專利名稱：一種異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌及其培養(yǎng)方法和用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物領(lǐng)域，具體涉及一種高效的異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌及其 培養(yǎng)方法和用途。
背景技術(shù)：
含氮廢水是目前環(huán)境污染治理中的重大問題。生物脫氮是目前被公認(rèn)為廢水脫氮 中最經(jīng)濟(jì)、最有效的方法之一。傳統(tǒng)的氨氮廢水處理是通過自養(yǎng)硝化菌的硝化作用與異養(yǎng) 反硝化菌的反硝化作用的組合工藝使氨氮轉(zhuǎn)化為氮氣。
XIII ,自養(yǎng)硝化菌亞硝酸鹽氧化菌反硝化菌
NH4 _ no2 _^ NO3 _^ N2該工藝冗長，由于硝化和反硝化的工藝條件不同，需分別在兩個系統(tǒng)中完成，造成 了兩方面不足。首先是能耗大，氨氮硝化要耗氧，也就是要耗能供氧，前置反硝化系統(tǒng)需設(shè) 置回流比較大的混合液內(nèi)回流，這也增加了能耗。其次，反硝化反應(yīng)要有碳源作為電子供 體，若污水中碳源不足(C/N過低)，則需投加甲醇等有機(jī)碳，這不僅增加了運行費用，還增 加了運行管理和后續(xù)處理的難度。因此廢水處理工程投資大，運行成本高。而且硝化細(xì)菌 通常是自養(yǎng)硝化菌，增殖緩慢，容易在廢水生物處理系統(tǒng)中被淘汰，由此影響廢水生物處理 系統(tǒng)脫氮效果的穩(wěn)定性。因此國內(nèi)外學(xué)者一直在尋找高效低耗的脫氮工藝。近幾十年來，從土壤、深?；鹕娇?、污泥、湖水等處分離得到了多種具有硝化活性 的異養(yǎng)微生物，包括有細(xì)菌、放線菌和真菌等，被稱為異養(yǎng)硝化菌。這是一類具有重要應(yīng)用 價值的微生物資源，它們可以利用很多基質(zhì)，包括無機(jī)N和有機(jī)N 如銨、胺、酰胺、N 一烷基 羥胺、肟、氧肟酸及芳香硝基化合物等。由于許多異養(yǎng)硝化菌也具有好氧反硝化作用，在氧 化過程中形成多種無機(jī)和有機(jī)N化合物，包括一些氣態(tài)N產(chǎn)物如氧化亞氮等直接脫出水溶 液系統(tǒng)，這為研究開發(fā)簡捷的含氮廢水處理新工藝提供了基礎(chǔ)，而具有好氧反硝化作用的 異養(yǎng)硝化菌就是簡捷脫氮新工藝的關(guān)鍵菌株。異養(yǎng)硝化菌易于培養(yǎng)，增殖較快，底物利用范圍廣，在廢水生物脫氮系統(tǒng)中可以穩(wěn) 定存在。因此采用異養(yǎng)硝化菌開發(fā)設(shè)計簡捷的廢水脫氮新工藝，可實現(xiàn)生物脫氮工藝的快 速啟動和穩(wěn)定運行，提高脫氮效率，降低運行成本。有望克服傳統(tǒng)處理工藝在處理效率與經(jīng) 濟(jì)適用兩方面的矛盾，實現(xiàn)廢水高效經(jīng)濟(jì)的脫氮，為解決日益嚴(yán)重的含氮化合物對環(huán)境的 污染問題作出貢獻(xiàn)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就在于針對以上問題和不足，提供一株具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化 活性的細(xì)菌。本發(fā)明的另一個目的是提供該菌株的培養(yǎng)方法和使用方法，使該細(xì)菌發(fā)揮好氧條 件下一步脫除水體中氮素的能力。本發(fā)明提供該菌在水體生物脫氮中的應(yīng)用，使用本發(fā)明提供的細(xì)菌可有效的脫除水體中的氨氮、亞硝酸鹽氮和硝酸鹽氮。本發(fā)明可以通過以下方式得以實現(xiàn)1.本發(fā)明中的菌株是一種具有脫氮生物活性的細(xì)菌，可以單株脫除水體中的氨 氮，還可以通過好氧反硝化脫除水體中的亞硝酸氮和硝酸氮。該菌株既可以異養(yǎng)生長，又 能自養(yǎng)生長；并且能在有機(jī)碳源條件下脫氮。在脫氮過程中，沒有檢測到亞硝酸鹽和硝酸 鹽的積累。更具體地，該菌株為紅球菌屬Rhodococcus sp. DN2. 3。保藏登記號CCTCC NO: M209300，保藏地點中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間2009年12月11日。2.本發(fā)明菌株的分離鑒定(1)培養(yǎng)基A 自養(yǎng)硝化培養(yǎng)基(g/L) :(NH4)2S04 2，K2HP04 1，MgS04 7H20 0.5， FeS04 7H200. 4，NaCl 2。裝瓶后按質(zhì)量百分比為0. 5 %的比例加入CaC03，最后用1 %的 NaOH溶液調(diào)pH到7. 2，121°C滅菌20分鐘。B.硅膠平板的制作將Na2Si03 -9H20配成比重為1. 10的溶液，并過濾澄清。將等 體積的上述溶液緩慢倒入比重為1.09的鹽酸中，不斷攪拌，使其混合均勻。在溶液混合均 勻的情況下倒平板。靜置24小時，待其凝固。用緩慢流水沖洗2 3天，以便除去CI—。加 AgN03檢測，直到無白色產(chǎn)生為止。用煮沸的蒸餾水沖洗3次滅菌。C.分離培養(yǎng)基在每一個硅膠平板培養(yǎng)皿中加入培養(yǎng)基A2mL，輕輕轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿， 使培養(yǎng)液均勻分布，打開烘箱在50°C烘箱烘至無水流動為止。D.牛肉膏培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏5. 0，蛋白胨10. 0，NaCl 5. 0，調(diào)pH 7. 2 7. 4， 121°C滅菌20分鐘。上述培養(yǎng)基如制成固體培養(yǎng)基，則添加瓊脂1. 5% 2. 0%。(2)紅球菌菌株DN2. 3的分離純化以發(fā)明人實驗室長期運行的廢水脫氮生物反應(yīng)器中的污泥為樣品，取100mL污 泥，靜置10分鐘，去掉上清液，用剩下的污泥作為原液進(jìn)行梯度稀釋為K^KTuo-2。采 用(1)中所述的分離培養(yǎng)基C平板培養(yǎng)，用移液槍在每個平板中加入KAKTuo-2樣品各 0. 2mL，然后用滅菌玻璃珠均勻涂布。倒置放入加了水的干燥器中，以防硅膠平板干裂，30°C 培養(yǎng)直至硅膠平板上長出單菌落。挑取單菌落采用培養(yǎng)基A平板劃線，進(jìn)一步純化得到本 發(fā)明中的菌株Rhodococcus Sp.DN2.3。后來發(fā)現(xiàn)該細(xì)菌能在培養(yǎng)基D中生長，于是采用培 養(yǎng)基D進(jìn)行菌種保藏。(3)紅球菌菌株DN2. 3菌落形態(tài)特征(附圖1)在培養(yǎng)基A平板上培養(yǎng)2d后，解 剖鏡下觀察到菌落直徑約0. 3mm，橙紅色，菌落呈圓形，表面濕潤凸起、邊緣不光滑。在培養(yǎng) 基D平板上培養(yǎng)3d后，觀察到菌落直徑約0. 5mm，橙紅色，菌落圓形，表面濕潤凸起，邊緣不 光滑。(4)紅球菌菌株DN2. 3菌體形態(tài)特征(附圖2):掃描電鏡的觀察表明，菌體呈不規(guī) 則短桿狀或桿狀，大小為0. 5 0. 8iimXl 3iim。(5)紅球菌菌株DN2. 3的生理生化特征最適培養(yǎng)溫度范圍30 37°C，pH7. 0 7. 5。主要的生理生化特性見表1。表1DN2. 3菌株的主要生理生化特性 注+表示陽性反應(yīng)或能利用；-表示陰性反應(yīng)或不能利用(6) 16S rDNA 的 PCR 擴(kuò)增與測序?qū)嶒瀮x器BIO-RADMJ Mini Thermal Cycler (PCR 儀)，BIO-RAD PowerPac 3000 穩(wěn)壓電泳儀，GDS8000, Gene Company Limited凝膠成像儀實驗方法熱裂解菌懸液，以基因組DNA為模板擴(kuò)增16S rDNA，擴(kuò)增引物采用細(xì)菌 通用引物 27F(5' -AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3 ‘)和 1505R(5' -GGTTACCTTGTTACGACTT-3 ‘)，分別對應(yīng)于大腸桿菌(Escherichia coli) 16S rDNA 8 27位和1487 1505位的 核苷酸，引物合成由寶生物公司(TAKARA)完成。PCR反應(yīng)體系采用50 yl反應(yīng)體系10X 緩沖液(含 Mg2+)5ii l,4u 1 (1^ (各2.5111 mol/L)，10iimol/L 引物各 lyl，rTaq 酶(5U/ U 1)0. 5u l,10ng/u 1 DNA 模板 liil，去離子水 37. 5iil。PCR 擴(kuò)增條件94°C 預(yù)變性 5min ； 94°C lmin，53°C lmin，72°C lmin30s，共 30 個循環(huán)；最后 72°C延伸 lOmin，4°C放置。擴(kuò)增 的PCR產(chǎn)物在1 %瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳分離，驗證后切下膠條，用DNA膠回收試劑盒(杭 州V-gene)純化PCR產(chǎn)物?；厥债a(chǎn)物與載體pMD18_T (TAKARA) 16°C連接過夜，轉(zhuǎn)化感受態(tài)大 腸桿菌JM109，在含氨芐青霉素Amp(100ng/L)的LB平板上涂板，挑取單菌落培養(yǎng)并篩選陽 性克隆，送公司測序，測序工作由上海英俊生物公司完成。(7) 16S rDNA序列分析與系統(tǒng)發(fā)育分析測序后得到DN2. 3的16S rDNA序列1484bp，提交NCBI進(jìn)行BLAST序列比對(登 陸號EU382217)，發(fā)現(xiàn)DN2. 3與紅球菌屬(Rhodococcus)中多株紅球菌(如Rhodococcus sp. P14等)的16S rDNA序列相似性水平達(dá)到99%，據(jù)此可初步確定DN2. 3屬于紅球菌屬 Rhodococcus ；結(jié)合菌株的形態(tài)學(xué)和生理生化鑒定特征，可初步確定DN2. 3為Rhodococcus， 命名為 Rhodococcussp. DN2. 3。3.紅球菌菌株DN2. 3的脫氮活性菌株DN2. 3具有異養(yǎng)脫氮的能力，并且在脫氮過程中不積累硝酸鹽和亞硝酸鹽。
以葡萄糖為碳源，硫酸銨為氮源，DN2. 3能去除氨氮，并且培養(yǎng)體系中始終沒有 檢測出硝酸氮、亞硝酸氮的積累。培養(yǎng)基組分為碳源葡萄糖0.5 10. Og/L，氮源硫酸銨 0. 1 2. 5g/L，其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸餾 水 lOOOmL ；NaOHi周 pH 7. 0 7. 4，121°C滅菌 20 分鐘。以乙酸鈉為碳源，硫酸銨為氮源，DN2. 3能去除氨氮，并且在整個培養(yǎng)過程中，沒有 檢測出硝酸氮和亞硝酸氮的明顯積累。培養(yǎng)基組分為碳源乙酸鈉1. 0 5. 0g/L，氮源為硫 酸銨 0. 2 1. 0g/L，其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H20 0. 5g/L，CaCl2 2H20 0. 5g/L， 蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0 7. 5，121°C滅菌 20 分鐘。本發(fā)明菌株還可以在有機(jī)碳源條件下進(jìn)行以NaN02、KN03為底物的好氧反硝化。以葡萄糖為碳源，亞硝酸鈉為氮源時，本發(fā)明菌株可以進(jìn)行好氧反硝化。培養(yǎng)基組 分為碳源葡萄糖0. 5 2. 0g/L，氮源為亞硝酸鈉1. 25 5. 0g/L，其余成分為KH2P04 0. 7g/ L, MgS04 7H20 0. 5g/L, CaCl2 2H20 0. 5g/L,蒸餾水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0 7. 5，121 °C 滅菌20分鐘。以葡萄糖為碳源，硝酸鉀為氮源時，本發(fā)明菌株可以進(jìn)行好氧反硝化。培養(yǎng)基組 分為碳源葡萄糖0. 5 2. 0g/L,氮源為硝酸鉀2. 0 7. 0g/L,其余成分為KH2P04 0. 7g/L， MgS04 7H200. 5g/L, CaCl2 2H20 0. 5g/L,蒸餾水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0 7. 5，121°C 滅菌 20分鐘。以乙酸鈉為碳源，亞硝酸鈉為氮源時，本發(fā)明菌株可以進(jìn)行好氧反硝化。培養(yǎng)基組 分為碳源乙酸鈉0. 6 5. 0g/L，氮源為亞硝酸鈉1. 25 5. 0g/L，其余成分為KH2P04 0. 7g/ L, MgS04 7H20 0. 5g/L, CaCl2 2H20 0. 5g/L,蒸餾水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0 7. 5，121 °C 滅菌20分鐘。以乙酸鈉為碳源，硝酸鉀為氮源時，本發(fā)明菌株可以進(jìn)行好氧反硝化。培養(yǎng)基組 分為碳源乙酸鈉0. 6 5. 0g/L，氮源為硝酸鉀2. 0 7. 0g/L，其余成分為KH2P04 0. 7g/L， MgS04 7H200. 5g/L, CaCl2 2H20 0. 5g/L,蒸餾水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0 7. 5，121°C 滅菌 20分鐘。本發(fā)明中的菌株DN2. 3在存在氮素如氨態(tài)氮和/或硝酸鹽氮和/或亞硝酸氮的水 體中，均有脫除氮素的活性。這樣，本發(fā)明菌株可用于多種含氮廢水的處理。4.本發(fā)明中紅球菌菌株DN2. 3的培養(yǎng)(1)所使用的培養(yǎng)基A.牛肉膏培養(yǎng)基(g/L)牛肉膏5. 0，蛋白胨10. 0，NaCl 5. 0，調(diào)pH 7. 2 7. 4， 121°C滅菌20分鐘。B.有機(jī)碳源脫氮培養(yǎng)基(g/L) :KH2P04 0. 7，MgS04 7H20 0. 5，CaCl2 2H20 0. 5， (NH4) 2S04 0. 5，葡萄糖 2. 0，NaOH 調(diào) pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌 20 分鐘。上述培養(yǎng)基如制成固體培養(yǎng)基，則添加加瓊脂1. 5% 2. 0%。(2)本發(fā)明中紅球菌菌株DN2. 3培養(yǎng)條件將牛肉膏培養(yǎng)基斜面上保存的Rhodococcus sp. DN2. 3用接種環(huán)刮取一環(huán)菌分別 接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基或有機(jī)碳源脫氮液體培養(yǎng)基中，30 37°C，170 200rpm振蕩培 養(yǎng)，在24 36h內(nèi)可收獲菌液。5.本發(fā)明中紅球菌菌株DN2. 3的使用方法
6
本發(fā)明提供該菌在水體生物脫氮中的應(yīng)用，使用本發(fā)明提供的細(xì)菌可有效地脫除 水體中的氨氮、硝酸氮和亞硝酸氮。(1)使用前用有機(jī)碳源脫氮培養(yǎng)基活化菌株。從牛肉膏培養(yǎng)基斜面上刮取一環(huán)菌 苔，接種入裝有30mL 50mL有機(jī)碳源脫氮液體培養(yǎng)基的250mL錐形瓶中，30 37 °C，170 200rpm振蕩培養(yǎng)24 36h，即可完成菌株活化。(2)將活化后的菌液按2% 10%比例接種于待處理模擬含氮廢水中，30 37°C， 170 200rpm振蕩或曝氣培養(yǎng)，或采用填料掛膜、載體吸附或好氧顆粒污泥等固定化技術(shù) 固定后，曝氣培養(yǎng)，定時取樣檢測NH4+-N、no2--N、NO3--N、TN、C0DCr等去除情況。(3)檢測方法NH4+-N 采用水楊酸-次氯酸鹽分光光度法NCV-N 采用N- (1-萘基)-乙二胺光度法NCV-N 采用DMP分光光度法TN 采用堿性過硫酸鉀法消解紫外分光光度法C0DCr 采用重鉻酸鉀消解分光光度法以上方法均參照中國環(huán)境科學(xué)出版社出版的《水和廢水檢測分析方法》(第四 版)。 NH4+-N、N02--N、N03--N、TN、C0DCr等的測定采用德國WTW多功能水質(zhì)分析儀 (TheSpectroquant Analysis System PhotoLab S12)，型號 PhotoLab S12，工作電壓 12V。 消煮使用WTW公司產(chǎn)CR 2200加熱器。測試試劑為默克公司生產(chǎn)的配套試劑。本發(fā)明具有以下優(yōu)點(1)本發(fā)明菌株既可自養(yǎng)生長，又可異養(yǎng)生長，基質(zhì)利用范圍廣，易于培養(yǎng)，水質(zhì)適 應(yīng)范圍廣。(2)本發(fā)明菌株能在異養(yǎng)條件下脫氮，并且在脫氮過程中沒有硝酸鹽和亞硝酸鹽 的積累。(3)本發(fā)明菌株可以脫除水體中多種形態(tài)的氮，包括氨態(tài)氮、硝酸態(tài)氮和亞硝酸態(tài)氮。(4)本發(fā)明菌株可同時去除有機(jī)廢水中的氮和C0D&。(5)本發(fā)明菌株適用于有機(jī)含氮廢水的處理，可以在一個處理系統(tǒng)中完成快捷脫 氮，不同于傳統(tǒng)的硝化_反硝化多步脫氮途徑。因此，使用該菌株處理廢水，工藝簡單、工藝 路線短，并且脫氮效果穩(wěn)定。


附圖1紅球菌DN2. 3在牛肉膏培養(yǎng)平皿上生長的菌落圖附圖2紅球菌DN2. 3菌體掃描電鏡顯微照片下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步闡明本發(fā)明，應(yīng)當(dāng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
具體實施例方式實施例1 本發(fā)明菌株的培養(yǎng)
(1)牛肉膏培養(yǎng)基和有機(jī)碳源脫氮培養(yǎng)基，121°C，滅菌20分鐘。(2)將菌株紅球菌DN2. 3接種至滅菌的牛肉膏斜面上，37°C活化培養(yǎng)24 36h備用。(3)將活化后的菌種接種于牛肉膏液體培養(yǎng)基或有機(jī)碳源脫氮液體培養(yǎng)基中， 250mL三角瓶中裝量50mL培養(yǎng)基，37°C，170 200rpm振蕩培養(yǎng)24 36h。(4)4000rpm, lOmin離心收獲菌體或直接將菌懸液轉(zhuǎn)接于待處理的廢水樣品中。實施例2 本發(fā)明菌株在乙酸鈉為有機(jī)碳源條件下對氨氮和COD&的去除模擬廢水(g/L):KH2P04 0. 7，MgS04 7H20 0. 5，CaCl2 2H20 0. 5，(NH4) 2S04 0. 5， 乙酸鈉2. 6，NaOH調(diào)pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌20分鐘。配制以乙酸鈉為碳源、硫酸銨為氮源的模擬廢水，初始C0%d々 2000mg/L，氨氮 約100mg/L。接種2 %的菌懸液(培養(yǎng)方法見實施例1)，對照用同體積滅菌水代替，37°C， 170rpm振蕩培養(yǎng)，定時取樣測定氨氮、硝酸氮、亞硝酸氮濃度的變化。結(jié)果見表1。從表1 中可以看出，在乙酸鈉為有機(jī)碳源時，DN2.3能去除氨氮。在初始氨氮濃度為103mg/L的 有機(jī)碳源培養(yǎng)基中，DN2. 3經(jīng)過144小時的培養(yǎng)，將體系中的氨氮降到了 32mg/L，C0DCr降 至300mg/L，氨氮去除率為71.9%，COD去除率為85. 5%。在此過程中，培養(yǎng)體系中沒有檢 測到明顯的硝酸氮、亞硝酸氮積累(濃度彡0. 02mg/L)。這與文獻(xiàn)“好氧同時硝化-反硝 化菌的分離鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析”(張光亞、方柏山等，2005)中報道的菌株Rhodococcus sp. SDN在乙酸鈉和硫酸銨分別為碳源和氮源時，對數(shù)生長期(28 36h)可以檢測到130 140 u mol/L的亞硝酸(換算成亞硝酸氮濃度為1. 82 1. 96mg/L)不同。表1DN2. 3在乙酸鈉為機(jī)碳源條件下對氨氮和C0D&的去除
培養(yǎng)時間(h)氨氮濃度(mg/L)CODtt 濃度(mg/L)氨氮去除率(％)CODCr去除率(％)01032070//2487216015.5/4879195023.35.87280189022.38.79661165040.820.312050126054.539.11443230071.985.5實施例3 本發(fā)明菌株在葡萄糖為有機(jī)碳源條件下對氨氮和C0D&的去除模擬廢水(g/L):KH2P04 0. 7，MgS04 7H20 0. 5，CaCl2 2H20 0. 5，(NH4) 2S04 0. 5， 葡萄糖2. 0，NaOH調(diào)pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌20分鐘。配制葡萄糖為有機(jī)碳源、硫酸銨為氮源的模擬廢水，初始C0D&濃度為2000mg/L， 氨氮約為100mg/L。接種2%菌懸液(培養(yǎng)方法見實施例1)，對照用同體積滅菌水代替， 30°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，定時測定C0D&和氨氮含量。實驗結(jié)果見表2。從表2可看出，DN2. 3 在初始C0D&濃度在2000mg/L時，培養(yǎng)48h，氨氮和C0D&都得到了較好的去除，去除率分別 為54. 4%和37.9%。培養(yǎng)液中均未檢出硝酸氮和亞硝酸氮。因此，DN2. 3能利用葡萄糖作 為外加有機(jī)碳源進(jìn)行異養(yǎng)生長，并能同步去除C0D&和氨氮。表2DN2. 3在葡萄糖為有機(jī)碳源條件下對氨氮和C0D&的同時去除 實施例4 本發(fā)明菌株以葡萄糖為碳源對NaN02、KN03為底物的好氧反硝化脫氮培養(yǎng)基(g/L):KH2P04 0. 7，MgS04 7H20 0. 5，CaCl2 2H20 0. 5，KN03/NaN02 按需濃 度配制，葡萄糖1. 0，NaOH調(diào)pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌20分鐘。以亞硝酸鈉、硝酸鉀為氮源分別配制兩種不同的反硝化培養(yǎng)基1#、2#，NaN02/KN03 3. 6mM，氮元素濃度為50mg/L，其他培養(yǎng)基成分相同(碳源均為0. 葡萄糖)，接種菌懸液 量均為5% (培養(yǎng)方法見實施例l)，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，定時測定氮的去除情況。實驗 結(jié)果見表3。從表3中可看出，DN2. 3在此條件下對亞硝酸氮和硝酸氮都能進(jìn)行反硝化，表
明DN2. 3具有好氧反硝化能力。表3DN2. 3以葡萄糖為碳源的好氧反硝化脫氮作用 *1#培養(yǎng)基中出現(xiàn)硝酸氮估計是由于亞硝酸鈉藥品在空氣中部分氧化的原因?qū)嵤├? 本發(fā)明菌株以乙酸鈉為碳源對NaN02、KN03的好氧反硝化脫氮培養(yǎng)基(g/L):KH2P04 0. 7，MgS04 7H20 0. 5，CaCl2 2H20 0. 5，NaN02/KN03 按需濃 度配制，乙酸鈉2. 0，NaOH調(diào)pH 7. 2 7. 4，121°C滅菌20分鐘。以亞硝酸鈉、硝酸鉀為氮源分別配制兩種不同的反硝化培養(yǎng)基1#、2#，KN03/NaN02 0. 2%，氮元素濃度約為40mg/L，其他培養(yǎng)基成分相同(碳源均為0. 2%乙酸鈉)，接種菌懸 液量均為5% (培養(yǎng)方法見實施例l)，37°C，200rpm振蕩培養(yǎng)，定時測定氮的去除情況。實 驗結(jié)果見表4。從表4中可看出，DN2. 3在此條件下對亞硝酸氮和硝酸氮都能進(jìn)行反硝化， 表明DN2. 3具有好氧反硝化能力，這與文獻(xiàn)“好氧反硝化菌的分離鑒定及特性研究”(張光 亞，陳培欽，2005)中所報道的，菌株Rhodococcus sp.DN在0. 2%乙酸鈉為碳源，0. 2%亞硝 酸鈉為氮源的培養(yǎng)基中不生長的情況明顯不同。表4DN2. 3以乙酸鈉為碳源的好氧反硝化脫氮作用 *1#培養(yǎng)基中出現(xiàn)硝酸氮估計是由于亞硝酸鈉藥品在空氣中部分氧化的原因。
權(quán)利要求
一株異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌，該細(xì)菌為紅球菌屬Rhodococcus sp.DN2.3，保藏登記號CCTCC NOM209300，保藏地點中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏時間2009年12月11日。
2.一種培養(yǎng)權(quán)利要求1所述細(xì)菌的方法，其特征是將Rhodococcus Sp.DN2.3接種于 培養(yǎng)基中，30-37 °C，170-200rpm振蕩培養(yǎng)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為牛肉膏5.0g/ L，蛋白胨 10. Og/L, NaCl 5. Og/L，蒸餾水 1000mL ；調(diào) pH 7. 2-7. 4，121°C滅菌 20 分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為碳源葡萄 糖 0. 5-10. 0g/L，氮源硫酸銨 0. 1-2. 5g/L，其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H200. 5g/L， CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 4，121°C滅菌 20 分鐘。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為碳源乙酸鈉 1. 0-5. 0g/L,氮源為硫酸銨 0. 2-1. 0g/L,其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H200. 5g/L， CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 20 分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為碳源葡萄糖 0. 5-2. 0g/L，氮源為亞硝酸鈉 1. 25-5. 0g/L，其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H200. 5g/ L, CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 20 分鐘。
7.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為碳源葡萄糖 0. 5-2. 0g/L,氮源為硝酸鉀 2. 0-7. 0g/L,其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H200. 5g/L， CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 20 分鐘。
8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為碳源乙酸鈉 0. 6-5. 0g/L，氮源為亞硝酸鈉 1. 25-5. 0g/L，其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H200. 5g/ L, CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 20 分鐘。
9.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細(xì)菌培養(yǎng)方法，其特征是所述的培養(yǎng)基組分為碳源乙酸鈉 0. 6-5. 0g/L,氮源為硝酸鉀 2. 0-7. 0g/L,其余成分為 KH2P04 0. 7g/L，MgS04 7H200. 5g/L， CaCl2 2H20 0. 5g/L，蒸溜水 lOOOmL ；NaOH 調(diào) pH 7. 0-7. 5，121°C滅菌 20 分鐘。
10.權(quán)利要求1所述的細(xì)菌及其培養(yǎng)物的用途，用于水體生物脫氮，將培養(yǎng)得到的菌液 按2%-10%比例接種于待處理含氮廢水中，170-200rpm振蕩培養(yǎng)或采用填料掛膜、載體吸 附或好氧顆粒污泥固定化技術(shù)固定后曝氣培養(yǎng)。
全文摘要
本發(fā)明屬于環(huán)境微生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種高效的異養(yǎng)硝化好氧反硝化細(xì)菌及其培養(yǎng)方法和用途。該細(xì)菌是紅球菌屬Rhodococcus sp.DN2.3，保藏登記號為CCTCC M209300，能夠有效脫除水體中的氨氮、亞硝酸氮、硝酸氮及其混合物，還可同時去除有機(jī)廢水中的CODCr，適用于高濃度有機(jī)含氮廢水的處理，脫氮過程中，不產(chǎn)生亞硝酸鹽和硝酸鹽的積累。使用該菌株處理廢水工藝簡單，脫氮效果穩(wěn)定。
文檔編號C02F3/02GK101875909SQ201010101218
公開日2010年11月3日 申請日期2010年1月26日 優(yōu)先權(quán)日2010年1月26日
發(fā)明者牟麗娉, 趙永貴, 黃鈞 申請人:中國科學(xué)院成都生物研究所