專利名稱：一種耐高濃度乙酸的釀酒酵母菌株及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及酒精發(fā)酵，特別涉及一種耐高濃度乙酸的釀酒酵母菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
酵母菌是發(fā)酵工業(yè)中非常重要的微生物細胞工廠，其應(yīng)用涉及到食品(如白酒、 啤酒、其他果酒、面包等)、生物化工產(chǎn)品(乙醇、谷胱甘肽、麥角甾醇等)、疫苗 等蛋白質(zhì)藥物、工業(yè)用酶制劑等多個產(chǎn)業(yè)中。在這些生物轉(zhuǎn)化過程中，酵母細胞會受 到不同程度的環(huán)境脅迫，其中由于原料預處理或代謝副產(chǎn)物-乙酸引起的酸脅迫使酵 母菌的生長和代謝活性受到抑制，導致發(fā)酵速度和產(chǎn)率降低。改良酵母細胞的酸脅迫 耐受性對提高上述發(fā)酵過程的發(fā)酵效率，降低生產(chǎn)成本有重要意義。
當前，由于石油、天然氣和煤炭等化石能源用量的急增，能源緊缺已成為世界性 問題，能源多元化發(fā)展和加快可再生能源開發(fā)已成為世界各國的研發(fā)重點。以燃料乙 醇等替代能源為代表的能源供應(yīng)多元化戰(zhàn)略已成為我國能源政策的重要方向。近年 來，以淀粉質(zhì)或糖質(zhì)為原料生產(chǎn)燃料乙醇發(fā)展迅速， 一定程度緩解了能源緊缺，但卻 引發(fā)了糧食安全問題。木質(zhì)纖維素是十分豐富而廉價的生物質(zhì)原料，可以被降解為可 發(fā)酵性糖，用于燃料乙醇的生產(chǎn)。大力發(fā)展生物質(zhì)燃料乙醇作為可再生能源，有助于 緩解石油資源短缺，改善大氣環(huán)境等問題，在穩(wěn)定糧食生產(chǎn)，促進農(nóng)業(yè)生產(chǎn)與消費的 良性循環(huán)和可持續(xù)發(fā)展等方面具有積極作用。
釀酒酵母是以糖質(zhì)和淀粉質(zhì)為原料的乙醇發(fā)酵最經(jīng)典的菌株。由于其對工業(yè)化生 產(chǎn)條件具有較高的適應(yīng)性，對多種抑制因子和高滲透壓具有一定耐受性，而且乙醇產(chǎn)
量也具有競爭性，因此在發(fā)酵木質(zhì)纖維素水解物生產(chǎn)乙醇方面也具有明顯的優(yōu)勢。而 且利用釀酒酵母發(fā)酵纖維素水解物生產(chǎn)乙醇可以很好地與以甘蔗糖和淀粉為底物的 乙醇發(fā)酵工藝整合起來，降低纖維素乙醇的成本。但在降解木質(zhì)纖維素為可發(fā)酵糖的 過程中，以及微生物發(fā)酵過程中均會產(chǎn)生許多抑制微生物生長和發(fā)酵的物質(zhì)，嚴重影
響乙醇的產(chǎn)率，其中乙酸在木質(zhì)纖維素水解物中最高含量可達0.5%，它能延長酵母菌 的延滯期，降低酵母菌的生長和發(fā)酵速度，導致發(fā)酵周期的延長和乙醇產(chǎn)量的降低。 提高酵母細胞的酸耐受性，使其在脅迫條件下具有良好的發(fā)酵性能是酵母菌成功應(yīng)用 于纖維素乙醇生產(chǎn)的必須條件。最終實現(xiàn)纖維素乙醇生產(chǎn)中酵母發(fā)酵層面的低能耗、 低消耗、低成本和乙醇高產(chǎn)率，產(chǎn)生巨大經(jīng)濟效益的同時，也帶來良好的社會效益。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種釀酒酵母菌株。
本發(fā)明提f共的釀酒酵母(6^cc/ 3/YM7yces cereK/w'ae) R8-10-2已于2009年8 月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址 為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCCW.3226。
菌株R8-10-2具有典型的釀酒酵母形態(tài)特征細胞為橢圓形，多邊芽殖。菌落凸 起、光滑、乳白色、邊緣整齊。最適生長溫度3(TC， pH為5.0。
該菌株具有典型的釀酒酵母生理生化特征，能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海 藻糖，緩慢發(fā)酵棉子糖；不能發(fā)酵半乳糖、乳糖、纖維二糖、蜜二糖和淀粉等。
本發(fā)明的另一 目的在于提供釀酒酵母R8-10-2在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種生產(chǎn)乙醇的方法，是將上述的釀酒酵母R8-10-2 置于發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵培養(yǎng)得到乙醇。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基包括有機物，所述有機物是玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、 甘薯淀粉糖化液和糖蜜中的至少一種。
上述每升發(fā)酵培養(yǎng)基是由如下物質(zhì)組成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g尿 素，0.5-lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為100 — 300g的 玉米淀粉糖化液，其余為水。
上述每升發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選是由如下物質(zhì)組成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素， lg磷酸二氫鉀，1. 5g七水硫酸鎂，0. 5g氯化鈣，總還原糖為200g的玉米淀粉糖化液， 其余為水。
上述發(fā)酵培養(yǎng)基的pH自然。
上述發(fā)酵培養(yǎng)的條件是在30 — 37。C條件下、培養(yǎng)30_36小時，溶氧控制在0-0.5 mg/L。
本發(fā)明的又一目的在于提供一種用于發(fā)酵上述的釀酒酵母R8-10-2的培養(yǎng)基。 本發(fā)明提供的每升培養(yǎng)基是由如下物質(zhì)組成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g
尿素，0.5-lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為100 — 300g
的玉米淀粉糖化液，其余為水。
上述1L發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選是由如下物質(zhì)組成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，
lg磷酸二氫鉀，1. 5g七水硫酸鎂，0. 5g氯化鈣，總還原糖為200g的玉米淀粉糖化液，
其余為水。
實驗證明在3(TC下，培養(yǎng)基含0.5%(體積百分比)乙酸條件下，釀酒酵母R8-10-2發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量為89.6g/L;在37。C下，培養(yǎng)基含0.5% (體積百分比)乙酸條件 下，釀酒酵母R8-10-2發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量為88.9g/L。
釀酒酵母是淀粉質(zhì)、糖質(zhì)和生物質(zhì)原料產(chǎn)乙醇的經(jīng)典優(yōu)勢菌種，酸脅迫是酵母細 胞在乙醇發(fā)酵過程中細胞活性和代謝活性的重要限制因素。提高酵母菌的酸脅迫耐受 性將改善酵母細胞在乙醇發(fā)酵過程中的活力和發(fā)酵性能，進而提高乙醇產(chǎn)量，縮短發(fā) 酵時間，降低生產(chǎn)成本。本發(fā)明利用新的基因組改組策略提高了釀酒酵母的酸脅迫耐 受性，獲得酸脅迫條件下乙醇產(chǎn)量提高的、遺傳穩(wěn)定的釀酒酵母重組菌，該釀酒酵母 重組菌對發(fā)酵條件和發(fā)酵培養(yǎng)基沒有特殊要求，而且能夠適應(yīng)較寬的發(fā)酵溫度范圍 (30-37°C)，可以降低發(fā)酵過程中的冷卻成本，可直接應(yīng)用于目前的酒精生產(chǎn)工藝 中，應(yīng)用前景廣闊。


圖1為出發(fā)菌株R8及耐高濃度乙酸的釀酒酵母R8-10-2在不同溫度下的乙酸耐 受性比較
圖2為酸脅迫條件下出發(fā)菌株R8及耐高濃度乙酸的釀酒酵母R8-10-2在3(TC下 的發(fā)酵性能比較
圖3為酸脅迫條件下出發(fā)菌株R8及耐高濃度乙酸的釀酒酵母R8-10-2在37"下 的發(fā)酵性能比較
具體實施例方式
下面結(jié)合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實施例。 下述實施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
實施例1耐高濃度乙酸的釀酒酵母(5"accAaro/^cas c&rew'w'ae) R8-10-2的獲
得
一、出發(fā)菌株R8的獲得
以酵母菌完全培養(yǎng)基YPD為基礎(chǔ)對釀酒酵母菌(5"3cc力arov^ces cerew'w'ae) R8 (購自中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)保藏，CGMCC2. 1151) 的乙酸抗性、乙醇抗性、高滲透壓抗性，最高生長溫度和乙醇產(chǎn)量等指標進行考察， 發(fā)現(xiàn):R8在3(TC時最高能抗17y。(體積百分比)乙醇、0. 4%(體積百分比)乙酸、14g/100ml 氯化鉀，最高生長溫度為42。C， 30。C發(fā)酵200g/l葡萄糖乙醇產(chǎn)量為93.2g/1，以R8 作為本研究的出發(fā)菌株。
二耐高濃度乙酸的釀酒酵母(&ccAgro/z jres cerew'w'se) R8-10-2的獲得 1、耐乙酸高產(chǎn)菌株的單倍體菌株R8-10的分離
5按常規(guī)方法對釀酒酵母菌R8進行生孢培養(yǎng)和單倍體分離。分別測定單倍體菌株 的交配型、乙酸耐受性和乙醇產(chǎn)量，從中選出乙酸耐受性和乙醇產(chǎn)量高的單倍體菌株
R8-10。
2、 對單倍體菌株R8-10進行化學誘變
用硫酸二乙酯對單倍體菌株R8-10進行誘變，在含0. 5%乙酸(體積百分比)的YPD 平板上篩選突變菌株，從中選出遺傳穩(wěn)定性高、在3(TC最高能抗0.55。/。乙酸(體積百 分比)的突變株，作為基因組改組的親株。
3、 原生質(zhì)體融合及融合菌株篩選
制備乙酸抗性突變株的原生質(zhì)體，各菌株原生質(zhì)體等量混合，在PEG4000介導下 進行融合，在含0.6。/。乙酸(體積百分比)的YPD平板上篩選融合菌株。測定融合菌株的 乙酸抗性、遺傳穩(wěn)定性和乙醇產(chǎn)量，從中篩選出5株遺傳穩(wěn)定的、在3(TC最高能抗 0.63%乙酸(體積百分比)、乙醇產(chǎn)量高的融合菌株。
4、 基因重組
制備上述5株菌的原生質(zhì)體，進行亞硝基胍誘變和原生質(zhì)體融合，在含0.67%乙 酸(體積百分比)的滲透保護平板YPDS (含lmo1/1山梨醇的YPD培養(yǎng)基)上篩選基因 組改組菌株。通過乙酸抗性、遺傳穩(wěn)定性和乙醇產(chǎn)量測定，篩選出5株遺傳穩(wěn)定的、 在3(TC最高能抗0. 65-0. 7%乙酸(體積百分比)、乙醇產(chǎn)量高的酵母重組菌株。
提取上述5株酵母菌的總DNA，通過電擊轉(zhuǎn)化的方法(Bio-RadGene-Pulser， 1.5 kV， 50uF， 200Q， 3mSec)將上述DNA轉(zhuǎn)化到乙醇產(chǎn)量最高的菌株細胞中，使不同的 基因組DNA之間發(fā)生重組，在含0. 75%乙酸(體積百分比)的YPD平板上篩選重組菌株， 共獲得18個能夠在3(TC最高抗0. 8%乙酸(體積百分比)的重組菌。
5、 性能檢測獲得耐高濃度乙酸的釀酒酵母(&cc力ara/^ces cerew'she) R8-10-2 通過遺傳穩(wěn)定性分析和乙醇發(fā)酵實驗篩選到遺傳穩(wěn)定的、耐高濃度乙酸、乙醇產(chǎn)
量高的釀酒酵母R8-10-2，該菌株在3(TC能夠抗0.8y。乙酸(體積百分比)，在37。C能 抗0.6%乙酸(體積百分比)(圖l)。已于2009年8月14日保藏于中國微生物菌種保 藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，保藏編號為CGMCC No. 3226。
菌株R8-10-2的形態(tài)特征菌落凸起、光滑、乳白色、邊緣整齊。最適生長溫度 3CTC， pH為5.0。
該菌株具有典型的釀酒酵母生理生化特征，能夠發(fā)酵葡萄糖、麥芽糖、蔗糖、海
藻糖，緩慢發(fā)酵棉子糖；不能發(fā)酵半乳糖、乳糖、纖維二糖、蜜二糖和淀粉。
實施例2、菌株R8-10-2與菌株R8在不同溫度下和不同乙酸濃度條件下的發(fā)酵能 力分析一、菌株R8-10-2與菌株R8在3(TC發(fā)酵
原始出發(fā)菌株R8和釀酒酵母R8-10-2在YPD (2g/100ml蛋白胨，lg/100ml酵母粉，2g/100ml葡萄糖)培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)18小時，按10% (體積百分比)接種量轉(zhuǎn)接于50mlYPD中，3(TC搖床培養(yǎng)20小時，該菌液即為種子液。按10% (體積百分比)接種量接于裝有100ml乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基EFM (6g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氫鉀，L5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，200g葡萄糖，溶于水，定容至1升，自然pH，接種前不加乙酸，或加入乙酸，使之終濃度為0.5% (體積百分比))的250ml的搖瓶中，3(TC搖床(150rpm)培養(yǎng)6小時，然后密閉瓶口，在3(TC搖床(60 rpm)厭氧培養(yǎng)，不同時間取樣測定細胞生物量、發(fā)酵液中乙醇含量和殘?zhí)橇?。實驗重?次，每次接種4個搖瓶。
其中，生物量測定方法如下取5ml發(fā)酵液測定0D6。。，然后5000rpra離心5分鐘，分別收集細胞和上清液，上清液4'C保存?zhèn)溆谩＝湍讣毎谜麴s水洗一次后，稱重獲得細胞濕重，然后在65。C干燥至恒重，稱重獲得細胞干重，生物量為g干細胞/l發(fā)酵液。
發(fā)酵液中乙醇含量用氣相色譜法測定，具體如下(1)色譜條件島津2010氣
相色譜儀，毛細管色譜柱DB-5(25. 0mX0.25mmX 0.25 um);柱溫130 。C、檢測器溫度:180 。C 、進樣器溫度:180 。C;載氣氮氣1. Oml/min，分流比5:1 、氫氣流量:45ml/min、空氣流量500ml/min、尾吹氣20ml/min;進樣量O. 5 (il。
(2)乙醇標準曲線用色譜純無水乙醇分別配制濃度為0. 1%、 0. 2%、 0. 5%、 1. 0%、 1. 5%、 2. 0%的乙醇水溶液，上述色譜條件下進樣0.5^1，獲得對應(yīng)的峰面積，每個濃度設(shè)三個重復，以峰面積平均值為縱坐標，乙醇濃度為橫坐標繪制標準曲線，獲得峰面積(Y)和乙醇濃度(x)的函數(shù)關(guān)系式Y(jié)=55.324x+0.0158。
(3)樣品測定將4"C保存的發(fā)酵液上清適當稀釋，如上進樣0.5^1，測定乙醇對應(yīng)的峰面積，按如上函數(shù)公式計算樣品中乙醇濃度。發(fā)酵液中殘?zhí)前炊趸畻钏?DNS)法測定，具體如下(1)溶液的配制1克二硝基水楊酸溶于20ml 2M氫氧化鈉和50ml水中，再加入30克四水合酒石酸鉀鈉，加水定容至100ml，存放在避光密閉的容器中，即為DNS溶液。(2)標準曲線的繪制配制濃度在l-10mM的葡萄糖標準溶液各lml，加入lml DNS溶液，沸水浴10min后，各管加入蒸餾水4ml， 540nm處測定吸光度，每一濃度做三個平行，求平均值，繪制吸光度相對于葡萄糖濃度的標準曲線，獲得0054。和葡萄糖濃度(函)之間的函數(shù)關(guān)系式OD54(T0.1951x葡萄糖濃度(mM)。
(3)樣品測定取4"C保存的發(fā)酵液上清lml或適當稀釋后取lml，加入lml DNS溶液，沸水浴10min后，各管加入蒸餾水4ml，540mn處測定吸光度，每個樣品做三個重復，求0054。平均值，按上述函數(shù)公式計算樣品中葡萄糖濃度。
發(fā)酵結(jié)果見圖2，圖2中，A為不含乙酸條件下的發(fā)酵性能，B為發(fā)酵培養(yǎng)基中含 0.5%乙酸時的發(fā)酵性能；實心符號為重組釀酒酵母R8-10-2的發(fā)酵性能指標(麗、參、 ▲)，空心符號是原始出發(fā)菌株R8的發(fā)酵性能指標(□、〇、△)，其中(■、 □) 表示發(fā)酵液中剩余糖濃度，(參、〇)表示生物量(細胞干重)，(▲、 △)表示乙 醇產(chǎn)量。
在發(fā)酵培養(yǎng)基中不含乙酸的條件下，結(jié)果如圖2A所示，耐酸重組的釀酒酵母 R8-10-2和原始出發(fā)菌株R8的發(fā)酵性能變化趨勢基本一致，但在糖利用率、細胞生物 量和乙醇產(chǎn)量方面略優(yōu)于原始出發(fā)菌株，重組菌株在3(TC發(fā)酵200g/l葡萄糖48小時， 糖利用率為99%，糖醇轉(zhuǎn)化率為理論值的98.5%，乙醇產(chǎn)量為94. 5g/L;當在含0. 5% 乙酸的培養(yǎng)基中發(fā)酵時，結(jié)果如圖2B所示，重組菌株的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于原始出發(fā) 菌株，發(fā)酵200g/l葡萄糖60小時，糖利用率為93.5%,比原始出發(fā)菌株R8提高了 31%; 乙醇產(chǎn)量為89. 6g/L，比原始出發(fā)菌株R8提高了 30%。
其中，糖利用率是發(fā)酵開始發(fā)酵液中糖量減去發(fā)酵結(jié)束發(fā)酵液中殘?zhí)橇康牟钆c原 始糖量比值的百分數(shù)；糖醇轉(zhuǎn)化率是乙醇產(chǎn)量和消耗的糖的比值，再除以0.51 (0.51 為lg葡萄糖最多可以轉(zhuǎn)化為0.51g乙醇)。
二、菌株R8-10-2與菌株R8在37。C發(fā)酵
原始出發(fā)菌株R8和耐酸重組的釀酒酵母R8-10-2在YPD (2g/100ml蛋白胨， 1g/100ml酵母粉，2g/100ml葡萄糖)培養(yǎng)基中，3(TC培養(yǎng)18小時，按10% (體積百 分比)接種量轉(zhuǎn)接于50mlYPD中，37。C搖床培養(yǎng)20小時，該菌液即為種子液。按10% (體積百分比)接種量接于裝有l(wèi)OOnil乙醇發(fā)酵培養(yǎng)基EFM (6g酵母粉，10g蛋白胨， 5g尿素，lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，200g葡萄糖，溶于水， 定容至1升，自然pH，接種前不加乙酸，或加入乙酸，使之終濃度為0.5% (體積百 分比))的250ml的搖瓶中，37。C搖床(150rpm)培養(yǎng)6小時，然后密閉瓶口，在37 'C搖床(60 rpm)厭氧培養(yǎng)，實驗重復3次，每次接種4個搖瓶，不同時間取樣測定
細胞生物量、發(fā)酵液中乙醇含量和殘?zhí)橇?。標準曲線的獲得方法，以及生物量、發(fā)酵 液中殘?zhí)呛鸵掖己康臏y定方法和計算公式同實施例2。
發(fā)酵結(jié)果如圖3所示，圖3中，A為不含乙酸條件下的發(fā)酵性能，B為發(fā)酵培養(yǎng) 基中含0. 5%乙酸時的發(fā)酵性能；實心符號為重組釀酒酵母R8-10-2的發(fā)酵性能指標 (■、參、▲)，空心符號是原始出發(fā)菌株R8的發(fā)酵性能指標(□、〇、△)，其 中(■、 □)表示發(fā)酵液中剩余糖濃度，(參、〇)表示生物量(細胞干重)，(▲、 △)表示乙醇產(chǎn)量。說明書第7/8頁
在不含乙酸的培養(yǎng)基中37'C發(fā)酵，耐酸重組的釀酒酵母R8-10-2和原始出發(fā)菌株R8的發(fā)酵性能變化趨勢基本一致，但在糖利用率、細胞生物量和乙醇產(chǎn)量方面略優(yōu)于原始出發(fā)菌株，重組菌株在37i:發(fā)酵200g/l葡萄糖40小時，糖利用率為97.3%，糖醇轉(zhuǎn)化率為理論值的99%，乙醇產(chǎn)量為94. lg/L (圖3A)。當在含0. 5%乙酸的培養(yǎng)基中37'C發(fā)酵時，重組菌株的發(fā)酵性能明顯優(yōu)于原始出發(fā)菌株，發(fā)酵200g/l葡萄糖60小時，糖利用率為93.5%，比原始出發(fā)菌株1 8提高了36%;乙醇產(chǎn)量為88. 9g/L，比原始出發(fā)菌株R8提高了 33% (圖3B)。
實施例3、利用菌株R8-10-2生產(chǎn)乙醇
利用釀酒酵母(5^ccA3ra^c" cerew'w'ae) R8-10-2 (CGMCC No. 3226)發(fā)酵生產(chǎn)乙醇的工藝過程包括
斜面菌種—液體菌種~> 一級液體種子培養(yǎng)—二級液體種子培養(yǎng)—發(fā)酵培養(yǎng)—乙醇。
具體步驟如下
(1) 斜面菌種將酵母菌株R8-10-2接種于YEPD固體斜面上，在28-37。C培養(yǎng)48小時，放入4'C冰箱保存；
(2) 液體菌種將保存的菌株R8-10-2活化后，接一環(huán)細胞于裝有150毫升YEPD液體培養(yǎng)基的三角瓶中，于28-37"C振蕩(200rpm)培養(yǎng)14-20小時即為液體菌種；
(3) —級液體種子培養(yǎng)將液體菌種按體積比10%的接種量接入裝有1000毫升發(fā)酵培養(yǎng)基(每升發(fā)酵培養(yǎng)基為5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為100g的玉米淀粉糖化液，其余為水，pH自然)的三角瓶中，于28-37。C振蕩(200rpm)培養(yǎng)14-20小時即為一級液體種子培養(yǎng)物；
(4) 二級液體種子培養(yǎng)將一級種子培養(yǎng)液按體積比10%的接種量接入裝有100升發(fā)酵培養(yǎng)基(每升發(fā)酵培養(yǎng)基為5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為150g的玉米淀粉糖化液，其余為水，pH自然)的種子培養(yǎng)罐，在28-37"C攪拌(100-500rpm)培養(yǎng)14-20小時，溶氧控制在3-4mg/1，即為二級液體種子培養(yǎng)物；
(5) 發(fā)酵罐發(fā)酵將二級種子培養(yǎng)液按體積比20%的接種量接入裝有500升發(fā)酵發(fā)酵培養(yǎng)基(每升發(fā)酵培養(yǎng)基為5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為200g的玉米淀粉糖化液，其余為水，pH自然)中，在28-37。C攪拌(100- 200rpm)培養(yǎng)，溶氧低于0.5 mg/L， 20-36小時后得到發(fā)酵醪。
9在上述工藝條件下，發(fā)酵醪乙醇含量為91.2g/1，糖利用率為98.7%，糖醇轉(zhuǎn)化率為理論值的94%。
權(quán)利要求
1、釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)R8-10-2，CGMCC №.3226。
2、 權(quán)利要求1所述的酵母菌株R8-10-2在酒精發(fā)酵中的應(yīng)用。
3、 一種生產(chǎn)乙醇的方法，是將權(quán)利要求l所述的酵母菌株置于發(fā)酵培養(yǎng)基中， 發(fā)酵培養(yǎng)得到乙醇。
4、 根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)基包括有機物，所 述有機物是玉米淀粉糖化液、大米淀粉糖化液、甘薯淀粉糖化液和糖蜜中的至少一種。
5、 根據(jù)權(quán)利要求3或4所述的方法，其特征在于所述1L發(fā)酵培養(yǎng)基是由如下 物質(zhì)組成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g尿素，0.5-lg磷酸二氫鉀，1.5g七水 硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為100 — 300g的玉米淀粉糖化液，其余為水。
6、 根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于所述1L發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選是由如下 物質(zhì)組成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g 氯化鈣，總還原糖為200g的玉米淀粉糖化液，其余為水。
7、 根據(jù)權(quán)利要求3-6任一所述的方法，其特征在于所述發(fā)酵培養(yǎng)的條件是 在30 — 37。C條件下、培養(yǎng)30 — 36小時，溶氧為0-0.5 mg/L。
8、 一種用于發(fā)酵權(quán)利要求l所述酵母菌株的培養(yǎng)基，其特征在于所述1L發(fā)酵 培養(yǎng)基是由如下物質(zhì)組成5-10g酵母粉，5-10g蛋白胨，2-6g尿素，0.5-lg磷酸二 氫鉀，1.5g七水硫酸鎂，0.5g氯化鈣，總還原糖為100 — 300g的玉米淀粉糖化液， 其余為水。
9、 根據(jù)權(quán)利要求8所述的培養(yǎng)基，其特征在于所述1L發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選是由如 下物質(zhì)組成5g酵母粉，10g蛋白胨，5g尿素，lg磷酸二氫鉀，1.5g七水硫酸鎂， 0.5g氯化鈣，總還原糖為200g的玉米淀粉糖化液，其余為水。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種耐高濃度乙酸的釀酒酵母菌株。該菌株R8-10-2已于2009年8月14日保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC，地址為中國北京市朝陽區(qū)大屯路)，保藏號為CGMCC №.3226。利用該菌株進行發(fā)酵，在30℃下，培養(yǎng)基含0.5％(體積百分比)乙酸條件下，R8-10-2發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量為89.6g/L；在37℃下，培養(yǎng)基含0.5％(體積百分比)乙酸條件下，R8-10-2發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量為88.9g/L。
文檔編號C12N1/18GK101633896SQ20091009184
公開日2010年1月27日 申請日期2009年8月27日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月27日
發(fā)明者何秀萍, 瑩 盧, 張博潤, 郭雪娜 申請人:中國科學院微生物研究所