專利名稱：具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌及其N₂O生物控逸方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一株具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能的菌株，具體地說是具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047及其N20生物控逸方法。
背景技術：
在目前已應用的多種脫氮方法中，生物脫氮仍然是廢水脫氮處理中的主要手段，其中對異養(yǎng)硝化菌脫氮作用的研究，是對傳統(tǒng)硝化-反硝化理論的豐富與突破。異養(yǎng)硝化作用是指異養(yǎng)微生物在好氧條件下，將氨或有機氮化合物氧化到羥胺、亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程，異養(yǎng)硝化作用的重要性正日益受到關注，尤其是具有好氧反硝化特性的異養(yǎng)硝化細菌的發(fā)現，為污水脫氮引入了全新的概念。
發(fā)明人早期專利"具有好氧反硝化性能的戴爾福特菌及其處理廢水的方法"
ZL 200610140872. 3，該專利是一種涉及采用戴爾福特("W/fi3 "w"力afe/ sk)WXZ-9 CGMCC No. 1797菌株在好氧條件下進行生物脫氮處理廢水的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的睪丸酮叢毛單胞菌及其處理廢水的方法"ZL200610140870.4，該專利是一種涉及采用睪丸酮叢毛單胞菌(Cb/z/a/^/ "fe^ostero/w') WXZ-18 CGMCC No. 1800菌株及其應用于廢水脫氮處理的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的惡臭假單胞菌及其處理廢水的方法"ZL200610140871.9，該專利是一種涉及采用惡臭假單胞菌(/^ewo^/7 o/ asWXZ-4 CGMCC No. 1798菌株及其應用于廢水脫氮處理的方法。發(fā)明專利"具有好氧反硝化性能的草螺菌及其處理廢水的方法"ZL 200610140869. 1，該專利是一種涉及采用草螺菌(yyeWafA2力7A朋力〃"ie7^e) WXZ-14 CGMCC No. 1799菌株及其應用于廢水脫氮處理的方法。這四項專利所涉及的這些菌株具有優(yōu)異的好氧反硝化性能，可以去除廢水中的硝基氮和亞硝基氮。
具有反硝化性能的菌株能進行反硝化反應，反硝化反應過程包括4個還原步驟(涉及五種含氮物質其中后三種物質是氣體)，如下式所示。好氧反硝化反應就是在有氧條件下進行4個還原步驟，分別由硝酸鹽還原酶Nar、亞硝酸鹽還原酶Nir、 一氧化氮還原酶Nor、氧化亞氮還原酶Nos催化完成。
<formula>formula see original document page 3</formula>異養(yǎng)硝化作用(heterotrophic nitrification)是異養(yǎng)微生物參與無機氮
氧化的生物化學過程，它的底物是無機態(tài)氨氮。近年來，有研究者提出更為嚴格
的異養(yǎng)硝化作用的定義為(Papen， 1998):異養(yǎng)微生物在好氧條件下將氨/銨或
是有機態(tài)氮氧化到羥胺，亞硝酸鹽和硝酸鹽的過程，艮P:
NH3/NH:/RNH2~^NH2OH — N02 — NO;
目前國外尚未見芽孢桿菌具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的報道，但國內已有了相關的初步研究。郝桂玉研究了 SBR中芽孢桿菌的異養(yǎng)硝化作用，指出SBR周期連續(xù)運行后，污泥濃度會相對穩(wěn)定，芽孢桿菌能很好適應好氧與缺氧環(huán)境，成為污泥中的優(yōu)勢菌種。馴化過程中，進水氨氮濃度在20mg/L左右，且最大氨氮去除率低于60°/。，但未指出究竟是否有反硝化脫氮功能，因此不能判斷是否存在好氧反硝化性能。何霞等從膜生物反應器中分離出來的1株異養(yǎng)硝化細菌Bacillus sp. LY，經鑒定為芽孢桿菌。在氨氮濃度分別為40、 80和120 mg/L 3種情況下，120 h反應后，氨氮的去除率分別是100 %、 85.7 %、 73.7 % 。但該菌株的硝化作用啟動慢，在120h才能達到較好的脫氮效果。
因為本領域中主要的任務是去除廢水中的氮，所以一般來說人們對上述現有好氧反硝化菌株的關注點僅僅保留在反硝化到氣體產物能達到去除廢水中氮的目的即可。由于氣體N0的毒性很大，菌株為了自身不受傷害，在早期研究中就發(fā)現，還原酶Nir和Nor基本成對出現，因此一般脫氮產物是N20或N2。但是隨著全球變暖危機的到來，人們越來越多地關注溫室氣體，C02為我們所熟知的溫室氣體，可N"的單體溫室效應比C02要強310倍。除此之外大氣中化0經紫外線照射還能分解為毒性更大的氣體NO;還能與臭氧分子反應，破壞臭氧層。為此，本領域技術人員一直致力于研究如何降低脫氮過程的產物N20，其中生物學控制的方法即選擇效果更好的菌株可將脫氮反應完全進行至N"這樣的菌株應該具有上述反應式全部的四種酶，目前尚未見有關N力生物控逸菌株報道。
現有其他脫氮產物AO控逸的有工藝控逸報道，如通過調節(jié)脫氮反應的工藝操作條件，如溫度、pH或制造輻射氛圍等。這些方法原理基本是通過提高脫氮菌群中氧化亞氮還原酶Nos的活性來達到實現控制N,O排放的目的。但工藝控逸方法不能解決某些菌株根本缺乏氧化亞氮還原酶Nos的問題，即不能從根本上解決N」0能否被還原的問題，因此工藝操作條件改變往往改善N20產生的比例十分有限，一般改善后N20占從水體中脫除氮量的10 30%。我們的方案是尋找一種菌株，
4具有上述反應式全部的四種酶，而且Nor還原酶位點需要非常接近Nos還原酶位點，使得產生N》的同時能夠迅速被Nos還原酶催化還原為N2。因為若不能迅速被Nos還原酶催化還原為N2.氣體N20 —旦產生將有可能迅速揮發(fā)到空氣中。
綜上所述，篩選到既生成&0量少，又能保證一定脫氮效率的高效菌株，是本發(fā)明的目的。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的在于提供一株既以硝酸鹽也以氨氮為氮源進行生長的菌株；將其接種于常規(guī)好氧污泥中，即可實現含氨氮廢水的直接脫氮作用，可以解決傳統(tǒng)廢水處理中脫氮需要利用不同的硝化和反硝化菌群，可以解決因不同菌群生物習性不同，如反硝化需要在缺氧環(huán)境、硝化在好氧環(huán)境分段處理的問題，更重要的是本菌株脫氮產物中N20發(fā)生量僅萬分之五以下，可以有效地實現N20生物控逸。
本發(fā)明的發(fā)明思路是篩選具有N20生物控逸特性的天然生長優(yōu)勢的高效異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌株，并對菌株進行測序鑒別。將篩選得到的菌株，接種于含硝酸鹽的廢水中，其能有效地進行好氧反硝化脫氮；將該菌株接種于不同濃度的氨氮廢水中，并通過不同反應條件試驗(溶解氧，碳氮比，pH等)，也能有效地進行好氧脫氮，證實該菌株為一株異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌，并且有較廣泛的適應性。
本發(fā)明的技術方案為 一株具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(^sc/77m cere^)，于2009年4月30日，在北京保藏于"中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心"，地址北京市朝陽區(qū)大屯路，其保藏號為CGMCCNO. 3047。
上述的一株具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047，該菌株16SrRNA具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，序列長度為1404bp。
一種N》的生物控逸方法，其是將上述的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047接種于氨氮廢水中。接種前需要恒溫保持3(TC，搖床轉速120 160r/min進行菌株活化，活化12 16小時后，取對數生長期菌株，以體積百分數為5%的接種量接種到氨氮廢水中?；罨^程不會影響菌種性能，只能使得最終效果更佳。
上述的N力的生物控逸方法，所述蠟狀芽孢桿菌CGMCC N0. 3047接種于氨氮廢水中的條件為以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度40 4(TC，C0D/N=15 30， pH=5.0 9.0，轉速=90 180r/min， NH/-N初始濃度約為80 120mg/L。
本發(fā)明所述菌株CGMCC NO. 3047具有以下特征(1)菌落特征在BTB平板上培養(yǎng)2 3天，菌落成圓形，光澤度很好，黃色，中心無突起。(2)細胞形態(tài)特征適宜于pH中性左右，常溫下培養(yǎng)，細胞為桿狀，革蘭氏染色陰性。(3)蠟狀芽孢桿菌(AsciW^ cere"s) CGMCC NO. 3047的16SrRNA基因序列特征其16SrRNA具有序列表所示的核苷酸序列，序列長度為序列長度為1404bp，在Genbank中的登錄號為EF440610。
參照《伯杰細菌鑒定手冊》(第八版)的內容，根據其形態(tài)特征和生理生化特征，以及根據其16S rDNA基因序列在Genbank中的檢索，鑒定該菌株(CGMCCNo.)為蠟狀芽孢桿菌(ifecW〃s cer面)。
該菌株CGMCC NO. 3047接種于硝基氮模擬廢水中，在轉速為100 r/min，對應溶解氧濃度為4. 2 5. 0 mg/L;硝基氮濃度為10 130mg/L左右；碳氮比10 25， pH值為6.5 7.5的條件下，對該菌進行反硝化性能測定。結果表明4天后N0:r-N還原率78. 0%， 4天后總氮(TN)去除率為76. 8%，該菌株能有效的進行反硝化作用，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液均能以硝基氮為氮源生長。
該菌株CGMCC NO. 3047接種于氨氮模擬廢水中，對溶解氧、溫度的耐受程度強，在轉速為90 180r/min (對應的溶解氧濃度為25% 98%飽和溶解氧)條件下，溫度為20 40°C，碳氮比為15 30， pH為5. 0 9. 0，初始氨氮濃度20 120mg/L的條件下反應，發(fā)現24h后，氨氮的去除率達96.3%,總氮去除率達93.81%。過程中無硝基氮、亞硝基氮的積累，該菌株能有效地進行異養(yǎng)硝化脫氮。
該菌株CGMCC NO. 3047為一株異養(yǎng)硝化一好氧反硝化菌株。具體地講，本發(fā)明涉及一株蠟狀芽孢桿菌(^3cy^M cere"s) CGMCC NO. 3047，該菌株的生長細胞、細胞懸浮液均能以氨氮為氮源生長，也能以硝基氮為氮源生長，其可在好氧條件下實現同步硝化反硝化，使廢水中氮化合物降低，達到脫氮的目的，同時經檢測在脫氮過程中有害氣體產物N20的逸出少，僅占從水體中脫除氮的0. 047%。
本發(fā)明的優(yōu)點及有益效果是
1、該菌株CGMCC NO. 3047接種于含不同濃度氨氮的廢水中，選擇不同條件如溶解氧、C0D/N、 pH等在不同實驗范圍內進行實驗，并計算硝化能力。實驗結果表明，該菌株在反應轉速90 180rpra，相當于溶解氧濃度為飽和溶解氧的25W 98%, C0D/N=15 30，氨氮廢水濃度在20 120mg/L， pH=5. 0 9. 0的實驗范圍
6內，其氨氮最大去除速率可達到51.91 mg/(L*d)， 24h后，氨氮去除率可達到 96. 3%，總氮去除率達93. 81%。
2、在該菌株CGMCC NO. 3047接種于含氨氮的廢水中，在以檸檬酸三鈉為唯 一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度=20 40°<:， COD/N=15 30， pH=5.0 9.0，轉 速二90 180r/min，NHr-N初始濃度約為20 120mg/L，空氣密封培養(yǎng)96h后，NH/-N 去除率為90.52%，總氮去除率為91.54%。產生的仏0氣體為0. 00945mg，占從水 體中脫除的氮的0.047%;在純氧密封培養(yǎng)96h后，NHZ-N去除率為91.45%,總氮 去除率為92.49%。產生的N力為O. 00425mg，占從水體中脫除的氮的0. 024%。
3、 本發(fā)明中涉及的蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO. 3047在培養(yǎng)液溶解氧濃度為2 7mg/L時，培養(yǎng)初始硝基氮濃度10 130mg/L，且該菌株兼具異養(yǎng)硝化一好氧反 硝化性能和NaO的生物控逸能力。
4、 采用空氣密封和純氧培養(yǎng)兩個條件，證實這兩個條件對N20的產生量影響 很小，AO的產生量均占從水體中脫除總氮量的不足0. 05%，表明該菌株具有很 強的氧化亞氮還原能力，確實能夠達到^0的控逸目的，同時表明空氣密封培養(yǎng) 提供的氧氣就能夠滿足菌株培養(yǎng)的溶解氧控逸條件。
5、 本發(fā)明提供的蠟狀芽孢桿菌(fec^7"s cere^) CGMCC NO. 3047能在硝 酸鹽廢水中生長，在好氧條件下降解利用硝酸鹽，進行反硝化脫氮作用；也能在 氨氮廢水中生長，在好氧條件下利用氨氮進行異養(yǎng)硝化一好氧反硝化脫氮，且脫 氮過程中氣體產物&0逸出量少；也能在以牛肉蛋白胨、營養(yǎng)瓊脂等為碳源、氮 源的營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長。


圖1為實驗中為測定^0所用特制雙孔培養(yǎng)搖瓶示意圖2為GC-ECD法測定廢水生物脫氮過程中產生的N力氣體典型色譜圖。
具體實施例方式
實施例1蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的篩選
該菌株來自于本實驗室，以硝酸鹽為底物，高溶解氧條件馴化下的SBR曝氣 反應器A (總氮TN去除率60.0 83.0X， COD去除率85. 0 90. 0%)中的活性污 泥，菌株編號為WXZ-8，保藏編號為CGMCC NO. 3047。
利用BTB培養(yǎng)基中所含的溴百里酚藍遇堿變藍的特點(作為產堿指示劑)， 采用梯度稀釋及涂布法將本實驗室反應器A中的混合液均勻涂布于BTB培養(yǎng)基，3(TC恒溫好氧培養(yǎng)數天后，挑取周圍培養(yǎng)基出現藍色的暈圈并且菌落形態(tài)不相同 的單菌落作為初篩的好氧反硝化菌，在平板上劃線進行菌株的純化。劃線篩選得 到的純菌株在試管中劃斜面保存。接著對菌株進行反硝化性能測試(以硝基氮去 除率來衡量)，復篩出純的好氧反硝化菌。
將篩選出的好氧反硝化菌株接種于異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中，測定菌株的硝化性能 (硝化性能以氨氮去除率和總氮的去除率來衡量)，選取氨氮去除率較高的的菌
株WXZ-8，至此認為篩選出異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌株。
實施例2:蠟狀芽孢桿菌CGMCC N0.3047好氧反硝化性能的測定方法
為了防止模擬廢水中帶入雜菌，硝酸鹽模擬廢水i和硝酸鹽模擬廢水n均在
高溫滅菌鍋0. IMP中滅活20min。取50mL滅菌后的硝酸鹽模擬廢水I于100mL錐 形瓶中，將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(^3"Wws cere"s) CGMCC NO. 3047 接入硝酸鹽模擬廢水I，置于氣浴恒溫搖床，恒溫保持3(TC，搖床轉速120 160r/min進行菌株活化。活化12 16小時后，以5%的接種量接種到裝有200 raL 硝酸鹽模擬廢水II的250mL錐形瓶中進行反硝化、脫氮性能測定。每隔24小時， 用裝有0.2um混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品5mL，測定 NO「-N和NO:r-N濃度。通過計算NO,,—-N還原率和總氮(廢水中氨氮、硝酸鹽和亞 硝酸鹽濃度之和)去除率分析菌株的NO:「-N還原性能和脫氮性能。
硝酸鹽模擬廢水I (/L):琥珀酸鈉8.5g， KN03: l.Og， KH2P04: l.Og， FeCl2-6H20 : 0.5g， CaCl2.7H20: 0.2g， MgS04.7H20 : l.Og。
硝酸鹽模擬廢水II (/L):琥珀酸鈉2.4g， KN03: 0.722g， KH2P04: l.Og， MgS04-7H20: l.Og。
實施例3:蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的好氧反硝化測定
廢水好氧反硝化條件為溶解氧濃度，通過控制不同轉速rpm(r/min)實現， 轉速為100r/min，對應溶解氧濃度為4. 2 5. 0 mg/L;硝基氮濃度為126mg/L; 碳氮比10 25， pH值為6. 5 7. 5的條件下，對該菌CGMCC NO. 3047進行反硝化 性能測定。
按照實施例2方法進行反硝化性能測定，試驗結果4天后NO:,—-N還原率 78.0%, 4天后TN (總氮為硝基氮和亞硝基氮之和)去除率為76.8%。 實施例4:蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的測定方法
為了防止模擬廢水中帶入雜菌，氨氮模擬廢水I和氨氮模擬廢水II均在高溫滅菌鍋0. IMPa中滅活20min。將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(fe"77"s cere〃5)CGMCC NO. 3047接入氨氮模擬廢水I ，置于氣浴恒溫搖床，恒溫保持30°C ， 搖床轉速120 160r/min進行菌株活化?；罨?2 16小時后，以5%的接種量接 種到裝有200ml氨氮模擬廢水n的250mL錐形瓶中進行硝化、脫氮性能測定。每 隔24小時，用裝有0. 2 u m混合纖維膜的針式過濾器過濾抽取錐形瓶中廢水樣品 5mL，測定麗/^ ， NO廣N和NO廣N濃度。通過計算氨氮去除率和總氮(廢水中 氨氮，硝酸鹽和亞硝酸鹽濃度之和)的去除率分析菌株的硝化性能和脫氮性能。
氨氮模擬廢水I (/L):(亂SO" 0.47g， K跳:lg， FeCl2.6H20: 1.25g， CaCl" 7Ha0: 0. 2g， MgSO., 7H20: lg，檸檬酸三鈉(Qi;Na:i07 2H20): 5. lg，碳源 用量依據正交實驗設計COD/N比調節(jié)，并同時調節(jié)初始pH值。
氨氮模擬廢水II (/L): (NH.丄S(X為氮源，檸檬酸三鈉(C晶Na:A 2H20)為
碳源，(注氮源用量根據實驗中初始氨氮濃度的不同要求而調節(jié)，碳源用量依
據實驗設計COD/N比調節(jié))，維氏鹽溶液50ml;加水溶解，補充蒸餾水至1L，并 同時調節(jié)初始pH值。其中維氏鹽溶液(/L): K2HP01: 5.0g; FeS04'7H20: 0. 05g; NaCl: 2. 5g; MgSOi 7H^: 2. 5g; MnS(X 4H20: 0. 05g，溶解后加水定容至1L。 實施例5 10不同培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的異養(yǎng)硝化-好氧 反硝化性能測定
按照實施例4方法進行異養(yǎng)硝化性能測定，蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus) CGMCC NO. 3047的6次試驗結果見表1。
表1實施例5 10的廢水硝化脫氮試驗條件及脫氮效率
編號COD /N溫度 廠CpH值轉速 /rpm氨氮初始 濃度(mg/L)4天后氨氮 去除率/%4天后TN 去除率％
實施例525209.01809886.4887.50
實施例615307.018010059.4362.79
實施例720309.0卯10669.8672.52
實施例825305.013010067.6470.97
實施例920355.018011480.6881.55
實施例1020307.01803698.7199.23
從表1可以看出，對蠟狀芽孢桿菌(&cj7"s cere^)菌株的氨氮去除能
9力影響因素最主要的是COD/N，其次為溶解氧和pH，溫度的影響最小。 實施例ll:在優(yōu)選培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的異養(yǎng)硝化-好氧 反硝化性能測定
采用優(yōu)選的硝化、反硝化優(yōu)選培養(yǎng)條件溫度為30°C、 C0D/N為25、初始 pH值為9. 0、轉速為180 r/min。此條件下，蠟狀芽孢桿菌(^scj77m ce/^a ) CGMCC NO. 3047在24h時氨氮去除率達最大，為96. 30%。24h時TN去除率達93. 81%。 該菌株對數生長期發(fā)生在最初24小時內，菌體生長量在第24小時達到最大，0D6。。 值為1. 094。 TN的去除與NH/-N的去除有著相同的趨勢，在第16小時TN去除率 達95.21%，在整個硝化過程中僅有極少量的NO:,—-N、 N02—-N的累積，菌株在硝化 過程中將NH/-N氧化為N0:「-N、 N0廣N，且通過好氧反硝化作用被去除。 實施例12:空氣密封瓶培養(yǎng)條件下，以檸檬酸三鈉為碳源，硫酸銨為唯一氮源， 對蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047異養(yǎng)硝化過程中N20的生物控逸技術
為了防止模擬廢水中帶入雜菌，氨氮模擬廢水i和氨氮模擬廢水n均在高溫
滅菌鍋0. IMPa中滅活20min。將以液體石蠟封存的蠟狀芽孢桿菌(勘c/"z^ ce/'e^)CGMCC NO. 3047接入氨氮模擬廢水I ，置于氣浴恒溫搖床，恒溫保持30°C， 搖床轉速120 160r/min進行菌株活化?；罨?2 16小時后，以5%的接種量接 種到裝有200tnl氨氮模擬廢水II的1L帶有密封橡膠塞的三角瓶中進行硝化能力、 脫氮產物NL'0氣體測定。在20 40°C ， ， pH=7. 0 9. 0，轉速為90 180r/min， C0D/N 為15 30的條件下，用氣浴恒溫搖床下進行培養(yǎng)，分析測定。同樣條件下，空 白廢水樣品(未接菌株的氨氮模擬廢水II)作為對比基準試驗。
每隔24小時，用10ml鎖式進樣器緩慢勻速抽取錐形瓶中逸出的氣體，直接 分析檢測&0。同時用抽取液體樣品，測定NH/-N ， N0廣N和N0廣N濃度。通過 計算氨氮去除率、總氮去除率以及N力的氣體產量分析菌株的硝化性能和脫氮性 能。
N"采用GC-ECD法測定，Varian 3800氣相色譜儀；10mci63Ni電子捕獲檢 測器(ECD); 3mX3mm不銹鋼柱，填充固體Porapak Q柱，80/100目。選用的 綜合色譜條件檢測器溫度(L)( 350'C)、分離柱溫度(Tj ( 5(TC)、載氣流速 (fc) ( 20mL/min)，在此條件下具有較高的靈敏度和精確度，重現性較好(相對 標準偏差C.V=1.05%， n=23)。如圖2所示，依據上述測試條件可以看出，02和 仏0分離度較大，說明氣體成分清楚，下述結果測量精準。
10實驗結果表明在空氣密封培養(yǎng)條件下，蠟狀芽孢桿菌(5sw7/m cere^) CGMCCNO. 3047菌株在以檸檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度^3(TC， COD/N=25， pH=8. 0，轉速-160r/min， 初始濃度為100mg/L，實驗條件下，
96h后NH一N去除率為90. 52%，總氮去除率=91. 54%，產生的N20為0. 00945mg， 占從水體中脫除的氮的0. 047%。
實施例13:純氧密封瓶培養(yǎng)條件下，以檸檬酸三鈉為碳源，硫酸銨為唯一氮源, 對蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047異養(yǎng)硝化過程中N20的生物控逸技術
與實施例11不同，本試驗中將200ml氨氮模擬廢水II接入1L帶有雙孔密封 橡膠塞的三角瓶中進行硝化能力、脫氮產物N"氣體測定。如圖1所示，為實驗 中為測定N20所用特制雙孔培養(yǎng)搖瓶示意圖；其中該培養(yǎng)搖瓶包括雙孔橡膠塞1、 氣體取樣口2、閥門3、液體取樣口4、出氣口5 (帶有夾子的橡膠管另一端連著 玻璃管)和進氣口6 (帶有夾子的橡膠管另一端連著玻璃管)。
培養(yǎng)中，將99.999%的高純氧氣以相同流速注入到培養(yǎng)瓶中，充氧時間為60 秒(注通過前期的實驗驗證，40秒的充氧時間能夠保證化瓶中含95%以上的 氧氣)，立刻用夾子夾緊連著玻璃管的橡膠管，然后進行搖床培養(yǎng)。每隔24小時， 用10ml鎖式進樣器緩慢勻速抽取錐形瓶中逸出的氣體，直接分析檢測N20。同時 用抽取液體樣品，測定NH.r-N ， N0「N和NO:,—-N濃度。通過計算氨氮去除率、總 氮去除率以及N20的氣體產量分析菌株的硝化性能和脫氮性能。
實驗結果表明蠟狀芽孢桿菌(&"W"s ce/^/s)菌株在以檸檬酸三鈉為 唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度30。C， C0D/N二25， pH=8.0，轉速460r/min， NH:-N初始濃度為100mg/L實驗條件下，96h后NH,-N去除率為91. 45%,總氮去 除率=92. 49%,產生的N20為0. 00425mg，占從水體中脫除的氮的0. 024%。 實施例14:蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047的16SrRNA基因的PCR擴增和序列測 定
將蠟狀芽孢桿菌WXZ-8 (&w77m cere")接種到100 y L雙蒸水中，沸水 浴煮5min，進行菌落PCR擴增。用于16SrRNAPCR反應的引物為一對通用引物， 即正向引物為 f27(5' -AGAGTTGATCCTGGCTAG-3')和反向引物為 r1492(5， -GGTTACCTTCGACTT-3，)。引物由北京華大中生科技發(fā)展有限公司合 成。PCR反應體系(50uL): 10XBuffer 5yL， dNTPs4uL，引物f27和r1492 各1 u L，雙蒸水39 u L，離心混勻后加入DNA模板0. 5 u L， Taq酶0. 5 u L。 PCR
11反應程序包括(1) 94。C預變性5min; (2) 94"變性lmin; (3) 5(TC退火lmin;
(4) 72。C延伸2min;進行25個循環(huán)；最后再次72。C延伸10 min.瓊脂糖凝膠電 泳(1XTAE電泳緩沖液，1%凝膠)分析PCR結果，交由北京華大中生科技發(fā)展有 限公司進行16SrRNA測序，16SrRNA基因序列長度為1404bp，在Genbank中的登 錄號為EF440610。序列表
<110> 北京工商大學
〈120>具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌及其仏0的生物控逸方 法
<130〉
〈160〉 1
<170> Patentln version 3.5
<210〉 1
<211〉 1406
<212〉 腿
<213〉 人工序列
<400> 1
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ctaaccgcaaggagggcgct3CC3Cg140權利要求
1、一株具有異養(yǎng)硝化-好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其特征在于，所述蠟狀芽孢桿菌保藏編號為CGMCC NO.3047。
2、 根據權利要求1所述的具有異養(yǎng)硝化一好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047，其特征在于，該菌株16SrRNA具有如SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列，序列長度為1404bp。
3、 一種脫氮產物N20生物控逸方法，其特征在于，將權利要求1或2所述的蠟狀芽孢桿菌CGMCC NO. 3047接種于氨氮廢水中。
4、 根據權利要求3所述的仏0生物控逸方法，其特征在于，接種前需要恒溫保持20 35°C，搖床轉速120 160r/min進行菌株活化，活化12 16小時后，取對數生長期的菌株，以5%的接種量接種到氨氮廢水中。
5、 根據權利要求4所述的N》生物控逸方法，其特征在于，所述蠟狀芽孢桿菌CGMCCNO. 3047接種于氨氮廢水的條件為以擰檬酸三鈉為唯一碳源，硫酸銨為唯一氮源，溫度^20 40。C， C0D/N二15 30， pH=5.0 9. 0，轉速=90 180r/min， NH4'-N初始濃度為80 120mg/L。
全文摘要
本發(fā)明公開了一株具有異養(yǎng)硝化—好氧反硝化性能的蠟狀芽孢桿菌(Bacillus cereus)，其保藏編號為CGMCC NO.3047，及其N₂O生物控逸方法。本發(fā)明菌株在好氧條件下能降解硝酸鹽，并進行反硝化脫氮作用；也能在氨氮廢水中生長，在好氧條件下利用氨氮進行異養(yǎng)硝化—好氧反硝化脫氮，且脫氮過程中氣體產物N₂O逸出量極低，可以從生物學角度實現N₂O控逸。
文檔編號C12N1/20GK101665777SQ20091009260
公開日2010年3月10日 申請日期2009年9月18日 優(yōu)先權日2009年9月18日
發(fā)明者劉健楠, 尹明銳, 廖小紅, 蘋 汪, 磊 王, 項幕飛 申請人:北京工商大學