，鼠疫菌能感 應(yīng)這種復雜的信號刺激并自我調(diào)節(jié)，合成一系列毒力因子主動攻擊宿主或?qū)λ拗骶哂卸拘?以實現(xiàn)其在宿主體內(nèi)的繁殖和擴散，最終使鼠疫菌適應(yīng)環(huán)境得以存活。從分子水平來說，病 原菌從感應(yīng)信號刺激到表達毒力因子，是個緊密調(diào)控的過程，其中，毒力調(diào)控子在轉(zhuǎn)錄水平 上的調(diào)控至關(guān)重要。目前鼠疫C092和91001等菌株已完成全基因組測序，這為鼠疫菌的毒 力調(diào)控研究提供了非常有用的信息；而基因組學和蛋白質(zhì)組學技術(shù)則為毒力調(diào)控提供了新 的技術(shù)手段。2004年，F(xiàn)lashner等通過信號標簽突變技術(shù)篩選出參與鼠疫菌毒力調(diào)控的轉(zhuǎn) 錄調(diào)控子（LcrF)和一些毒力因子。但是，目前有關(guān)鼠疫菌的毒力調(diào)控機制研究主要集中一 些重要的毒力調(diào)控子上（包括？^1〇?/?11〇0、〇^、？111'、1?(^4、(^71?、2111'、1^沖等）。因此發(fā)現(xiàn) 毒力調(diào)控子及進行研究，對闡明鼠疫菌的致病機制具有重要的作用。
[0005] TyrR作為一種大腸埃希菌芳香族氨基酸合成代謝中的全局性調(diào)控蛋白質(zhì)，包括N 末端、中央?yún)^(qū)和C末端等三個功能區(qū)。N末端含有配體結(jié)合區(qū)域ACT、PAS和DM(二聚體化基 序）3個區(qū)，主要參與芳香族氨基酸代謝基因的轉(zhuǎn)錄激活；中央?yún)^(qū)主要參與對基因轉(zhuǎn)錄的抑 制；C末端含DM和HTH (helix-turn-helix)基序。TyrR控制著包括自身編碼基因tyrR 在內(nèi)，涉及苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸合成與運輸?shù)?個轉(zhuǎn)錄單元的轉(zhuǎn)錄。這些轉(zhuǎn)錄單元的 共同特征是在其轉(zhuǎn)錄調(diào)控區(qū)內(nèi)存在數(shù)量為1~3個不等的，保守結(jié)構(gòu)為TGTAAAN6TTTACA的 22bp莖環(huán)結(jié)構(gòu)，稱為TyrR盒。當TyrR蛋白與轉(zhuǎn)錄單元的TyrR盒結(jié)合，可實現(xiàn)對8個轉(zhuǎn)錄 單元調(diào)控?？傊?，TyrR作為一個很典型的調(diào)控子，其調(diào)控受到ATP、TyrR蛋白類型和濃度、 TyrR盒的組成和位置及芳香族氨基酸種類等的影響，可參與對芳香族氨基酸代謝基因轉(zhuǎn)錄 激活或抑制的調(diào)控，國內(nèi)外尚未見TyrR調(diào)控毒力的報道。
[0006]目前對鼠疫菌基因表達調(diào)控的認識，還僅限于部分特定環(huán)境調(diào)控的毒力因子，對 鼠疫菌致病性的認識還不全面，因此尋找新的毒力調(diào)控因子有助于了解鼠疫菌的致病機 制，為制備鼠疫菌減毒活疫苗和藥物治療靶點提供基礎(chǔ)。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR及其應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明在工作中發(fā)現(xiàn)鼠疫耶爾森菌47kb大片段缺失后毒力較野生株降低約10萬 倍，并產(chǎn)生高滴度的F1抗體及免疫保護效果好。通過采取分段敲除并結(jié)合LD 5(I試驗，發(fā)現(xiàn) 鼠疫耶爾森菌A tyrR缺失株毒力較野生株下降近萬倍，通過構(gòu)建A tyrR突變株的互補株 后發(fā)現(xiàn)毒力恢復，最終確認TyrR調(diào)控子基因敲除是導致47kb大片段減毒最主要的原因。
[0009] 本發(fā)明提供了鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR，其核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0010] 本發(fā)明還提供了鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR的氨基酸序列，如SEQ ID NO. 2所 /_J、i〇
[0011] 本發(fā)明提供了含有鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR的載體或表達盒。
[0012] 本發(fā)明提供了鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR在調(diào)控鼠疫耶爾森菌毒力中的用 途。
[0013] 本發(fā)明提供了鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR在制備鼠疫疫苗中的應(yīng)用。
[0014] 本發(fā)明提供了鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR在制備以TyrR為靶標的藥物中的應(yīng) 用。
[0015] 本發(fā)明還提供了一種TyrR基因缺失或突變的鼠疫疫苗，所述TyrR基因的核苷酸 序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明提供的鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR在調(diào)控鼠疫菌毒力中的用途， 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠合理預(yù)期，一種針對鼠疫耶爾森菌毒力調(diào)控子TyrR的單克隆抗體也 屬于本申請的保護范圍，該單克隆抗體對應(yīng)的抗原表位含有SEQ ID NO. 2所示的氨基酸序 列。
[0017] 因此，分泌上述單克隆抗體的雜交瘤細胞株也屬于本發(fā)明的保護范圍。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種檢測試劑盒，其含有對應(yīng)的抗原表位含有SEQ IDN0. 2所示 的氨基酸序列的單克隆抗體。
[0019] 鼠疫菌毒力調(diào)控和致病機制研究，是目前研究的熱點領(lǐng)域。TyrR作為一個全局性 的轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白，在大腸埃希菌中僅調(diào)控芳香族氨基酸代謝，但在鼠疫菌中功能不明。本發(fā) 明發(fā)現(xiàn)鼠疫菌A tyrR缺失株毒力較野生株下降近萬倍，通過構(gòu)建A tyrR突變株的互補株 后發(fā)現(xiàn)毒力恢復，最終確認TyrR調(diào)控子基因敲除是導致47kb大片段減毒最主要的原因。 RNA-seq和Real-time PCR證實鼠疫菌TyrR能調(diào)控8個基因，其中包括負調(diào)控五個芳香簇 氨基酸代謝基因（aroF-tyrA，aroP，aroL和tyrP)的轉(zhuǎn)錄及正調(diào)控2個酸應(yīng)答基因（hdeB 和hdeD)。綜上所述，既然TyrR影響鼠疫菌毒力又能調(diào)控芳香族氨基酸代謝及抗酸基因的 轉(zhuǎn)錄，因此TyrR是鼠疫菌的一個毒力調(diào)控子。
[0020] 此外TyrR基因缺失后在體外不影響鼠疫菌生長，而在小鼠體內(nèi)鼠疫菌A tyrR和 野生株競爭試驗表明：在小鼠感染48h或72h后，在肝臟或脾臟中鼠疫野生株201載菌量達 到 107CFU，而A tyrR突變株在肝脾中的載菌量較少，生存能力較野生株顯著減少并導致毒 力明顯下降，進一步證實TyrR是鼠疫菌在體內(nèi)生存和感染所必需的調(diào)控子。
[0021] 抗酸性是鼠疫菌重要的毒力相關(guān)表型。在極酸環(huán)境（pH5. 0左右），A tyrR突變株 生存率和生長速度較野生株降低，此外TyrR能下調(diào)抗酸基因hdeD和hdeB的表達。以上結(jié) 果說明A tyrR突變株抗酸能力下降，影響鼠疫菌的存活和生長，證實了 TyrR調(diào)控子能調(diào)控 細菌的抗酸性。
[0022] 總之，本發(fā)明發(fā)現(xiàn)TyrR是一種毒力調(diào)控子，并從轉(zhuǎn)錄水平驗證TyrR作用的靶基 因，結(jié)合表型和分子生物學技術(shù)，初步研究TyrR調(diào)控關(guān)鍵毒力（如抗酸性等）分子機制，這 對闡明鼠疫菌的致病機制具有十分重要的意義，并為鼠疫菌減毒活疫苗的研制和抗菌藥物 作用靶點提供依據(jù)。
【附圖說明】
[0023] 圖1為鼠疫菌47kb大片段缺失的PCR鑒定電泳圖，其中1為47kb缺失的鼠疫株； 2為陽性對照（鼠疫野生201株）；3為陰性對照（不加模板DNA)。圖中，tnp_20外側(cè)鑒定 引物rstA鑒定為陽性，tnp_22內(nèi)側(cè)鑒定引物rhsAl、dalD、tpx和pspA均為陰性，說明47kb 大片段缺失。
[0024] 圖2為鼠疫菌缺失株和EV76活疫苗的F1抗體滴度測定示意圖。F1抗原為鼠疫一 種重要保護性抗原，測其抗體可測定體液免疫的效果，EV76活疫苗為標準的鼠疫減毒活疫 苗，47kb缺失株為鼠疫菌201株47kb缺失株。
[0025] 圖3為鼠疫菌缺失株和EV76活疫苗的免疫保護效果測定示意圖。其中A圖為滴 鼻感染的保護效果；B圖為皮下感染的保護效果。
[0026] 圖4為47kb大片段分段敲除示意圖。
[0027] 圖5為47kb分段敲除株、tyrR敲除及回補株構(gòu)建的PCR鑒定示意圖，圖中" + "為陽 性對照（鼠疫野生201株為陰性對照，是不加模板DNA的試劑對照。其中：A圖為47-2 敲除鑒定電泳圖，其中hrpA(l-3) :1為A 47-2, 2為陽性對照，3為陰性對照；dalD(4-6) :4 為A 47-2, 5為陽性對照，6為陰性對照；IdhA(7-9) :7為A 47-2, 8為陽性對照，9為陰性對 照；hrpA是47-2外側(cè)鑒定引物，dalD和IdhA 1是內(nèi)側(cè)鑒定引物，PCR鑒定為陽性，說明47-2 局支除成功。
[0028] B圖為47-3敲除鑒定電泳圖，其中IdhA 1 (1-3) : 1為A 47-3, 2為陽性對照，3為陰 性對照；tyrR(4-6) :4為A 47-3,5為陽性對照，6為陰性對照；nifj(7_9) :7為A 47-3, 8為 陽性對照，9為陰性對照；IdhAl是47-3外側(cè)鑒定引物，PCR鑒定為陽性，tyrR和nif J是內(nèi) 側(cè)鑒定引物，PCR鑒定為陰性，說明47-3敲除成功。
[0029] C圖為47_3a敲除鑒定電泳圖，其中l(wèi)-4:A47_3a敲除株。" + "為陽性對照， 為陰性對照。hslj和YP_2127是47-3a外側(cè)鑒定引物，PCR鑒定為陽性。nifj和aesS2是 內(nèi)側(cè)鑒定引物，PCR鑒定為陰性，說明47-3a敲除成功。
[0030] D圖為47-3b敲除鑒定電泳圖，其中1-4為A 47-3b敲除株；" + "為陽性對照， 為陰性對照