專利名稱：一種與植物耐逆相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及與植物耐逆相關(guān)的蛋白及其編碼基因與應(yīng)用。
背景技術(shù)：
干旱、低溫、高溫是影響作物生長(zhǎng)發(fā)育的常見逆境因子，很大程度上限制了作物的 產(chǎn)量和地理分布。為了提高作物在逆境下的產(chǎn)量并且打破地理分布限制，找到新的耐逆基 因并利用基因工程手段提高作物耐逆性是一個(gè)行之有效的途徑。傳統(tǒng)方法由于植物抗逆 調(diào)控機(jī)制的復(fù)雜性以及缺乏有效的篩選技術(shù)等原因而受到限制。有研究表明，植物中大部 分基因組都參與了自身對(duì)干旱、高鹽等逆境因子的響應(yīng)，改變某單一基因的表達(dá)量可以明 顯提高植物的抗旱、抗鹽能力。普遍看法認(rèn)為，植物適應(yīng)低溫、干旱、高鹽等逆境時(shí)存在不 同作用機(jī)制，均被復(fù)雜的信號(hào)途徑調(diào)控。因此，對(duì)信號(hào)途徑的中間產(chǎn)物進(jìn)行深入研究可能 是一種行之有效的提高作物耐逆性的策略。以往研究表明，植物遭受低溫、干旱、高鹽等 逆境脅迫時(shí)細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度迅速升高，Ca2+作為信號(hào)分子，要將信號(hào)傳遞下去并調(diào)節(jié)多種 生化與細(xì)胞反應(yīng)，其下游Ca2+受體蛋白非常重要。EF-hand是含有螺旋-環(huán)-螺旋結(jié)構(gòu)的 結(jié)構(gòu)域，可特異性結(jié)合Ca2+，普遍存在于大部分Ca2+結(jié)合蛋白中[16]。植物中的Ca2+結(jié)合蛋 白可劃分為三大類鈣調(diào)素(calmodulin，CaM)，鈣依賴型蛋白激酶(calcium-cbpendent protein kinase, CDPK)以及鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶 B 樣蛋白(calcineurin B-like protein, CBL。鈣調(diào)素(Calmodulin，CaM)是真核細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的、高度保守的一類鈣離子結(jié)合 蛋白，結(jié)合Ca2+后引起自身構(gòu)象發(fā)生變化從而激活自身功能，并與下游蛋白相互作用共 同組成多條信號(hào)系統(tǒng)，作為一個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)元件調(diào)控于其下游的靶蛋白，參與植物的生長(zhǎng)發(fā) 育[2°]以及對(duì)外界各種逆境信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)。除了鈣調(diào)素外，植物中還存在許多類鈣調(diào)素蛋白 (Calmodulin-lik印rotein，CML)。擬南芥全基因組存在約232個(gè)具有EF-Hand結(jié)構(gòu)域的蛋 白，其中包括7個(gè)典型鈣調(diào)素蛋白和50個(gè)類鈣調(diào)素蛋白，Bongkoj等對(duì)水稻全基因組進(jìn)行 分析后發(fā)現(xiàn)，水稻中存在243個(gè)具有EF-Hand結(jié)構(gòu)域的蛋白，這其中包括5個(gè)鈣調(diào)素蛋白和 32個(gè)類鈣調(diào)素蛋白。干旱、低溫等逆境脅迫通常引起植物細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高，Ca2+與CAM結(jié)合形成 Ca2+-CaM復(fù)合體，通過與下游靶蛋白(蛋白酶、轉(zhuǎn)錄因子等)的相互作用，使細(xì)胞信號(hào)得以傳 遞，并最終引發(fā)細(xì)胞反應(yīng)。Hu等的研究表明干旱脅迫下玉米葉片中Ca2+/CaM的含量增加， 并且發(fā)現(xiàn)Ca2+/CaM含量的增加對(duì)于干旱引起的抗氧化防衛(wèi)反應(yīng)是必須的；Zhang等的研究 證明AtCaM3基因是擬南芥熱激信號(hào)傳導(dǎo)途徑中的關(guān)鍵成分，與擬南芥的耐熱性呈正相關(guān)； 依賴CaM的蛋白激酶基因AtCPK23是擬南芥耐旱和耐鹽脅迫的負(fù)調(diào)控因子。Delk等研究 發(fā)現(xiàn)，CML24可以調(diào)控?cái)M南芥體內(nèi)離子的動(dòng)態(tài)平衡，響應(yīng)ABA、光周期變化等逆境信號(hào)。到目 前為止，大量的研究表明，擬南芥中的類鈣調(diào)素基因主要在抗病、耐鹽、同源重組以及在ABA 的信號(hào)途徑中發(fā)揮作用。Barbara Vanderbeld等利用⑶S作為報(bào)告基因研究了擬南芥類鈣 調(diào)素基因CML37、CML38和CML39在不同發(fā)育時(shí)期和不同逆境條件下的表達(dá)模式，發(fā)現(xiàn)CMLs表達(dá)具有組織和時(shí)間特異性，在逆境條件下尤為明顯。目前，關(guān)于植物類鈣調(diào)素基因的研究 主要集中在擬南芥中，類鈣調(diào)素基因在水稻中的功能知之甚少。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白，命名為0sMSr2，來源于水稻，是如下1)或2)的 蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨 基酸且與植物耐逆相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。序列表序列2為0sMSr2的氨基酸序列，包括151個(gè)氨基酸，在該蛋白質(zhì)序列中，疏 水氨基酸占62個(gè)，親水氨基酸占67個(gè)，堿性氨基酸占15個(gè)，酸性氨基酸占33個(gè)，該蛋白質(zhì) 的分子量為16. 46KD，等電點(diǎn)為3. 94。生物信息學(xué)分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，0sMSr2含有2個(gè)EF-Hand 結(jié)構(gòu)域(具有結(jié)合鈣離子的功能)，分別是序列2中的第11-74位以及第89-149位的氨基 酸組成的結(jié)構(gòu)域。該蛋白質(zhì)是國(guó)際上未曾報(bào)道的新蛋白質(zhì)。為了使1)中的0sMSr2便于純化，可在由序列表中序列2所示的氨基酸序列組成 的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1.標(biāo)簽的序列
標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個(gè))RRRRRPoly-Hi s2_10(通常為6個(gè))HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagll8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述2)中的0sMSr2可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。 上述2)中的0sMSr2的編碼基因可通過將序列表中序列1自5'末端第134到586位堿基 所示的DNA序列中缺失一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個(gè)或幾個(gè)堿基對(duì)的 錯(cuò)義突變，和/或在其5'端和/或3'端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。上述蛋白的編碼基因，命名為0sMSr2，也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。上述編碼基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)編碼序列是序列表中序列1的自5’端第134位-第586位所示的基因；2)編碼序列是序列表中序列1的自5’端第128位-622位所示的基因；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼所述蛋白的基因；4)與1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且編碼所述蛋白的基因。
序列表1為編碼0sMSr2的全長(zhǎng)cDNA。該序列共由982個(gè)堿基組成，其中，5，端未翻 譯區(qū)包括133個(gè)堿基，3’端未翻譯區(qū)包括396個(gè)堿基(其中包括179個(gè)堿基組成的PolyA)， 編碼區(qū)由453個(gè)堿基(從134位到586位)組成，編碼具有序列表中序列2的氨基酸序列的 0sMSr2 蛋白，編碼區(qū)中，A 占 17.22% (78 個(gè))，C 占 26. 49% (120 個(gè))，G 占 41. 06% (186 個(gè))，T 占 15. 23% (69 個(gè))，A+T 占 32. 45% (147 個(gè))，C+G 占 67. 55% (306 個(gè))。數(shù)據(jù)庫搜索氨基酸與核苷酸序列發(fā)現(xiàn)，鈣調(diào)素基因家族是目前已知基因中與 0sMsr2同源性最高的基因，雖然核苷酸序列的同源性較低(35.4% -49. )，但是氨基酸 的同源性達(dá)到48. 4%，初步推測(cè)基因0sMsr2可能與鈣調(diào)素功能相似。目前為止，尚未發(fā)現(xiàn) 任何與該基因的相關(guān)的研究報(bào)道。上述的高嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件是指，將雜交膜置于預(yù)雜交液(0.25mol/L磷酸鈉緩沖 液，pH7. 2,7% SDS)中，65°C預(yù)雜交30min ；棄預(yù)雜交液，加入雜交液(0. 25mol/L磷酸鈉 緩沖液，PH7. 2,7% SDS,同位素標(biāo)記的核苷酸片段)，65°C雜交12hr ；棄雜交液，加入洗膜 液I (20mmol/L磷酸鈉緩沖液，pH7. 2,5% SDS)，65°C洗膜2次，每次30min ；加入洗膜液 II (20mmol/L 磷酸鈉緩沖液，pH7. 2,1% SDS)，65°C洗膜 30min。擴(kuò)增上述0sMSr2基因全長(zhǎng)或其任一片段的引物對(duì)也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述基因的重組菌也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。含有上述基因的重組載體也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍?？捎矛F(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有0sMSr2基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá) 載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等，如pCAMBIA3301、pCAMBIA1300、 pBI121、pBinl9、pCAMBIA2301、pCAMBIA1301-UbiN、pBY505 或其它衍生植物表達(dá)載體。使用0sMSr2基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，可在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前加上任何一種 增強(qiáng)型、組成型、組織特異型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(CAMV)35S啟動(dòng)子、泛素 (Ubiquitin)基因啟動(dòng)子(pUbi)、Actin啟動(dòng)子等，它們可單獨(dú)使用或與其它的植物啟動(dòng)子 結(jié)合使用。此外，使用本發(fā)明的基因構(gòu)建植物表達(dá)載體時(shí)，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子 或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，這些增強(qiáng)子區(qū)域可以是ATG起始密碼子或鄰接區(qū)域起始密碼子等，但必需 與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個(gè)序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號(hào)和起始密碼子 的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或 結(jié)構(gòu)基因。為了便于對(duì)轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對(duì)所用植物表達(dá)載體進(jìn)行 加工，如加入在植物中表達(dá)可產(chǎn)生顏色變化的酶或發(fā)光化合物的基因(GUS基因、GFP基因、 螢光素酶基因等)、具有抗性的抗生素標(biāo)記物(慶大霉素標(biāo)記物、卡那霉素標(biāo)記物等)或是 抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因(如抗除莠劑基因)等。上述重組載體具體的構(gòu)建方法如下是將上述的基因插入pCOsAC的多克隆位點(diǎn)， 得到的重組載體；所述pCOsAC是將序列3所示pActin啟動(dòng)子插入pCambial301的多克隆 位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明的另一目的在于提供一種培育耐逆轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將上述的基因?qū)?入目的植物，得到耐逆轉(zhuǎn)基因植物，所述耐逆轉(zhuǎn)基因植物的耐逆性高于目的植物。
所述耐逆轉(zhuǎn)基因植物為耐低溫、耐高鹽、耐甘露醇和/或耐干旱轉(zhuǎn)基因植物。上述的基因是通過上述的重組載體導(dǎo)入目的植物中。攜帶有本發(fā)明的0sMSr2基 因的植物表達(dá)載體可通過Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、如基因槍法、花粉管通道、顯微 注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化到植物細(xì)胞或組織中。上述植物為雙子葉植物或單子葉植物，所述雙子葉植物為擬南芥。實(shí)驗(yàn)證明0SMSr2可以提高種子在逆境條件下的萌發(fā)率；增加根長(zhǎng)及根重；增加 植株的生長(zhǎng)勢(shì)，使種子變大；提高葉片凈光合速率；增加逆境條件下植株的耐受性。


圖1為PCR產(chǎn)物凝膠電泳圖，M :Marker ；1,2均為擴(kuò)增產(chǎn)物。圖2為質(zhì)粒PCR鑒定陽性克隆，M :Marker ； 1，2，3分別代表質(zhì)粒編號(hào)。圖3為酶切鑒定陽性克隆，M :Marker ； 1，2分別代表質(zhì)粒編號(hào)。圖 4 為 pCOsAc 圖譜。圖5為載體構(gòu)建流程圖。圖6為表達(dá)載體酶切鑒定圖，Ml、M2分別代表200bp、100p landing marker ； 1-6 分別代表不同質(zhì)粒編號(hào)，其中1、2、3是BamHI酶切；4、5、6是Noc I和Kpnl雙酶切。圖7為RNA凝膠電泳，1-2表示不同RNA樣品。圖8為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定，M marker，1、2為轉(zhuǎn)基因株系，3為無模板對(duì)照。圖9為轉(zhuǎn)基因植株P(guān)CR鑒定，M :marker ；1 轉(zhuǎn)基因植株1 ；2 轉(zhuǎn)基因植株2 ；3 野 生型cDNA ；4 無模板對(duì)照。圖10為種子萌發(fā)圖。圖11為種子生長(zhǎng)勢(shì)比較圖。圖12為根長(zhǎng)比較圖。圖13為成熟根的照片。圖14為種子大小比較圖。圖15為低溫(12°C )條件下萌發(fā)率。圖16為NaCl脅迫下萌發(fā)率。圖17為NaCl脅迫下子葉出現(xiàn)率。圖18為高鹽、甘露醇脅迫下根長(zhǎng)比較結(jié)果。圖19為高鹽脅迫處理的照片。圖20為鹽脅迫復(fù)水后成活率比較。圖21為干旱脅迫后的照片。圖22為葉片失水率統(tǒng)計(jì)結(jié)果。圖23為正常條件下各植株凈光合速率。圖24為高鹽脅迫下各植株凈光合速率。上述圖10-圖24中，WT為野生型對(duì)照；WT-1空載體對(duì)照；L_l、L_5、L_8、L-9和 L-15為PC0sAc-0sMsr2擬南芥的不同株系。
具體實(shí)施例方式下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明，但本發(fā)明并不限于以下實(shí)施例。下述實(shí)施例中，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。實(shí)施例1、培育耐逆轉(zhuǎn)基因擬南芥一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、OsMsr2基因的克?、偎究俁NA提取植物組織材料培矮64s (由國(guó)家雜交水稻工程技術(shù)研究中心羅孝和提供，公眾可 從湖南農(nóng)業(yè)科學(xué)院種質(zhì)資源庫或培矮64s育種者羅孝和處獲取)，文獻(xiàn)羅孝和，邱趾忠，李 任華.導(dǎo)致不育臨界溫度低的兩用核不育系培矮64S.雜交水稻，1992，(1) 27-29)取材后 迅速在液氮中研磨成粉末狀，取約lOOmg粉末狀材料置于盛有l(wèi).OmlTRIzoianvitrogen) 的1. 5ml離心管中，置-80°C保存?zhèn)溆谩２捎肨RIzol試劑提取法將_80°C保存?zhèn)溆玫臉悠?取出，室溫解凍后，加入200 u 1氯仿，振蕩混勻，離心后，小心取出上層水相，轉(zhuǎn)入另一離心 管中，加入500 u 1異丙醇，沉淀、離心分離出RNA，再經(jīng)75%酒精洗滌，室溫微干后，加入適 當(dāng)體積的RNase-free的水，充分溶解。所提RNA經(jīng)DNA酶(Fermentas)處理。②反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)取培矮64s總RNA 2 y g進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，加入0. 5 y g/y L Oligo (dT) 1 i L，加入去離 子水補(bǔ)足到12 u L，70°C保溫5min后，依次加入5XRT buffer 4u L, 20U/ u LRNase抑制劑 1 U L，lOmmol/L dNTP 2 u L, 37°C保溫 5min 后加入 200U/ u L M-MLV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 u L，反應(yīng)終 體積為20ii L。42°C反應(yīng)60min，70°C加熱lOmin終止反應(yīng)。③PCR體外擴(kuò)增人工合成一對(duì)引物，并在其5’端分別加上Bgl II和Pmac I酶切位點(diǎn)。上游引物 及下游引物如下0sMsr2-F 5' -AGATCTTCGACAATGGTTGTTGC-3‘，0sMsr2-R 5' -CACGTGAGCTAGCGGAGGGATCAGC-3‘。以上述培矮64s cDNA作為模板，以0sMsr2_F和0sMsr2_R為引物，采用 保真性較高的LA Taq聚合酶(TaKaRa)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。在滅菌的PCR管中建立如 下反應(yīng)體系GCXBuffer 溶液 25 ii 1，dNTP Mixture 8u 1, LA Taq 聚合酶 0. 5 ii 1， 0sMsr2-F(10nmol)2u 1，0sMsr2-R(10nmol) 2 u 1，培矮 64s cDNA 3. 5u 1, ddH209 u 1，總反 應(yīng)體積50iil.反應(yīng)程序95°C預(yù)變性6min，PCR擴(kuò)增:94°C變性40s，61°C退火40s，72°C延 伸lmin，35個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸lOmin，反應(yīng)結(jié)束后，電泳檢測(cè)PCR結(jié)果(圖1)。④PCR產(chǎn)物的純化電泳后，在紫外光照射下進(jìn)行切膠回收，利用凝膠回收試劑盒(天為時(shí)代)回收目 的基因片斷。⑤DNA連接反應(yīng)參照pMD18-T Vector (TaKaRa)說明書，按試劑盒要求建立連接反應(yīng)體系 pMD18-TVector 0. 5u 1, Solution I 4. 5 ii 1，回收基因片斷 2 ii 1，ddH20 3 yl，總反應(yīng)體積 10 yl。16°C過夜連接。⑥連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞(熱激法)
無菌條件下取5 u 1連接產(chǎn)物加到感受態(tài)細(xì)胞中，輕輕混勻后冰浴30min。42°C熱 激90s，將離心管迅速轉(zhuǎn)到冰浴中放置2-3min。加無抗生素的LB培養(yǎng)基800 yl，37°C搖床 (100-160rpm)，溫和搖振lh左右。取200 yl培養(yǎng)液涂于含抗生素50 u g/ml的LB固體培 養(yǎng)基上，在涂菌液之前首先加入X-Gal和IPTG涂勻，37°C倒置培養(yǎng)12_16h。⑦陽性克隆的篩選及鑒定1)陽性克隆的篩選培養(yǎng)基中長(zhǎng)出許多的藍(lán)色和白色菌斑，待菌斑長(zhǎng)到合適大小時(shí)，用滅菌的芽簽挑 取幾個(gè)白斑，分別于含有50 u g/ml Amp的LB液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)12_16h。2)堿裂解法小量提取質(zhì)粒DNA3)PCR 鑒定鑒定分別采用PCR擴(kuò)增和酶切鑒定。以上述克隆載體質(zhì)粒為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增， 鑒定所提質(zhì)粒中是否含有目的基因片段(圖2)。PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件與基因克隆時(shí)條件相同。 酶切利用Bgl II和Pmac 1(上、下游引物所加酶切位點(diǎn))，結(jié)果見圖3。選取鑒定出的陽性 克隆，送交公司測(cè)定序列。測(cè)序結(jié)果表明目的片段的DNA序列為序列表中序列1所示的自 5’端第128位-622位的核苷酸序列。其中編碼區(qū)是自5’端第134位-586位，可編碼序列 2所示的蛋白。2、構(gòu)建重組表達(dá)載體構(gòu)建流程圖如圖5所示。①載體材料PCOsAc載體構(gòu)建流程a、利用PCR技術(shù)從水稻培矮64s基因組中擴(kuò)增得到pActin啟動(dòng)子(序列3)，在上 游引物加了 Kpnl切點(diǎn)，下游引物依次添加了 XbaI,PmacI和NC0I位點(diǎn)。其中上游引物是5 ，-GGTACCCTCGAGGTCATTCATATGCTTGAG-3 ；下游引物是 5，-CCATGGCACGTGTCTAGATCTACCTACAA AAAAGCTCCG-3，。b、將擴(kuò)增產(chǎn)物先克隆到pMD18-T載體上，挑單克隆提取質(zhì)粒，并且做了酶切鑒定。c、用Kpnl和NC0I酶切帶有正確目的片段的克隆先用NC0I酶切，接著用Klenow 將末端填平，然后再用Kpnl酶切，回收酶切產(chǎn)物，得到一端為Kpnl粘性末端，一端為平端的 啟動(dòng)子片段。d、>|f pCambial301 質(zhì)粒(CambiaLabs, http // www. cambia. org/daisy/bioforge_ legacy/3725, html)用Kpnl和PmacI雙酶切，同樣得到一端為Kpnl粘性末端，一端為平端 的載體片段。e、將酶切好的啟動(dòng)子和載體連接，轉(zhuǎn)化，鑒定，得到pCOsAc載體。②基因片斷的準(zhǔn)備(片段粘性末端補(bǔ)平)將目的基因片斷從已經(jīng)測(cè)序并證明序列正確的克隆載體上切割下來，所選用的限 制性內(nèi)切酶是Bgl II (黏性末端)，Pmac I。回收基因片斷利用Klenow酶(TaKaRa)將黏 性末端補(bǔ)平。反應(yīng)程序如下lOXKlenow buffer5. OuldNTP mixture5. OulKlenow enzyme1. 3ul (3. 5U/ul)
目的片斷38. 7ul共 50ul25°C下反應(yīng)30分鐘，然后75°C下反應(yīng)25分鐘。③載體片斷的準(zhǔn)備利用單一限制性內(nèi)切酶Pmac I (平末端)酶切原始載體pCOsAC，對(duì)回收片斷進(jìn)行 去磷酸化處理，防止自連。④表達(dá)載體構(gòu)建利用T4連接酶將基因片斷與載體片斷進(jìn)行連接，并進(jìn)行方向性鑒定。連接程序如 下載體 pCOsAC 2ul，T4 ligase lul, T4Xbuffer lul, 0sMsr2 6ul，16°C，8 小時(shí)。熱激轉(zhuǎn)化及抽提質(zhì)粒與前面方法相同。⑤表達(dá)載體鑒定表達(dá)載體pCOsAc-OsMsrf構(gòu)建完成后，根據(jù)基因本身所具有的限制性內(nèi)切酶位點(diǎn) 和載體上的酶切位點(diǎn)，分別選用BamH I單酶切，Noc I、Kpn I雙酶切，酶切后分別得到914bp 和1932bp大小的條帶，結(jié)果與預(yù)測(cè)結(jié)果吻合(圖6)，說明構(gòu)建載體成功，并且基因在載體上 的插入方向正確。二、培育耐逆轉(zhuǎn)基因擬南芥及其檢測(cè)1、耐逆轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1)表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌將表達(dá)載體pCOsAc-OsMsrf利用熱激法分別轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101 (購(gòu)于天根生化科 技(北京)有限公司)，抽提質(zhì)粒并進(jìn)行酶切鑒定，采用方法與上述表達(dá)載體鑒定的步驟相 同，結(jié)果表示表達(dá)載體pCOsAc-OsMsrf已經(jīng)成功轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌。2)擬南芥的轉(zhuǎn)化采用農(nóng)桿菌浸染花序法將表達(dá)載體整合到擬南芥(Col-0)基因組中，篩選在含有 潮霉素(50mg/l)的MS培養(yǎng)基上進(jìn)行，T2代種子繼續(xù)在含潮霉素的MS上篩選，選取分離比 例為3 1的株系在T3代繼續(xù)篩選，T3代時(shí)若種子100%可以在含潮霉素的MS上生長(zhǎng)，則 認(rèn)為該株系為純合株系。隨機(jī)選取其中兩個(gè)純合株系進(jìn)行分子檢測(cè)。采用Trizol試劑提取法 (Invitrogen)提取擬南芥總RNA。提取后的RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)RNA質(zhì)量，從凝 膠電泳結(jié)果來看，RNA質(zhì)量高(圖7)。轉(zhuǎn)基因擬南芥總RNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。反轉(zhuǎn)錄所得cDNA為模板(反轉(zhuǎn)錄步驟 與實(shí)施例1相同)，利用如下引物pC13(可擴(kuò)增潮霉素基因片斷)進(jìn)行PCR擴(kuò)增pC13-F 5' -ACCTGCCTGAAACCGAACTG-3‘；pC13-R 5' -CTGCTCCATACAAGCCAACC-3‘。擴(kuò)增后的瓊脂糖凝膠電泳如圖8。結(jié)果顯示，以轉(zhuǎn)基因植株1、2的cDNA為模板的 反應(yīng)可以擴(kuò)增出與潮霉素基因大小一致的條帶(約480bp)，無模板對(duì)照無條帶，證明潮霉 素基因(篩選標(biāo)記)已整合到擬南芥基因組中。同時(shí)，本發(fā)明還利用另外一對(duì)0sMsr2的特異引物(可擴(kuò)增基因本身)進(jìn)行PCR擴(kuò) 增。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因植株1，2均可以擴(kuò)增出目的基因大小的條帶，野生型cDNA和無模板 對(duì)照均無條帶，如圖9。
以上結(jié)果共同說明，pCOsAc-OsMsrf載體已經(jīng)存在于轉(zhuǎn)基因擬南芥植株，并且基因 OsMsrf基因已整合到擬南芥基因組中，且在轉(zhuǎn)基因擬南芥中能進(jìn)行表達(dá)。2、檢測(cè)分析將上述轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥移至溫室培養(yǎng)，自交，收集轉(zhuǎn)基因擬南芥的種子。同時(shí)以轉(zhuǎn)pCOsAc的擬南芥為空載體對(duì)照；以野生型擬南芥作為野生型對(duì)照。1)無逆境脅迫時(shí)的表型分析A.萌發(fā)率取轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥、轉(zhuǎn)pCOsAc的擬南芥和野生型擬南芥的種子消毒，消 毒后的種子點(diǎn)種于MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)皿置于4°C，黑暗。2天后將皿取出放到光照培養(yǎng)箱中， 常規(guī)生長(zhǎng)條件培養(yǎng)(16h/8h，光期/暗期；22°C ；光強(qiáng)，SOymolmH，每日統(tǒng)計(jì)種子萌發(fā)數(shù) 目。結(jié)果如圖10所示，正常生長(zhǎng)條件下(無任何逆境脅迫)，轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥種子 (L-5、L-8、L-9和L-15)萌發(fā)第1天的萌發(fā)率高于野生型對(duì)照WT和空載體對(duì)照WT-1，隨后 萌發(fā)率無差別。B.生長(zhǎng)勢(shì)實(shí)驗(yàn)步驟與上述步驟A萌發(fā)率相同，萌發(fā)第3天時(shí)拍照，結(jié)果如圖11所示，L-5的 生長(zhǎng)勢(shì)更強(qiáng)，先于野生型和空載體對(duì)照出現(xiàn)子葉。C.根長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)步驟與上述A或B相同，只是將培養(yǎng)皿始終保持直立，第5天時(shí)拍照，結(jié)果如 圖12所示，轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥(L-5和L-15)根長(zhǎng)長(zhǎng)于野生型和空載體對(duì)照。D.根的干重將轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥、轉(zhuǎn)pCOsAc的擬南芥和野生型擬南芥的種子播種于土 中，待95天擬南芥成熟后，將根從土中挖出，經(jīng)過洗凈、烘干(60°C下4天)稱其重量并拍 照。照片如圖13所示，轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥L-5的成熟根的根毛多于野生型對(duì)照和空 載體對(duì)照。干重結(jié)果如表1所示，轉(zhuǎn)pCOsAc-OsMsrf擬南芥的成熟根的根重與野生型對(duì)照 和空載體對(duì)照相比，平均根重增加56. 6%和48. 48%。表1.轉(zhuǎn)基因植株的成熟根的干重
權(quán)利要求
一種蛋白，是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與植物耐逆相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。
2.權(quán)利要求1所述蛋白的編碼基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的基因，其特征在于所述基因是如下1)或2)或3)或4)的基因1)編碼序列是序列表中序列1的自5’端第134位-第586位所示的基因；2)編碼序列是序列表中序列1的自5’端第128位-622位所示的基因；3)在高嚴(yán)謹(jǐn)條件下與1)或2)限定的基因雜交且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因；4)與1)或2)限定的基因具有90%以上的同源性且編碼權(quán)利要求1所述蛋白的基因。
4.含有權(quán)利要求2或3所述基因的轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌。
5.含有權(quán)利要求2或3所述基因的重組載體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的重組載體，其特征在于，所述重組載體的構(gòu)建方法如下是將 權(quán)利要求2或3所述的基因插入pCOsAC的多克隆位點(diǎn)，得到的重組載體；所述pCOsAC是將 序列3所示pActin啟動(dòng)子插入pCambial301的多克隆位點(diǎn)得到的重組質(zhì)粒。
7.一種培育耐逆轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將權(quán)利要求2或3所述的基因?qū)肽康闹参?，?到耐逆轉(zhuǎn)基因植物。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于權(quán)利要求2或3所述的基因是通過權(quán)利 要求5或6所述的重組載體導(dǎo)入目的植物中。
9.根據(jù)權(quán)利要求7或8所述的方法，其特征在于所述耐逆轉(zhuǎn)基因植物為耐低溫、耐高 鹽、耐甘露醇和/或耐干旱轉(zhuǎn)基因植物。
10.根據(jù)權(quán)利要求7-9任一所述的方法，其特征在于所述植物為雙子葉植物或單子葉 植物；所述雙子葉植物為擬南芥。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種本發(fā)明的目的在于提供一種蛋白，命名為OsMSr2，來源于水稻，是如下1)或2)的蛋白1)序列表中序列2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；2)在序列表中序列2的氨基酸序列經(jīng)過取代和/或缺失和/或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸且與植物耐逆相關(guān)的由1)衍生的蛋白質(zhì)。將該蛋白質(zhì)的編碼基因OsMsr2導(dǎo)入植物中，可以提高種子在逆境條件下的萌發(fā)率；增加根長(zhǎng)及根重；增加植株的生長(zhǎng)勢(shì)，使種子變大；提高葉片凈光合速率；增加逆境條件下植株的耐受性。
文檔編號(hào)C12N5/10GK101993481SQ20091009172
公開日2011年3月30日 申請(qǐng)日期2009年8月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年8月24日
發(fā)明者夏新界, 徐國(guó)云 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所